綠原酸在制備預(yù)防和治療原發(fā)性皮膚t細(xì)胞淋巴癌的藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌治療領(lǐng)域，具體為綠 原酸在制備預(yù)防和治療原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（cutaneous T cell lymphoma, CTCL)，曾被稱為蕈狀肉 芽腫（granuloma fungoid)，是T淋巴細(xì)胞（特別是T輔助細(xì)胞亞群）起源的一種皮膚原發(fā) 淋巴癌。其作為一組具有明顯異質(zhì)性的淋巴增生性疾病，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化治療方案。
[0003] 在其發(fā)病早期，以增強(qiáng)患者免疫力和局部治療為主，可用干擾素、卡介菌或轉(zhuǎn)移因 子等；局部治療可選用氮芥或芳香維A酸外用，電子束照射，X線、光化學(xué)療法等均有一定療 效。目前，尚未見用于該病治療的新的化療藥及靶向治療藥物的報(bào)道。
[0004] 綠原酸（即3-咖啡奎寧酸）作為一種多酚類的化合物，其結(jié)構(gòu)中的多羥基、不飽 和酯以及鄰二酚結(jié)構(gòu)可使綠原酸具有高抗氧性。目前，對(duì)綠原酸生理/藥理活性研宄報(bào)道 的文獻(xiàn)已有許多，如US5, 788, 971中報(bào)道了綠原酸的抗氧化作用對(duì)清除氧自由基的影響及 治療炎癥反應(yīng)的作用。W099/34812報(bào)道了由三羥基酮、連翹精醇和綠原酸組成的制劑具有 的抗病毒、抗菌或免疫調(diào)節(jié)劑的功能。US20050282892記載了綠原酸治療慢性粒細(xì)胞白血 病。SanR.H.C.等在MutaionRes. 1987,117:229~239中報(bào)道了關(guān)于多酚類化合物綠原酸 對(duì)黃曲霉素B1和苯并[a ]芘致癌物質(zhì)活性的抑制作用。同時(shí)，中國(guó)專利CN201110373137. 8 公開了綠原酸在制備治療腎癌的藥物中的用途，CN201210086313. 4公開了一種治療膀胱 癌的藥物組合物，CN200710140602. 7公開了綠原酸在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用 途，CN200610021897. 1公開了綠原酸在制備具有預(yù)防和治療鼻咽癌功效的藥物中的應(yīng)用， CN200610021591. 6公開了綠原酸在制備具有預(yù)防和治療宮頸癌功效的藥物中的應(yīng)用。
[0005]目前，還沒(méi)有任何文獻(xiàn)公開綠原酸用于治療原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的發(fā)明目的提供一種綠原酸在制備預(yù)防和治療原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌 的藥物中的用途。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，綠原酸能夠激活CD4T淋巴細(xì)胞和CD8T淋巴細(xì)胞， 并以CD4T淋巴細(xì)胞和CD8T淋巴細(xì)胞為靶點(diǎn)，預(yù)防和治療原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌。本發(fā) 明通過(guò)綠原酸促進(jìn)機(jī)體T淋巴細(xì)胞的增殖，并激活T淋巴細(xì)胞，以達(dá)到治療原發(fā)性皮膚T細(xì) 胞淋巴癌的目的。同時(shí)，綠原酸還能抑制原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌細(xì)胞的增殖，且抑制效果 與干擾素的抑制效果相近。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 綠原酸在制備預(yù)防和治療原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌的藥物中的用途。
[0009] 綠原酸在制備以CD4淋巴細(xì)胞為靶點(diǎn)預(yù)防和治療原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌的藥物 中的用途。
[0010] 綠原酸在制備以CDS淋巴細(xì)胞為靶點(diǎn)預(yù)防和治療原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌的藥物 中的用途。
[0011] 綠原酸在制備以CD4和CD8為靶點(diǎn)預(yù)防和治療原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌的藥物中 的用途。
[0012] 以綠原酸為有效成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制成藥物。
[0013] 其中，所述藥物的劑型為注射制劑或口服制劑。
[0014] 其中，每制劑單位含有綠原酸l-1000mg。
[0015] 其中，藥物臨床使用劑量為l-100mg/kg。
[0016] 綠原酸與抗腫瘤藥物在制備治療原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌的聯(lián)合用藥物中的用 途，所述抗腫瘤藥物為環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、白介素12、白介素2、Y干擾素中的一種或幾 種。
[0017] 其中，所述綠原酸與抗腫瘤藥物的劑量配比為1:5~5:1。
[0018] 原發(fā)性皮膚淋巴瘤屬結(jié)外非霍奇金淋巴瘤，研宄證明：原發(fā)性皮膚淋巴瘤與有相 同組織學(xué)亞型的原發(fā)性淋巴結(jié)淋巴瘤在累及皮膚時(shí)，在臨床及組織學(xué)特征、生物學(xué)行為及 預(yù)后，都有明顯不同。此外，皮膚淋巴瘤的基因易位，癌基因表達(dá)，病毒片段，黏附分子，均有 不同于淋巴結(jié)淋巴瘤的特點(diǎn)。不同部位起源的形態(tài)學(xué)一致的淋巴瘤是許多不同的、器官相 關(guān)的淋巴細(xì)胞亞群的單克隆擴(kuò)增，這些淋巴細(xì)胞保留了他們相應(yīng)良性部分的許多特征。原 發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（primary cutaneous T-cell lymphoma，PCTCL)是主要的原發(fā)性皮 膚淋巴瘤，以皮膚內(nèi)輔助T細(xì)胞的單克隆擴(kuò)增為特征，患都在數(shù)年內(nèi)死亡，預(yù)后差。
[0019] 針對(duì)這一問(wèn)題，申請(qǐng)人提供綠原酸在制備預(yù)防和治療原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌的 藥物中的用途。申請(qǐng)人通過(guò)研宄發(fā)現(xiàn)，綠原酸能夠以T淋巴細(xì)胞亞群⑶4、⑶8細(xì)胞為靶點(diǎn)， 激活T細(xì)胞的功能，以達(dá)到預(yù)防和治療原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。同時(shí)，綠原酸還能抑制原 發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌細(xì)胞的增殖，且抑制效果與干擾素的抑制效果相近。
[0020] 基于上述發(fā)現(xiàn)，綠原酸可以和藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制成藥物，采用 各種制藥技術(shù)，制備成注射制劑、口服制劑或外用透皮給藥制劑等劑型。
[0021] 以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)綠原酸所具有的上述功效加以證實(shí)。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí) 驗(yàn)例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改 進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 本發(fā)明將通過(guò)例子并參照附圖的方式說(shuō)明，其中：
[0023] 圖1為實(shí)施例1中，T淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果（p〈0. 05)圖。
[0024] 圖2為實(shí)施例1中，⑶4T淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果圖。
[0025] 圖3為實(shí)施例1中，原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果（p〈0. 05)圖。
[0026] 圖4為實(shí)施例2中，T淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果（p〈0. 05)圖。
[0027] 圖5為實(shí)施例2中，⑶8T淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果圖。
[0028] 圖6為實(shí)施例2中，原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果（p〈0. 05)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本說(shuō)明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過(guò)程中的步驟，除了互相排斥 的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。
[0030] 本說(shuō)明書中公開的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的 替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個(gè)特征只是一系列等效或類似特征中的一個(gè)例子 而已。
[0031] 實(shí)施例1以CD4T淋巴細(xì)胞為靶點(diǎn)治療原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌
[0032] (1)動(dòng)物模型建立及分組
[0033] 小鼠原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌模型，選取成年BABL/c小鼠，雄性，18-22g。實(shí)驗(yàn) 時(shí)，取生長(zhǎng)良好的腫瘤組織，剪碎，研磨，過(guò)濾，用無(wú)菌生理鹽水按1 :3比例稀釋后，制成腫 瘤細(xì)胞懸液，每只小鼠腋背部接種〇. 2ml腫瘤細(xì)胞懸液。接種后次日動(dòng)物隨機(jī)分組，分為8 組，分別為：（1)陰性對(duì)照組（生理鹽水組，NS)，（2)綠原酸給藥組（CHA，5mg/kg)，（3)綠原 酸給藥組（CHA，10mg/kg)，（4)綠原酸給藥組（CHA，20mg/kg)，（5)干擾素給藥組（IFN-y)， (6)綠原酸和干擾素同時(shí)給藥組（CHA+IFN-y，5mg/kg)，（7)綠原酸和干擾素同時(shí)給藥組 (CHA+IFN-y，10mg/kg)，⑶綠原酸和干擾素同時(shí)給藥組（CHA+IFN-y，20mg/kg);每組20 只，稱重，并開始給藥。
[0034] 綠原酸給藥組每天采用腹腔給藥的方式注射各劑量的注射用綠原酸（擬給藥時(shí) 間為15天）；干擾素給藥組以腹腔給藥的方式，隔天注射500單位的干擾素；綠原酸和干擾 素同時(shí)給藥組以腹腔給藥的方式，隔天注射500單位的干擾素和各劑量的注射用綠原；陰 性對(duì)照組每天采用皮下給藥的方式注射相同劑量的生理鹽水。分別于給藥的第3、6、9、12 和15天分別各組小鼠3只，采用眼球取血法進(jìn)行取血，離心后檢測(cè)；同時(shí)對(duì)已經(jīng)處死的小鼠 進(jìn)行解剖，觀察脾臟、胸腺和腫瘤，評(píng)價(jià)給藥的效果。采用生物樣品保存法對(duì)分離得到的小 鼠血清、脾臟、胸腺和腫瘤進(jìn)行保存以備后期檢測(cè)。
[0035] (2)T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
[0036] 無(wú)菌條件下取小鼠的脾臟，加適量的Hank's液研磨，以200目細(xì)胞篩濾過(guò)，1500r/ m離心5分鐘，棄上清，加Hank' s液重復(fù)洗滌2次。收集脾細(xì)胞，加適量的RPMI1640培養(yǎng) 液混懸，以0. 4%的臺(tái)盼蘭拒染色法計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)不小于95%，加RPMI1640完全培養(yǎng)液稀 釋，并調(diào)整細(xì)胞濃度至lxlO7個(gè)/ml。于96孔微量板中，每孔加100 y L脾細(xì)胞懸液和等體 積的ConA溶液（終濃度為5 y g/ml)、LPS溶液（終濃度為10 y g/ml)或RPMI1640培養(yǎng)液， 重復(fù)3孔。另設(shè)空白對(duì)照組。然后，再在37°C、5%C02培養(yǎng)4小時(shí)后，各孔加入50yl MTT 溶液（2mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。然后，再1000r/m離心5分鐘，棄去各孔上清，分別加入 150 y 1酸性DMS0溶液，振蕩，于室溫暗處放15分鐘，以酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)578nm處測(cè)定0D值。
[0037] (3) CD4T淋巴細(xì)胞檢測(cè)
[0038] 取血加抗體，取小鼠血1ml，用EDTAk3血常規(guī)管抗凝全血，試管標(biāo)號(hào)。取50 y 1抗凝 全血，分別加入試管①、試管②，直接加至底部，不可觸試管壁。試管①加入5 y 1抗體⑶4+， 試管②統(tǒng)一加入5 y 1抗體⑶3+和5 y 1抗體⑶4 +，用振蕩器混勻后暗室放置20~30分鐘， 使抗體與血樣充分的結(jié)合；避光常溫30分鐘后，加裂解液：試管在振蕩中加入500 y 1裂解 液，在30°C水浴中放置15分鐘，達(dá)到透亮；裂解后，1500r/m離心5分鐘，用PBS液洗2次， 加lmlPBS液1500r/m離心5分鐘后去上液；再加入lmlPBS液，1500r/m離心5分鐘后去上 液，加500 y 1PBS液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0039] (4)原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌細(xì)胞檢測(cè)
[0040] 用CFSE流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴癌細(xì)胞。
[0041] 無(wú)菌條件下，取小鼠的瘤塊，加適量的Hank' s液研磨，以200目細(xì)胞篩濾過(guò)， 15