抗體共價修飾的泊洛沙姆共聚物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗體共價修飾的末端抗體化泊洛沙姆兩 親性聚合物的制備方法及其在藥物輸運(yùn)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥物的靶向輸運(yùn)技術(shù)因載體具有定向或定點遞釋的功能，具有減毒增效的優(yōu)點， 而受到廣大科學(xué)工作者的特別青睞。例如，免疫脂質(zhì)體的研宄，通過單克隆抗體或其片段修 飾脂質(zhì)體，借助其表面修飾的抗體與靶細(xì)胞表面過度表達(dá)或特有的標(biāo)識物結(jié)合，從而使藥 物濃集于靶器官、靶組織或靶細(xì)胞內(nèi)，減少其在正常組織中的蓄積，達(dá)到增效減毒的作用。
[0003] 抗體或其片段修飾載體代表了靶向載體輸運(yùn)技術(shù)的主流方向?？贵w或其片段修飾 載體的制備方法，除了將二者進(jìn)行簡單的物理混合孵育以外，主要是利用了共價修飾手段， 即抗體或其片段共價修飾到連接材料上，然后帶有抗體或片段的連接材料嵌入或摻雜到藥 物載體內(nèi)部。例如抗體修飾長循環(huán)脂質(zhì)體，是將抗體共價連接磷脂材料，后嵌入到已經(jīng)制備 好的長循環(huán)脂質(zhì)體中從而制得。
[0004] 泊洛沙姆是一類由聚氧乙烯（PEO)和聚氧丙烯（PPO)組成的I3EO-PPO-PEO非 離子型三嵌段共聚物，其結(jié)構(gòu)式為：H0- (CH2CH2O) y- (CHCH3CH2O) x- (CH2CH2O) y-H，商品名為 Pluronic、LutrolF(BASF，Germany)及Poloxamer(ICI)，中文譯名為普流羅尼克或泊洛沙 姆。
[0005] 泊洛沙姆系列含有30多種不同高聚物，均具有表面活性。泊洛沙姆無生理活性、 無溶血性、對皮膚無刺激性、毒性小，作為藥用輔料可充當(dāng)乳化劑、增溶劑、吸收促進(jìn)劑、緩 釋材料等，應(yīng)用到溶液劑、乳劑、栓劑、軟膏、注射劑以及脂質(zhì)體等新型給藥系統(tǒng)中。
[0006] 因泊洛沙姆具有廣泛應(yīng)用的前景，又因泊洛沙姆末端羥基的活性基團(tuán)，泊洛沙姆 的修飾衍生化研宄一直受到人們關(guān)注，如利用羥基末端和難溶性羧酸類藥物共價偶聯(lián)，增 加難溶性藥物的應(yīng)用前景；又如將泊洛沙姆末端氨基化和肝素等糖胺聚糖成分結(jié)合，作為 抗凝血藥物載體或生長因子緩控釋載體。
[0007] 目前，國際上尚未報導(dǎo)抗體化泊洛沙姆兩親性聚合物這一結(jié)構(gòu)分子，特別是將泊 洛沙姆末端馬來酰亞胺化，進(jìn)而同巰基化抗體進(jìn)行結(jié)合的制備方法尚未報導(dǎo)。將泊洛沙姆 末端抗體化修飾，以此為連接材料，利用泊洛沙姆的疏水嵌段孵育摻入到載體材料疏水部 位中，從而使載體具有靶向功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種抗體化泊洛沙姆兩 親性共聚物及其制備方法和應(yīng)用，將泊洛沙姆共聚物末端馬來酰亞胺化，進(jìn)而同巰基化抗 體進(jìn)行共價結(jié)合，得到抗體化泊洛沙姆，可應(yīng)用于在載體材料中，使載體既具有抗體的靶向 功能，又具有泊洛沙姆分子的兩親性特點。
[0009] 技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0010] -種抗體共價修飾的泊洛沙姆共聚物，由泊洛沙姆共聚物的兩末端或單末端經(jīng) 抗體衍生化而制成，結(jié)構(gòu)通式為抗體-泊洛沙姆共聚物，所述泊洛沙姆共聚物是由聚氧乙 烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段形成的具有羥基末端的共聚物。
[0011] 可用于與抗體共價連接的材料是多種多樣的，主要是含有活性基團(tuán)的天然材料或 合成材料，如末端羧基化的聚乙二醇磷脂、羥基末端的聚合物類等，而泊洛沙姆共聚物則是 具有羥基末端的共聚物，具兩親性，也易衍生化。將泊洛沙姆共聚物的末端進(jìn)行抗體化修 飾，并作為連接材料，利用泊洛沙姆共聚物的疏水嵌段將抗體孵育摻入到載體材料疏水部 位中，從而使載體具有靶向功能。
[0012] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述泊洛沙姆共聚物的結(jié)構(gòu)通式為HO-(CH2CH 2O) y-(CHCH3CH2O) x-(CH2CH2O)y-H,所述X和y表示相應(yīng)嵌段的聚合度，X = 25?30, y = 75? 85。在泊洛沙姆系列中，Poloxamer 188 (Pluronic F68, X = 25 ?30 且 y = 75 ?85)，因 其較高的安全性得到美國FDA批準(zhǔn)。
[0013] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述抗體為單克隆抗體，包括完整的單克隆抗體和單克隆 抗體的片段。
[0014] -種抗體共價修飾的泊洛沙姆共聚物的制備方法，包括以下步驟：
[0015] 4-1)加入使抗體疏基化的試劑使所述抗體疏基化；
[0016] 4-2)將所述泊洛沙姆共聚物的羥基末端進(jìn)行馬來酰亞胺衍生化，得到具有馬來酰 亞胺末端的馬來酰亞胺化泊洛沙姆共聚物；
[0017] 4-3)將步驟4-1)和步驟4-2)所得的產(chǎn)物混合孵育，純化，即得抗體共價修飾的泊 洛沙姆共聚物。
[0018] 抗體共價修飾載體材料的手段有許多，例如利用抗體內(nèi)源的氨基，與含有羧基的 連接材料，在EDC/NHS催化下進(jìn)行生成酰胺鍵的反應(yīng)；但是由于抗體含有較多數(shù)量的氨基， 如采用這種方法進(jìn)行連接，可能引發(fā)抗體各個部位產(chǎn)生隨機(jī)性交聯(lián)，不利于抗體中抗原結(jié) 合位點的暴露，有可能降低抗原結(jié)合位點的活性。而采用巰基修飾抗體可限制抗體中被修 飾部位的數(shù)量，增加修飾后抗原結(jié)合活性的保留幾率。
[0019] 為了利用抗體的巰基，本發(fā)明將泊洛沙姆共聚物的羥基末端進(jìn)行馬來酰亞胺衍生 化，使抗體通過巰基和馬來酰亞胺基形成共價鍵結(jié)合到泊洛沙姆材料上。
[0020] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟4-1)中，抗體巰基化的方法包括在抗體上加入 外源性巰基化試劑使抗體巰基化，或利用還原試劑將抗體的內(nèi)源性二硫鍵打開產(chǎn)生巰基使 抗體巰基化。由于抗體自身缺乏巰基或巰基不足，需要通過對其自身的二硫鍵進(jìn)行還原或 通過硫醇化試劑制備產(chǎn)生巰基，而后通過形成巰醚鍵或二硫鍵使抗體偶聯(lián)到脂質(zhì)體上。
[0021] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述使抗體疏基化的試劑包括Traut' s試劑、3-(2- R比啶 二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨?、琥珀酰亞胺基乙 酰硫代丙酸酯和S-乙酰巰基丁二酸酐。
[0022] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟4-1)中將抗體巰基化的處理方法是：取抗體或 抗體片段適量加入Traut ' s試劑，混合均勾，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)2小時，4°C下通過透析方 法除去多余的Traut' s試劑，收集透析袋內(nèi)的抗體溶液，濃縮蛋白。Traut' s試劑作為使抗 體巰基化的有效試劑，在PH7-9的條件下與伯胺反應(yīng)，在巰基基團(tuán)上添加短間隔末梢，可以 作為巰基特異性交聯(lián)或標(biāo)記的靶點應(yīng)用。
[0023] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟4-2)中泊洛沙姆共聚物的羥基末端進(jìn)行馬來酰 亞胺衍生化的方法是：
[0024] 8-1)將所述泊洛沙姆的羥基末端進(jìn)行氨基衍生化，得到具有氨基化末端的氨基化 泊洛沙姆共聚物；
[0025] 8-2)將所述氨基化泊洛沙姆共聚物與馬來酸酐混合反應(yīng)，氨基化末端經(jīng)馬來酰亞 胺衍生化，得到具有馬來酰亞胺末端的馬來酰亞胺化泊洛沙姆共聚物。
[0026] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述泊洛沙姆共聚物的羥基末端進(jìn)行馬來酰亞胺衍生化 的具體操作步驟是：
[0027] 9-1)將對甲磺酰氯或磺酰氯溶于二氯甲烷中，慢慢滴加到含有三乙醇胺的泊洛沙 姆和二氯甲烷混合溶液中，冰水浴反應(yīng)2?10時，然后將含有乙二胺的二氯甲烷溶液緩慢 滴加至反應(yīng)物中，反應(yīng)持續(xù)6?24小時，反應(yīng)物通過冷乙醚沉淀，再經(jīng)二氯甲烷溶解和冷乙 醚沉淀，收集后進(jìn)行真空干燥，即得氨基化泊洛沙姆共聚物；
[0028] 9-2)稱取所述氨基化泊洛沙姆共聚物和馬來酸酐，一同溶于冰醋酸中，常溫反應(yīng) 12h，反應(yīng)液用乙醚沉淀后得白色沉淀，真空干燥，得中間產(chǎn)物（紅外譜圖見附圖2);
[0029] 9-3)將所述中間產(chǎn)物溶于乙酸酐，反應(yīng)液中加入乙酸鈉，在90°C下加熱，將反應(yīng) 液用二氯甲烷清洗，收集有機(jī)相，再使用冷乙醚沉淀；將得到的沉淀物溶于氯化鈉水溶液， 調(diào)節(jié)pH到4. 0?7. 5,再用二氯甲烷清洗，收集有機(jī)相，冷乙醚沉淀；抽濾并真空干燥，即得 具有馬來酰亞胺末端的馬來酰亞胺化泊洛沙姆共聚物。
[0030] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，抗體共價修飾的泊洛沙姆共聚物在包括基因、多肽、蛋白 以及顯像物質(zhì)的輸運(yùn)載體系統(tǒng)制備的藥物中應(yīng)用，作為抗體高分子前藥或載體材料中應(yīng) 用，或摻雜修飾脂質(zhì)體、脂質(zhì)微納氣泡、水凝膠、納米凝膠、納米粒和膠束的藥物輸運(yùn)載體系 統(tǒng)中應(yīng)用。
[0031] 有益效果：本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明公開的抗體共價修飾的泊洛沙姆共聚 物，既具有抗體作為靶向分子的