一種檢驗(yàn)原兒茶酸可溶性粉在禽病治療方面應(yīng)用的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸醫(yī)禽病治療領(lǐng)域，涉及一種檢驗(yàn)原兒茶酸在禽病治療方面應(yīng)用的新 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 原兒茶酸，別名3, 4-二羥基苯甲酸，CAS登記號(hào)為[99-50-3]，分子式是 (HO)2C6H3COOH，分子量為154. 12,性狀為白色至褐色結(jié)晶性粉末，在空氣中變色。密度 1.54g/cm3。熔點(diǎn)約200°C(分解）。溶于50份水中；溶于乙醇、乙醚。原兒茶酸存在于鱗 始蕨科植物烏蕨的葉，冬青科植物冬青的葉等植物中。具有抗菌作用，體外試驗(yàn)時(shí)對(duì)綠膿桿 菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、產(chǎn)堿桿菌及枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度 的抑菌作用。亦有祛痰、平喘作用。臨床用于治療慢性氣管炎。近年來(lái)，原兒茶酸的應(yīng)用在 人醫(yī)方面研宄報(bào)道的較多，在獸藥應(yīng)用方面授權(quán)公告號(hào)為CN102151256B)的專利，其專利 是通過(guò)原兒茶酸的體內(nèi)試驗(yàn)介紹了原兒茶酸在防治畜禽病毒感染性疾病的應(yīng)用。
[0003]H9N2型禽流感，1966年HoMee從患溫和呼吸道病的火雞中分離到第一株H9N2亞 型禽流感病毒，之后J19N2亞型禽流感在世界范圍內(nèi)迅速流行，尤其是1994?1999年在世 界范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1998年秋H9N2亞型禽流感在我國(guó)發(fā)生，短短2個(gè)月內(nèi)即 席卷了大多數(shù)省份。新的研宄表明，J19N2亞型部分流行株的致病力明顯變異，尤其對(duì)肉仔 雞，死亡率可達(dá)到30%以上；對(duì)產(chǎn)蛋高峰期的蛋雞，其產(chǎn)蛋下降幅度大，恢復(fù)困難。
[0004] 禽流感H7N9型是一種新型禽流感，自2013年2月以來(lái)，中國(guó)上海市、安徽省、江 蘇省和浙江省等地先后發(fā)生不明原因重癥肺炎病例，經(jīng)病原體分離鑒定后，于2013年3月 31日將其確診為人感染H7N9亞型禽流感（Gao等，2013)。這是首次發(fā)現(xiàn)H7N9亞型禽流感 感染人的病例。最新研宄結(jié)果表明該病毒是由東亞地區(qū)的野鳥(niǎo)所攜帶的與中國(guó)上海、浙江、 江蘇等地的鴨群和雞群所攜帶AIV的基因重組而成。
[0005] 雞新城疫（ND)俗稱雞瘟，是由雞新城疫病毒引起的雞的一種高度接觸性、急性、 烈性傳染病。常呈現(xiàn)敗血癥經(jīng)過(guò)，主要特征是呼吸困難，下痢，神經(jīng)機(jī)能紊亂，黏膜和漿膜出 血。各種雞和各種年齡的雞都能感染，幼雞和中雞更易感染，兩年以上的老雞易感性降低。 該病一年四季均可發(fā)生。在非免疫區(qū)或免疫低下的雞群，一旦有速發(fā)型毒株侵入，可迅速傳 播，呈毀滅性流行，發(fā)病率和死亡率可達(dá)90%以上。
[0006] 隨著我國(guó)對(duì)食品生物安全重視程度的提高，在畜禽用藥方面也會(huì)更加規(guī)范，抗生 素濫用的情況必會(huì)得到治理。原兒茶酸作為一種天然植物提取物，因其具有抗菌抗病毒作 用，其在畜禽疾病治療應(yīng)用方面會(huì)得到廣泛重視，尤其是對(duì)家禽流行疾病禽流感、新城疫等 的治療方面的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種檢驗(yàn)原兒茶酸在禽病治療方面應(yīng)用的新方法，通過(guò)體外 試驗(yàn)，能夠快速評(píng)價(jià)原兒茶酸對(duì)禽病毒的殺滅作用，為開(kāi)展禽病治療體內(nèi)試驗(yàn)提供理論依 據(jù)。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] -種檢驗(yàn)原兒茶酸在禽病治療方面應(yīng)用的新方法，包括以下步驟：
[0010] (1)將所述原兒茶酸可溶性粉用含抗生素的純化水按照預(yù)設(shè)的至少兩種稀釋比例 稀釋，得到具有至少兩種稀釋度的原兒茶酸可溶性粉稀釋液；
[0011] (2)將步驟（1)得到的至少兩種稀釋度的原兒茶酸可溶性粉稀釋液分別與禽病 毒等比例混合，得到至少兩種混合物，同時(shí)用含抗生素的無(wú)菌生理鹽水與禽病毒等比例混 合作為對(duì)照；
[0012] (3)將步驟（2)所述至少兩種混合物置37°C作用30-60min，每隔5min輕輕搖動(dòng)一 次；
[0013] (4)將經(jīng)過(guò)步驟（3)處理的所述至少兩種混合物接種于9-10日齡無(wú)特定病原體 SPF雞胚，每個(gè)稀釋度6-10枚，0. 2ml/枚；
[0014] (5)將步驟（4)得到的接種的SPF雞胚置于孵化箱中培養(yǎng)，每日觀察雞胚死亡情 況，24h內(nèi)死亡的雞胚棄去，24h-144h死亡的雞胚暫存于4°C保存，144h以上時(shí)無(wú)論雞胚是 存活還是死亡均全部取尿囊液，檢測(cè)HA，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0015] 優(yōu)選的，步驟（1)中所述抗生素為青鏈霉素。
[0016] 優(yōu)選的，步驟（1)中所述純化水中的濃度為1000IU/ml。
[0017] 優(yōu)選的，步驟（1)中所述預(yù)設(shè)的至少兩種稀釋比例為1:100、1 :1000、1:5000、 1:10000。
[0018] 優(yōu)選的，步驟（2)中所述禽病毒為新城疫病毒（NDV)、禽流感H9亞型病毒（H9N2) 和禽流感H7亞型病毒（H7N9)中的任意一種或任意多種組合。
[0019] 優(yōu)選的，步驟（2)中各病毒量為200ELD50/0. 1ml。
[0020] 優(yōu)選的，步驟（3)中所述混合物置37°C作用45min。
[0021] 優(yōu)選的，步驟（4)中所述SPF日齡為10日齡。
[0022] 優(yōu)選的，步驟（4)中每種稀釋度接種于10枚雞胚。
[0023] 優(yōu)選的，步驟（5)中所述接種雞胚24h后每隔8h觀察一次。
[0024] 本發(fā)明的有益效果是提供一種檢驗(yàn)原兒茶酸在禽病治療方面應(yīng)用的新方法，通過(guò) 體外試驗(yàn)，能夠快速評(píng)價(jià)原兒茶酸對(duì)禽病毒的殺滅作用，為開(kāi)展禽病治療體內(nèi)試驗(yàn)提供理 論依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 本發(fā)明的目的是提供一種檢驗(yàn)原兒茶酸在禽病治療方面應(yīng)用的新方法，通過(guò)體外 試驗(yàn)，能夠快速評(píng)價(jià)原兒茶酸對(duì)禽病毒的殺滅作用，為開(kāi)展禽病治療體內(nèi)試驗(yàn)提供理論依 據(jù)。
[0026] 為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0027] 一種檢驗(yàn)原兒茶酸在禽病治療方面應(yīng)用的新方法，包括以下步驟：
[0028] (1)將所述原兒茶酸可溶性粉用含抗生素的純化水按照預(yù)設(shè)的至少兩種稀釋比例 稀釋，得到具有至少兩種稀釋度的原兒茶酸可溶性粉稀釋液；
[0029] (2)將步驟⑴得到的至少兩種稀釋度的原兒茶酸可溶性粉稀釋液分別與禽病毒 等比例混合，得到至少兩種混合物，同時(shí)用含抗生素的無(wú)菌生理鹽水與禽病毒等比例混合 作為對(duì)照；
[0030] (3)將步驟（2)所述至少兩種混合物置37°C作用30-60min，每隔5min輕輕搖動(dòng)一 次；
[0031] (4)將經(jīng)過(guò)步驟（3)處理的所述至少兩種混合物接種于9-10日齡無(wú)特定病原體 SPF雞胚，每個(gè)稀釋度6-10枚，0. 2ml/枚；