專利名稱：生物工程化的組織構(gòu)建物、其制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域。本發(fā)明涉及誘導(dǎo)細(xì)胞體外產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的方法。這種有生命的細(xì)胞外基質(zhì)具有類似于組織的特征，可用于檢驗(yàn)或臨床目的。
背景技術(shù)：
組織工程領(lǐng)域?qū)⑸锕こ谭椒ㄅc生命科學(xué)的基本原理結(jié)合起來(lái)，以便了解正常及病理狀態(tài)下的哺乳動(dòng)物組織中結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。組織工程的目標(biāo)是開發(fā)并最終應(yīng)用生物代用品保存、維持或改進(jìn)組織的功能。因此，通過組織工程有可能在實(shí)驗(yàn)室里設(shè)計(jì)并制造生物工程化的組織。生物工程化的組織可包括通常與天然哺乳動(dòng)物或人類組織相關(guān)的細(xì)胞，以及合成的或外源的基質(zhì)支架。新的生物工程化組織應(yīng)當(dāng)是移植至宿主后具有功能，而且可在該宿主體內(nèi)持久摻入或由受體宿主患者的細(xì)胞不斷進(jìn)行生物再改造。不含支持組件或支架的組織等價(jià)體的制備為新型生物工程化組織的產(chǎn)生帶來(lái)了科學(xué)挑戰(zhàn)。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及生物工程化的組織構(gòu)建物，其含有培養(yǎng)的細(xì)胞和無(wú)需外源性基質(zhì)成分或網(wǎng)狀系統(tǒng)支持物或支架組件便可內(nèi)源產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)成分。因此，當(dāng)本發(fā)明的生物工程化組織構(gòu)建物是設(shè)計(jì)用于人類時(shí)，它可從人的細(xì)胞，以及由這些細(xì)胞產(chǎn)生的人的基質(zhì)成分而完整產(chǎn)生。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生組織構(gòu)建物的方法，其為刺激培養(yǎng)中的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞，從而在不添加任何外源性基質(zhì)成分、網(wǎng)狀系統(tǒng)支持物、或支架組件的情況下可產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分。
本發(fā)明還涉及另一種產(chǎn)生組織構(gòu)建物的方法，其為刺激培養(yǎng)中的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞，以便在組成已知的培養(yǎng)基系統(tǒng)中和/或在沒有使用不明確或非人類衍生的生物成分，如牛血清或有機(jī)提取物的情況下產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分。
該組織構(gòu)建物的產(chǎn)生可以是，通過不同類型細(xì)胞的系列培養(yǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)生與天然組織具有類似細(xì)胞組成和組織構(gòu)建物的培養(yǎng)的組織構(gòu)建物。
培養(yǎng)的細(xì)胞無(wú)需加入支架支持物或外源性細(xì)胞外基質(zhì)成分，就可以產(chǎn)生所述組織構(gòu)建物。
該組織構(gòu)建物的強(qiáng)度特征使其便于操作，可以從產(chǎn)生它的培養(yǎng)儀器中輕易剝離，并在臨床或檢驗(yàn)中直接轉(zhuǎn)移而無(wú)需任何支持物或載體。
本發(fā)明的組織構(gòu)建物具有臨床應(yīng)用價(jià)值，如可移植給具有組織或器官缺陷的患者，如皮膚漬瘍或傷口，或進(jìn)行體外組織檢驗(yàn)或移植入動(dòng)物進(jìn)行安全性檢驗(yàn)或藥物、化妝品、及化學(xué)產(chǎn)品的效力鑒定。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖示羥脯氨酸試驗(yàn)中測(cè)定的相對(duì)于人類新生包皮細(xì)胞衍生的真皮構(gòu)建物之細(xì)胞數(shù)的膠原濃度，如實(shí)施例1所述。
圖2為顯微照片(接物鏡20×)，顯示在化學(xué)確定型培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天的人真皮成纖維細(xì)胞所形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物經(jīng)固定、石蠟包埋、蘇木精和伊紅染色后的切片。多孔膜呈現(xiàn)為所述構(gòu)建物以下的薄層透明帶。
圖3為透射電鏡圖，顯示在化學(xué)確定型培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天的人真皮成纖維細(xì)胞所形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物在兩種分辨率下的圖像。圖3A為7600×分辨率，顯示內(nèi)源基質(zhì)，包括成纖維細(xì)胞之間的膠原纖絲的排列。圖3B為19000×分辨率，顯示完整形成的內(nèi)源膠纖絲，其證實(shí)纖絲的排列和包裹。
圖4為顯微照片(接物鏡20×)，顯示在化學(xué)確定型培養(yǎng)基中，在缺乏外源基質(zhì)成分的情況下，形成的皮膚構(gòu)建物經(jīng)固定、石蠟包埋、蘇木精和伊紅染色后的切片，其中包含人真皮成纖維細(xì)胞在化學(xué)確定型培養(yǎng)基上所形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物，以及由人的角質(zhì)細(xì)胞在化學(xué)確定型培養(yǎng)基上形成的多層、已分化的表皮。
發(fā)明詳述現(xiàn)有人工活組織構(gòu)建物并非完全由細(xì)胞組成，需另行加入或摻入外源基質(zhì)成分或人工合成的結(jié)構(gòu)和/或支持物。
本文所述經(jīng)生物工程技術(shù)產(chǎn)生的組織構(gòu)建物顯示其來(lái)源組織的很多天然特征。如此產(chǎn)生的組織構(gòu)建物可用于向患者移植或體外檢測(cè)。
一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是一種細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物，其含有第一種細(xì)胞及內(nèi)源產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)，其中所述第一種細(xì)胞能合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，從而產(chǎn)生所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物。
另一優(yōu)選實(shí)施方案是一種雙層構(gòu)建物，其包含第一種細(xì)胞，外源產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)，以及由所述第一種細(xì)胞形成于其上層或其內(nèi)部的一層第二種細(xì)胞。
一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案是一種細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物，其含有成纖維細(xì)胞(如衍生于真皮的那些)以形成人工培養(yǎng)型真皮構(gòu)建物。
另一更優(yōu)選實(shí)施方案是一種細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物，其含有成纖維細(xì)胞(如衍生于真皮的那些)以形成人工培養(yǎng)型真皮構(gòu)建物，其上層為一層培養(yǎng)的角化蛋白，用于形成表皮，從而最終形成人工培養(yǎng)型雙層皮膚構(gòu)建物。本發(fā)明的人工培養(yǎng)型皮膚構(gòu)建物可表達(dá)天然皮膚的多種物理、形態(tài)、及生化特征。
在一個(gè)還要更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物是一種組織構(gòu)建物，它是類似于皮膚真皮層的人類真皮構(gòu)建物，是在含有人源細(xì)胞、但未使用任何化學(xué)非確定成分的、成分確定的系統(tǒng)中經(jīng)培養(yǎng)而形成的。
在一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組織構(gòu)建物形成于一種化學(xué)確定型系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含人源細(xì)胞，但不含化學(xué)非確定的或非人類生物學(xué)的成分或細(xì)胞。
本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括由至少一種產(chǎn)細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞和內(nèi)源產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)成分(簡(jiǎn)稱“基質(zhì)”)所形成的結(jié)構(gòu)層，其中所述基質(zhì)完全由細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)而合成并包裹。該層在本文稱為“細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物”或“細(xì)胞-基質(zhì)層”，因?yàn)檫@些細(xì)胞可分泌基質(zhì)并使它們自身包含在該基質(zhì)中或穿過該基質(zhì)。所述人工培養(yǎng)的組織構(gòu)建物無(wú)需，因此也不包括，外源基質(zhì)成分，即并非由培養(yǎng)細(xì)胞而是通過其它方式引入的基質(zhì)成分。在一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述由人的真皮成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物具有類似于天然皮膚的膠原優(yōu)勢(shì)濃度。電鏡檢查表明，該基質(zhì)本性為纖維狀，其含有表現(xiàn)為垂直交錯(cuò)(quarter-staggered)的67nm帶狀形式的膠原，以及類似于天然膠原的纖絲構(gòu)成和纖絲束。經(jīng)延遲還原型SDS-PAGE檢測(cè)出這些構(gòu)建物中同時(shí)存在I型和III型膠原，這是天然人類皮膚中出現(xiàn)的占優(yōu)勢(shì)類型的膠原。用標(biāo)準(zhǔn)的免疫組化(IHC)技術(shù)，所述真皮細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物中的decorin(已知其為與膠原纖絲相關(guān)的硫酸皮膚素蛋白多糖，并被認(rèn)為可體內(nèi)調(diào)節(jié)纖絲直徑)為陽(yáng)性染色。在用TEM檢查所述構(gòu)建物時(shí)也可見到decorin。所產(chǎn)生的組織中腱生蛋白(在諸如間質(zhì)或待修復(fù)的組織中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì))也為陽(yáng)性染色。與體內(nèi)待修復(fù)的組織極其相似的是，培養(yǎng)中產(chǎn)生的組織在形成基質(zhì)時(shí)其I型和III型膠原的比例增加。在不受任何理論限制的情況下，認(rèn)為所述細(xì)胞很快與一種松散基質(zhì)一起充斥于它們之間(該松散基質(zhì)類似于粒狀組織(granulation tissue)，主要包含III型膠原和纖連蛋白)，然后用主要含有I型膠原的較緊密基質(zhì)重新改造上述松散基質(zhì)。所產(chǎn)生的細(xì)胞-基質(zhì)含有糖胺聚糖(GAG)，如透明質(zhì)酸(HA)；纖連蛋白；除decorin以外的多糖蛋白如雙糖和多功能蛋白聚糖；以及一組(a profile)硫酸糖胺聚糖如二-透明質(zhì)酸；二-軟骨素-0-硫酸；二-軟骨素-4-硫酸；二-軟骨素-6-硫酸；二-軟骨素-4，6-硫酸；二-軟骨素-4-硫酸-UA-2S；及二-軟骨素-6-硫酸-UA-2S。這些結(jié)構(gòu)和生化特征在培養(yǎng)形成構(gòu)建物時(shí)表現(xiàn)出來(lái)，在構(gòu)建物最終形成時(shí)變得明顯，并各具特色。這些成分在已完全形成的培養(yǎng)型真皮細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物中的存在，表明所述構(gòu)建物具有接近于正常真皮的結(jié)構(gòu)和生化特征。
上述所列是由真皮成纖維細(xì)胞形成的培養(yǎng)細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的生化及結(jié)構(gòu)特征，須知由其它類型成纖維細(xì)胞形成的培養(yǎng)型細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物可產(chǎn)生其來(lái)源組織類型的這些特征和其它表型特征。在某些例子中，可通過化學(xué)暴露或接觸、物理壓力、或通過轉(zhuǎn)基因方式誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞，使之表達(dá)非表型成分。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案是細(xì)胞-基質(zhì)層，其上層有第二層細(xì)胞。在所述細(xì)胞-基質(zhì)上培養(yǎng)所述第二層細(xì)胞，以形成一種生物工程化的雙層組織構(gòu)建物。在一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第二層包含培養(yǎng)的人源角質(zhì)細(xì)胞，其與第一層細(xì)胞-基質(zhì)(由真皮成纖維細(xì)胞形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物)以及內(nèi)源基質(zhì)一起形成一個(gè)包含活的皮膚構(gòu)建物的真皮層。當(dāng)徹底成形時(shí)，該表皮層為角質(zhì)細(xì)胞的多層、分層的、良好分化層，其表現(xiàn)為基底層、基底上層、立方上皮層(granulst layert)和角質(zhì)層。該皮膚構(gòu)建物在真皮-表皮連接處有發(fā)育良好的基底膜，如透射電鏡(TEM)所示。該基底膜在半橋粒周圍是最厚的，由包含VII型膠原的錨著纖絲包圍，如TEM所示?？捎^察到該錨著纖絲始于基底膜，將膠原纖絲陷在真皮層中。這些錨著纖絲，以及其它基底膜成分均由角質(zhì)細(xì)胞分泌。已知白色角質(zhì)細(xì)胞能在它們的表面分泌基底膜，可識(shí)別的基底膜在缺乏成纖維細(xì)胞的情況下不能形成。對(duì)本發(fā)明皮膚構(gòu)建物的免疫組化染色也顯示存在層粘連蛋白，它是一種基底膜蛋白。
本發(fā)明關(guān)于形成一種細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的優(yōu)選實(shí)施方案中，將第一種能產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞接種于培養(yǎng)基質(zhì)上，加以培養(yǎng)，并進(jìn)行誘導(dǎo)以便合成和在它們周圍分泌一種有序排列的細(xì)胞外基質(zhì)，從而形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物。本發(fā)明另一實(shí)施方案中，在該細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的一個(gè)表面上接種第二種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)以形成雙層組織構(gòu)建物。在一個(gè)更優(yōu)選方法中，通過在足以誘導(dǎo)基質(zhì)合成以便形成真皮細(xì)胞和基質(zhì)的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的條件下，培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，如人類真皮成纖維細(xì)胞，在真皮層上接種人類表皮細(xì)胞如角質(zhì)細(xì)胞并在足以形成完全分化的分層的表皮層的條件下培養(yǎng)，最終可形成具有類似于天然人類皮膚的特征的完整厚度的皮膚構(gòu)建物。
因此，獲得本發(fā)明組織構(gòu)建物的一種方法包括(a)在缺乏外源基質(zhì)成分或結(jié)構(gòu)支持物的情況下，培養(yǎng)至少一種產(chǎn)細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞；和(b)刺激步驟(a)的細(xì)胞，使它們合成、分泌、和排列細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而形成一種組織構(gòu)建物，該構(gòu)建物包含上述細(xì)胞及其合成的基質(zhì)；其中步驟(a)和(b)可以同時(shí)進(jìn)行，也可以依次進(jìn)行。
為了形成雙層組織構(gòu)建物(其包含細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物和位于其上的第二細(xì)胞層)，所述方法還包括以下步驟(c)在所形成的組織構(gòu)建物上培養(yǎng)第二種細(xì)胞，以產(chǎn)生雙層組織構(gòu)建物。
本發(fā)明所用的產(chǎn)細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞可以是能產(chǎn)生并分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，排列這些細(xì)胞外基質(zhì)成分以形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的任何細(xì)胞類型?？蓪?duì)不止一種的產(chǎn)細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物?？蓪?duì)不同類型或組織來(lái)源的細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)以產(chǎn)生類似于天然組織中的互補(bǔ)成分和結(jié)構(gòu)。例如，所述產(chǎn)細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞類型可能有其它細(xì)胞類型參與其產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，這種產(chǎn)量并非上述第一種類型細(xì)胞的正常產(chǎn)量?；蛘?，也可將所述產(chǎn)細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞類型與其它細(xì)胞類型混合，所述其它類型的細(xì)胞來(lái)自所述組織中特化的組織結(jié)構(gòu)，但基本不參與所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物中基質(zhì)方面的整個(gè)形成，如在本發(fā)明的某些皮膚構(gòu)建物中那樣。
根據(jù)本發(fā)明，任何產(chǎn)細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞類型均可使用，但優(yōu)選使用衍生于間質(zhì)的細(xì)胞。更優(yōu)選的細(xì)胞類型有成纖維細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、和其它支持性結(jié)締組織細(xì)胞，更優(yōu)選發(fā)現(xiàn)于人的真皮的人真皮成纖維細(xì)胞，以便產(chǎn)生人的真皮構(gòu)建物。通常，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，主要是膠原。由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的膠原有數(shù)種類型，但體內(nèi)最常見的是I型膠原。人成纖維細(xì)胞株有多種來(lái)源，包括但不限于新生男性包皮、真皮、腱、肺、臍帶、軟骨、尿道、角膜基質(zhì)、口腔粘膜、和腸。人的細(xì)胞可包括但不限于成纖維細(xì)胞，但可包括平滑肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和間質(zhì)來(lái)源的其它結(jié)締組織細(xì)胞。優(yōu)選(但非必需)用于產(chǎn)生組織構(gòu)建物的產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞衍生自以下組織類型，即通過應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)方法將被類似或模擬的組織類型。例如，在產(chǎn)生皮膚構(gòu)建物的實(shí)施方案中，優(yōu)選的產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，優(yōu)選為真皮來(lái)源。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，可使用由毛囊的真皮乳頭經(jīng)顯微解剖分離的成纖維細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生所述基質(zhì)或與其它成纖維細(xì)胞相連。在產(chǎn)生角膜構(gòu)建物的實(shí)施方案中，所述產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞衍生自角膜基質(zhì)。細(xì)胞供體可能在發(fā)育和年齡上有差異。細(xì)胞可衍生自胚胎、新生兒、或較年長(zhǎng)個(gè)體包括成人的供體組織。胚胎始祖細(xì)胞如間質(zhì)干細(xì)胞可用于本發(fā)明，并可通過誘導(dǎo)而分化發(fā)育為所需組織。
雖然本發(fā)明優(yōu)選使用人的細(xì)胞，但本發(fā)明方法所用的細(xì)胞不限于人源的。細(xì)胞可來(lái)自其它哺乳動(dòng)物物種，包括但不限于馬、犬、豬、牛、和綿羊；或嚙齒類動(dòng)物如小鼠或大鼠。此外，本發(fā)明的細(xì)胞均通過自發(fā)轉(zhuǎn)染、化學(xué)轉(zhuǎn)染、或病毒轉(zhuǎn)染，或可使用重組細(xì)胞或遺傳工程化細(xì)胞。對(duì)于那些摻入了不止一種細(xì)胞類型的實(shí)施方案而言，可使用兩種或多種來(lái)源的正常細(xì)胞的嵌合混合物；正常細(xì)胞與遺傳修飾的細(xì)胞或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的混合物；或兩個(gè)或多個(gè)物種或組織來(lái)源的細(xì)胞的混合物。
重組細(xì)胞或遺傳工程化細(xì)胞可用于所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生一種組織構(gòu)建物，其可作為向患者運(yùn)送藥物的轉(zhuǎn)移物發(fā)揮作用，其中所述患者需要增加天然細(xì)胞產(chǎn)物水平或需要藥物治療。所述細(xì)胞可產(chǎn)生并通過該轉(zhuǎn)移物向患者運(yùn)送重組細(xì)胞產(chǎn)物、生長(zhǎng)因子、激素、肽或蛋白質(zhì)，這種行為可以是連續(xù)的或發(fā)生在患者病情變化而發(fā)出了生物學(xué)、化學(xué)、或熱學(xué)信號(hào)以示需要時(shí)。根據(jù)所培養(yǎng)的組織構(gòu)建物的使用說明，可能需要基因產(chǎn)物的長(zhǎng)期或短期表達(dá)。通過埋植培養(yǎng)型組織構(gòu)建物而在較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)向患者運(yùn)送治療性產(chǎn)物時(shí)，需要長(zhǎng)期表達(dá)。相反，當(dāng)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)型組織構(gòu)建物旨在使該培養(yǎng)型組織構(gòu)建物的細(xì)胞促進(jìn)患者傷口恢復(fù)正常或接近正?；驕p小傷處的損傷時(shí)，需要短期表達(dá)。一旦傷處治愈，不再需要所述培養(yǎng)型組織構(gòu)建物產(chǎn)生的基因產(chǎn)物或其在該部位的存在。也可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程修飾，使其表達(dá)以下蛋白質(zhì)或不同類型的細(xì)胞外基質(zhì)成分，所述蛋白質(zhì)或成分既可以是“正?！钡牡磉_(dá)水平較高，也可以以某種方式被修飾而能產(chǎn)生包含細(xì)胞外基質(zhì)及活細(xì)胞的轉(zhuǎn)移裝置，該裝置對(duì)于促進(jìn)傷口復(fù)原、促進(jìn)或指導(dǎo)新血管形成、或減少疤痕或瘢痕瘤形成具有治療作用。這些方法為領(lǐng)域內(nèi)已知，見Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港出版社，冷泉港，紐約(1989)，已引入作參考。上述所有類型的細(xì)胞均包括在本發(fā)明所用“產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞”的定義內(nèi)。
成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的最主要細(xì)胞外基質(zhì)成分是纖絲膠原，尤其I型膠原。纖絲膠原是細(xì)胞-基質(zhì)結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵成分；但本發(fā)明并不限于僅包含這種蛋白或蛋白類型的基質(zhì)。例如，通過使用適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型可以產(chǎn)生其它膠原，它們可以是膠原家族的纖絲膠原或非纖絲膠原，如II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX型膠原。類似地，可用現(xiàn)有方法產(chǎn)生并保存的其它基質(zhì)蛋白包括，但不限于，彈性蛋白；多糖蛋白如decorin或雙糖；或糖蛋白如腱生蛋白；玻連蛋白；纖連蛋白；層粘連蛋白，血小板反應(yīng)蛋白I，及糖胺聚糖(GAG)如透明質(zhì)酸(HA)。
產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞在適于動(dòng)物細(xì)胞或組織培養(yǎng)的培養(yǎng)皿、燒瓶、或滾瓶(roller-bottle)等允許形成三維組織樣結(jié)構(gòu)的容器內(nèi)培養(yǎng)。可用于所述細(xì)胞生長(zhǎng)的適當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)表面可以是能允許所述細(xì)胞粘附并為所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的形成提供固定方式的任何生物學(xué)兼容性材料。玻璃；不銹鋼；聚合物，包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚偏乙烯、聚二甲基硅氧烷、含氟聚合物、及氟化亞乙基丙烯；硅物質(zhì)如熔凝硅石、聚硅、或硅晶等均可作為細(xì)胞生長(zhǎng)表面使用。細(xì)胞生長(zhǎng)表面材料可接受化學(xué)處理或修飾，或帶電荷，或用生物材料如多聚-1-賴氨酸或多肽包被。肽包被的實(shí)例如RGD肽。
本發(fā)明的組織構(gòu)建物雖然可以生長(zhǎng)在固相細(xì)胞生長(zhǎng)表面，但優(yōu)選帶有孔的細(xì)胞生長(zhǎng)表面，它可以聯(lián)通這種膜的上表面和下表面，從而允許培養(yǎng)基與形成中的組織構(gòu)建物的雙向交流或僅與培養(yǎng)基以下部分進(jìn)行接觸。雙向交流使培養(yǎng)基與形成中的構(gòu)建物的頂部和底部均可以交流，從而有最大表面積與培養(yǎng)基所含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)接觸。培養(yǎng)基也可以僅與形成中的組織構(gòu)建物底部接觸，而使上表面在形成皮膚構(gòu)建物時(shí)暴露于空氣。優(yōu)選的培養(yǎng)容器是應(yīng)用了隔膜插入件的容器，所述隔膜插入件是一種經(jīng)培養(yǎng)處理的滲透膜如多孔膜，它懸浮于含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中。通常將此膜固定在某種管狀膜或基架的一端，后者則插入底座并形成接觸面，如有蓋培養(yǎng)皿。插入了多孔隔膜插入件的培養(yǎng)容器為領(lǐng)域內(nèi)已知，并被優(yōu)選用于實(shí)施本發(fā)明，參見本領(lǐng)域的多個(gè)美國(guó)專利，其中部分已有商品，如5766937，5466602，5366893，5358871，5215920，5026649，4871674，4608342，均引入本文參考。使用這些類型的容器時(shí)，組織構(gòu)建物產(chǎn)生于所述膜的其中一個(gè)表面，優(yōu)選上表面，細(xì)胞培養(yǎng)基可同時(shí)與上、下兩個(gè)表面接觸。生長(zhǎng)表面上的孔可傳送培養(yǎng)基，以便為穿膜培養(yǎng)物的下表面提供營(yíng)養(yǎng)，從而使細(xì)胞接受雙面營(yíng)養(yǎng)或僅從下表面接受營(yíng)養(yǎng)。優(yōu)選孔的孔徑小到不會(huì)讓生長(zhǎng)的細(xì)胞穿過此膜，但又大到足以使培養(yǎng)基所含營(yíng)養(yǎng)物可自由地向該細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的下表面?zhèn)魉停缤ㄟ^毛細(xì)作用。優(yōu)選的孔徑大小約不到3μm，可使用約0.1-3μm，更優(yōu)選約0.2-1μm，最優(yōu)選約0.4-0.6μm。在人類真皮成纖維細(xì)胞的例子中，最優(yōu)選的材料是孔徑為約0.4-0.6μm的聚碳酸酯。最大孔徑不僅取決于細(xì)胞大小，還取決于細(xì)胞改變其形狀并穿過該膜的能力。重要的是，該組織樣構(gòu)建物與所述表面粘附，但不摻入或包埋至所述材料，因此只需稍稍加力便可剝除。所形成的組織構(gòu)建物的大小和形狀受它生長(zhǎng)于其上的容器表面或膜的大小的引導(dǎo)。所述材料可以是圓形、有角形、或帶有圓形邊角的形狀、或不規(guī)則形狀，也可以是平整的、或有一定輪廓的模具，以便形成一定形狀的構(gòu)建物而與傷口吻合或可模仿天然組織的物理結(jié)構(gòu)。用于生長(zhǎng)的材料表面積越大，就需要在該表面接種越多的細(xì)胞，并加入更大體積的培養(yǎng)基從而足以浸泡并滋養(yǎng)這些細(xì)胞。當(dāng)組織構(gòu)建物最終形成時(shí)，不管它是單層細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物還是雙層構(gòu)建物，均需在植入患者前從所述膜材料上剝離。
本發(fā)明的培養(yǎng)型組織構(gòu)建物的形成并不依賴于合成的或生物可吸收的膜如網(wǎng)狀膜。網(wǎng)狀膜為機(jī)織物、手工編織物、或毛氈材料。在使用了網(wǎng)狀膜的系統(tǒng)中，細(xì)胞在該網(wǎng)狀膜上培養(yǎng)，可生長(zhǎng)于其中任一面的網(wǎng)眼中，使該網(wǎng)狀膜被包裹或摻入所述培養(yǎng)型組織構(gòu)建物內(nèi)。通過這些摻入網(wǎng)狀膜的方法最終形成的構(gòu)建物依賴于這些網(wǎng)狀膜以獲得物理支持并擴(kuò)增。依賴合成的網(wǎng)狀膜的培養(yǎng)型組織構(gòu)建物可參見Naughton等人的美國(guó)專利5580781，5443950，5266480，5032508，4963489。
產(chǎn)生細(xì)胞-基質(zhì)層的系統(tǒng)可以是靜態(tài)的，也可以是向培養(yǎng)基中灌注式的。靜態(tài)系統(tǒng)中的培養(yǎng)基相對(duì)較平靜，而灌注系統(tǒng)中的培養(yǎng)基是處于動(dòng)態(tài)的。培養(yǎng)基的灌注影響細(xì)胞的活性并促進(jìn)基質(zhì)層的形成。灌注方式包括，但不限于在培養(yǎng)皿下部或鄰近含培養(yǎng)膜的隔膜材料處使用磁力棒或機(jī)動(dòng)葉輪來(lái)攪拌培養(yǎng)基；在培養(yǎng)皿或室內(nèi)抽吸培養(yǎng)基或使之流經(jīng)培養(yǎng)皿或室；在振動(dòng)或旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿；如果是形成于滾瓶，則滾動(dòng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定能在本發(fā)明中使用的其它灌注方式。
適用于本發(fā)明的培養(yǎng)基可根據(jù)待培養(yǎng)的細(xì)胞類型和待形成的組織結(jié)構(gòu)來(lái)選擇。促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、基質(zhì)合成、以及活力的培養(yǎng)基以及具體培養(yǎng)條件取決于培養(yǎng)細(xì)胞的類型。
有時(shí)，如形成本發(fā)明生物工程化的雙層皮膚構(gòu)建物時(shí)，不同形成階段培養(yǎng)基的組成不同以適應(yīng)不同的添加需要。在一優(yōu)選方法中，細(xì)胞-基質(zhì)層在指定條件，即在化學(xué)確定的培養(yǎng)基中形成。在另一優(yōu)選方法中，組織構(gòu)建物含有細(xì)胞-基質(zhì)層以及在其上生長(zhǎng)的第二細(xì)胞層，其中這兩種細(xì)胞均在指定的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。或者，該組織構(gòu)建物含有在限定的培養(yǎng)條件下形成的細(xì)胞-基質(zhì)層，和在非限定的培養(yǎng)條件下于該層上形成的第二層。反之，所述組織構(gòu)建物含有可在非限定培養(yǎng)條件下形成的細(xì)胞-基質(zhì)層，以及在限定的培養(yǎng)條件下形成于其上的第二層。
優(yōu)選使用化學(xué)確定的培養(yǎng)基，即不含成分不明的動(dòng)物器官或組織提取物，如血液、垂體提取物、下丘腦提取物、胎盤提取物、或胚胎提取物或滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)和因子。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基不含未確定的成分和確定的非人源生物成分。未確定的成分雖然不優(yōu)選加入，但可根據(jù)已公開的方法在任何時(shí)間點(diǎn)向培養(yǎng)基中加入，以便成功地形成組織構(gòu)建物。當(dāng)利用在非人動(dòng)物來(lái)源的化學(xué)確定的成分上培養(yǎng)后篩選出來(lái)的人類細(xì)胞實(shí)施本發(fā)明時(shí)，所得組織構(gòu)建物是限定的組織構(gòu)建物?？稍诨瘜W(xué)確定的培養(yǎng)基中添加最優(yōu)選的制備方法中所用的化學(xué)確定的人工合成型功能等價(jià)體。通常，本領(lǐng)域的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)人員無(wú)需調(diào)查或?qū)嶒?yàn)就能確定向本發(fā)明培養(yǎng)基中添加的等價(jià)于公知?jiǎng)游锍煞值奶烊蝗祟惖葍r(jià)體、人的重組等價(jià)體、或人工合成的等價(jià)體。這種構(gòu)建物在臨床上的優(yōu)勢(shì)在于消除了偶然的動(dòng)物或其它物種病毒的污染和感染。在檢驗(yàn)環(huán)節(jié)中，化學(xué)確定的構(gòu)建物的優(yōu)勢(shì)在于，進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，所得結(jié)果不會(huì)由于未限定的成分的存在而被混淆。
培養(yǎng)基由營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)組成，通常還添加其它成分。技術(shù)人員可確定動(dòng)物細(xì)胞領(lǐng)域的適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)并有理由預(yù)期能成功地產(chǎn)生本發(fā)明的組織構(gòu)建物。有很多商供營(yíng)養(yǎng)源可有效實(shí)施本發(fā)明。這些包括提供無(wú)機(jī)鹽、能源、氨基酸、以及B族維生素的商供營(yíng)養(yǎng)源如Dulbecco’s改良型Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)；最小基本培養(yǎng)基(MEM)；M100；RPMI1640；Iscove’s改良型Dulbecco’s培養(yǎng)基(EDMEM)。最小基本培養(yǎng)基(MEM)和M199需要額外加入磷脂前體和非必需氨基酸。商供的可提供額外氨基酸、核酸、酶之輔因子、磷脂前體、及無(wú)機(jī)鹽的富含維生素之混合物包括Ham’s F-12，Ham’s F-10，NCTC109，和NCTC135。雖然在各種濃度下，所有基本培養(yǎng)基以葡萄糖、氨基酸、維生素、和無(wú)機(jī)離子，以及其它基本培養(yǎng)基成分的形式為細(xì)胞提供基本營(yíng)養(yǎng)源。最優(yōu)選的本發(fā)明基本培養(yǎng)基所含營(yíng)養(yǎng)源為無(wú)鈣或低鈣的Dulbecco’s改良型Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)，或可任選的，DMEM加Ham’s F-12(比例在3∶1至1∶3之間)。
在所述基本培養(yǎng)基中添加氨基酸、生長(zhǎng)因子、和激素等成分。培養(yǎng)本發(fā)明細(xì)胞的確定型培養(yǎng)基見Parenteau的美國(guó)專利5712163，和PCT國(guó)際公開號(hào)WO95/31473，該文本已引入本文作參考。其它培養(yǎng)基為領(lǐng)域內(nèi)已知，如Ham&McKeehan，酶學(xué)方法，58∶44-93(1979)所述的那些，或Bottenstein等，酶學(xué)方法，58∶94-109(1979)中的其它合適的化學(xué)確定型培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，向基本培養(yǎng)基中添加本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的以下成分胰島素、運(yùn)鐵蛋白、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、乙醇胺與對(duì)磷?；掖及分换蛉?，其中這些添加物的濃度和替換由技術(shù)人員確定。
胰島素是促進(jìn)對(duì)葡萄糖和氨基酸的攝取，從而在數(shù)代內(nèi)提供長(zhǎng)期效益的一種多肽激素。長(zhǎng)期培養(yǎng)中由于細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸的能力逐漸損耗，且細(xì)胞表型可能退化，故必需添加胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)。胰島素可離子動(dòng)物如牛，人類，或經(jīng)重組產(chǎn)生如人型重組胰島素。因此，人型胰島素將被定性為并非來(lái)自非人生物來(lái)源的化學(xué)確定型成分。進(jìn)行系列培養(yǎng)時(shí)優(yōu)選添加胰島素，加至培養(yǎng)基的濃度變化范圍較大。優(yōu)選范圍為約0.1μg/ml一約500μg/ml，更優(yōu)選約5μg/ml一約400μg/ml，最優(yōu)選約375μg/ml。添加胰島素樣生長(zhǎng)因子(如IGF-1或IGF-2)的適當(dāng)濃度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞類型很輕易地確定。
運(yùn)鐵蛋白在培養(yǎng)基中可調(diào)節(jié)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)。鐵是發(fā)現(xiàn)于血清中的必需的痕量元素。游離鐵對(duì)細(xì)胞有毒性，因此，在血清中鐵是以結(jié)合于運(yùn)鐵蛋白的形式供給細(xì)胞，其濃度范圍優(yōu)選約0.05-約50μg/ml，更優(yōu)選約5μg/ml。
三碘甲狀腺原氨酸(T3)是一種基本成分，是甲狀腺激素的活性形式，在培養(yǎng)基中可以維持細(xì)胞代謝的速率。培養(yǎng)基中所加的三碘甲狀腺原氨酸的濃度范圍為約0-約400ρM，更優(yōu)選約2-約200ρM，最優(yōu)選約20ρM。
乙醇胺和對(duì)磷?；掖及肪鶠榱字?，它們中的任一個(gè)或全部是肌醇途徑中以及脂肪酸代謝的重要前體。在無(wú)血清培養(yǎng)基中必需添加通常發(fā)現(xiàn)于血清中的脂類。培養(yǎng)基中所加乙醇胺和對(duì)磷酰基乙醇胺的濃度范圍為約10-6-10-2M，更優(yōu)選約1×10-4M。
在整個(gè)培養(yǎng)期間，該基本培養(yǎng)基還將額外添加其它成分如氫化可的松、硒、和L-谷氨酰胺，以誘導(dǎo)合成或分化或改善細(xì)胞的生長(zhǎng)。
已知?dú)浠傻乃煽稍诮琴|(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)中促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的表型形成并因此強(qiáng)化分化特征如外皮蛋白(involucrin)和角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)氨酶的含量(Rubin等，細(xì)胞生理學(xué)雜志，138208-214(1986))。因此，當(dāng)這些特征有利于諸如形成角質(zhì)細(xì)胞片層轉(zhuǎn)移物或皮膚構(gòu)建物時(shí)，氫化可的松是優(yōu)選的添加劑。氫化可的松的所用濃度為約0.01μg/ml-約4.0μg/ml，最優(yōu)選約0.4μg/ml-16μg/ml。
可在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加硒以取代通常由血清提供的痕量元素硒。所添加的硒的濃度范圍為約10-9-10-7M，最優(yōu)選約5.3×10-8M。
L-谷氨酰胺存在于某些營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中，當(dāng)缺乏或其量不足時(shí)可以添加。也可提供穩(wěn)定形式的L-谷氨酰胺，如GlutaMAX-1TM(Gibco BRL，GrandIsland，NY)。GlutaMAX-1TM是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的穩(wěn)定二肽形式，可與L-谷氨酰胺互換使用，添加時(shí)所用濃度等同于L-谷氨酰胺的。這種二肽可使L-谷氨酰胺在長(zhǎng)期保存以及保溫期間不被降解，從而避免了培養(yǎng)基中L-谷氨酰胺有效濃度的不確定性。通常，基本培養(yǎng)基中優(yōu)選加入L-谷氨酰胺或GlutaMAX-1TM約1mM-約6mM，更優(yōu)選約2mM-約5mM，最優(yōu)選4mM。
培養(yǎng)基中還可加入生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，以幫助在細(xì)胞按比例增加以及接種期間形成培養(yǎng)物。EGF的天然形式或重組形式均可使用。當(dāng)形成不含非人生物成分的皮膚替代物時(shí)，優(yōu)選使用天然或重組的人型EGF。EGF是任選添加的成分，添加濃度為約1-15ng/ml，更優(yōu)選約5-10ng/ml。
上述培養(yǎng)基通常如下制備。但應(yīng)理解本發(fā)明的成分可用與它們的生理特征相容的常規(guī)方法制備并組裝。領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，基于適用性或經(jīng)濟(jì)的考慮，特定成分可用相應(yīng)類似物或功能等價(jià)的活性試劑取代，并獲得相似的結(jié)果。天然生長(zhǎng)因子可用具有相似特性并可在實(shí)施本發(fā)明時(shí)獲得相似結(jié)果的重組的或人工合成的生長(zhǎng)因子取代。
本發(fā)明的培養(yǎng)基均為無(wú)菌。無(wú)菌成分用常規(guī)方法除菌，如制備完成后過濾除菌。正確的無(wú)菌操作在以下實(shí)施例的全程中使用。首先混合DMEM和F-12，然后加入單個(gè)成分以組成完整培養(yǎng)基。所有成分的原液貯存于-20℃，但營(yíng)養(yǎng)源應(yīng)貯存于4℃。所有原液的終濃度為上述所列的500×。胰島素、運(yùn)鐵蛋白、和三碘甲狀腺原氨酸(均來(lái)自Sigma)的原液均如下制備三碘甲狀腺原氨酸先溶于2∶1的無(wú)水乙醇與IN鹽酸(HCl)中。胰島素溶于稀鹽酸(約0.1N)，運(yùn)鐵蛋白溶于水。然后將這三者混合，用水稀釋至500×并過濾除菌。黃體酮溶于無(wú)水乙醇并用水稀釋。氫化可的松溶于無(wú)水乙醇并用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。硒溶于水至500×的濃度并過濾除菌。EGF為無(wú)菌商品，將其溶于PBS。腺嘌呤難以溶解，但可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何多種方法溶解。血清白蛋白可加入特定成分中以便使它們?cè)谌芤褐蟹€(wěn)定，現(xiàn)有的血清白蛋白來(lái)自人類或動(dòng)物。例如，人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)加入后可延長(zhǎng)保存時(shí)間，從而維持黃體酮和EGF原液的活性。培養(yǎng)基可在制備好后馬上投入使用，也可貯存于4℃。如果是貯存，先不加EGF，使用前再加。
為了通過產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)形成細(xì)胞-基質(zhì)層，所述培養(yǎng)基中還添加了能促進(jìn)細(xì)胞合成基質(zhì)并貯存基質(zhì)的試劑。正向添加劑均與細(xì)胞相容、成分明確、純度很高，且無(wú)污染。用于產(chǎn)生所述細(xì)胞-基質(zhì)層的培養(yǎng)基稱為“產(chǎn)基質(zhì)培養(yǎng)基”。
為了制備產(chǎn)基質(zhì)培養(yǎng)基，在基本培養(yǎng)基中添加一種抗壞血酸衍生物，如抗壞血酸鈉、抗壞血酸、或其化學(xué)更穩(wěn)定的衍生物之一如L-抗壞血酸磷酸酶鹽的n水合物。加入抗壞血酸可以促進(jìn)脯氨酸的羥化和溶膠原(所貯存的膠原分子的可溶性前體)的分泌。已知抗壞血酸是其它酶的翻譯后加工的重要輔因子以及I型和II型膠原合成的調(diào)節(jié)因子。
在不限于任何理論的前提下，在培養(yǎng)基中加入?yún)⑴c蛋白質(zhì)合成的氨基酸可保存細(xì)胞的能量，因?yàn)檫@些細(xì)胞不必再產(chǎn)生這些氨基酸。優(yōu)選加入脯氨酸和甘氨酸，因?yàn)樗鼈儯约案彼岬牧u化形式羥脯氨酸都是組成膠原的結(jié)構(gòu)的基本氨基酸。
所述產(chǎn)基質(zhì)培養(yǎng)基還可任選(非必需)加入一種中性聚合物。本發(fā)明的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物可在無(wú)中性聚合物的情況下生成，但同樣不限于任何理論，培養(yǎng)基中中性聚合物的存在使膠原的加工和保存在不同樣品之間更趨于一致。一種優(yōu)選的中性聚合物是聚乙二醇(PEG)，它可促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的溶膠原可溶性前體體外加工成基質(zhì)中儲(chǔ)存的膠原。本發(fā)明的培養(yǎng)基中優(yōu)選加入分子量約1000-4000MW的組織培養(yǎng)級(jí)PEG，更優(yōu)選約3400-約3700MW。所述方法中使用的PEG濃度優(yōu)選約5％w/v或更少，還優(yōu)選約0.01％w/v-約0.5％w/v，更優(yōu)選約0.025％w/v-約0.2％w/v，最優(yōu)選約0.05％w/v。其它培養(yǎng)級(jí)中性聚合物如萄聚糖，優(yōu)選葡聚糖T-40，或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，優(yōu)選范圍為30,000-40,000MW，使用濃度也可優(yōu)選為約5％w/v或更少，還優(yōu)選約0.01％w/v-約0.5％w/v，更優(yōu)選約0.025％w/v-約0.2％w/v，最優(yōu)選約0.05％w/v。其它細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)以及有利于膠原加工和儲(chǔ)存的與細(xì)胞相容的試劑可由技術(shù)人員在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域內(nèi)確定。
當(dāng)細(xì)胞發(fā)生融合、而培養(yǎng)基中也添加了有助于基質(zhì)的合成、分泌或排列的成分時(shí)，稱這些細(xì)胞受到刺激，將形成含有細(xì)胞及細(xì)胞所合成基質(zhì)的組織構(gòu)建物。
因此，優(yōu)選的產(chǎn)基質(zhì)培養(yǎng)基配方是Dulbecco’s改良型Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高葡萄糖配方，無(wú)L-谷氨酰胺)與Hams F-12(添加有4mM L-谷氨酰胺或等價(jià)物)的3∶1混合物，5ng/ml表皮生長(zhǎng)因子，0.4μg/ml氫化可的松，1×10-4M鄰磷酰基乙醇胺，5μg/ml胰島素，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白，20ρM三碘甲狀腺原氨酸，6.78ng/ml硒，50ng/ml L-抗壞血酸，0.2μg/ml L-脯氨酸，和0.1μg/ml甘氨酸。可在所述產(chǎn)基質(zhì)培養(yǎng)基中加入其它藥理試劑，以改變所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)的特點(diǎn)、量、或類型。這些試劑可包括多肽生長(zhǎng)因子，轉(zhuǎn)錄因子或無(wú)機(jī)鹽以上調(diào)膠原的轉(zhuǎn)錄。多肽生長(zhǎng)因子有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)和組織-纖溶酶原激活劑(TPA)，已知它們均可上調(diào)膠原合成。Raghow等，臨床研究雜志，791285-1288(1987)；Pardes等，皮膚病學(xué)研究雜志，100549(1993)。刺激膠原產(chǎn)生的無(wú)機(jī)鹽有鈰。Shivakumar等，分子和細(xì)胞心臟病學(xué)雜志，24775-780(1992)。
將培養(yǎng)物維持在溫箱中以確?？刂茰囟?、濕度、氣體混合物條件，使之有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。優(yōu)選的條件是約34℃-約38℃，更優(yōu)選37±1℃，氣體環(huán)境為約5-10±1％CO2，相對(duì)濕度(Rh)約80-90％。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物是由真皮成纖維細(xì)胞及它們分泌的基質(zhì)形成的真皮構(gòu)建物。優(yōu)選使用人的真皮成纖維細(xì)胞，它們來(lái)源于真皮原代細(xì)胞或更優(yōu)選其來(lái)自已檢查了病毒和細(xì)菌污染并檢測(cè)了純度的現(xiàn)有細(xì)胞原種或細(xì)胞庫(kù)的連續(xù)傳代培養(yǎng)物。在培養(yǎng)基上用適當(dāng)條件培養(yǎng)細(xì)胞，使之生長(zhǎng)至適當(dāng)數(shù)量，該數(shù)量接種至培養(yǎng)基質(zhì)后足以形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物?；蛘撸蓪龃娴募?xì)胞直接培養(yǎng)在所述培養(yǎng)基質(zhì)上。
一旦獲得了足夠的細(xì)胞量，即可收獲細(xì)胞并接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)表面，使之在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下生長(zhǎng)，從而形成細(xì)胞融合層。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將細(xì)胞接種在多孔膜上，這種膜通過浸沒使培養(yǎng)層之下的培養(yǎng)基通過膜上的孔直接與上層的細(xì)胞接觸。優(yōu)選，將細(xì)胞懸浮于基座或培養(yǎng)基中，并接種在細(xì)胞培養(yǎng)表面，密度為約1×105個(gè)細(xì)胞/cm2-約6.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2，優(yōu)選約3×105個(gè)細(xì)胞/cm2-約6.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2，最優(yōu)選約6.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2(每平方厘米的表面的細(xì)胞數(shù))。通過在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)形成培養(yǎng)物，當(dāng)培養(yǎng)至約80％至100％融合時(shí)，將培養(yǎng)基換成產(chǎn)基質(zhì)的培養(yǎng)基，從而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)，以上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌。在另一方法中，細(xì)胞直接接種在產(chǎn)基質(zhì)的培養(yǎng)基中，這樣可不必將基本培養(yǎng)基替換成產(chǎn)基質(zhì)培養(yǎng)基，但這種方法要求較高的接種密度。
在培養(yǎng)期間，成纖維細(xì)胞將所分泌的分子排列成三維組織樣結(jié)構(gòu)，但它們不表現(xiàn)顯著的收縮力，因而不導(dǎo)致所形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物與所述培養(yǎng)基質(zhì)接觸并從培養(yǎng)基質(zhì)上剝離。每?jī)傻饺煊眯迈r的產(chǎn)基質(zhì)培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，逐漸地，所分泌的基質(zhì)厚度增加，排列更有序。生成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物所需時(shí)間取決于原始接種密度、細(xì)胞類型、細(xì)胞系的年齡、細(xì)胞系合成并分泌基質(zhì)的能力。本發(fā)明的構(gòu)建物完全形成時(shí)，由于細(xì)胞產(chǎn)生并排列的纖維狀基質(zhì)而使所述構(gòu)建物具有相當(dāng)?shù)暮穸?；它們并非通常的?xì)胞融合或?qū)盈B的融合細(xì)胞培養(yǎng)物，這些培養(yǎng)物中細(xì)胞松散地相互粘附。纖維狀特性使所述構(gòu)建物具有不同于普通培養(yǎng)物的組織樣特點(diǎn)，它們?cè)谂R床常規(guī)操作中更能抵抗物理?yè)p傷，如撕裂或爆裂。在培養(yǎng)型真皮構(gòu)建物的形成過程中，細(xì)胞將在細(xì)胞培養(yǎng)表面上沿它們自身的周圍排列，優(yōu)選厚度至少約30μm，更優(yōu)選跨膜表面的約60-120μm厚，但已獲得了超過120μm的厚度，其適用于需此厚度的檢測(cè)或臨床應(yīng)用。
在一更優(yōu)選的方法中，在一個(gè)表面上應(yīng)用一個(gè)上皮層，優(yōu)選為上表面，向上直面所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物。可在該細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物上接種并培養(yǎng)上皮細(xì)胞，從而形成一種多層組織構(gòu)建物。在最優(yōu)選的方法中，于所述細(xì)胞構(gòu)建物上培養(yǎng)來(lái)自皮膚的角質(zhì)細(xì)胞，以形成皮膚構(gòu)建物。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，可在所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物上接種角膜上皮細(xì)胞，也稱為角膜角質(zhì)細(xì)胞，從而形成角膜構(gòu)建物?？稍谒黾?xì)胞-基質(zhì)上接種來(lái)自口腔粘膜的上皮細(xì)胞以形成口腔粘膜的構(gòu)建物。將來(lái)自食道的上皮細(xì)胞接種在所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物上可形成食道組織的構(gòu)建物。來(lái)自泌尿生殖道的尿道上皮細(xì)胞接種在所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物上可形成尿道上皮的構(gòu)建物?？蛇x擇上皮來(lái)源的其它細(xì)胞用于形成產(chǎn)生這些細(xì)胞的組織的構(gòu)建物。
向真皮基質(zhì)提供上皮細(xì)胞的方法，它們的培養(yǎng)方法，包括誘導(dǎo)分化和角質(zhì)化以形成分化的角質(zhì)細(xì)胞層的方法均為領(lǐng)域內(nèi)已知，見Parenteau等人的美國(guó)專利5712613，Kemp等人的美國(guó)專利5536656(均全文引入作參考)。通常將角質(zhì)細(xì)胞接種在細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物上，培養(yǎng)至1-3層細(xì)胞層厚，從而使該細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物表皮化。然后誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞分化以形成一種多層表皮，然后誘導(dǎo)角質(zhì)化以形成角質(zhì)層。
在形成分化的表皮層的方法中，自細(xì)胞原種中取角質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，使其細(xì)胞數(shù)增加。獲得所需細(xì)胞數(shù)后，將它們從培養(yǎng)基質(zhì)中分離出來(lái)，懸浮、計(jì)數(shù)、稀釋、然后接種在所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的上表面，接種密度約4.5×103細(xì)胞/cm2-約5.0×105細(xì)胞/cm2，更優(yōu)選約1.0×104細(xì)胞/cm2-約1.0×105細(xì)胞/cm2，最優(yōu)選約4.5×104細(xì)胞/cm2。然后將構(gòu)建物于37±1℃、10％CO2下培養(yǎng)約60-90分鐘，使角質(zhì)細(xì)胞相互接觸。然后將這些構(gòu)建物浸沒在表皮化培養(yǎng)基中。培養(yǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間后，這些角質(zhì)細(xì)胞增殖并向周圍擴(kuò)展形成橫跨所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的融合單層。一旦融合，就將細(xì)胞培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基以誘導(dǎo)細(xì)胞分化。形成多層上皮后，使用角質(zhì)化培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)物置于氣-液界面。使這些細(xì)胞暴露于干燥或低濕度的氣-液界面以便角質(zhì)細(xì)胞的分化和角質(zhì)化。干燥或低濕度的氣-液界面的特征是，努力達(dá)到皮膚之低濕度水平的兩倍。逐漸地，角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)大多數(shù)或全部角蛋白及其它可見于天然皮膚暴露在這些條件下出現(xiàn)的特征。
如上述，產(chǎn)生細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的方法可用于形成角膜構(gòu)建物。所述角膜上皮細(xì)胞可來(lái)自各種哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的上皮細(xì)胞為兔或人的角膜上皮細(xì)胞(角膜角質(zhì)細(xì)胞)，但任何哺乳動(dòng)物角膜角質(zhì)細(xì)胞均可使用。也可用諸如來(lái)自鞏膜(眼部外層白色不透明部分)或真皮的上皮角質(zhì)細(xì)胞，但優(yōu)選角膜的角質(zhì)細(xì)胞。在形成角膜構(gòu)建物的方法中，將插入的培養(yǎng)物(含有細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物)和其周圍部分除去。正常的兔角膜上皮細(xì)胞通過連續(xù)培養(yǎng)而擴(kuò)增，胰蛋白酶消化使它們與所述培養(yǎng)基質(zhì)分離，將它們懸浮于培養(yǎng)基中，然后接種在所述膜的上表面，接種密度約7.2×104細(xì)胞/cm2-約1.4×105細(xì)胞/cm2。然后將這些構(gòu)建物在無(wú)培養(yǎng)基的條件下37±1℃、10％CO2中培養(yǎng)至這些上皮細(xì)胞粘附。之后，將這些構(gòu)建物浸沒在角膜維持培養(yǎng)基(CMM)(Johnson等，1992)中。使上皮細(xì)胞培養(yǎng)至所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物被這些上皮細(xì)胞覆蓋。上皮的徹底覆蓋可用各種方法測(cè)知，如用硫酸尼羅蘭溶液(磷酸鹽緩沖液中1∶10,000稀釋)對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行染色。一旦覆蓋了所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物，約7天后，將這些構(gòu)建物無(wú)菌轉(zhuǎn)移至含有充足的角膜維持培養(yǎng)基(CMM)的新培養(yǎng)皿中，使所述構(gòu)建物的表面形成流體，從而無(wú)需浸沒上皮層就可維持潮濕界面。所述構(gòu)建物在37±1℃、10％CO2和60％以上的濕度下，用CMM培養(yǎng)，必要時(shí)更換培養(yǎng)基，通常每周三次。
產(chǎn)生角膜構(gòu)建物時(shí)需要使上皮細(xì)胞分化，但不角質(zhì)化，為此使上皮細(xì)胞表面暴露于潮濕的氣-液界面。提供氣-液界面的方法見Parenteau的美國(guó)專利5374515。如本文所用，“潮濕界面”指一種培養(yǎng)環(huán)境，其經(jīng)過調(diào)節(jié)可以使構(gòu)建物的表面潮濕，具有較高濕度，但不干也不浸沒。對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中潮濕的確切水平并無(wú)苛求，但其應(yīng)足以避免形成角質(zhì)化細(xì)胞。潮濕界面的特征可以是使人的眼睛的類似潮濕水平加倍。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，可在第一細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物之上接種第二種產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞，以獲得一種更厚的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物或一種雙層細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物。第二次接種可使用相同類型的細(xì)胞或菌株或使用不同類型的細(xì)胞或菌株，這取決于所要達(dá)到的結(jié)果。第二次接種使用產(chǎn)生第一層所用的方法和產(chǎn)基質(zhì)培養(yǎng)基以相同條件進(jìn)行。用不同類型的細(xì)胞實(shí)施第二次接種的一個(gè)結(jié)果是形成具有不同基質(zhì)成分之特征或基質(zhì)包裝密度的基質(zhì)，該構(gòu)建物移植至患者后可以影響傷口的恢復(fù)。第一次的細(xì)胞接種產(chǎn)生類似于真皮網(wǎng)狀層的基質(zhì)，這是I型膠原和組成型細(xì)胞外基質(zhì)成分的更致密包裝層。第二次細(xì)胞接種產(chǎn)生類似于真皮乳頭層的基質(zhì)，其特征為更松散的膠纖絲和細(xì)胞外基質(zhì)。另一結(jié)果是所述第二層細(xì)胞可產(chǎn)生一種有治療價(jià)值的物質(zhì)，其也可以影響傷口復(fù)原，如改善對(duì)移植物的吸收，促進(jìn)移植物整合，使形成的疤痕最小或阻止其形成。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，兩種或更多種細(xì)胞的混合群體可以在形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物期間一起培養(yǎng)，只要所用的細(xì)胞至少有一種能合成細(xì)胞外基質(zhì)。所述第二種細(xì)胞可以發(fā)揮所需的另一種組織功能或形成該組織構(gòu)建物的特有結(jié)構(gòu)特征。例如，在產(chǎn)生皮膚構(gòu)建物時(shí)，來(lái)自附件的真皮乳頭細(xì)胞或上皮細(xì)胞可與產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞一起培養(yǎng)，從而形成上皮附件或它們的成分。表皮附件如汗腺或皮脂腺結(jié)構(gòu)或成分或毛囊結(jié)構(gòu)或成分可以在與產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞一起培養(yǎng)的時(shí)侯形成。上皮細(xì)胞可以衍生自深部真皮中腺體和毛發(fā)的附件結(jié)構(gòu)，如通過顯微解剖，它們包括外分泌細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞、腺體分泌細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞。也可加入皮膚中常見的組成皮膚的其它類型細(xì)胞如黑色素細(xì)胞、郎罕細(xì)胞、和Merkel細(xì)胞。類似地，血管內(nèi)皮細(xì)胞也可實(shí)施共培養(yǎng)以產(chǎn)生可用于新血管形成的基本成分。脂肪細(xì)胞也可以與產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞一起培養(yǎng)以形成用于再造手術(shù)的構(gòu)建物。運(yùn)送這第二種細(xì)胞的另一方式是，將細(xì)胞點(diǎn)種或多點(diǎn)排列式接種于正在形成或已徹底形成的用于定位形成所述結(jié)果的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物上或其中?？梢詫⒓?xì)胞注射至上表面和下表面之間，所述細(xì)胞-基質(zhì)內(nèi)，以便于細(xì)胞生長(zhǎng)，形成特定結(jié)構(gòu)并發(fā)揮它們的特殊功能。
為了產(chǎn)生第三層組織構(gòu)建物，將含有產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞或非產(chǎn)基質(zhì)型細(xì)胞的第一次接種物接種于所述培養(yǎng)基質(zhì)上，培養(yǎng)至形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物或細(xì)胞層。一旦形成第一細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物或細(xì)胞層，將含有產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞的第二細(xì)胞接種物接種在第一細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物或細(xì)胞層的上表面，培養(yǎng)直至在該第一構(gòu)建物上形成第二細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物。在該第二細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物上接種第三種細(xì)胞，培養(yǎng)至形成第三層。例如，為產(chǎn)生一種三層角膜構(gòu)建物，第一細(xì)胞層可能由內(nèi)皮來(lái)源的細(xì)胞如角膜內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成；第二細(xì)胞層可能由結(jié)締組織來(lái)源的細(xì)胞如角膜角質(zhì)細(xì)胞組成；第三細(xì)胞層可能由上皮來(lái)源的細(xì)胞如角膜上皮細(xì)胞組成。另一種三層式皮膚構(gòu)建物如第一次接種的細(xì)胞為血管來(lái)源以提供用于血管形成的成分；第二次接種的細(xì)胞可能含有真皮成纖維細(xì)胞以形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物來(lái)作為真皮構(gòu)建物，第三次接種的細(xì)胞可以是表皮角質(zhì)細(xì)胞以形成表皮層。
本發(fā)明的組織構(gòu)建物可使用透明(vitrification)技術(shù)或低溫貯藏方法保存在低溫下。使組織構(gòu)建物透明的方法如美國(guó)專利5518878所述，低溫貯藏的方法如美國(guó)專利5689961和5891617以及國(guó)際PCT申請(qǐng)WO96/24018所述，它們均全文引入作參考。
本發(fā)明的皮膚構(gòu)建物可在體外毒理學(xué)檢驗(yàn)的組織檢測(cè)系統(tǒng)中使用。為檢驗(yàn)的目的加入了皮膚構(gòu)建物的檢測(cè)系統(tǒng)如美國(guó)專利4835102所述，其已引入本文作參考。由于這種產(chǎn)生細(xì)胞的皮膚構(gòu)建物具有類似于皮膚的結(jié)構(gòu)，更重要的是具有類似的構(gòu)成，它可以作為活的人或動(dòng)物體檢驗(yàn)的另一種或取而代之的檢測(cè)系統(tǒng)，用于檢驗(yàn)產(chǎn)物的吸收作用，毒力，以及大多數(shù)情況下產(chǎn)物的有效性。所述基質(zhì)的形成已顯示可模擬體內(nèi)基質(zhì)產(chǎn)生以及基質(zhì)修復(fù)的多個(gè)過程。因此，所述系統(tǒng)可以成為分析創(chuàng)傷恢復(fù)和組織再生，以及檢測(cè)和分析創(chuàng)傷修復(fù)的化學(xué)和/或物理次級(jí)的良好工具。
本發(fā)明皮膚構(gòu)建物的最優(yōu)選應(yīng)用是移植或植入哺乳動(dòng)物宿主中以修復(fù)皮膚因受傷或疾病造成的損傷。移植皮膚構(gòu)建物的指標(biāo)包括但不限于整形手術(shù)、皮膚創(chuàng)傷、燒傷、牛皮癬、靜脈和糖尿病性漬瘍、及基底細(xì)胞癌。本發(fā)明的皮膚構(gòu)建物可有效用于保護(hù)受傷的組織，然后作為宿主組織向內(nèi)生長(zhǎng)的支架。據(jù)信本發(fā)明中產(chǎn)生的組織構(gòu)架也可以簡(jiǎn)化并很可能加速創(chuàng)傷修復(fù)作用。
本發(fā)明的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物具有共聚特征?！肮簿邸痹诒疚闹改芫S持物理整體性以及類似于組織的手感特征。主要產(chǎn)生本發(fā)明構(gòu)建物之共聚特征的物理特性是厚度和纖維狀基質(zhì)結(jié)構(gòu)。所述纖維狀細(xì)胞外基質(zhì)形成于細(xì)胞所合成的膠原以及其它基質(zhì)成分，主要為纖絲中排列的纖維狀膠原和纖維束，它們使這些構(gòu)建物具有一定體積。本發(fā)明的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物均可用手操作，即，可以用手使它們與它們的培養(yǎng)基質(zhì)脫離，無(wú)需載體支持物或特殊工具，然后可以應(yīng)用于患者或檢測(cè)儀器。它可抵抗諸如撕裂或爆裂等常規(guī)臨床操作中的傷害，而不會(huì)損傷其結(jié)構(gòu)或功能。當(dāng)應(yīng)用于患者時(shí)，可通過縫線或釘(staple)將它們固定。
為了將本發(fā)明的皮膚構(gòu)建物移植至患者，可根據(jù)常規(guī)操作準(zhǔn)備該移植區(qū)域。對(duì)于燒傷指征而言，待移植的燒傷部位經(jīng)處理應(yīng)使燒傷皮膚區(qū)徹底切除。切除后暴露的部分在移植前應(yīng)是清潔的且無(wú)臨床感染。對(duì)于因手術(shù)切除造成的深部傷口而言，需在操作前刮毛，必要時(shí)用抗微生物的皮膚消毒劑進(jìn)行清潔并用生理鹽水沖洗。局部麻醉通常包括皮內(nèi)給予利多卡因和/或腎上腺素。一旦完成麻醉，即用植皮刀除去皮膚至一適當(dāng)深度，造成一個(gè)深部傷口?？赏ㄟ^壓入含有利多卡因的腎上腺素及通過電烙術(shù)止血。然后在這一傷口床上施用皮膚構(gòu)建物，必要時(shí)用縫線和釘固定，然后用適當(dāng)?shù)姆罅隙ㄎ徊?br> 本發(fā)明的皮膚構(gòu)建物還可在移植給患者之前形成網(wǎng)狀。網(wǎng)狀化使皮膚構(gòu)建物與傷口床更好地吻合，并使傷口滲出物可以從移植物下面通過該網(wǎng)狀排出。術(shù)語(yǔ)“網(wǎng)狀化”指一種機(jī)械方法，其使組織上產(chǎn)生孔隙，從而形成網(wǎng)狀排列。網(wǎng)狀化優(yōu)選使用常規(guī)皮膚網(wǎng)(ZIMMER；BIOPLASTY)獲得。也可用解剖刀或針在組織上手動(dòng)打孔。網(wǎng)狀化的皮膚可通過將皮膚拉伸而使其擴(kuò)展，從而使孔隙打開，然后可施用于傷口床。擴(kuò)展的網(wǎng)狀組織可對(duì)傷口區(qū)實(shí)施最大范圍的覆蓋?；蛘撸梢圆粩U(kuò)展而直接以具有未擴(kuò)展之孔陣的片狀物形式應(yīng)用網(wǎng)狀組織。網(wǎng)狀化的皮膚構(gòu)建物可單獨(dú)施用，也可與來(lái)自患者機(jī)體其它部位的自體皮膚一起施用。組織構(gòu)建物也可帶有洞或穿孔以及以其它方式產(chǎn)生的孔。穿孔可以使用激光、拳擊(punch)、解剖刀、針或大頭針經(jīng)手動(dòng)應(yīng)用。
本發(fā)明的皮膚構(gòu)建物可以應(yīng)用于除外科手術(shù)傷口以外的創(chuàng)傷或燒傷區(qū)域。應(yīng)用此次公開的皮膚構(gòu)建物可以對(duì)其他創(chuàng)傷例如靜脈性潰瘍，糖尿病性漬瘍，褥瘡等起到治療效應(yīng)。對(duì)其他先天性皮膚疾病如大皰性表皮松解也可能有益處。
提供下面的實(shí)施例以更好解釋本發(fā)明的實(shí)施，而且無(wú)論如何它們不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)發(fā)現(xiàn)在不背離本發(fā)明的精神和范圍時(shí)可以對(duì)這里所述方法進(jìn)行多種修改。
實(shí)施例實(shí)施例1利用人新生期包皮成纖維細(xì)胞形成膠原基質(zhì)人新生期包皮成纖維細(xì)胞(來(lái)自O(shè)rganognesis，Inc.Canton，MA)以5×105個(gè)細(xì)胞/162cm2接種于組織培養(yǎng)處理瓶(CostarCorp.，劍橋，MA，批號(hào)3150)并在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成為Dulbecco’s改良型Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型，無(wú)L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％新生小牛血清(NBCS)(HyClone實(shí)驗(yàn)室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱于37±1℃，10±1％CO2中維持。每2-3天將培養(yǎng)基更換成新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)8天后，細(xì)胞長(zhǎng)至融合，即細(xì)胞沿組織培養(yǎng)瓶的底部形成緊密的單細(xì)胞層，從培養(yǎng)瓶中將培養(yǎng)基吸出。將經(jīng)無(wú)菌過濾的磷酸鹽緩沖液加到每個(gè)培養(yǎng)瓶的底部以沖洗單細(xì)胞層，然后從瓶中吸出。向每個(gè)瓶中加入5ml胰蛋白酶-維爾烯谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)并輕輕搖動(dòng)以確保完全覆蓋單細(xì)胞層，使細(xì)胞從瓶上消化下來(lái)。將培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱。一旦細(xì)胞被消化下來(lái)立即向每個(gè)瓶中加入5ml SBTI(大豆胰蛋白酶抑制劑)并與懸浮液混合使胰蛋白酶-維爾烯的作用終止。將細(xì)胞混懸液從瓶中移出并均分入無(wú)菌圓錐形離心管中。于大約800-1000g離心5分鐘收集細(xì)胞。
用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸至濃度為3.0×106個(gè)細(xì)胞/ml，并在六孔板中以3.0×106個(gè)細(xì)胞/插條(insert)(6.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2)的密度接種于孔徑為0.4μm，直徑為24mm的組織培養(yǎng)處理的插條(TRANSWELL，Coming Costar)上。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中以37±1℃，10±1％CO2維持，并每2-3天換以新鮮的生產(chǎn)培養(yǎng)基，培養(yǎng)21天。生產(chǎn)培養(yǎng)基含有DMEM和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX-1TM(Gibco BRL，Grand Island，紐約)及添加劑，至終濃度為5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，紐約)，2％新生小牛血清(HyClone，Logan，Utah)，0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約，分析純)，1×10-4M鄰磷?；掖及?Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗壞血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.#013-12061)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)3400-3700MW(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))(Sigma St.Louis，MO)。
于第7，14和21天取標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)分析，在福爾馬林中固定，然后在石蠟中包埋。將福爾馬林固定的標(biāo)本包埋于石蠟中并取5μm按本領(lǐng)域已知的方法用蘇木精-伊紅(H&E)染色。使用H&E染色切片，隨機(jī)挑選10個(gè)顯微鏡視野利用裝有10mm/100測(cè)微計(jì)網(wǎng)格的10×目鏡測(cè)量厚度。
人真皮成纖維細(xì)胞的兩個(gè)不同細(xì)胞株的結(jié)果總結(jié)于表1，它顯示細(xì)胞基質(zhì)在發(fā)育過程中的厚度。
在7天，14，和21天取樣分析膠原濃度。使用本領(lǐng)域已知的羥脯氨酸含量比色測(cè)定法(Woessner，1961)來(lái)評(píng)估膠原的含量。在上述相同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定細(xì)胞數(shù)。用上述方法從兩種細(xì)胞株(B156和B119)產(chǎn)生的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物得到中膠原濃度(表2)和細(xì)胞數(shù)據(jù)(表3)。
在第7，14，21天取源于皮膚基質(zhì)的人類細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)延遲還原型SDS-PAGE測(cè)定標(biāo)本中顯示I型和III型膠原α帶的膠原組合物。
所述真皮基質(zhì)的生化特征用免疫組化方法測(cè)定。應(yīng)用zymed組織染色鏈親和素-生物素系統(tǒng)(Zymed Laboratories Inc.，南舊金山，CA)在石蠟包埋的切片上完成對(duì)纖連蛋白的鑒定。用抗-腱生蛋白抗體作第一抗體(Dako，Carpintheda，CA)、抗-小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體(Calbiochem)作為第二抗體染色測(cè)定腱生蛋白的存在。用二氨基苯炔(Sigma St.Louis，MO)和核堅(jiān)牢紅(Nuclear Fast red)復(fù)染觀察標(biāo)本。
用上述方法(Famdale，1986)在21天的標(biāo)本上測(cè)定糖胺聚糖(GAG)的量。試驗(yàn)顯示接種后21天由真皮基質(zhì)產(chǎn)生的人型細(xì)胞標(biāo)本中GAG的量為0.44g/cm2。
實(shí)施例2完整厚度的皮膚構(gòu)建物使用通過實(shí)施例1所述的方法形成的皮膚構(gòu)建物將正常人新生期包皮表皮的角質(zhì)細(xì)胞(來(lái)自O(shè)rganogenesis，Inc.Canton，MA)鋪于細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物上以形成皮膚構(gòu)建物的表皮層。
從培養(yǎng)物插條和其周圍無(wú)菌去除培養(yǎng)基。將正常人表皮角質(zhì)細(xì)胞從細(xì)胞凍存株傳4代至融合。然后用胰蛋白酶-維爾烯將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來(lái)，混合，離心以形成細(xì)胞沉淀，在表皮化培養(yǎng)基中重懸，計(jì)數(shù)并按4.5×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于膜的上表面。然后將此構(gòu)建物在37±1℃，10±1％CO2條件下保溫90分鐘以允許角質(zhì)細(xì)胞貼壁。保溫后，將這些構(gòu)建物浸沒到表皮化培養(yǎng)基中。表皮化培養(yǎng)基含有Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型，無(wú)L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，加有0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約)，1×10-4M鄰磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，0.3％螯合的新生小牛血清(Hyclone，Logan，Utah)，0.628ng/ml黃體酮(Amersham Arlington Heights，IL)，50μg/ml L-抗壞血酸鈉鹽(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(Life Technologies Inc.，MD)和50μg/ml硫酸慶大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。將這些構(gòu)建物在37±1℃，10±1％CO2的表皮化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。
2天后將此構(gòu)建物浸入含以下成分的培養(yǎng)基中Dulbeceo’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型，無(wú)L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，加有0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約)，1×10-4M鄰磷?；掖及?Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwankee，WI)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，0.3％螯合的新生小牛血清(BioWhittaker，Walkersville，MD)，0.628ng/ml黃體酮(Amersham，Arlington，Heights，IL)，50μg/ml L-抗壞血酸鈉，265μg/ml氯化鈣(Mallinckrodt，Chesterfield，MO)，和50μg/ml硫酸慶大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。將此構(gòu)建物再次于37±1℃，10％CO2條件下培養(yǎng)2天。
2天后將含有此構(gòu)建物的載體無(wú)菌轉(zhuǎn)移到含有足量(9ml)角質(zhì)化培養(yǎng)基的新培養(yǎng)板上，使液面剛好到達(dá)載體膜表面，以維持能使上皮層分層的干燥界面。將這些構(gòu)建物在37±1℃，10％CO2，和低濕度條件下保溫，每隔2-3天更換培養(yǎng)基，持續(xù)7天。該培養(yǎng)基含有Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型，無(wú)L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)1∶1的混合物，加有0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約)，1×10-4M鄰磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，2％新生小牛血清(BioWhittaker，Walkersville，MD)，50μg/ml L-抗壞血酸鈉，和50μg/ml硫酸慶大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。7天后將此構(gòu)建物用維持培養(yǎng)基再培養(yǎng)10天，每2-3天更換培養(yǎng)基。維持培養(yǎng)基含有Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型，無(wú)L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)1∶1的混合物，加有0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約)，1×10-4M鄰磷?；掖及?Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(SigmaAldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，24.4μg/ml腺嘌呤(SigmaAldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，1％新生小牛血清(BioWhittaker，Walkersville，MD)，和50μg/ml硫酸慶大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。
取最終的標(biāo)本按照實(shí)施例1所述用蘇木精-伊紅染色，在光鏡下判斷總體形態(tài)。此所得構(gòu)建物包括成纖維細(xì)胞構(gòu)成的底(真皮)層，其周圍包繞具有實(shí)施例1所述特征的基質(zhì)，并且上面被多層、已分層且分化良好的角質(zhì)細(xì)胞層完全覆蓋，此角質(zhì)細(xì)胞層顯示出與原位皮膚相似的基底層，基底上層，粒狀層和角質(zhì)層。透射電鏡(TEM)顯示皮膚構(gòu)建物在真皮-表皮交界處存在發(fā)育良好的基底膜。如TEM所見以VII型膠原構(gòu)成的錨著纖絲為標(biāo)記的半橋粒周圍基底膜呈現(xiàn)為最厚。如所預(yù)期，可以容易地看到這些錨著纖絲從基底膜伸出并捕捉膠纖絲。用上述親和素-生物素免疫酶技術(shù)(Guesdon，1979)顯示層粘連蛋白(一種基底膜糖蛋白)的存在。
實(shí)施例3人新生期包皮成纖維細(xì)胞在化學(xué)確定的培養(yǎng)基上體外形成膠原基質(zhì)將人新生期包皮成纖維細(xì)胞用實(shí)施例1所述方法擴(kuò)增。然后將細(xì)胞重懸使?jié)舛葹?×106個(gè)細(xì)胞/ml，并在六孔板中以3.0×106個(gè)細(xì)胞/TW(6.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2)的密度接種于孔徑為0.4μm，直徑為24mm的組織培養(yǎng)處理膜插條上。然后如實(shí)施例1所述維持這些細(xì)胞，全程中培養(yǎng)基不含新生小牛血清。更具體而言培養(yǎng)基中含有DMEM和Hams F-12培養(yǎng)基(QualityBiologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX-1TM(GibcoBRL，Grand Island，紐約)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(UpstateBiotechnology Lake Placid，紐約)，0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約批號(hào)02400，分析純)，1×10-4M鄰磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine ChemicalsCo.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗壞血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO)。用上述方法于第7天，14天，和21天檢測(cè)標(biāo)本的膠原濃度和細(xì)胞數(shù)。結(jié)果見表4(細(xì)胞數(shù)目)和5(膠原)。如實(shí)施例1所述將標(biāo)本用福爾馬林固定并用蘇木精和伊紅染色，光鏡分析。組織學(xué)評(píng)價(jià)證明，在確定的培養(yǎng)基中構(gòu)建物的生長(zhǎng)相似于在有2％新生小牛血清存在的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。用實(shí)施例1所述方法，標(biāo)本也呈纖連蛋白染色陽(yáng)性.。

細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物中除內(nèi)源產(chǎn)生的纖絲膠原外還有decorin和糖胺聚糖。
實(shí)施例4用化學(xué)確定的培養(yǎng)基形成的完全厚度的皮膚構(gòu)建物使用人的真皮成纖維細(xì)胞在類似于實(shí)施例3所述方法的化學(xué)確定的條件下培養(yǎng)25天形成的皮膚構(gòu)建物，將正常人新生期包皮表皮的角質(zhì)細(xì)胞接種于該細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的上表面以形成皮膚構(gòu)建物的表皮層。
無(wú)菌操作除去培養(yǎng)插條及其周圍的培養(yǎng)基。將正常人表皮角質(zhì)細(xì)胞從細(xì)胞凍存株傳4代至融合。然后用胰蛋白酶-維爾烯將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來(lái)，混合，離心以形成細(xì)胞沉淀，在表皮化培養(yǎng)基中重懸，計(jì)數(shù)并按4.5×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于膜的上表面。然后將這些構(gòu)建物在37±1℃，10±1％CO2條件下保溫90分鐘以允許角質(zhì)細(xì)胞貼壁。保溫后，將這些構(gòu)建物浸沒到表皮化培養(yǎng)基中。表皮化培養(yǎng)基含有Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型，無(wú)L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，加有0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約)，1×10-4M鄰磷?；掖及?Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰島索(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwankee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，50μg/ml L-抗壞血酸鈉鹽(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，16μM亞油酸(Sigma St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸慶大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。將這些構(gòu)建物在37±1℃，10±l％CO2的表皮化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。
2天后將培養(yǎng)基更換成成分同上的新鮮培養(yǎng)基，并再放回設(shè)置為37±1℃，10±1％CO2的培養(yǎng)箱中保持2天。2天后將含有構(gòu)建物的載體無(wú)菌轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)板上，板中所含培養(yǎng)基足以使液面恰至載體膜表面，從而使生長(zhǎng)中的構(gòu)建物維持在氣-液界面?？諝饨佑|形成中的表皮層上表面可以使上皮層分層。將這些構(gòu)建物在37±1℃，10％CO2，和低濕度條件下保溫，每隔2-3天更換培養(yǎng)基，持續(xù)7天。此培養(yǎng)基包含Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型，無(wú)L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)1∶1的混合物，加有0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，5×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約)，5×10-4M鄰磷?；掖及?Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(SigmaAldrich Fine Chemicals Company)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich FineChemicals Company)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，2.65μg/ml氯化鈣(Mallinckrodt，Chesterfield，MO)，16μM亞油酸(Sigma St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma St.Louis，MO)，1.25mM絲氨酸(SigmaSt.Louis，MO)，0.64mM膽堿鹽酸鹽(Sigma St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸慶大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。將培養(yǎng)物培養(yǎng)14天，每2-3天更換培養(yǎng)基。
取出將構(gòu)建物提升到氣-液界面后10天，12天，和14天的標(biāo)本，一式三份，按照實(shí)施例1中所述方法進(jìn)行蘇木精伊紅染色以在光鏡下判定總體形態(tài)。所得構(gòu)建物包括由成纖維細(xì)胞及周圍包繞的具有實(shí)施例3所述特征的基質(zhì)構(gòu)成的底(真皮)層，其上層為分層且已分化的角質(zhì)細(xì)胞。
實(shí)施例5用人跟腱成纖維細(xì)胞體外形成膠原基質(zhì)按實(shí)施例1所述方法用人跟腱成纖維細(xì)胞(HATF)替換人新生期包皮成纖維細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物。在生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天后，用實(shí)施例1中所述方法取標(biāo)本做H&E染色和厚度判定。觀察到所得構(gòu)建物為厚度75.00±27.85微米(n＝2)的細(xì)胞基質(zhì)組織樣構(gòu)建物。在該構(gòu)建物中也存在內(nèi)源產(chǎn)生的纖絲膠原，decorin和糖胺聚糖。
實(shí)施例6用轉(zhuǎn)染的人新生期包皮成纖維細(xì)胞體外形成膠原基質(zhì)按以下方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的人新生期包皮成纖維細(xì)胞。將一小瓶iCRIP-43血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)病毒生產(chǎn)者(Morgan，J.等)解凍，以2×106個(gè)細(xì)胞/162cm2瓶(Coming Costar，Cambridge，MA)接種。培養(yǎng)瓶中含生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在37±1℃，10±1％CO2的培養(yǎng)箱中保溫。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成為Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型，無(wú)L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％新生小牛血清(HyClone實(shí)驗(yàn)室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。于同一天，也融化1小瓶人新生期包皮成纖維細(xì)胞(HDFB156)并按1.5×106個(gè)細(xì)胞/162cm2瓶(Coming Costar，Cambridge，MA)平鋪。3天后將jCRIPPDGF-43病毒生產(chǎn)者用新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)。將HDFB156用上述生長(zhǎng)培養(yǎng)基加8μg/ml Polybrene(Sigma St.Louis，MO)培養(yǎng)。第二天將HDFB156細(xì)胞如下感染。收集已培養(yǎng)過jCRIP PDGF-43病毒生產(chǎn)者的培養(yǎng)基并經(jīng)0.45μm濾膜過濾。向已過濾的培養(yǎng)基中加入8μg/ml Polybrene。然后將此培養(yǎng)基放于HDF上。接下來(lái)的兩天用新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)HDF。再過一天將HDF從第5代傳至第6代并以2.5×106個(gè)細(xì)胞/162cm2瓶(Coming Costar，Cambridge，MA)接種。細(xì)胞按下述傳代吸除舊培養(yǎng)基。然后用磷酸鹽緩沖液沖洗培養(yǎng)瓶以去除任何殘留的新生小牛血清。通過向每個(gè)瓶中加入5mL胰蛋白酶-維爾烯并輕輕搖動(dòng)以確保完全覆蓋單細(xì)胞層可使細(xì)胞從瓶上消化下來(lái)。將培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱。一旦細(xì)胞被消化下來(lái)，立即向每個(gè)瓶中加入5ml SBTI(大豆胰蛋白酶抑制劑)并與懸浮液混合使胰蛋白酶-維爾烯的作用終止。將細(xì)胞/胰蛋白酶/SBTI混懸液從瓶中移出并均分入無(wú)菌圓錐形離心管中。于大約800-1000g離心5分鐘收集細(xì)胞。將細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中重懸，以上述同樣濃度接種。用生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞兩天。隨后的一天里同上收獲細(xì)胞，并在含10％新生小牛血清(NBCS)及10％二甲亞砜(DMSO)(Sigma St.Louis，MO)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中稀釋至1.5×106個(gè)細(xì)胞/ml。然后將細(xì)胞在大約-80℃以1ml/冷凍瓶?jī)龃妗?br> 利用實(shí)施例1和3的相同方法，使用上述已轉(zhuǎn)化而能產(chǎn)生高水平血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)的人新生期包皮成纖維細(xì)胞生產(chǎn)本實(shí)施例的膠原基質(zhì)。于接種后18天取標(biāo)本做H&E染色。將標(biāo)本用實(shí)施例1的親和素-生物素方法染色以檢測(cè)纖連蛋白的存在。接種后18天取標(biāo)本按實(shí)施例1所述做H&E染色，顯示與實(shí)施例1所述相似的細(xì)胞基質(zhì)總體形態(tài)，所測(cè)厚度為123.6μm(N＝1)。在培養(yǎng)期全程(18天)，用ELISA檢測(cè)細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物中轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PDGF產(chǎn)量為100ng/ml，而對(duì)照組未檢測(cè)到PDGF產(chǎn)量。
實(shí)施例7真皮構(gòu)建物作為移植材料的應(yīng)用使用源自新生期包皮的人真皮成纖維細(xì)胞按照實(shí)施例1的方法制備細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物，移植到無(wú)胸腺裸鼠的完全切除傷口上。按照Parenteau等(1996)所述方法移植給小鼠，其內(nèi)容在此引入以作參考。在14，28和56天檢測(cè)移植物粘附創(chuàng)傷床的跡象，傷口收縮、移植物缺失區(qū)、和血管再生存在(顏色)的指征。當(dāng)移植區(qū)在小鼠上完整時(shí)將其拍照。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死一些小鼠，將移植區(qū)及其周圍沿鼠皮膚邊緣切下至少達(dá)肌層。每份標(biāo)本保留移植物與鼠皮膚的連接。然后將外植的組織標(biāo)本在磷酸鹽緩沖的10％福爾馬林中固定并于甲醇中固定。按照實(shí)施例1所述方法將福爾馬林固定的標(biāo)本作H&E染色。移植物能與鼠皮膚融為一體，表現(xiàn)出最輕微收縮。在移植14天，鼠的表皮已經(jīng)完全遷移過移植物。使用H&E染色的標(biāo)本，在14天時(shí)移植物上血管明顯可見，并貫穿試驗(yàn)全程。在實(shí)驗(yàn)全程中，經(jīng)過總體觀察和H&E染色的標(biāo)本，可斷定看起來(lái)能持久存留于皮膚并保持健康的移植物含有活細(xì)胞，無(wú)總體基質(zhì)的異常等。
實(shí)施例8完整厚度皮膚構(gòu)建物作為皮膚移植物的應(yīng)用如實(shí)施例2所述，用新生期包皮真皮層的人真皮成纖維細(xì)胞和另一新生期包皮表皮層的人角質(zhì)細(xì)胞制備雙層皮膚構(gòu)建物。不需載體支持處理能使所述皮膚構(gòu)建物從膜上手工脫離，并將其放置在移植部位。將雙層皮膚構(gòu)建物移植到無(wú)胸腺裸鼠的完全切除傷口上。按照Parenteau等(1996)所述方法移植給小鼠，其內(nèi)容在此引入以作參考。取標(biāo)本的時(shí)間點(diǎn)為移植后7，14，28，56，和184天。當(dāng)移植區(qū)在小鼠上完整時(shí)將其拍照。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死一些小鼠，將移植區(qū)及其周圍沿鼠皮膚邊緣切下至少達(dá)肌層。每份標(biāo)本保留移植物與鼠皮膚的連接。然后將外植的組織標(biāo)本在磷酸鹽緩沖的10％福爾馬林中固定并于甲醇中固定。按照實(shí)施例1所述方法將福爾馬林固定的標(biāo)本作H&E染色。
通過大體觀察和組織學(xué)表現(xiàn)顯示在7天內(nèi)移植物與宿主組織融為一體。通過H&E染色，在移植7天內(nèi)可見血管從宿主組織長(zhǎng)入移植物。整個(gè)試驗(yàn)期間移植物保持健康并且持久停留于皮膚上，呈最輕微的收縮。利用抗人Involucrin染色發(fā)現(xiàn)整個(gè)移植期人的表皮細(xì)胞持久停留。
實(shí)施例9用人的角膜角質(zhì)細(xì)胞體外形成基質(zhì)在角膜的基質(zhì)構(gòu)建物生產(chǎn)中使用人角膜角質(zhì)細(xì)胞(來(lái)自O(shè)rganognesis，Inc.，Canton，MA)。將人角質(zhì)細(xì)胞的融合培養(yǎng)物用胰蛋白酶-維爾烯從其培養(yǎng)基質(zhì)上消化下來(lái)。消化下來(lái)后，使用大豆胰蛋白酶抑制劑中和胰蛋白酶-維爾烯，將細(xì)胞懸液離心，棄去上清然后將細(xì)胞在基本培養(yǎng)基中重懸使?jié)舛冗_(dá)3×106個(gè)細(xì)胞/ml。在六孔板中以3.0×106個(gè)細(xì)胞/TW(6.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2)的密度接種于孔徑為0.4μm，直徑為24mm的組織培養(yǎng)處理的transwell上。將這些培養(yǎng)物在接種培養(yǎng)基中過夜。接種培養(yǎng)基包含DMEM和HamsF-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD cat.)3∶1的基本混合物，4mMGlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，紐約)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(Upstate Biotechnology Lake Placid，紐約)，0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約，分析純)，1×10-4M鄰磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich FineChemicals Co.，Milwaukee，WI)。此后將培養(yǎng)物用新鮮的生產(chǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)。生產(chǎn)培養(yǎng)基包含DMEM和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality BiologicsGaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，GrandIsland，紐約)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(Upstate BiotechnologyLake Placid，紐約)，2％新生小牛血清(HyClone，Logan，Utah)，0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約分析純)，1×10-4M鄰磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich FineChemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗壞血酸(WAKO ChemicalsUSA，Inc.#013-12061)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))。
將細(xì)胞在10％±1％CO2，37±1℃的培養(yǎng)箱中保溫并且每隔2-3天更換新鮮生產(chǎn)培養(yǎng)基，持續(xù)20天(總計(jì)培養(yǎng)21天)。培養(yǎng)21天后，用實(shí)施例1所述方法測(cè)量顯示，角質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)沉積為約40微米厚的基質(zhì)層。在該細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物中也存在內(nèi)源產(chǎn)生的纖絲膠原，decorin和糖胺聚糖。
實(shí)施例10用接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基的人新生期包皮成纖維細(xì)胞體外形成膠原基質(zhì)將人新生期包皮成纖維細(xì)胞(來(lái)自O(shè)rganognesis，Inc.，Canton，MA)在六孔板(TRANSWELL，Costar Corp.Cambridge，MA)上以1×105個(gè)細(xì)胞/ml 0.4微米孔徑、24mm直徑之組織培養(yǎng)處理載體接種，并在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型，無(wú)L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％新生小牛血清(HyClone實(shí)驗(yàn)室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。將細(xì)胞置于10±1％CO2，37±1℃的培養(yǎng)箱中。每?jī)傻饺旄鼡Q培養(yǎng)基。培養(yǎng)9天后，從培養(yǎng)皿上吸除培養(yǎng)基，并換成生產(chǎn)培養(yǎng)基。將細(xì)胞在10％±1％CO2和37±1℃的培養(yǎng)箱中保溫并且每隔2-3天更換新鮮生產(chǎn)培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)21天。生產(chǎn)培養(yǎng)基包含DMEM和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mMGlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，紐約)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，紐約)，2％新生小牛血清(HyClone，Logan，Utah)，0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約，分析純)，1×10-4M鄰磷?；掖及?Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰島索(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗壞血酸(WAKO Pure Chemical Company)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))。
于第21天取標(biāo)本并福爾馬林固定，石蠟包埋。將福爾馬林固定的標(biāo)本包埋于石蠟中并取5μm按本領(lǐng)域已知方法用蘇木精-伊紅(H&E)染色。使用H&E染色切片，隨機(jī)挑選10個(gè)顯微鏡視野利用裝有10mm/100測(cè)微計(jì)網(wǎng)格(Olympus America Inc.，Melville，紐約)的10×目鏡(Olympus AmericaInc.，Melville，紐約)測(cè)量。用此方法生成的構(gòu)建物具有類似于實(shí)施例1所生成構(gòu)建物的結(jié)構(gòu)和生化組成，其厚度為82.00±7.64微米。
實(shí)施例11用豬真皮成纖維細(xì)胞體外形成膠原基質(zhì)將豬真皮成纖維細(xì)胞(來(lái)自O(shè)rganognesis，Inc.Canton，MA)按5×105個(gè)細(xì)胞/162cm2組織培養(yǎng)處理瓶(Costar Corp.，劍橋，MA，批號(hào)3150)接種于并在下述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型，無(wú)L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％胎牛血清(HyClone實(shí)驗(yàn)室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。將細(xì)胞置于10±1％CO2，37±1℃的培養(yǎng)箱中。每?jī)傻饺旄鼡Q培養(yǎng)基。當(dāng)融合即細(xì)胞沿組織培養(yǎng)瓶的底部形成緊密的一層后，從培養(yǎng)瓶中將培養(yǎng)基吸出。將無(wú)菌過濾的磷酸鹽緩沖液加到每個(gè)培養(yǎng)瓶的底部以沖洗單細(xì)胞層，然后從瓶中吸出。向每個(gè)瓶中加入5mL胰蛋白酶-維爾烯谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)并輕輕搖動(dòng)以確保完全覆蓋單細(xì)胞層以使細(xì)胞從瓶上消化下來(lái)。將培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱。一旦細(xì)胞被消化下來(lái)立即向每個(gè)瓶中加入5mlSBTI(大豆胰蛋白酶抑制劑)并與懸浮液混合使胰蛋白酶-維爾烯的作用終止。將細(xì)胞混懸液從瓶中移出并均分入無(wú)菌圓錐形離心管中。于大約800-1000g離心5分鐘收集細(xì)胞。將細(xì)胞重懸并稀釋至濃度為3.0×106個(gè)細(xì)胞/ml，并在六孔板中以3.0×106個(gè)細(xì)胞/TW(6.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2)的密度接種于孔徑0.4μm，直徑為24mm的組織培養(yǎng)處理的transwell上。將細(xì)胞在接種培養(yǎng)基上維持過夜。接種培養(yǎng)基的組成為DMEM和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD cat.)3∶1的基本混合物，4mMGlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，紐約)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，紐約)，0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約分析純)，1×10-4M鄰磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine ChemicalsCo.，Milwankee，WI)，50ng/ml L-抗壞血酸(WAKO Pure Chemical Company)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)。將細(xì)胞置于10±1％CO2，37±1℃的培養(yǎng)箱中并且每?jī)傻饺煊眯迈r的生產(chǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)持續(xù)7天。生產(chǎn)培養(yǎng)基的組成為DMEM和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mMGlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，紐約)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，紐約)，2％新生小牛血清(HyClone，Logan，Utah)，0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約，分析純)，1×10-4M鄰磷?；掖及?Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗壞血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.# 013-12061)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))。7天后將培養(yǎng)基換成無(wú)新生小牛血清的生產(chǎn)培養(yǎng)基。每2-3天將培養(yǎng)基換液再持續(xù)20天，總計(jì)培養(yǎng)28天。
于第21天取材并福爾馬林固定，石蠟包埋。將福爾馬林固定的標(biāo)本包埋于石蠟中并取5μm按本領(lǐng)域習(xí)慣使用的技術(shù)用蘇木精-伊紅(H&E)染色。使用H＆E染色切片，隨機(jī)挑選10個(gè)顯微鏡視野利用裝有10mm/100測(cè)微計(jì)網(wǎng)格(Olympus AmericaInc.，Melville，紐約)的10×目鏡(Olympus AmericaInc.，Melville，紐約)測(cè)量。標(biāo)本顯示由細(xì)胞和基質(zhì)組成的厚度為71.20±9.57微米的結(jié)構(gòu)。除內(nèi)源產(chǎn)生的纖絲膠原外，在該細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物中也存在decorin和糖胺聚糖。
實(shí)施例12體外形成含真皮乳頭細(xì)胞的雙層皮膚構(gòu)建物用人新生期包皮成纖維細(xì)胞作為第一基質(zhì)生產(chǎn)型細(xì)胞按實(shí)施例1的方法制造細(xì)胞基質(zhì)。在該細(xì)胞基質(zhì)局部點(diǎn)種真皮乳頭細(xì)胞作為第二細(xì)胞群，再在第二細(xì)胞群上接種角質(zhì)細(xì)胞作為第三細(xì)胞群，從而在所述細(xì)胞基質(zhì)和真皮乳頭上形成連續(xù)的表皮層。
首先，用人的新生期包皮皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物。通過將HDF以5×105個(gè)細(xì)胞/162cm2組織培養(yǎng)處理瓶(Costar Corp.，劍橋，MA)接種于生長(zhǎng)培養(yǎng)基使其擴(kuò)增，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型，無(wú)L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％新生小牛血清(NBCS)(HyClone實(shí)驗(yàn)室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。當(dāng)融合后，用胰蛋白酶-維爾烯將HDF從瓶上消化下來(lái)并用新鮮培養(yǎng)基重懸至濃度為3.0×106個(gè)細(xì)胞/ml，在六孔板中以3.0×106個(gè)細(xì)胞/插條(6.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2)的密度接種于孔徑為0.4μm，直徑為24mm的組織培養(yǎng)處理的插條(TRANSWELL，Coring Costar)上。按照實(shí)施例1詳述的方法將HDF培養(yǎng)物置于10±l％CO2，37±1℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每?jī)傻饺旄鼡Q新鮮的生產(chǎn)培養(yǎng)基，持續(xù)23天。
在細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物形成后，在其上點(diǎn)種真皮乳頭細(xì)胞作為第二細(xì)胞群。真皮乳頭細(xì)胞是特化的成纖維細(xì)胞的分散群體，其被毛囊的發(fā)根包圍，可支持毛發(fā)生長(zhǎng)。通過顯微解剖毛囊和用前面Messenger，A.G.，人毛囊的真皮乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)，Br.J.Dermatol.110685-9(1984)所述方法在體外培養(yǎng)可以分離真皮乳頭，該培養(yǎng)方法在此引入以作參考。當(dāng)真皮乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)物達(dá)融合時(shí)可形成聚集體，將其再鋪入培養(yǎng)瓶中可以再形成新聚集體。從4周齡豬的皮膚活檢物上分離真皮乳頭。將真皮乳頭(PDP)細(xì)胞在含20％NBCS的DMEM上連續(xù)培養(yǎng)至第8代。培養(yǎng)3周后，PDP細(xì)胞形成真皮乳頭樣結(jié)構(gòu)，或聚集體，其每個(gè)直徑約90-210微米。然后用移液管強(qiáng)力吸取培養(yǎng)基使聚集體與培養(yǎng)基分離，然后將聚集體以200聚集體/cm2的密度接種在人膠原基質(zhì)上。在DMEM 20％NBCS中將聚集體另浸沒培養(yǎng)15天，每2-3天用新鮮培養(yǎng)基更換舊培養(yǎng)基。
在含有真皮乳頭細(xì)胞的細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)物上接種角質(zhì)細(xì)胞并培養(yǎng)，從而在細(xì)胞基質(zhì)和真皮乳頭上形成連續(xù)的表皮層。制備兩種不同的構(gòu)建物第一種用人角質(zhì)細(xì)胞，第二種用豬角質(zhì)細(xì)胞。從人新生期包皮(HEP)，或從豬角質(zhì)細(xì)胞(PEP)分離正常表皮角質(zhì)細(xì)胞，用外植塊生長(zhǎng)建立原代培養(yǎng)。然后將豬的細(xì)胞擴(kuò)增至第3代，將人的細(xì)胞擴(kuò)增至第4代。約培養(yǎng)5-6天后，用胰蛋白酶-維爾烯將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來(lái)，混合，離心以形成沉淀，在表皮化培養(yǎng)基中重懸，計(jì)數(shù)并以HEP為4.5×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度或PEP為1.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于膜的上表面。如前面實(shí)施例2所述將表皮化培養(yǎng)物培養(yǎng)12天。
取最終標(biāo)本做蘇木精伊紅染色，光鏡鏡檢。所得皮膚構(gòu)建物顯示出與皮膚相似的基本形態(tài)構(gòu)成由成纖維細(xì)胞及其周圍的內(nèi)源生基質(zhì)構(gòu)成的真皮層，局部的真皮乳頭細(xì)胞區(qū)，穿過該細(xì)胞-基質(zhì)層的連續(xù)、分層式角質(zhì)細(xì)胞層和真皮乳頭，其中所述內(nèi)源生基質(zhì)包括內(nèi)源生纖絲膠原，decorin和糖胺聚糖。在覆蓋有人或豬角質(zhì)細(xì)胞的兩種組織構(gòu)建物中，真皮乳頭保持緊密的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可引起其上覆蓋的上皮出現(xiàn)小的起伏。分化的上皮細(xì)胞經(jīng)常出現(xiàn)在真皮乳頭細(xì)胞附近。
實(shí)施例13用夾心法ELISA檢測(cè)透明質(zhì)酸在分別按照實(shí)施例1和3的方法于含血清的培養(yǎng)基和化學(xué)確定的培養(yǎng)基中由真皮成纖維細(xì)胞形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物中檢測(cè)透明質(zhì)酸(HA)。
在直徑75mm的結(jié)合有多孔膜(TRANSWELL，Corning Costar)的圓形載體上形成細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物。通過向含有細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的試管中加入10ml醋酸銨緩沖液和0.5mg/ml蛋白酶K來(lái)制備所述細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的提取物。所述混合物在60℃保存過夜。完全消化后，將混合物離心并將上清提取物轉(zhuǎn)移到用于測(cè)定透明質(zhì)酸的另一試管中。96孔板用20μg/ml HA結(jié)合蛋白的0.1M NaHCO3溶液50μl包被并于4℃過夜。然后將此平板用含0.05％吐溫20的0.85％NaCl洗三次。每孔加250μl封閉溶液(磷酸鈉緩沖液，10mM，，pH＝7.4，含有3％BSA和0.9％NaCl，PBS＋3％BSA)，將平板于室溫保持2h。然后將此平板用含有0.05％吐溫20的0.85％NaCl洗三次。平板中加入標(biāo)準(zhǔn)HA溶液50μl以及在兩種試驗(yàn)條件(包括這些條件的各種稀釋度)下的提取物。將平板在室溫(約20℃)保溫2h，然后用含有0.05％吐溫20的0.85％NaCl洗三次，向平板中加入生物素化的HA(1∶2000稀釋)50μl并于室溫保持2h。然后將平板用含有0.05％吐溫20的0.85％NaCl洗三次，每孔加50μl的HRP-親和素D(1∶3000稀釋)。然后將平板于室溫保溫45分鐘。再將平板用含有0.05％吐溫20的0.85％NaCl洗三次，每孔加100μl鄰苯二胺底物溶液。將平板在37℃保溫10分鐘。加50μl的1M HCl終止反應(yīng)。最后，用酶標(biāo)儀，在492nm讀取光吸收值并記錄。
將光吸收值取均值并轉(zhuǎn)換成定量值。在含血清培養(yǎng)基中形成的圓形細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物經(jīng)測(cè)定每個(gè)含透明質(zhì)酸約200μg，在化學(xué)確定的培養(yǎng)基中形成的每個(gè)含透明質(zhì)酸約1.5mg。
實(shí)施例14所產(chǎn)生的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的物理測(cè)試和機(jī)械特性實(shí)施例1(細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物)，實(shí)施例2(其上帶有角質(zhì)細(xì)胞層的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物)，和實(shí)施例3(在化學(xué)確定的培養(yǎng)基中形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物)的組織構(gòu)建物的機(jī)械特性用膜膨脹試驗(yàn)定量檢測(cè)。這些實(shí)驗(yàn)與用于臨床的試驗(yàn)(例如Dermaflex，Cyberderm Inc.，Media，PA，和Cutameter，CourageKhazaka，Cologne，Germany)相似但有更強(qiáng)的壓力包括能使膜破裂的壓力。將細(xì)胞基質(zhì)標(biāo)本平放于聚碳酸酯板上，該板位于充滿張力正常之鹽水的直徑10mm柱形孔中心。在標(biāo)本上放置一塊金屬板，此板有一圓孔直徑與所述柱形孔相符，使該金屬板與聚碳酸酯板夾緊。然后用注射泵向孔中注入額外的鹽水使標(biāo)本膨脹。通過壓力傳感器測(cè)量所達(dá)壓力。加壓直至裝置受損，破裂強(qiáng)度在用實(shí)施例1的方法產(chǎn)生的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物上平均為439.02mm Hg；在用實(shí)施例2的方法產(chǎn)生的帶有角質(zhì)細(xì)胞層的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物標(biāo)本上平均為998.52mm Hg；在用實(shí)施例3的方法于化學(xué)確定的培養(yǎng)基上產(chǎn)生的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物標(biāo)本上平均為1542.26 mmHg。
為判定真皮基質(zhì)的熔點(diǎn)，將在21天取材的標(biāo)本(細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物)按照實(shí)施例1程序制備。通過使用Mettler Toledo(Highston，NJ)差示掃描測(cè)熱儀(DSC產(chǎn)品，批號(hào)DSC12E)分析來(lái)判定標(biāo)本的變性溫度。為了我們的目的，通過將標(biāo)本以1℃/分鐘的速率從45℃加熱到80℃來(lái)判定熔化溫度。標(biāo)本的平均變性溫度為60.8±1.2℃(n＝3)。
檢測(cè)按實(shí)施例1(細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物)和3(在化學(xué)確定的培養(yǎng)基中形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物)產(chǎn)生的表皮基質(zhì)的縫線保持和牽拉強(qiáng)度，從而判定特定臨床情況下構(gòu)建物的可縫合性。根據(jù)關(guān)于血管移植修復(fù)術(shù)的美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)出版物中所述方法(Instruments，1986)使用Mini-Bionex858試驗(yàn)系統(tǒng)(MTSsystems Corporation，Minneapolis，Minn.)判定21天齡的人真皮基質(zhì)的縫線保持強(qiáng)度。
經(jīng)測(cè)定，實(shí)施例1的標(biāo)本(細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物)可伸展強(qiáng)度為365N/m；按照實(shí)施例2制備的標(biāo)本(帶有角質(zhì)細(xì)胞層的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物)，可伸展強(qiáng)度為2720N/m。
按照實(shí)施例1制備的標(biāo)本縫縫線保持強(qiáng)度為0.14N；實(shí)施例2所得標(biāo)本的為0.22N。
將如實(shí)施例1，2和3所述生成的構(gòu)建物制成直徑24mm和75mm兩種。用三種培養(yǎng)方法制得的構(gòu)建物帶有組織樣結(jié)構(gòu)，可用微小的力輕易使它們從膜上脫離，因此為“可脫離的”，并且使用和檢測(cè)時(shí)可物理操作而不發(fā)生損傷。
實(shí)施例15在化學(xué)確定的培養(yǎng)基中用人新生期包皮成纖維細(xì)胞形成膠原基質(zhì)用實(shí)施例1所述方法擴(kuò)增人新生期包皮成纖維細(xì)胞。然后將細(xì)胞重懸使?jié)舛葹?×106個(gè)細(xì)胞/ml，并在六孔板中以3.0×106個(gè)細(xì)胞/TW(6.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2)的密度接種于孔徑為0.4μm，直徑為24mm的組織培養(yǎng)處理的膜插條上。本實(shí)施例全程中，細(xì)胞在化學(xué)確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
所述培養(yǎng)基包含DMEM和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality BiologicsGaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，GrandIsland，紐約)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(Upstate BiotechnologyLake Placid，紐約)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約，#02400分析純)，1×10-4M鄰磷?；掖及?Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/mlL-抗壞血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)。
向上述基本培養(yǎng)基中添加其它成分，條件分別如下1.5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO)。
2.5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)。
3.375μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，6μg/ml氫化可的松(SigmaSt.Louis，MO)。
標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定，蘇木精-伊紅染色，以便光學(xué)顯微鏡分析。組織學(xué)觀察證實(shí)，由缺乏PEG的條件2產(chǎn)生的基質(zhì)與有PEG的條件1產(chǎn)生的基質(zhì)相似。所述構(gòu)建物膠原含量的生化分析顯示，兩者膠原量幾乎相同有PEG的條件1為168.7±7.98μg/cm2，無(wú)PEG的條件2為170.88±9.07μg/cm2。含有高水平胰島素和氫化可的松的條件3在比其他兩種條件早的時(shí)間點(diǎn)上顯示出基質(zhì)，包括膠原的高表達(dá)。除了內(nèi)源產(chǎn)生的纖絲膠原外，decorin和糖胺聚糖也存在于各種條件下的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物中。本實(shí)施例中用條件2的方法形成的培養(yǎng)型皮膚構(gòu)建物如圖2所示。圖2是人真皮成纖維細(xì)胞于化學(xué)確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天，形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物切片經(jīng)固定、石蠟包埋、蘇木精-伊紅染色的顯微照片。多孔膜表現(xiàn)為構(gòu)建物下方的窄透明帶，細(xì)胞生長(zhǎng)在膜表面，并未被帶有基質(zhì)的膜整個(gè)包埋。
圖3顯示用本實(shí)施例中條件2的方法于21天形成的真皮構(gòu)建物培養(yǎng)物兩種分辨率的透射電子顯微鏡(TEM)圖像。圖3A為7600×分辨率，顯示在成纖維細(xì)胞之間內(nèi)源膠原纖絲的排列。圖3B為19000×分辨率，顯示完整成形的內(nèi)源膠原纖絲，其證明纖絲排列和包裹。
在本實(shí)施例的所有條件下，所形成的培養(yǎng)的真皮構(gòu)建物包括皮膚成纖維細(xì)胞和內(nèi)源產(chǎn)生的基質(zhì)。它們均含有于細(xì)胞間包裹排列的完整成形的膠原纖絲。它們的纖維性質(zhì)，厚度，和所具整體性賦予該構(gòu)建物相當(dāng)大的強(qiáng)度從而可將它從膜上脫離并移走，當(dāng)轉(zhuǎn)移給接受該構(gòu)建物的患者(如在移植物或植入物中)可進(jìn)行處理。
實(shí)施例16完整厚度的皮膚構(gòu)建物將正常人新生期包皮的表皮角質(zhì)細(xì)胞接種于細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的上表面以形成皮膚構(gòu)建物的表皮層，所述構(gòu)建物是根據(jù)實(shí)施例15條件2(無(wú)PEG)的方法在化學(xué)確定的條件下，對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)21天形成的皮膚構(gòu)建物。
從培養(yǎng)物插條和其周圍無(wú)菌去除培養(yǎng)基。將正常人表皮角質(zhì)細(xì)胞從細(xì)胞凍存株傳4代至融合。然后用胰蛋白酶-維爾烯將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來(lái)，混合，離心以形成細(xì)胞沉淀，在表皮化培養(yǎng)基中重懸，計(jì)數(shù)并按4.5×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于膜的上表面。然后將此構(gòu)建物在37±1℃，10±1％CO2條件下保溫90分鐘以允許角質(zhì)細(xì)胞貼壁。保溫后，將這些構(gòu)建物浸沒到表皮化培養(yǎng)基中。表皮化培養(yǎng)基含有Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(不含葡萄糖和鈣，BioWhittaker，Walkersville，MD)和HamsF-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，加有0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約)，1×10-4M鄰磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，50μg/ml L-抗壞血酸鈉鹽(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，16μM亞油酸(Sigma St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸慶大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。將所述構(gòu)建物在37±1℃，10±1％CO2的表皮化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。
2天后將培養(yǎng)基更換成成分同上的新鮮培養(yǎng)基，并再放回設(shè)置為37±1℃，10±1％CO2的培養(yǎng)箱中保持2天。2天后將含有構(gòu)建物的載體無(wú)菌轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)板上，板中所含培養(yǎng)基足以使液面恰至載體膜表面，從而使生長(zhǎng)中的構(gòu)建物維持在氣-液界面?？諝饨佑|形成中的表皮層上表面可以使上皮層分層。將這些構(gòu)建物在37±1℃，10％CO2，和低濕度條件下保溫，每隔2-3天更換培養(yǎng)基，持續(xù)7天。此培養(yǎng)基包含Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型，無(wú)L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)1∶1的混合物，加有0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，5×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約)，5×10-4M鄰磷?；掖及?Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰島素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(SigmaAldrch Fine Chemicals Company)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich FineChemicals Company)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，2.65μg/ml氯化鈣(Mallinckrodt，Chesterfield，MO)，16μM亞油酸(Sigma St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma St.Louis，MO)，1.25mM絲氨酸(SigmaSt.Louis，MO)，0.64mM膽堿鹽酸鹽(Sigma St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸慶大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。將培養(yǎng)物培養(yǎng)14天，每2-3天更換培養(yǎng)基。
取出將構(gòu)建物提升到氣-液界面后10天，12天，和14天的標(biāo)本，一式三份，按照實(shí)施例1中所述方法進(jìn)行蘇木精伊紅染色以在光鏡下判定總體形態(tài)。所得構(gòu)建物包括由真皮成纖維細(xì)胞及周圍包繞的基質(zhì)構(gòu)成的底層真皮層，其上層為分層且已分化的角質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的上層表皮層。本實(shí)施例的雙層皮膚構(gòu)建物如圖4所示。圖4是培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建物的切片經(jīng)固定，石蠟包埋，蘇木精伊紅染色的顯微照片，該構(gòu)建物形成于缺乏外源基質(zhì)成分的化學(xué)確定的培養(yǎng)基，該構(gòu)建物包括由培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞在化學(xué)確定的培養(yǎng)基上形成的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物，以及由培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞在化學(xué)確定的培養(yǎng)基上形成的多層、已分化的表皮。
實(shí)施例17用人面頰成纖維細(xì)胞形成膠原基質(zhì)本實(shí)驗(yàn)的目的是用由人面頰組織分離的面頰成纖維細(xì)胞生產(chǎn)細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物。將面頰于T-150瓶?jī)?nèi)含10％NBCS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。7天后，為進(jìn)一步擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)，收獲面頰細(xì)胞并以4.0×106細(xì)胞轉(zhuǎn)移至9個(gè)T-150瓶中含10％NBCS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至融合時(shí)收獲細(xì)胞。
為收獲細(xì)胞，從培養(yǎng)瓶中吸出培養(yǎng)基。向每個(gè)培養(yǎng)瓶底部加入經(jīng)無(wú)菌過濾的磷酸鹽緩沖液以中洗單細(xì)胞層，然后從瓶中吸出。向每個(gè)瓶中加入5mL胰蛋白酶-維爾烯谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)并輕輕搖動(dòng)以確保完全覆蓋單細(xì)胞層，從而使細(xì)胞從瓶上消化下來(lái)。將培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱。一旦細(xì)胞被消化下來(lái)立即向每個(gè)瓶中加入5ml SBTI(大豆胰蛋白酶抑制劑)并與懸浮液混合使胰蛋白酶-維爾烯的作用終止。將細(xì)胞混懸液從瓶中移出并均分入無(wú)菌圓錐形離心管中。于大約800-1000g離心5分鐘收集細(xì)胞。
用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸至濃度為3.0×106個(gè)細(xì)胞/ml，并在六孔板中以3.0×106個(gè)細(xì)胞/插條(6.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2)的密度接種于孔徑為0.4μm，直徑為24mm的組織培養(yǎng)處理插條(TRANSWELL，Coming Costar)上。將細(xì)胞置于10±1％CO2，37±1℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基含有DMEM和Hams F-12培養(yǎng)基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，紐約)和添加劑5ng/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，紐約)，0.4μg/ml氫化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，紐約#02400分析純)，1×10-4M鄰磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰島素(SigmaSt.Louis，MO)，5μg/ml運(yùn)鐵蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲狀腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine ChemicalsCo.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗壞血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO)。
接種1天后，將培養(yǎng)基換成無(wú)血清的生產(chǎn)培養(yǎng)基，每2-3天換液持續(xù)21天。于21天，將標(biāo)本固定于福爾馬林中以便組織學(xué)分析。三份標(biāo)本用于蛋白和膠原產(chǎn)量的分析。
培養(yǎng)21天后的直徑24mm的構(gòu)建物，膠原產(chǎn)量平均為每構(gòu)建物519μg，總蛋白質(zhì)產(chǎn)量平均為每構(gòu)建物210μg。形態(tài)學(xué)上，面頰成纖維細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物(一種口腔結(jié)締組織的培養(yǎng)型組織構(gòu)建物)顯示由基質(zhì)圍繞的面頰成纖維細(xì)胞，在物理學(xué)上，該構(gòu)建物具有較大體積和完整性。
以上發(fā)明通過舉例說明和實(shí)施例詳述以便明確理解，但顯然對(duì)于本領(lǐng)于技術(shù)人員來(lái)說，在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)可進(jìn)行特定的變化和修飾。
權(quán)利要求
1.一種含成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)的組織構(gòu)建物，所述成纖維細(xì)胞在產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)層的條件下生長(zhǎng)，所述細(xì)胞外基質(zhì)由培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞合成并裝配，培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞包含在所述合成的細(xì)胞外基質(zhì)層內(nèi)，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)包括(i)纖絲膠原，其顯示纖絲和纖絲束的緊密排列，為垂直交錯(cuò)的67nm帶狀；(ii)decorin；和(iii)糖胺聚糖；且其中所述細(xì)胞外基質(zhì)由培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)條件下在缺乏外源基質(zhì)成分或合成的成分時(shí)產(chǎn)生。
2.權(quán)利要求1的培養(yǎng)的組織構(gòu)建物，其中成纖維細(xì)胞來(lái)自選自下組的組織新生男嬰包皮，真皮，腱，肺，尿道，臍帶，角膜基質(zhì)，口腔粘膜，和腸。
3.權(quán)利要求1的培養(yǎng)的組織構(gòu)建物，其中所述培養(yǎng)的細(xì)胞為真皮成纖維細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的培養(yǎng)的組織構(gòu)建物，其中所述培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)自毛囊的真皮乳頭。
5.權(quán)利要求1的培養(yǎng)的組織構(gòu)建物，其中所述層具有來(lái)自毛囊的真皮乳頭的培養(yǎng)細(xì)胞，它們定位于該層。
6.權(quán)利要求1的培養(yǎng)的組織構(gòu)建物，其中所述培養(yǎng)細(xì)胞在化學(xué)確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
7.權(quán)利要求1的培養(yǎng)的組織構(gòu)建物，其中所述培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)自人的組織并在不含非人成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
8.一種含培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)的組織構(gòu)建物，所述成纖維細(xì)胞在產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)層的條件下生長(zhǎng)，所述細(xì)胞外基質(zhì)由培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞合成并裝配，所述培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞包含在所述合成的細(xì)胞外基質(zhì)層內(nèi)，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)包括(i)纖絲狀I(lǐng)型和II型膠原，其顯示纖絲和纖絲束的緊密排列，為垂直交錯(cuò)的67nm帶狀；(ii)decorin，(iii)纖連蛋白，(iv)腱生蛋白；和(v)糖胺聚糖；且其中所述細(xì)胞外基質(zhì)由培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)條件下在缺乏外源基質(zhì)成分或合成的成分時(shí)產(chǎn)生。
9.一種培養(yǎng)的組織構(gòu)建物，其至少有2層，其包括(a)第一層培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，其在產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)層的條件下生長(zhǎng)，所述細(xì)胞外基質(zhì)由培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞合成并裝配，所述培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞包含在所述合成的細(xì)胞外基質(zhì)層內(nèi)，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)包括(i)纖絲膠原，其顯示纖絲和纖絲束的緊密排列，為垂直交錯(cuò)的67nm帶狀；(ii)decorin；和(iii)糖胺聚糖；其中所述細(xì)胞外基質(zhì)由培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)條件下在缺乏外源基質(zhì)成分或合成的成分時(shí)產(chǎn)生；和(b)第二層細(xì)胞，其含有處于所述第一層上的上皮細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的培養(yǎng)的雙層組織構(gòu)建物，其中所述上皮細(xì)胞選自角質(zhì)細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、口腔粘膜的上皮細(xì)胞、食道上皮細(xì)胞、和尿道上皮細(xì)胞。
11.權(quán)利要求9的培養(yǎng)的雙層組織構(gòu)建物，其中所述包含在該第一層中的成纖維細(xì)胞衍生自選自下組的組織新生男嬰包皮，真皮，腱，肺，軟骨，尿道，角膜基質(zhì)，口腔粘膜，和腸。
12.權(quán)利要求9的培養(yǎng)的雙層組織構(gòu)建物，其中所述包含在該第一層中的成纖維細(xì)胞為皮成纖維細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的培養(yǎng)的雙層組織構(gòu)建物，其中所述包含在該第一層中的成纖維細(xì)胞來(lái)自毛囊的真皮乳頭。
14.權(quán)利要求9的培養(yǎng)的雙層組織構(gòu)建物，其中所述第一層具有來(lái)自毛囊真皮乳頭的培養(yǎng)的細(xì)胞，它們定位于該第一層上。
15.權(quán)利要求9的培養(yǎng)的雙層組織構(gòu)建物，還包括位于所述第二層上皮細(xì)胞上的第三層細(xì)胞。
16.一種培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建物，其至少有2層，其包含(a)第一層培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞，其在產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)層的條件下生長(zhǎng)，所述細(xì)胞外基質(zhì)由所述培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞合成并裝配，所述培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞包含在所述合成的細(xì)胞外基質(zhì)層內(nèi)，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)包括(i)I型和II型膠原，其顯示纖絲和纖絲束的緊密排列，為垂直交錯(cuò)的67nm帶狀；(ii)decorin，(iii)纖連蛋白，(iv)腱生蛋白；和(v)糖胺聚糖；且其中所述細(xì)胞外基質(zhì)由所述培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)條件下在缺乏外源基質(zhì)成分或合成的成分時(shí)產(chǎn)生；和(b)第二層角質(zhì)細(xì)胞，其位于第一層上，形成一個(gè)表皮細(xì)胞層，其中所述表皮細(xì)胞層為多層、分層的已分化層，并表現(xiàn)為基底層、基底上層、立方上皮層和角質(zhì)層；且其中所述培養(yǎng)的雙層皮膚構(gòu)建物在該第一和第二層之間的連接處有一基底膜。
17.權(quán)利要求1，8，9，和16中任一項(xiàng)的構(gòu)建物，其中所述培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞受到遺傳修飾以產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分。
18.權(quán)利要求17的構(gòu)建物，其中所述培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞受到遺傳修飾以產(chǎn)生生長(zhǎng)因子、激素、肽、或蛋白質(zhì)。
19.一種產(chǎn)生培養(yǎng)的組織構(gòu)建物的方法，其包括(a)在培養(yǎng)容器中的多孔膜上，于第一細(xì)胞培養(yǎng)基中接種能合成細(xì)胞外基質(zhì)的成纖維細(xì)胞；(b)于所述第一細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(a)的成纖維細(xì)胞，使所述多孔膜上的細(xì)胞融合達(dá)到約80％-約100％；(c)在培養(yǎng)條件下刺激所述成纖維細(xì)胞在第二培養(yǎng)基中合成、分泌并排列細(xì)胞外基質(zhì)成分；和(d)繼續(xù)培養(yǎng)這些成纖維細(xì)胞，直至這些細(xì)胞合成至少約30μM厚的細(xì)胞外基質(zhì)層，所述培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞包含在該合成的細(xì)胞外基質(zhì)層中，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)層包括(i)纖絲膠原，其顯示纖絲和纖絲束的緊密排列，為垂直交錯(cuò)的67nm帶狀；(ii)decorin；和(iii)糖胺聚糖；且其中所述細(xì)胞外基質(zhì)由培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)條件下在缺乏外源基質(zhì)成分或合成的成分時(shí)產(chǎn)生。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述第一培養(yǎng)基，或所述第二培養(yǎng)基為化學(xué)確定的培養(yǎng)基，或這兩種培養(yǎng)基均為化學(xué)確定的培養(yǎng)基。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述第一和第二培養(yǎng)基不含非人的成分。
22.權(quán)利要求19的方法，其中步驟(a)的成纖維細(xì)胞以約1×105個(gè)細(xì)胞/cm2-約6.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述成纖維細(xì)胞衍生自選自下組的組織新生男嬰包皮，臍帶，真皮，腱，肺，尿道，角膜基質(zhì)，口腔粘膜，和腸。
24.一種產(chǎn)生培養(yǎng)的雙層組織構(gòu)建物的方法，其包括(a)在培養(yǎng)容器中的多孔膜上，于第一細(xì)胞培養(yǎng)基中接種能合成細(xì)胞外基質(zhì)的成纖維細(xì)胞；(b)于所述第一細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(a)的成纖維細(xì)胞，使所述多孔膜上的細(xì)胞融合達(dá)到約80％-約100％；(c)在培養(yǎng)條件下刺激所述成纖維細(xì)胞在第二培養(yǎng)基中合成、分泌并排列細(xì)胞外基質(zhì)成分；和(d)繼續(xù)培養(yǎng)這些成纖維細(xì)胞，直至這些細(xì)胞合成約30μM-約110μM厚的細(xì)胞外基質(zhì)層，所述培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞包含在該合成的細(xì)胞外基質(zhì)層中，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)層包括(i)纖絲膠原，其顯示纖絲和纖絲束的緊密排列，為垂直交錯(cuò)的67nm帶狀；(ii)decorin；和(iii)糖胺聚糖；且其中所述細(xì)胞外基質(zhì)由培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)條件下在缺乏外源基質(zhì)成分或合成的成分時(shí)產(chǎn)生；(e)在步驟(d)的合成的細(xì)胞外基質(zhì)之上表面接種上皮細(xì)胞，和(f)在培養(yǎng)條件下刺激步驟(e)的上皮細(xì)胞，使之形成細(xì)胞外基質(zhì)的雙層組織構(gòu)建物，其中所述培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞包含在該合成的細(xì)胞外基質(zhì)中，和第二層上皮細(xì)胞層。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述能合成細(xì)胞外基質(zhì)的成纖維細(xì)胞衍生自選自下組的組織新生男嬰包皮，真皮，腱，肺，軟骨，尿道，角膜基質(zhì)，口腔粘膜，和腸。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述上皮細(xì)胞選自角質(zhì)細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、口腔粘膜的上皮細(xì)胞、食道上皮細(xì)胞、和尿道上皮細(xì)胞。
27.一種產(chǎn)生培養(yǎng)的雙層皮膚構(gòu)建物的方法，所述構(gòu)建物包含一個(gè)真皮層和一個(gè)表皮層，該表皮層在缺乏結(jié)構(gòu)支持物或外源基質(zhì)成分的情況下處在該真皮層上，其中該方法包括以下步驟(a)將成纖維細(xì)胞接種在培養(yǎng)容器中多孔膜上的化學(xué)確定的第一細(xì)胞培養(yǎng)基中，接種密度為約1×105個(gè)細(xì)胞/cm2-約6.6×105個(gè)細(xì)胞/cm2；(b)于所述化學(xué)確定的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(a)的成纖維細(xì)胞至約80％-約100％的融合；(c)通過在化學(xué)確定的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(a)的成纖維細(xì)胞，刺激它們合成、分泌并排列細(xì)胞外基質(zhì)成分；(d)繼續(xù)培養(yǎng)所述成纖維細(xì)胞，直至這些細(xì)胞合成至少約30μM厚的細(xì)胞外基質(zhì)層，所述培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞包含在該合成的細(xì)胞外基質(zhì)層中，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)包括(i)I型和II型膠原，其顯示纖絲和纖絲束的緊密排列，為垂直交錯(cuò)的67nm帶狀；(ii)decorin，(iii)腱生蛋白；和(iv)糖胺聚糖；且其中所述細(xì)胞外基質(zhì)由培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)條件下在缺乏外源基質(zhì)成分或合成的成分時(shí)產(chǎn)生；(e)于步驟(d)的合成的細(xì)胞外基質(zhì)之上表面接種角質(zhì)細(xì)胞，和(f)在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)這些角質(zhì)細(xì)胞以形成表皮層，其中所述表皮細(xì)胞層為多層、分層的、已分化的角質(zhì)細(xì)胞層，它表現(xiàn)為基底層、基底上層、立方上皮層和角質(zhì)層；且其中所述培養(yǎng)的雙層皮膚構(gòu)建物在該第一和第二層之間的連接處有一基底膜。
28.一種將培養(yǎng)的組織構(gòu)建物移植或植入患者的方法，其包括將權(quán)利要求1，8，9，或16中任一項(xiàng)的培養(yǎng)的組織構(gòu)建物移植或植入需要相應(yīng)治療的患者。
29.一種產(chǎn)生培養(yǎng)的組織構(gòu)建物的方法，其包括(a)在培養(yǎng)容器中的多孔膜上，于細(xì)胞培養(yǎng)基中接種能合成細(xì)胞外基質(zhì)的成纖維細(xì)胞至約80％-約100％融合；(b)在培養(yǎng)條件下刺激所述成纖維細(xì)胞在第二培養(yǎng)基中合成、分泌并排列細(xì)胞外基質(zhì)成分；和(c)繼續(xù)培養(yǎng)所述成纖維細(xì)胞，直至這些細(xì)胞合成至少約30μM厚的細(xì)胞外基質(zhì)層，所述培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞包含在該合成的細(xì)胞外基質(zhì)層中，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)包括(i)纖絲膠原，其顯示纖絲和纖絲束的緊密排列，為垂直交錯(cuò)的67nm帶狀；(ii)腱生蛋白；和(iii)糖胺聚糖；其中所述細(xì)胞外基質(zhì)由培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)條件下在缺乏外源基質(zhì)成分或合成的成分時(shí)產(chǎn)生。
30.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物能維持物理整體性以及類似于組織的手感特征。
全文摘要
本發(fā)明提供了經(jīng)培養(yǎng)的組織的構(gòu)建物,其含有培養(yǎng)的細(xì)胞和無(wú)需外源性基質(zhì)成分或網(wǎng)狀系統(tǒng)支持物或支架組件便可內(nèi)源產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)成分。本發(fā)明的某些組織構(gòu)建物由多層細(xì)胞或不止一種類型的細(xì)胞組成。本發(fā)明的組織構(gòu)建物具有與組織類似的形態(tài)特征和功能,它們的強(qiáng)度使它們更易于操作。本發(fā)明的優(yōu)選組織構(gòu)建物均在指定的培養(yǎng)基上制備,所謂指定的培養(yǎng)基即不含化學(xué)性質(zhì)不確定的成分。
文檔編號(hào)A61K35/22GK1333818SQ9981562
公開日2002年1月30日 申請(qǐng)日期1999年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月19日
發(fā)明者邁克爾·P·墨菲, 文森特·龍法德 申請(qǐng)人:奧加諾吉尼西斯公司