專利名稱：定向肝細(xì)胞的聚乙二醇接枝的聚－l－賴氨酸的聚合基因載體的制作方法
與有關(guān)申請的交叉參考本申請要求1998年5月20日提交的美國臨時申請60/086,072的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及基因治療。更具體地講，本發(fā)明涉及一種聚乙二醇接枝的聚-L-賴氨酸和肝細(xì)胞定向分子-聚乙二醇接枝的聚-L-賴氨酸的組合物，該組合物用于基因送遞到肝細(xì)胞中。
二十五年前，F(xiàn)riedmann指出了人類基因治療的前景(T.Friedmann與R.Roblin(1972)“人類遺傳疾病的基因治療？”175《科學(xué)》949-955(1972))。從此，基因治療已經(jīng)代表著治療人類疾病和給藥的一種新的方式?，F(xiàn)有研究暗含的側(cè)重點(diǎn)在于確定基因轉(zhuǎn)移步驟的安全性，并且通常將功效作為第二個目標(biāo)?；蜣D(zhuǎn)移主要的技術(shù)障礙在于缺乏理想的基因送遞系統(tǒng)。如果將基因以足夠的數(shù)量并且在沒有副作用的情況下送遞到合適的特異性細(xì)胞中是可能的話，那么基因治療將會是有效的。目前，非常少的器官或細(xì)胞可以被特異性地定向以便進(jìn)行基因送遞。現(xiàn)有許多用于將基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的確定的方法，其中包括磷酸鈣沉淀、電穿孔、粒子轟擊、脂質(zhì)體送遞、病毒-載體送遞以及受體介導(dǎo)的基因送遞(MS Wadhwa，“具有低分子量的糖肽載體的定向基因送遞”6《Bioconj.Chem.》283-291(1995))。盡管這些所有的方法都可以用于哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞，但是在將基因在體內(nèi)引入到靶細(xì)胞中存在著許多困難。
采用逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體的轉(zhuǎn)染方法克服了這些限制中的一些限制。特別是，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被成功地用于將外源基因引入到活性分裂細(xì)胞的基因組中，從而獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體(D.G.Miller等人“通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因轉(zhuǎn)移僅僅發(fā)生在感染階段中進(jìn)行活性復(fù)制的細(xì)胞中”10《分子細(xì)胞生物學(xué)》4239-4242(1990))。病毒載體系統(tǒng)通常涉及由插入到“輔助”細(xì)胞系中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)感染劑的基因來互補(bǔ)缺損載體。但是，眾所周知宿主對腺病毒的免疫應(yīng)答限制了其用作轉(zhuǎn)移促進(jìn)劑以進(jìn)行單一給藥。為了應(yīng)對這種限制，已經(jīng)采用流感病毒血凝素的融合肽來代替腺病毒作為紅細(xì)胞漿質(zhì)(endosomal)溶解劑，但是獲得了有限的成功(S.Gottschalk等人“有效地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的新的DNA-肽復(fù)合體”3《基因治療》448-457(1996))。但是，盡管其在體外轉(zhuǎn)染的效率很高，但是該方法中將基因插入到宿主細(xì)胞的基因組中取決于病毒感染的途徑。本申請中用于人類基因治療的病毒感染途徑的應(yīng)用給內(nèi)源病毒重組、致癌作用以及炎癥或免疫反應(yīng)帶來了嚴(yán)重的關(guān)注(G Ross等人“美國的基因治療五年?duì)顩r報告”7《人類基因治療》1781-1790(1996))。由于這些憂慮，用于人類基因治療的病毒載體的使用已經(jīng)受到了極大的限制。
另一方面，作為另一種替代的途徑廣泛地研究了非病毒基因送遞系統(tǒng)，比如陽離子脂質(zhì)體或合成的基因載體，例如聚-L-賴氨酸(PLL)(M.A.Wolfert等人，“由DNA與合成的嵌段共聚物自組裝形成的基因治療載體的特性描述”7《人類基因治療》2123-2133(1996)；AV Kabanov&VA Kabanov“用于將遺傳材料送遞到細(xì)胞中的具有聚陽離子的DNA復(fù)合體”6《Bioconj.Chem.》7-20(1995))。包括其相對的安全性和低的生產(chǎn)成本在內(nèi)，采用基于非病毒的基因治療具有許多的好處?；谫|(zhì)粒的途徑的主要限制為采用非病毒途徑在基因向若干重要身體目標(biāo)(即肝和肺)送遞的效率和體內(nèi)基因表達(dá)水平兩方面都要比采用病毒載體的低。
受體介導(dǎo)的基因送遞具有其優(yōu)勢和限制(J.C.Perales等人“通過脫唾液酸糖蛋白受體能夠定向基因go[sic]肝細(xì)胞的DNA復(fù)合體的生物化學(xué)與功能的特性描述”272《生物化學(xué)雜志》7398-7407(1997))。其在基因治療中使用的優(yōu)勢如下。首先，可以針對特異的靶受體設(shè)計和定做基因送遞載體。第二，不必將DNA整合到進(jìn)行表達(dá)的宿主細(xì)胞的基因組中。第三，送遞系統(tǒng)在理論上并不受轉(zhuǎn)基因大小的限制。最后，該技術(shù)并不涉及使用潛在的感染試劑。在將該技術(shù)常規(guī)地用于人類的基因治療之前，還存在著必須克服的不利之處。例如，該轉(zhuǎn)基因并沒有被整合到宿主細(xì)胞的染色體中，或者其表達(dá)是瞬時的。因此，最有可能的是必須使病人接受多次注射感興趣的基因。DNA-配體復(fù)合體難于制備，并且直到最近有關(guān)其結(jié)構(gòu)-功能之間的關(guān)系還所知甚少。而且，對參與轉(zhuǎn)基因向細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移及其隨后表達(dá)的生物過程僅僅有著不完整的了解。近來，已經(jīng)詳細(xì)地回顧了用于基因治療的該系統(tǒng)的上述以及其它的特征(J.C.Perales等人對采用合成DNA-配體復(fù)合體的受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的評價”226《歐洲生物化學(xué)雜志》255-266(1994))。
在20世紀(jì)70年代的中期，據(jù)表明PLL使得與DNA一起凝聚(condensate)(U.K.Laemmli“由聚環(huán)氧乙烷和聚賴氨酸引發(fā)的DNA凝聚物的特性描述”72《美國國家科學(xué)院學(xué)報》4288-4292(1975))。從此，已將用各種物質(zhì)修飾的PLL用作基因載體(M.S.Wadhwa等人“具有低分子量的糖肽載體的定向基因送遞”6《Bioconj.Chem.》283-291(1995)；A.Maruyama等人(1997)“具有聚(L-賴氨酸)接枝物多糖共聚物和聚(D，L-乳酸)的納米顆粒(nanoparticle)DNA載體”8《Bioconj.Chem.》735-742；G.Y.Wu與C.H.Wu“在體外定向基因送遞至Hep G2肝癌細(xì)胞中的證據(jù)”27《生物化學(xué)》887-892(1988)；P.Midoux等人“由乳糖基化的聚-L-賴氨酸介導(dǎo)的向肝癌細(xì)胞中的特異性基因轉(zhuǎn)移”21《核酸研究》871-878(1993)；P.Erbacher等人《糖基化聚賴氨酸/DNA復(fù)合體與糖基化聚賴氨酸的大小和糖取代水平以及與質(zhì)粒的大小有關(guān)的基因轉(zhuǎn)移效率》6《Bioconj.Chem.》401-410(1995))。PLL本身可以用作DNA的凝聚劑(condensate)(U.K.Laemmli“由聚環(huán)氧乙烷和聚賴氨酸引發(fā)的DNA凝聚物的特性描述”72《美國國家科學(xué)院學(xué)報》4288-4292(1975))。但是，單獨(dú)使用PLL作為基因送遞載體具有若干不利之處。首先，由于PLL除了在電荷中和中使用的氨基以外沒有官能團(tuán)，因此其轉(zhuǎn)染率是非常低的。而且，由于DNA磷酸鹽骨架帶有負(fù)電荷，因此DNA電荷中和程度的增加通常導(dǎo)致廣泛的凝聚以及呈不溶的緊密結(jié)構(gòu)的DNA相的分離(J.C.Perales等人“通過脫唾液酸糖蛋白受體能夠定向基因go[sic]肝細(xì)胞的DNA復(fù)合體的生物化學(xué)與功能的特性描述”272《生物化學(xué)雜志》7398-7407(1997)；D.E.Olins等人“模型核蛋白復(fù)合體有關(guān)陽離子型同聚多肽與DNA的相互作用的研究”24《分子生物學(xué)雜志》157-176(1967)；J.T.Shapiro等人“脫氧核糖核酸-聚賴氨酸復(fù)合體。結(jié)構(gòu)與核苷酸特異性”8《生物化學(xué)》3219-3232(1969))。
鑒于前述內(nèi)容，應(yīng)當(dāng)理解的是提供一種基因治療的定向組合物和一種采用所述組合物的方法在本領(lǐng)域中將會產(chǎn)生顯著的進(jìn)步。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的在于提供一種有效地介導(dǎo)DNA送遞到靶細(xì)胞中的組合物(composition)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的在于提供一種用來有效地進(jìn)行DNA送遞的生物適合的組合物，從而導(dǎo)致非細(xì)胞毒性地轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞中。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用來把DNA送遞到靶細(xì)胞中的方法。
上述以及其它的目的是通過合成出一種組合物(composition)來實(shí)現(xiàn)的，其中所述的組合物含有共價地接枝到一定百分比的聚乙二醇單元(member)上的聚賴氨酸單元，而聚乙二醇部分又共價地結(jié)合到定向部分上。此外，該組合物介導(dǎo)了DNA或基因部分轉(zhuǎn)染到人的細(xì)胞中。該轉(zhuǎn)染方法和組合物實(shí)現(xiàn)了這些目標(biāo)，與此同時產(chǎn)生了最少的細(xì)胞毒性并且顯著地提高了轉(zhuǎn)染率。
因此，通過將定向部分(TM)偶聯(lián)到PEG聚合物的一端并且共價地將TM-PEG的另一端連接到PLL的ε-氨基上來合成針對這些目的的聚合物。定向部分優(yōu)選乳糖或半乳糖。采用定向部分的目的在于使得用于基因送遞的細(xì)胞定向于特定的細(xì)胞。TM-PEG與PLL之比可以通過改變反應(yīng)條件來調(diào)整。這種合成的載體、即TM-PEG-PLL(其中PLL中5-30％的氨基與TM-PEG綴合，而其余的氨基仍保持為未取代的游離氨基)能夠與核酸一起形成穩(wěn)定且可溶的復(fù)合體，其繼而能夠有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)染。與單獨(dú)使用PLL相比，這種接枝到PLL上的PEG部分使得核酸/載體復(fù)合體的溶解性更好并且細(xì)胞毒性下降。與美國專利5,733,762中公開的不含PEG的PLL相比，本發(fā)明PEG接枝的PLL提供了在生理血清和細(xì)胞培養(yǎng)基中與DNA形成的復(fù)合體的高度溶解性，并且防止了所形成的復(fù)合體(或納米顆粒(nanopaticle))的沉淀和聚集，從而使得可以在體內(nèi)以非常高的劑量水平給藥。研究了TM-PEG-PLL系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞毒性并且與僅以PLL復(fù)合的DNA進(jìn)行了比較。舉例來說，用質(zhì)粒DNA/Lac-PEG-PLL復(fù)合體特異性地轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞，這表明乳糖充當(dāng)了肝癌細(xì)胞系的定向部分。本發(fā)明的PEG-PLL還降低了循環(huán)系統(tǒng)和細(xì)胞中DNA的蛋白水解降解程度并增強(qiáng)了細(xì)胞膜的融合，從而改善了轉(zhuǎn)染率。另外，PEG還起到了連接PLL骨架和定向部分的接頭的作用，從而提高了DNA送遞到靶細(xì)胞中的定向效率。
附圖若干視圖的描述

圖1顯示出合成Lac-PEG-PLL的流程圖。
圖2為Lac-PEG-PLL說明性的1H-NMR分析的描繪，其中位于大約3.5ppm處的峰表明組合物中存在著PEG。
圖3顯示出采用30摩爾％Lac-PEG-PLL進(jìn)行的說明性的條帶阻滯測定(band retardation assay)。泳道1和10分子量標(biāo)記物；泳道2質(zhì)粒DNA(1μg)；泳道3質(zhì)粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(1μg)；泳道4質(zhì)粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(0.3μg)；泳道5質(zhì)粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(0.5μg)；泳道6質(zhì)粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(1μg)；泳道7質(zhì)粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(3.0μg)；泳道8質(zhì)粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(5.0μg)；泳道9質(zhì)粒DNA(1μg)＋Lac-PEG-PLL(10.0μg)。
圖4顯示出質(zhì)粒pSV-β-gal和處于Lac-PEG-PLL中的溶解度的測試結(jié)果。
圖5為顯示出采用不同程度的乳糖-PEG取代之轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖示表示。(◆)6摩爾％Lac-PEG；(■)12摩爾％Lac-PEG-PLL；(▲)22摩爾％Lac-PEG-PLL；(×)30摩爾％Lac-PEG-PLL。
圖6顯示出作為聚合物基因載體的LIPOFECTIN、PLL、PEG-g-PLL、Gal-PEG-PLL和Lac-PEG-PLL在Hep G2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率的比較。
圖7顯示出對照培養(yǎng)基以及作為聚合物基因載體的LIPOFECTIN、PLL、PEG-g-PLL、Gal-PEG-PLL和Lac-PEG-PLL在Hep G2細(xì)胞中的細(xì)胞毒性的比較。
圖8顯示出本發(fā)明的組合物對各種細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染率的比較陰影柱-Hep G2細(xì)胞；實(shí)心柱-NIH3T3細(xì)胞；點(diǎn)劃線柱-A7R5細(xì)胞。
圖9顯示出DNA的數(shù)量對轉(zhuǎn)染的影響；陰影柱-DNA聚合物組合物為1∶2；實(shí)心柱-DNA聚合物組合物為1∶3。
圖10顯示出培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)染率的影響。
圖11顯示出培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因表達(dá)的影響。
圖12顯示出合成Lac-PEG-PLL的另一幅流程圖。
圖13顯示出合成Gal-PEG-PLL的流程圖。
發(fā)明的詳細(xì)描述在公開和描述本發(fā)明用于基因送遞的組合物以及方法之前，應(yīng)當(dāng)了解的是本發(fā)明并不限于本文所公開的具體的構(gòu)型、方法步驟和物質(zhì)，這是因?yàn)檫@樣的構(gòu)型、方法步驟和物質(zhì)可以多少發(fā)生些變化。還應(yīng)當(dāng)了解的是本文使用的術(shù)語僅僅是用于描述具體實(shí)施方案的目的并且并不打算進(jìn)行限制，這是因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅僅受到所附權(quán)利要求及其等同內(nèi)容的限制。
必須指出的是正如本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的那樣，除非上下文另外清楚地加以描述，單數(shù)形式的“一種”和“所述”均包括復(fù)數(shù)的相應(yīng)內(nèi)容。
本發(fā)明涉及一種能夠與核酸形成穩(wěn)定的、可溶的復(fù)合體的組合物及其制備方法，所述的組合物含有與聚乙二醇單元共價連接的聚賴氨酸(PLL)單元(PEG-PLL)，其又與可被細(xì)胞膜受體識別的定向部分(TM)共價連接。在解離的過程中，該復(fù)合體能夠釋放出核酸以便轉(zhuǎn)染幾種類型的細(xì)胞，并且定向部分(TM)使得選擇性地轉(zhuǎn)染到含有TM受體的細(xì)胞中。本發(fā)明還提供了一種用于在體外和體內(nèi)進(jìn)行特異性細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法。TM優(yōu)選選擇性地定向肝癌細(xì)胞的乳糖或半乳糖。
在其最一般的定義之一的概念上，本發(fā)明涉及一種在至少一種帶負(fù)電的核酸和至少一種帶正電的聚合綴合物之間形成的復(fù)合體，其中所述核酸和所述聚合綴合物之間的關(guān)系本質(zhì)上是靜電的，所說的帶正電的聚合綴合物基本上由聚L-賴氨酸(PLL)和PEG組成，其中大約5-30％的PLL(分子量為20-30K)的NH3+與PEG(分子量為0.5-20K)共價連接，其又與定向部分(TM)共價連接。本發(fā)明的PEG-PLL基因載體使得DNA凝聚(condensation)，由于PLL的正電荷和所述核酸的負(fù)電荷之間協(xié)同現(xiàn)象的結(jié)果，該作用仍保持得非常強(qiáng)烈。另外，在PLL的氨基部分上加入PEG防止了由PEG-PLL與核酸形成的復(fù)合體(或納米顆粒)的沉淀和聚集，從而增加了復(fù)合體的溶解度。與PLL連接的PEG還起到了融合細(xì)胞膜與防止核酸蛋白酶解降解的作用，從而提高了轉(zhuǎn)染率。此外，由于PEG可以起到連接PLL骨架和定向部分(TM)的接頭的作用，因而它提高了所述復(fù)合體的定向效率。
在本發(fā)明的組合物中，定向部分(TM)可以是任何可被細(xì)胞膜受體識別的信號部分，優(yōu)選地，，TM為含有特異性地結(jié)合肝細(xì)胞或肝癌細(xì)胞的半乳糖的糖。優(yōu)選地，所述含有半乳糖的糖為選自乳糖和半乳糖的部分。
本發(fā)明的組合物可以與核酸一起形成穩(wěn)定且可溶的復(fù)合體，它可以有效地轉(zhuǎn)染哺乳動物的細(xì)胞。所述核酸可以在下列物質(zhì)中進(jìn)行選擇a)基因標(biāo)記，諸如螢光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、賦于對抗生素(諸如潮霉素或新霉素)具有抗性的基因；b)用于治療目的的基因，諸如編碼在血膽固醇過多的情況下(肝臟)缺陷的低密度脂蛋白受體的基因、編碼凝固因子(coaglulation factor)的基因、腫瘤的抑制基因、編碼主要組織相容性蛋白的基因、抗癌基因、有義和反義RNA和編碼核酶的基因；以及c)具有疫苗目的的基因，諸如編碼病毒抗原的基因。
本發(fā)明中使用的PEG的分子量為0.5-20K道爾頓，優(yōu)選0.5-5K道爾頓，其中具有重復(fù)單元為11-114。
本發(fā)明中使用的PLL的分子量為2-100K道爾頓，優(yōu)選15-50K道爾頓，其中具有重復(fù)單元為10-250。
與采用僅僅具有PLL的相比，采用本發(fā)明組合物來將攜帶有待送遞基因的質(zhì)粒以增強(qiáng)的轉(zhuǎn)染率送遞到定向的肝細(xì)胞中。通常把質(zhì)粒pSV-β-gal(為對pRSV-β-半乳糖苷酶載體的修飾)用作標(biāo)記基因來監(jiān)測基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)(Promega公司pSV-β-半乳糖苷酶對照載體的圖譜和序列TB094Promega Technical公告1(1994))。SV40早期啟動子和增強(qiáng)子驅(qū)動lacZ基因在哺乳動物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。β-半乳糖苷酶是一種非常好的報道酶(N Rosenthal(1987)“通過功能測定對克隆基因調(diào)節(jié)元件的鑒定”152《Methl.》704-720(1987))并且通過分光光度測定可以在細(xì)胞提取物中快速和直接地測定。
據(jù)條帶阻滯測定表明乳糖-PEG-修飾的PLL具有與pSV-β-gal形成復(fù)合體的能力(圖3)。電泳過程中pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL條帶的遷移取決于pSV-β-gal與Lac-PEG-PLL之比，而這改變了復(fù)合體的凈電荷及其大小和密度(A.V.Kabanov&VA Kabanov“用于將遺傳材料送遞到細(xì)胞中的具有聚陽離子的DNA復(fù)合體”6《Bioconj.Chem.》7-20(1995))。pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL復(fù)合體電泳遷移率的下降伴隨著該系統(tǒng)中Lac-PEG-PLL含量的增加，而這是由于DNA的負(fù)電荷被載體的正電荷中和所致。在染料置換測定中同樣觀察到DNA-載體復(fù)合體的形成。
本發(fā)明在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法包括在使存在如下所列的條件下向含有待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基中引入核酸和PEG接枝的PLL聚合載體的復(fù)合體使所述復(fù)合體經(jīng)過培養(yǎng)基進(jìn)入到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，使前述復(fù)合體的核酸釋放到細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)所述的核酸。
正如前面討論的那樣，未經(jīng)修飾的PLL作為基因載體的問題之一為PLL與DNA之間的復(fù)合頻繁地導(dǎo)致形成了細(xì)小的沉淀，從而限制了可以使用的濃度(T.D.McKee等人“脫唾液酸血清類粘蛋白-聚賴氨酸綴合物的制備”5《Bioconj.Chem.》306-311(1994))。因此，在含有0.15M NaCl的20mM HEPES(pH7.4)中pSV-β-gal與PLL的復(fù)合導(dǎo)致生成了50μg/ml pSV-β-gal的沉淀。而當(dāng)在該濃度下與DNA形成復(fù)合體時，本發(fā)明的PEG-g-PLL和TM-PEG-PLL維持了pSV-β-gal的溶解性。因此，顯而易見的是所連接的PEG部分使得pSV-β-gal/基因載體的復(fù)合體基本上更加易于溶解，從而更能發(fā)揮作用。
本發(fā)明還涉及一種作為上述聚合基因載體的PEG接枝的PLL組合物的制備方法。舉例來說，在附圖以及實(shí)施例1、15和16中描述了用于合成Lac-PEG-PLL和Gal-PEG-PLL的方法。
本發(fā)明還涉及由核酸和本發(fā)明聚合基因載體形成的復(fù)合體用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的用途，其中所述的細(xì)胞可以選自下列細(xì)胞造血細(xì)胞(cellsfrom hematopoietic strains)；肝細(xì)胞；骨骼肌細(xì)胞；皮膚細(xì)胞，諸如成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、樹突細(xì)胞或黑素細(xì)胞；血管壁細(xì)胞，諸如內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；呼吸道的上皮細(xì)胞；中央神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞；癌細(xì)胞；免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，諸如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等。
作為本發(fā)明的一個實(shí)例，研究了合成載體Lac-PEG-PLL的基因送遞能力及其特異性。選出Hep G2細(xì)胞用于特異性測試，這是因?yàn)樗鼈冊诒砻嫔暇哂刑禺惖娜樘鞘荏w。乳糖的識別是通過位于肝細(xì)胞上的乳糖受體介導(dǎo)的(L.Stryer《糖的生物化學(xué)》(第3版)第345頁，WH Freemanand公司，紐約(1988))。采用它們從血液中除去糖蛋白。許多新合成的糖蛋白(諸如免疫球蛋白和肽激素)含有具有末端唾液酸和半乳糖殘基的糖單元。在幾個小時或者幾天的時間里，依賴于特殊的蛋白，末端的唾液酸殘基被位于血管表面上的唾液酸酶除去。這些修整蛋白暴露出的半乳糖殘基是通過肝細(xì)胞質(zhì)膜中的脫唾液酸糖蛋白受體來檢測的。然后通過胞吞過程使脫唾液酸糖蛋白及其受體的復(fù)合體進(jìn)入到肝細(xì)胞內(nèi)部，以便從血液中除去經(jīng)修整的糖蛋白。本發(fā)明公開的內(nèi)容表明載體上的乳糖部分能夠起到針對肝癌細(xì)胞系的定向物質(zhì)的作用。
Lac-PEG-PLL是通過包括兩個反應(yīng)的流程來合成的，其中包括乳糖-PEG二酸的合成以及由乳糖-PEG二酸和PLL合成出梳狀聚合物L(fēng)ac-PEG-PLL(圖1和圖15)。在第一個反應(yīng)中，氯甲酸異丁酯(IBCF)和羧酸在PEG二酸中生成活性酯，并釋放出一分子的鹽酸。采用三乙醇胺(TEA)作為堿來中和反應(yīng)過程中生成的鹽酸。對-氨基苯基-α-D-乳吡喃糖苷中的氨基與PEG上的酮基反應(yīng)，從而在糖和PEG之間生成了酰胺鍵。在4個小時的反應(yīng)之后，采用過量的乙醚使產(chǎn)物沉淀。然后將沉淀重新溶解在蒸餾水中，并使用1,000MWCO的透析膜進(jìn)行透析以除去未反應(yīng)的對-氨基苯基-α-D-乳吡喃糖苷。使用Con A-Sepharose柱來除去未反應(yīng)的PEG。通過向所述組合物中加入含有0.1M甲基-a-D-甘露吡喃糖苷的緩沖液，從Con A-Sepharose柱中分離出乳糖-PEG二酸。與乳糖-PEG二酸一同洗脫出乳糖-PEG-乳糖級分(其中PEG二酸的兩個羧酸端都已與乳糖部分發(fā)生了酯化)，但該級分卻無需進(jìn)行進(jìn)一步的純化，這是因?yàn)槿樘?PEG-乳糖在第二步反應(yīng)條件下是不反應(yīng)的。而且在第二步反應(yīng)的透析過程中，完全除去了乳糖-PEG-乳糖。在第二步反應(yīng)中，IBCF活化了乳糖-PEG中的羧酸，從而有助于在PLL中的氨基與羧酸或酯之間形成酰胺鍵。
本發(fā)明的Lac-PEG-PLL聚合物與pSV-β-gal一起形成了一種復(fù)合體。本發(fā)明的Lac-PEG-PLL化合物使得該復(fù)合體可溶，而pSV-β-gal與單獨(dú)PLL之間形成的復(fù)合體卻生成了細(xì)小的沉淀。當(dāng)與PLL復(fù)合體作用于Hep G2細(xì)胞相比時，Lac-PEG-PLL載體/DNA復(fù)合體的轉(zhuǎn)染率要高出10倍以上。這種提高可能是由于乳糖部分的細(xì)胞定向作用，并且一部分是由于PEG的融合作用。相連的PEG基團(tuán)還使得Lac-PEG-PLL與pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL復(fù)合體比起PLL的細(xì)胞毒性要低。乳糖部分特異性地起到了用于轉(zhuǎn)染到肝細(xì)胞中的定向部分的作用。這可以通過兩個證據(jù)來證明。首先，游離的乳糖在毫摩爾濃度的水平上抑制了轉(zhuǎn)染。其次，當(dāng)將其它乳糖受體缺陷型細(xì)胞系用于轉(zhuǎn)染時，監(jiān)測到非常低的轉(zhuǎn)染率。FBS和氯奎的存在改善了轉(zhuǎn)染，從而進(jìn)一步表明轉(zhuǎn)染是通過胞吞作用機(jī)理發(fā)生的。
提供了下列實(shí)施例來說明制備所述組合物的方法以及使用本發(fā)明組合物的方法。
實(shí)施例1Lac-PEG二酸的合成乳糖-PEG二酸的合成進(jìn)行如下。在氮?dú)夥障略诒≈?，?00毫克(1.0mM)的PEG二酸(分子量＝600；Fluka，Ronkonkoma，NY)溶解在含有1.0mM三乙胺(TEA；Aldrich)的1.5mL無水的N，N-二甲基甲酰胺(DMF；Aldrich)中。在冰水浴中逐滴地加入溶于1.0mL干燥DMF的1mM氯甲酸異丁酯(IBCF；Aldrich)，并且攪拌混合物15分鐘。IBCF起到了羧酸活化劑的作用。然后加入溶于1.0mL DMF的對-氨基苯基-α-D-乳吡喃糖苷(1.0mM；Sigma)，并且在冰水浴中攪拌混合物30分鐘，然后在室溫下再攪拌3小時。在過量的干乙醚(25mL)中沉淀產(chǎn)物。然后將沉淀溶解在20mL蒸餾水中，在蒸餾水中進(jìn)行透析(透析袋的MWCO為1,000；Spectrum，Houston，TX)并且冷凍干燥。通過在Con A-Sepharose柱(Sigma)中除去未反應(yīng)的PEG二酸來純化產(chǎn)物。將40毫克凍干的產(chǎn)物溶解在40mL的0.02M Tris緩沖液(pH7.4)、0.5M NaCl、3mM CaCl2和3mM MnCl2中，并以0.10mL/分鐘的流速裝入Con A-Sepharose柱中。洗脫該柱直至280nm處的吸光值降低到低于0.01，然后加入類似的、但卻含有0.1M甲基-α-D-甘露吡喃糖苷(Sigma)的緩沖液。通過在280nm下監(jiān)測檢測出乳糖-PEG和乳糖-PEG-乳糖混合物特異的洗脫峰，收集該部分，在蒸餾水中透析并且最終進(jìn)行冷凍干燥。通過滴定測定羧酸的含量。乳糖-PEG與乳糖-PEG-乳糖的摩爾比約為2∶1。
實(shí)施例2乳糖-PEG二酸與PLL的接枝在該實(shí)施例中描述了Lac-PEG-PLL具有30％(摩爾/摩爾％)乳糖-PEG)的合成。在氮?dú)夥障略诒≈校瑢⒏鶕?jù)實(shí)施例1的步驟制備的乳糖-PEG和乳糖-PEG-乳糖混合物(51.5mg；含有0.042M的乳糖-PEG)溶解在0.5mL無水的DMF中。將溶于0.5mL DMF的IBCF(0.036M)逐滴添加到上述溶液中。將該混合物在冰水浴中攪拌30分鐘，然后逐滴地加入到含有25mg PLL-HBr(120個重復(fù)單元；分子量＝25,000；Sigma)和10μLTEA的1mL無水的二甲亞砜(DMSO；Aldrich)(其已在冰水浴中用氮?dú)馇逑戳?0分鐘)中，然后在室溫下再攪拌3小時。在100mL的無水乙醚中沉淀產(chǎn)物，并將沉淀溶解在10mL蒸餾水中。將其在0.01M的NaHCO3溶液中透析(透析袋的MWCO為25,000)，然后再在0.01M的鹽酸溶液中透析，之后再在蒸餾水中透析。最后冷凍干燥透析所得的產(chǎn)物。通過1H-NMR計算出乳糖-PEG與PLL中氨基的摩爾比。
實(shí)施例3乳糖-PEG-PLL的1H-NMR分析在水中進(jìn)行由實(shí)施例1和2的步驟制得的Lac-PEG-PLL的1H-NMR分析。在圖2中顯示出30摩爾％的Lac-PEG-PLL的1H-NMR譜。大約3.5ppm處的峰表明該組合物中存在著PEG。通過將PEG(-CH2CH2-.s.3.4-3.7ppm)峰與PLL側(cè)鏈(-CH2CH2CH2-.m.1.1-1.8ppm)峰相關(guān)聯(lián)，從NMR譜中計算出PEG的含量。通過該方法證實(shí)了由本發(fā)明制得的四種說明性的載體組合物中乳糖-PEG含量之比如下分別為6，12，20和30摩爾％。
實(shí)施例4生化表征條帶阻滯測定進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)來研究本發(fā)明的Lac-PEG-PLL組合物是否與pSV-β-gal質(zhì)粒DNA(Promega公司，Madison，Wisconsin；EMBL登記號為X65335)形成了復(fù)合體。將根據(jù)實(shí)施例1和2的步驟制備的不同數(shù)量的Lac-PEG-PLL(0.1-10μg)添加到1μg的質(zhì)粒DNA中，并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。將凝膠電泳樣品緩沖液加入到每個樣品中，然后采用Easy-CastTM電泳系統(tǒng)(Owl Scientific公司，Woburn，MA)在100V下通過在1％(w/v)瓊脂糖凝膠上電泳90分鐘來分離樣品。使用TBE(45mM Tris-硼酸鹽，1mM EDTA，pH8.0)緩沖液作為電泳緩沖液。用溴化乙錠(0.5μg/mL)對凝膠染色30分鐘并用紫外發(fā)光器照明以顯示DNA的位置。采用由EcoRI消化的λDNA(Promega)作為DNA大小的標(biāo)記物。
實(shí)施例5生化表征溶解性通過Wadhwa等人(MS Wadhwa等人，“具有低分子量的糖肽載體的定向基因送遞”6《Bioconj.Chem.》283-291(1995))開發(fā)的并作了細(xì)小改進(jìn)的方法測定載體/質(zhì)粒DNA復(fù)合體的溶解性。將pSV-β-gal質(zhì)粒DNA和根據(jù)實(shí)施例1和2的步驟制備的Lac-PEG-PLL載體在1mL含有20mM HEPES、0.15M NaCl的緩沖液(pH7.4)中混合，其在1.5mL離心管中的最終濃度為50μg/mL。在室溫下培養(yǎng)30分鐘后，將試管在10,000rpm下離心5分鐘。取出上清液并測量其在260nm下的吸光值以確定溶液中殘留的DNA。將不含載體的DNA樣品用作標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過將DNA與PLL或與PEG-g-PLL(根據(jù)美國系列申請?zhí)?0/069,351來制備，該文獻(xiàn)插入本文僅供參考)混合生成了用于比較的復(fù)合體。
如果在選擇的條件下離心并未從上清液中除去DNA的話，那么定義質(zhì)粒DNA/載體復(fù)合體是可溶的。圖4顯示出pSV-β-gal與最終濃度50μg/ml的PLL之間復(fù)合體的形成導(dǎo)致生成了細(xì)小的沉淀，當(dāng)在10,000rpm下離心5分鐘時其沉積下來。但是，當(dāng)使用經(jīng)PEG修飾的PLL與pSV-β-gal形成復(fù)合體時，離心后仍有將近98％的DNA殘留在上清液中。當(dāng)與pSV-β-gal/PEG-g-PLL復(fù)合體相比時，帶有乳糖部分的PEG基團(tuán)末端的修飾并沒有導(dǎo)致溶解度下降超過10％。因此，在PLL上連接的PEG基團(tuán)防止了pSV-β-gal/載體復(fù)合體生成細(xì)小的沉淀和變得不能溶解。
實(shí)施例6轉(zhuǎn)染采用Hep G2細(xì)胞系(ATCC No.HB8065)評價根據(jù)實(shí)施例1和2合成的Lac-PEG-PLL的體外轉(zhuǎn)染率。Hep G2細(xì)胞為一種人的肝細(xì)胞瘤(肝癌)細(xì)胞系，在其表面上具有特異的乳糖受體。在37℃下，在5％CO2NapcoTM培養(yǎng)箱(Precision Scientific公司，芝加哥，IL)中，在補(bǔ)充有1mM丙酮酸鈉和10％FBS(Hyclone，Logan，UT)的MEM培養(yǎng)基中維持細(xì)胞。對轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)來說，不同的pSV-β-gal/PEG-g-PLL復(fù)合體是用固定量的pSV-β-gal(10μg/mL)和增加量的Lac-PEG-PLL(1-100μg/mL)配制的。使用不含F(xiàn)BS的細(xì)胞培養(yǎng)基作為混合培養(yǎng)基。
體外轉(zhuǎn)染通常進(jìn)行如下。將Hep G2細(xì)胞以20×104個細(xì)胞/mL的密度、100μL/孔的量接種在96孔平底微量測定平板(Falcon公司，Becton Dickenson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中，并且在加入質(zhì)粒DNA/載體復(fù)合體或者單單加入載體之前培養(yǎng)24小時。
在轉(zhuǎn)染之前，采用探針型超聲波儀(Sonifer250，branson)對Lac-PEG-PLL載體超聲處理6-8分鐘。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中使用的所有試劑都通過0.22μm聚碳酸酯濾膜過濾加以滅菌。通過在100μl不含F(xiàn)BS的細(xì)胞培養(yǎng)基中混合1μg的pSV-β-gal和不同數(shù)量的載體來制備質(zhì)粒pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL復(fù)合體。并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。分別以10％(v/v)和100μM的最終濃度添加FBS和氯奎。用100μL的轉(zhuǎn)染混合物替換96孔平板中每個孔中的培養(yǎng)基。然后在37℃下在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞4小時。4個小時后，除去轉(zhuǎn)染混合物并向每個孔中加入100μL含有10％FBS的新鮮培養(yǎng)基。在37℃下再培養(yǎng)細(xì)胞48小時。通過測量由pSV-β-gal引入細(xì)胞中的β-半乳糖苷酶的活性來測定轉(zhuǎn)染率。采用進(jìn)行了輕微修飾的O-硝基苯基-b-D-半乳吡喃糖苷(ONPG；Sigma)在420nm下通過分光光度法測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中β-半乳糖苷酶的活性(J.R.Saneset等人“采用重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒研究小鼠胚胎中移植后的細(xì)胞譜系”5《EMBO J.》3133-3142(1986)，該文獻(xiàn)插入本文僅供參考)。在96孔板中從細(xì)胞中除去生長培養(yǎng)基以便進(jìn)行測定，并且用1X PBS仔細(xì)地洗滌細(xì)胞兩次以防止粘附的細(xì)胞脫離。通過向細(xì)胞中加入60μL的1X報道溶解緩沖液(Promega，Madison，WI)并在室溫下培養(yǎng)30分鐘、在培養(yǎng)過程中中途搖晃平板來溶解細(xì)胞，接下來刮去細(xì)胞。將60微升溶于2X測定緩沖液(Promega，Madison，WI)的ONPG(1.33mg/mL)加入到溶解的細(xì)胞中，并在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞4小時。通過向每個孔中加入150μL的1M碳酸鈉溶液來終止反應(yīng)，并且采用Bio-Tek EL-311微量板讀出器(Bio-Tek儀器公司，Winooski，VT)讀取420nm下的吸光值以測定β-半乳糖苷酶的活性。
采用體外Hep G2細(xì)胞系來評價合成的Lac-PEG-PLL的轉(zhuǎn)染率。HepG2細(xì)胞(一種肝癌細(xì)胞系)在其表面上具有特異的乳糖受體。對轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)來說，不同的pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL復(fù)合體是用固定數(shù)量的pSV-β-gal(10μg/mL)和增加量的Lac-PEG-PLL(1-100μg/mL)配制的。使用不含F(xiàn)BS的細(xì)胞培養(yǎng)基作為混合培養(yǎng)基。
Lac-PEG-PLL呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)染到Hep G2細(xì)胞中的能力(圖5)。無論使用任何乳糖基化的載體都觀察到當(dāng)pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL(0.3或0.5mg的載體)的重量比低于1∶1時非常低的乃至為零的轉(zhuǎn)染率。當(dāng)DNA/載體的重量比為1∶2和1∶3時，那些乳糖的量越高的載體顯示出越高的轉(zhuǎn)染率。在這些比例中4種乳糖基化的載體中，30摩爾％的Lac-PEG-PLL是最佳的載體。盡管本發(fā)明并不局限于任何所提出的科學(xué)解釋，但是這種效率的提高可能是由于乳糖對Hep G2細(xì)胞的定向能力，而這揭示了與PEG-g-PLL的情況極為不同的趨勢。正如前面討論的那樣，10摩爾％的PEG-g-PLL顯示出比25摩爾％的PEG-g-PLL的效率要高。當(dāng)采用30摩爾％的Lac-PEG-PLL載體時，在1∶3的重量比下達(dá)到了最高的轉(zhuǎn)染率，但是重量比為1∶2時也呈現(xiàn)出幾乎相同的轉(zhuǎn)染程度。據(jù)證明載體中乳糖-PEG取代的程度越高，達(dá)到最高轉(zhuǎn)染率所需的載體數(shù)量也越大。當(dāng)使用5摩爾％的Lac-PEG-PLL時，比值為1∶1的復(fù)合體顯示出最高的效率。在30摩爾％Lac-PEG-PLL的情況下，比值為1∶3的復(fù)合體顯示出最高的效率。這可以由基因載體與pSV-β-gal形成復(fù)合體的能力來解釋。取代越多的Lac-PEG-PLL具有越少的游離胺基與DNA上的負(fù)電荷發(fā)生相互作用。因此，需要更多的載體與DNA形成復(fù)合體，以便達(dá)到與含有更少量游離胺相互作用之Lac-PEG-PLL相同的程度。
圖6歸納了采用PLL和修飾的PLL轉(zhuǎn)染的結(jié)果。采用LIPOFECTIN試劑(GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)來比較轉(zhuǎn)染率。在該實(shí)驗(yàn)所用的載體中，對HepG2細(xì)胞而言，PLL、PEG-g-PLL和Lac-PEG-PLL-以及LIPOFECTIN、Lac-PEG-PLL顯示出最佳的效率。
Lac-PEG-PLL顯示出要比PLL和PEG-g-PLL的改進(jìn)的轉(zhuǎn)染率。在具有不同修飾的比值的Lac-PEG-PLL中，在與pSV-β-gal的重量比為1∶3的情況下，30摩爾％的Lac-PEG-PLL達(dá)到了最高的效率。據(jù)證實(shí)位于PEG末端上的乳糖部分賦予了細(xì)胞定向能力到pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL復(fù)合體上。此外，PEG的融合能力可以起到所觀察到的提高轉(zhuǎn)染率的另一個因素的作用。這一斷言得到了這樣一種事實(shí)的支持，即已知PEG與細(xì)胞膜的磷脂頭部基團(tuán)有關(guān)，它協(xié)助了修飾蛋白滲透進(jìn)入細(xì)胞膜中(M.Yamazaki&T.Ito，“由憎滲透壓的締合作用導(dǎo)致的磷脂小泡膜結(jié)構(gòu)中的變形和不穩(wěn)定性聚乙二醇誘導(dǎo)的融合機(jī)理的機(jī)械應(yīng)力模型”29《生物化學(xué)》1309-1314(1990))。
實(shí)施例7細(xì)胞毒性在本實(shí)施例中，根據(jù)實(shí)施例6的步驟用pSV-β-gal/Lac-PEG-PLL轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞。以96孔板中每個孔3μg的濃度(細(xì)胞培養(yǎng)基中為30μg/mL)測試不同的基因載體。在37℃下使基因載體與細(xì)胞一起培養(yǎng)4小時，然后通過Y.H.Choi等人的方法(“用作聚合基因載體的聚乙二醇接枝的聚-L-賴氨酸”《J.Control.Rel.》(1997)該文獻(xiàn)插入本文僅供參考)測定細(xì)胞的存活。在圖7中顯示出針對Hep G2細(xì)胞的合成載體的細(xì)胞毒性。在有30μg/mL基因載體存在的情況下培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞4小時。之所以選擇30μg/mL的濃度是因?yàn)樵谠摑舛认翽EG-PLL和Lac-PEG-PLL呈現(xiàn)出其最佳的轉(zhuǎn)染率。對Lac-PEG-PLL而言，在Hep G2細(xì)胞中沒有觀察到細(xì)胞毒性，而PLL則呈現(xiàn)出中等至高度的細(xì)胞毒性。乳糖-PEG取代比例的不同并未在細(xì)胞生存力方面帶來顯著的變化。這可以得到相差顯微觀測的進(jìn)一步支持，即把Lac-PEG-PLL與Hep G2細(xì)胞一同培養(yǎng)并未給細(xì)胞的生存力帶來任何顯著的影響。將PLL與細(xì)胞一起培養(yǎng)4小時改變了細(xì)胞的形態(tài)，但是在相同的濃度和培養(yǎng)時間下PEG-g-PLL或Lac-PEG-PLL并未顯著地改變細(xì)胞的形態(tài)。
實(shí)施例8DNA的量對轉(zhuǎn)染的影響測試了質(zhì)粒DNA的數(shù)量對轉(zhuǎn)染的影響。根據(jù)上述實(shí)施例的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用了30摩爾％的Lac-PEG-PLL。pSV-β-gal的量由0.1變化至5μg。DNA與載體的重量比為1∶2或1∶3。轉(zhuǎn)染的條件包括10％的FBS和100M的氯奎。在轉(zhuǎn)染和隨后培養(yǎng)48小時后，溶解細(xì)胞并測定β-半乳糖苷酶的活性。圖9中所示的結(jié)果表明在這些條件下，1μg的質(zhì)粒DNA產(chǎn)生了最佳的結(jié)果。
實(shí)施例9時間對轉(zhuǎn)染的影響測試了時間對轉(zhuǎn)染的影響。根據(jù)上述實(shí)施例中所述的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在質(zhì)粒與Lac-PEG-PLL之比為1∶3的情況下，采用30摩爾％的Lac-PEG-PLL和1μg的pSV-β-gal來轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞。在有10％FBS和100μM氯奎存在的情況下，轉(zhuǎn)染時間由0.5變化至6小時。轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)細(xì)胞48小時，然后測定β-半乳糖苷酶的活性。圖10中所示的結(jié)果表明經(jīng)過4個小時的培養(yǎng)獲得了最佳的轉(zhuǎn)染率。
實(shí)施例10時間對基因表達(dá)的影響采用LIPOFECTIN試劑或30摩爾％的Lac-PEG-PLL作為基因載體。根據(jù)上述實(shí)施例的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在質(zhì)粒DNA與載體之比為1∶3的情況下，pSV-β-gal的量為1μg。在與HepG2細(xì)胞一起培養(yǎng)4小時后，除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并培養(yǎng)細(xì)胞。在1-4天的時間里，溶解細(xì)胞并測定β-半乳糖苷酶的活性。圖11中所示的結(jié)果表明在所述條件下，在介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的過程中Lac-PEG-PLL的存在比起LIPOFECTIN試劑要有效得多。對這兩種載體而言，β-半乳糖苷酶的活性都隨時間增加。但是，Lac-PEG-PLL在第1天產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的活性相當(dāng)于LIPOFECTIN試劑在第4天培養(yǎng)時獲得的活性。
在整個96小時的觀察期內(nèi)維持表達(dá)。對在培養(yǎng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染來說，維持基因的表達(dá)多達(dá)96個小時是本發(fā)明基因載體的一個優(yōu)點(diǎn)，這是因?yàn)樵诳赡馨l(fā)生轉(zhuǎn)染細(xì)胞的操作的過程中，這種表達(dá)的耐力提供了一個機(jī)會。已知在僅僅24個小時后，帶有甘露糖基化PLL/DNA的人巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染的螢光素酶的活性達(dá)到最大值，然后在72個小時后該活性迅速地降低至僅為2％。
實(shí)施例11Lac-PEG-PLL的另一種合成方法在圖12中說明了Lac-PEG-PLL的另一種合成途徑并且具體描述如下1)具有PEG的分子量為3,400的Lac-PEG二酸的合成將1.08g的叔丁氧羰基胺-聚乙二醇甲基羧基琥珀酰亞胺(tert-butyl carbonate amine-polythylene glycol methyl carboxysuccinimide)(Shearwater Polymer公司)溶解在20mL含有50mg TEA并用氮?dú)馇逑吹腄MF中。加入0.14g(0.33微摩爾)的對-氨基-苯基-吡喃型乳糖(PAPL，Sigma)并且攪拌過夜。通過用MWCO為1,000的Spectrum膜在DI水中透析來除去DMF、未反應(yīng)的PAPL、羥基琥珀酰亞胺和TEA。通過冷凍干燥得到產(chǎn)物。
2)氨基-PEG-Lac的合成將上述產(chǎn)物在-5℃下溶解在含有10％(v/v)茴香醚的并用氮?dú)馇逑催^的三氟乙酸中并且攪拌1個小時。用乙醚沉淀產(chǎn)物并且過濾。用醚洗滌沉淀三次。最后，通過用MWCO為1,000的Spectrum膜在DI水中透析來進(jìn)一步純化產(chǎn)物。通過冷凍干燥獲得了氨基-PEG-Lac。
3)琥珀酸-PEG-Lac的合成通過使氨基-PEG-Lac與琥珀酸酐(Aldrich)反應(yīng)，將氨基-PEG-Lac轉(zhuǎn)化成琥珀酸-PEG-Lac。將0.76g氨基-PEG-Lac溶解在10ml含有22.0mg琥珀酸酐的甲苯中并回流6小時。然后用過量的醚使聚合物Suc-PEG-Lac沉淀。用醚洗滌沉淀三次。最后將產(chǎn)物在真空下干燥3天。
將0.39g的Suc-PEG-Lac溶解在2mL含有12.7mg N-羥基琥珀酰亞胺的DMF中。然后加入22.7mg的DDC和15mg的TEA，并且攪拌過夜。通過過濾除去沉淀。將產(chǎn)物HOSu-Suc-PEG-Lac在真空下完全干燥2天。
4)Lac-PEG-PLL的合成
舉例來說，含有5％Lac-PEG的Lac-PEG-PLL的合成描述如下。將溶于0.5mL DMSO的23.7mg(0.11微摩爾)Suc-PEG-Lac在5分鐘的時間里逐滴添加到2mL含有25mg(0.11微摩爾)PLL的DMSO中，并且再攪拌5個小時。然后通過使用MWCO為25,000的Spectrum膜在DI水中使產(chǎn)物透析2天來除去DMSO、N-羥基琥珀酰亞胺和未反應(yīng)的PEG。通過冷凍干燥得到了最終的產(chǎn)物并且儲存于-20℃下。
實(shí)施例12Gal-PEG-PLL的合成方法在圖13中說明了Lac-PEG-PLL的另一種合成途徑并且具體描述如下1)HOSu-PEG二酸的合成在室溫下將1.20g(2.0微摩爾)PEG二酸(分子量為600，F(xiàn)luka，Ronkonloma，NY)溶解在20ml醋酸乙酯(Aldrich)中。然后加入69.0mg(0.6微摩爾)的N-羥基琥珀酰亞胺(Aldrich)、144.4mg(0.70微摩爾)的N，N’-二環(huán)己基碳酰亞胺(Aldrich)和300μL。在室溫下將上述溶液攪拌過夜。在反應(yīng)后，通過采用孔徑為0.22μm的Durapore濾膜過濾除去沉淀二環(huán)己脲，并用醋酸乙酯洗滌3次。在真空下通過Rotavap除去醋酸乙酯。將殘?jiān)芙庠诙燃淄橹?，然后?20℃下用乙醚沉淀PEG產(chǎn)物。通過在-20℃下離心并潷去上清液來收集沉淀。最后在室溫下在真空中完全干燥HOSu-PEG二酸若干天。
2)Gal-PEG的合成在室溫下將350mg(0.5微摩爾)的HOSu-PEG二酸、107.8mg(0.5微摩爾)的D(＋)-半乳糖胺(Sigma)、101mg(1.0微摩爾)的三乙胺(TEA，Aldrich)溶解在2ml二甲亞砜(DMSO，Aldrich)中，并且攪拌過夜。通過在-70℃下沉淀PEG的衍生物來除去未反應(yīng)的半乳糖胺、DMSO、TEA和N-羥基琥珀酰亞胺，并通過離心得到沉淀。通過離子交換柱除去由HOSu-PEG的水解產(chǎn)生的PEG二酸。在DI水中進(jìn)一步純化半乳糖-PEG(Gal-PEG)，并通過冷凍干燥得到產(chǎn)物。
3)將Gal-PEG二酸接枝到PLL上
采用與實(shí)施例2所述類似的Lac-PEG-PLL的接枝方法將Gal-PEG二酸接枝到PLL上。
提供上述實(shí)施例只是出于說明的目的，并且并不打算和不應(yīng)當(dāng)以任何方式構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在不偏離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，可以對本發(fā)明的化合物和方法作出各種改動，并且應(yīng)當(dāng)了解的是本發(fā)明僅僅受到所附權(quán)利要求限定的范圍的限制。
權(quán)利要求
1.一種用于聚合的基因載體的化合物，由聚乙二醇(PEG)接枝的聚(L-賴氨酸)(PLL)和定向部分(TM)組成，其中所說PLL的至少一個游離的氨基官能團(tuán)被所說的PEG取代，所說PLL的至少一個游離的氨基官能團(tuán)被所說的TM取代，并且所述接枝的PLL含有至少50％未取代的游離氨基官能團(tuán)。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中所說的PEG的分子量為0.5-20K道爾頓。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中所說的PEG的分子量為0.5-5K道爾頓。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中所說的PLL含有60-97％未取代的游離的氨基官能團(tuán)。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中所說的PLL的分子量為2K-100K道爾頓。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中所說的PLL的分子量為20K-30K道爾頓。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中所說的TM為一種可以被細(xì)胞膜受體識別的定向部分，選自乳糖和半乳糖。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中所說的TM為乳糖。
9.權(quán)利要求1的化合物，其中所說的TM為半乳糖。
10.一種含有權(quán)利要求1的化合物和核酸的組合物。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述的核酸含有編碼遺傳標(biāo)記的DNA序列，所述的遺傳標(biāo)記選自螢光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、潮霉素抗性基因和新霉素抗性基因以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。
12.權(quán)利要求10的組合物，其中所述的核酸含有編碼蛋白的DNA序列，所述的蛋白選自低密度脂蛋白受體、凝固因子、腫瘤的基因抑制劑、主要組織相容性蛋白、抗癌基因、p16、p53、胸苷激酶、IL2、IL4以及TNFα。
13.權(quán)利要求10的組合物，其中所述的核酸含有編碼病毒抗原的DNA序列。
14.權(quán)利要求10的組合物，其中所述的核酸編碼選自有義RNA、反義RNA和核酶的RNA。
15.權(quán)利要求10的組合物，其中所述的核酸編碼凝集素、甘露糖受體、唾液酸粘附素或逆轉(zhuǎn)錄病毒反式激活因子(TAT)。
16.一種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，所述的方法包括使所說的細(xì)胞與權(quán)利要求10的組合物在一定的條件下接觸，其中在所述的條件下所說的組合物進(jìn)入到所說的細(xì)胞中并且釋放出所說組合物的核酸。
17.一種轉(zhuǎn)染帶有識別TM的受體的細(xì)胞的方法，所述的方法包括使所說的細(xì)胞與含有權(quán)利要求1的化合物和核酸的組合物在一定的條件下接觸，其中在所述的條件下所說的組合物進(jìn)入到所說的細(xì)胞中并且釋放出所說組合物的核酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的TM為含有半乳糖的糖，其選自乳糖和半乳糖。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所說的TM為乳糖。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所說的TM為半乳糖。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的細(xì)胞為肝細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的細(xì)胞為肝癌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚合的定向基因送遞載體的化合物,所述的化合物由聚乙二醇(PEG)接枝的聚(L－賴氨酸)(PLL)和定向部分(TM)組成,其中PLL的至少一個游離的氨基官能團(tuán)被所說的PEG取代,PLL的至少一個游離的氨基官能團(tuán)被TM取代,并且接枝的PLL含有至少50%未取代的游離氨基官能團(tuán)。TM優(yōu)選為能夠特異地定向于肝癌細(xì)胞或肝細(xì)胞的乳糖或半乳糖。采用核磁共振波譜法鑒定了具有不同TM－PEG取代比例的新合成的載體。本發(fā)明新聚合的基因載體能夠與核酸形成穩(wěn)定且可溶的復(fù)合體,繼而能夠有效地轉(zhuǎn)化細(xì)胞。與PLL相連的PEG為基因/載體復(fù)合體提供了更好的溶解性并且在不具有相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性的情況下改善了轉(zhuǎn)染率。本發(fā)明公開了制備和使用TM－PEG－PLL作為聚合基因載體來有效地轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法。
文檔編號A61K47/34GK1333678SQ99815566
公開日2002年1月30日 申請日期1999年5月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月20日
發(fā)明者J·S·帕克, Y－H·喬, F·劉 申請人:表達(dá)遺傳學(xué)公司