專利名稱：乳房珠蛋白,一種分泌性乳房特異性乳腺癌蛋白的制作方法
相關申請本申請是1997年9月18日美國專利申請08/933,149的部分繼續(xù)申請，后者是1996年5月31日PCT/US96/08235和1995年5月31日的申請08/455,896即目前的美國專利5,668,267的部分繼續(xù)申請。有關政府基金本發(fā)明得到公共健康服務基金CA76227、CA76223-01和CA68485的資助。政府對本發(fā)明享有當然的權利。發(fā)明背景(1)發(fā)明領域本發(fā)明主要涉及乳腺癌病理領域，更具體地說，涉及用于檢測和治療乳腺癌的一段cDNA序列及其編碼的乳房特異性蛋白質。
(2)相關技術的說明乳腺癌是最常見的致死性癌癥之一。雖然，早期診斷和治療能降低該疾病的發(fā)病率和死亡率，但是乳房X照相術的陽性預測值據(jù)估計僅為25％(Hall等，《新英格蘭醫(yī)學雜志》(N Engl J Med)327319-328，1992，在此參考)。所以，需要一種方法能夠比乳房X照相術檢測更早檢測出癌癥，而遺傳或生物化學標記也許能夠提供這類補充和提高乳房X照相術陽性預測值的方法。(Hayes，美國臨床血液學腫瘤學(Hematol Oncol Clin N Am)8485，1994，在此參考)。
乳腺癌的發(fā)展伴隨著許多遺傳改變(參見Porter Jordan，美國臨床血液學腫瘤學873，1994，在此參考)。這類改變包括染色體總體改變和遺傳標記的丟失(Devilee等，《生物化學和生物生理學學報》(Biochim Biophys Acta)1198113，1994；Callahan等，《細胞生物化學雜志增刊》(J Cell Biochem Suppl)17167，1993，在此參考)。已證明，乳腺瘤形成的發(fā)展會導致已鑒定的編碼生長因子及其受體(Zajchowski等，《癌癥研究》(Cancer Res)487041，1988，在此參考)、結構蛋白(Trask等，《美國科學院院報》(Proc Natl Acad Sci)872319，1990，在此參考)、第二信使蛋白(Ohuchi等，《癌癥研究》262511，1986，在此參考)和轉錄因子(Harris，《癌癥研究進展》(Adv Cancer Res)59691992，在此參考)的基因在表達上的質變和量變。這些基因表達上的改變可能構成形成乳腺癌標記的基礎，盡管在患者的活組織檢驗樣品中，對這些基因的改變在乳腺癌病理方面的確切作用還知之不詳。
除了提供乳腺癌的遺傳或生物化學標記供早期診斷之用外，還需要一種腫瘤標記能夠對預后進行評估，用于選擇和評價治療的方法和用于導向性治療的方法。雖然已經(jīng)鑒定出了許多組織標記，但是都不夠敏感或缺乏腫瘤特異性，因而不適用于診斷或篩選一般性人群(同上)。所以，一直以來都需要一種乳腺癌標記，例如一種基因及其表達的蛋白，能夠用來特異性和選擇性地檢測出患者體內(nèi)乳腺癌的出現(xiàn)和病理發(fā)展，并可用于腫瘤特異性免疫治療。
用改良差異顯示聚合酶鏈反應技術分離乳腺癌差異表達的序列標簽，分離出了幾個序列片段，與正常組織對照相比，它們特定在瘤形成性乳腺上皮組織中表達(Watson和Fleming，《癌癥研究》544598-4602，1994，在此參考)。這類序列標記之一已被發(fā)現(xiàn)并被鑒定為DEST002，由此發(fā)現(xiàn)和分離出了一種新的全長cDNA及其編碼的蛋白質，即現(xiàn)在所稱的乳房珠蛋白(mammaglobin)。所述cDNA和蛋白質都是新的。
本發(fā)明綜述所以，本發(fā)明主要涉及鑒定在乳腺癌中表達增加的新基因，和由這些基因的mRNA分離cDNA。所以，申請人已經(jīng)成功地發(fā)現(xiàn)了一種新的cDNA及其編碼的乳房特異性分泌蛋白即乳房珠蛋白。該cDNA是純化及分離形式的，包含的一段核苷酸序列經(jīng)鑒定為SEQ ID NO15，其編碼的蛋白，即乳房珠蛋白，是純化及分離形式的，其氨基酸序列經(jīng)鑒定為SEQ ID NO2。
在美國專利5,668,267所作的小規(guī)模研究中，27％的I期原發(fā)性乳腺癌腫瘤過量表達乳房珠蛋白mRNA。本發(fā)明對多個階段及組織學類型的原發(fā)性乳腺癌進行了更大規(guī)模的研究，在約80％的受檢腫瘤中檢測到了乳房珠蛋白。這些信息提示，乳房珠蛋白基因的調節(jié)異常在乳腺癌早期就頻繁發(fā)生。因此，乳房珠蛋白及其cDNA的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)檢測和治療人等動物乳腺癌的新方法和新組合物提供了基礎。
因此，本發(fā)明涉及檢測樣品中乳房瘤形成性細胞存在的新方法。在實施方式之一中，使用一種聚核苷酸探針來檢測樣品中有否乳房珠蛋白mRNA。該方法包括(a)使樣品中的mRNA與特異性雜交含SEQ ID NO15的乳房珠蛋白mRNA或其等位變異體的聚核苷酸探針接觸；和(b)檢測探針與樣品中mRNA所成的雜交復合物。
本發(fā)明還提供一種通過雜交法檢測樣品中乳房瘤形成性細胞的試劑盒。該試劑盒包括裝在容器內(nèi)的能與含SEQ ID NO15的乳房珠蛋白mRNA或其等位變異體特異性雜交的聚核苷酸探針。
在本發(fā)明另一實施方式中，樣品中乳房珠蛋白的表達是通過檢測由樣品中乳房珠蛋白mRNA逆轉錄而成的cDNA來進行的。該方法包括以下步驟(a)在患者樣品中用逆轉錄法由mRNA生成編碼乳房珠蛋白的cDNA，(b)提供兩段用于聚合酶鏈反應的引物，它們所包含的寡核苷酸位于編碼乳房珠蛋白的cDNA的兩側或其中，和(c)用聚合酶鏈反應擴增編碼乳房珠蛋白的cDNA。這兩段引物宜具有核苷酸序列SEQ ID NO4和SEQ ID NO16。
本發(fā)明另一實施方式提供一種用聚合酶連反應法檢測樣品中乳房瘤形成性細胞的試劑盒。該試劑盒包括裝在容器中的兩段聚合酶鏈反應引物，它們位于編碼乳房珠蛋白的cDNA的兩側或其中。這兩段引物宜具有核苷酸序列SEQ ID NO4和SEQ ID NO16。
在本發(fā)明另一實施例中，用乳房珠蛋白的特異性抗體來檢測樣品中由腫瘤細胞表達的乳房珠蛋白。這種特異性抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
本發(fā)明還涉及治療乳房瘤形成性疾病的新的組合物和方法，所用的是乳房珠蛋白抗原，它能夠誘導針對表達乳房珠蛋白的腫瘤的抗體介導和/或細胞介導(即通過活化T細胞)的免疫應答。
本發(fā)明組合物實施例之一包含乳房珠蛋白B細胞抗原，它能夠激活乳房珠蛋白特異性B細胞。該B細胞抗原含有可被T輔助細胞識別的乳房珠蛋白特異性B細胞表位和TH表位或決定簇。
本發(fā)明另一實施例中，乳房珠蛋白抗原是可被乳房珠蛋白特異性細胞毒T淋巴細胞識別的乳房珠蛋白TC細胞抗原，它含有TC細胞表位和MHC I類分子的結合位點或抗原限制位(agretope)。
本發(fā)明組合物的另一實施例包含B細胞抗原和TC細胞抗原。治療乳房珠蛋白表達性腫瘤患者的方法包括過繼性免疫療法，該方法用乳房珠蛋白抗原體外刺激自患者分離的乳房珠蛋白特異性淋巴細胞，然后將活化的淋巴細胞返還患者；以及體內(nèi)激發(fā)抗乳房珠蛋白免疫應答，這包括給予患者含乳房珠蛋白抗原的疫苗。
所以，在本發(fā)明的優(yōu)點中值得一提的是，本發(fā)明提供了可作為乳腺癌細胞標記的一段核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列；提供了早期檢測乳房瘤形成性細胞的方法；提供了能夠對乳房X照相術進行補充并提高預測準確性的乳腺癌檢測方法；提供了能夠評估預后的方法；提供了可實現(xiàn)定向性治療的標記；以及提供了激發(fā)抗腫瘤的細胞和體液免疫應答的組合物。
附圖簡述

圖1描述用來分離全長乳房珠蛋白cDNA的策略，包括cDNA末端快速擴增(RACE)聚合酶鏈反應(PCR)技術，然后，亞克隆到載體pGEM7Z和pCEV27內(nèi)；圖2描述人cDNA序列(SEQ IN NO1)(上方為核苷酸編號)和所編碼乳房特異性蛋白質即乳房珠蛋白的氨基酸序列(SEQ IN NO2)(下方為氨基酸編號)，實線表示RACE PCR法分離得到的403bp片段(SEQ IN NO5)，空心線表示206bp的DEST002序列(SEQ IN NO6)；圖3顯示乳房特異性乳房珠蛋白(hMAM)的氨基酸序列(SEQ IN NO2)與大鼠前列腺甾體結合蛋白亞基C3(rPSC3)(SEQ IN NO7)以及人克拉拉細胞10kD蛋白(hCC10)(SEQ IN NO8)的比較，相同氨基酸以粗體字母和雙線標記，結構類似的氨基酸以單線標記；圖4A顯示編碼乳房特異性乳房珠蛋白(hMAM)的人cDNA序列與乳腺瘤發(fā)生組織、正常乳房組織以及其他成年組織所表達mRNA雜交的Northern印跡分析；圖4B是乳腺瘤發(fā)生組織、正常乳房組織以及其他成年組織的RT/PCR擴增樣品的分析；圖5顯示在體外兔網(wǎng)織紅細胞裂解液試驗系統(tǒng)中乳房特異性cDNA序列的翻譯；圖6顯示用編碼乳房珠蛋白的cDNA進行的Northern印跡雜交，該圖顯示在腫瘤2410、另8名患者中3人的腫瘤(粗體)中檢測到了mRNA，正常乳房組織中較少(斜體)，并在兩種情況下比較了腫瘤組織和患者相應正常組織內(nèi)乳房珠蛋白mRNA的表達(右側的4根泳道)；圖7顯示用乳房珠蛋白C末端(SEQ ID NO14)的多克隆抗體對MDA-MB-415乳腺癌細胞沒有(-)和有(+)免疫性肽存在下的條件培養(yǎng)基(S)和細胞裂解液(C)進行的Western印跡分析，該圖顯示，在細胞培養(yǎng)基和細胞裂解液中分別檢測到了乳房珠蛋白的前體形式和分泌形式；圖8顯示用抗乳房珠蛋白多克隆抗體對生長于沒有(-)和有(+)衣霉素(它阻斷糖基化)條件下的MDA-MB-415乳腺癌細胞培養(yǎng)基(S)和細胞裂解液(C)進行的Western印跡分析，該圖顯示，在N-連接糖基化被抑制的細胞裂解液或培養(yǎng)基中沒有可測水平的乳房珠蛋白；
圖9顯示人乳腺癌細胞裂解液的Western印跡分析，通過酶聯(lián)化學發(fā)光顯示，用抗乳房珠蛋白多克隆抗體和山羊抗兔抗體檢測到乳房珠蛋白前體；圖10顯示用抗乳房珠蛋白多克隆抗體對孕期及產(chǎn)后人乳房分泌液進行的Western印跡分析，該圖顯示在增殖期乳腺中檢測到分泌性乳房珠蛋白；圖1lA是患者乳腺癌細胞石蠟固定切片的彩色照片，用抗乳房珠蛋白多克隆抗體和聯(lián)有辣根過氧化物酶的山羊抗兔抗體，并以DAB為底物進行的免疫學組織學化學染色，表達乳房珠蛋白的細胞被染成棕色；圖11B是患者乳腺癌細胞石蠟固定切片的黑白照片，用抗乳房珠蛋白多克隆抗體和聯(lián)有辣根過氧化物酶的山羊抗兔抗體，并以DAB為底物進行的免疫學組織學化學染色，圖中指示出被染成棕色的乳房珠蛋白表達細胞；圖12顯示純原位乳管瘤(DCIS)(圖12A，B)，分化良好的乳管瘤(圖12C，D)和分化不良乳管瘤(圖12E，F(xiàn))相同組織切片中乳房珠蛋白的免疫反應性，其中圖12A，C，E以乳房珠蛋白抗血清免疫組化染色，圖12B，D，F(xiàn)以免疫前血清免疫組化染色；圖13顯示各種淋巴結樣品RNA的Northern印跡照片，這些樣品具有經(jīng)組織學證明的原發(fā)性乳腺瘤(泳道1—20，27)、頭頸鱗狀細胞瘤(泳道21、23、24)、子宮內(nèi)膜癌(泳道22)和結腸腺癌(28)的轉移，作為陰性對照的是取自無任何已知癌癥患者的淋巴結活組織切片(泳道29—33)，陽性對照是正常乳房組織的樣本(泳道34)，其中，上排與乳房珠蛋白cDNA雜交，下排與角蛋白cDNA雜交；圖14是轉移性乳腺癌(CA)患者或正常人(NL)RNA RT-PCR產(chǎn)物的Southern印跡照片，RNA獲自收集的外周血干細胞，以乳房珠蛋白cDNA探針進行檢測。
優(yōu)選實施方式的描述本發(fā)明內(nèi)容之一是基于cDNA SEQ IN NO1的鑒定與測序，它編碼一種乳房特異性分泌蛋白，乳房珠蛋白，即SEQ IN NO2(圖2)。如后文所述，本發(fā)明分離得到了全長的乳房珠蛋白cDNA由腫瘤細胞mRNA逆轉錄開始，接著以PCR擴增，然后亞克隆到表達載體中。此外，本發(fā)明還鑒定了該cDNA所編碼的乳房珠蛋白，并描述了其特征。
用稱為DEST002的匿名序列標簽發(fā)現(xiàn)，此前未知但在此鑒定為乳房珠蛋白的相應基因產(chǎn)物在乳腺癌腫瘤細胞系MDA-MB-415中特別豐富。為了分離全長乳房珠蛋白cDNA，對該細胞系的mRNA進行逆轉錄，并用RACE PCR技術(Edwards等，核酸研究195227-32，1991)進行克隆。該技術的基礎是將單鏈寡脫氧核糖核苷酸連接于單鏈cDNA3′末端的策略。圖1展示了用于分離乳房珠蛋白cDNA的該方法。
根據(jù)以上方法所得的403bp片段(SEQ ID NO5)(圖2)信息以及我們早期研究(Watson和Fleming，同上)由相應DEST序列(DEST002，SEQ ID NO6)所得的序列信息，推導出了全長的503bp cDNA序列(SEQ ID NO1)。在這503bp的cDNA中有一個279bp的開放式讀碼框(SEQ ID NO15)，它編碼一段93氨基酸，預計分子量為10.5kD的多肽(SEQ ID NO2)(圖2)。該開放式讀碼框的第一個甲硫氨酸位于一段近乎完美的Kozak共有序列(Kozak，細胞227-8，1980)內(nèi)。該序列上游的60bp內(nèi)沒有其他框內(nèi)甲硫氨酸或翻譯終止子。該cDNA的3′非翻譯區(qū)有163bp，含有聚腺苷酸化信號AATAAA，位于原DEST002序列引發(fā)位點的上游12bp處。以上信息表明分離得到的是全長乳房珠蛋白cDNA。所編碼多肽的前19個殘基可能是一段疏水性肽信號序列，殘基53-55和68-70是共有的N連接糖基化位點，這表明乳房珠蛋白是一種分泌性糖蛋白。
用BLAST算法(Benson等，核酸研究212963-2965，1993；Altschul等，分子生物學雜志215403-410，1990)在Genbank中檢索與乳房珠蛋白cDNA序列類似的DNA序列，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的DNA序列同源性。因此，乳房珠蛋白cDNA應認為是一種新的，此前未知的DNA序列。
對其他多肽進行乳房珠蛋白相關序列檢索，發(fā)現(xiàn)乳房珠蛋白與其他多肽之間存在著氨基酸序列同源性。乳房珠蛋白與大鼠前列腺甾體結合蛋白(前列腺蛋白)C3亞基(rPSC3)的氨基酸一致性為42％(若包括保守性取代則為58％)(圖3)(SEQ DI NO7)。大鼠前列腺甾體結合蛋白是大鼠腹前列腺內(nèi)的一種主要分泌蛋白，是由不同的2個二聚體亞基C3/C1和C3/C2構成的四聚體蛋白質(Parker等，Ann N Y Acad Sci438115-124；Parker等，甾體生物化學雜志2067-71，1984)。C1，C2和C3的基因都編碼約6kD的分泌蛋白，據(jù)信這是基因復制的結果，但是，雖然C1與C2的基因極其相似，它們與C3基因則大不相同。因此，乳房珠蛋白與C1或C2蛋白沒有序列同源性。
如上所述，前列腺甾體結合蛋白(前列腺蛋白)是大鼠腹前列腺內(nèi)的一種主要分泌蛋白，其表達受腎上腺素類甾體的調控(Parker等，Ann N Y Acad Sci438115-124；Parker等，甾體生物化學雜志2067-71，1984)。另一種蛋白質，人estramustin結合蛋白(hEMBP)在人的前列腺、乳腺癌和人惡性黑素瘤中表達(Bjork等，癌癥研究421935-1942，1982；Bjork等，抗癌研究111173-82，1991)。人estramustin結合蛋白的免疫化學性質與大鼠的estramustin結合蛋白相似，后者據(jù)推斷與大鼠甾體結合蛋白前列腺蛋白相同。如前所述，乳房珠蛋白的氨基酸序列與前列腺蛋白C3亞基的一致性為42％，若包括保守性取代則為58％。因此，乳房珠蛋白可能與hEMBP具有某種聯(lián)系。然而，雖然前列腺蛋白和hEMBP都存在于前列腺，該組織中卻完全沒有乳房珠蛋白的mRNA。因此，乳房珠蛋白既不與hEMBP相同也不是其亞基，而且，因為尚未確定hEMBP的序列，所以無從知道乳房珠蛋白與hEMBP的某片段或亞基是否具有相似性。
雖然最近的報道稱，rPSC3啟動子與SV40 T抗原融合在轉基因小鼠中同時造成前列腺癌和乳腺癌(Maroulakou等，美國科學院院報1911236-11240，1994；Sandmoller等，致癌基因92805-2815，1994)，但卻不知道該蛋白質的真正生物學功能。而且，雖然假設大鼠前列腺甾體結合蛋白與人EMBP相關，但未曾鑒定到與rPCS3對應的人多肽或人基因。因此，乳房珠蛋白及其編碼cDNA是此前未知的新序列。
與和乳房珠蛋白和rPSC3蛋白質序列的顯著性BLAST分值較低的其他序列手工排列對比，我們發(fā)現(xiàn)了與人克拉拉細胞10kD蛋白(hCC10)(SEQ IN NO8)(Peri等，臨床研究雜志922099-2109，1993)(圖3)，以及兔和小鼠子宮球蛋白(Miele等，內(nèi)分泌研究8474-90，1987；Cato和Beato，抗癌研究565-72，1985；Miele等，內(nèi)分泌研究雜志17679-692，1994)的其他同源物。根據(jù)物種，這些同源物的一致性為26％，包括保守性取代則為40％。特別是，許多氨基酸在以上所用蛋白質間完全保守，其中包括已知在子宮球蛋白亞基間二硫鍵形成中起作用的Cys-3和Cys-69(見后文)。這些同源物表明，乳房珠蛋白是一個上皮細胞所分泌的蛋白質小家族中的一個新成員(Miele等，1994，同上)。
hCC10基因是兔和小鼠子宮球蛋白基因的人同源基因(Peri等，臨床研究雜志922099-2109，1993)。最初認為子宮球蛋白是兔子宮內(nèi)的一種分泌蛋白，但此后被發(fā)現(xiàn)存在于肺、乳房和前列腺等其他上皮器官內(nèi)。與大鼠前列腺蛋白不同，子宮球蛋白是一種均二聚體蛋白質，由保守性殘基Cys-2和Cys-69處的兩根二硫鍵偶聯(lián)而成(Miele等，1994，同上)。雖然子宮球蛋白基因的轉錄受甾體類激素的調控，但對該蛋白質本身結合黃體酮等甾體類激素的能力尚無定論，而且也不知道該蛋白質的確切生物學功能(Miele等，1994，同上)。
乳房珠蛋白僅在乳腺內(nèi)表達。這與rPSC3在大鼠腹側前列腺內(nèi)表達(Parker等，Ann N Y Acad Sci.438115-1124，1984)，hCC10/子宮球蛋白在肺、子宮、前列腺和乳房等多種組織內(nèi)表達(Miele等，1987，同上；Cato和Beato，同上；Miele等，1994，同上)不同。因為乳房珠蛋白與這些蛋白質之間存在序列同源性，我們測定了組織特異性表達的方式。
500bp的乳房珠蛋白mRNA在腫瘤樣本2410(分離得到該原初序列標簽的組織)中很多，在正常的人乳房組織中則少得多(圖4A)。無限繁殖化的乳房上皮細胞系B5-589中未測到乳房珠蛋白mRNA。在人子宮和肺這兩個有子宮球蛋白表達的部位也未測到乳房珠蛋白的表達。
通過RT/PCR擴增在腫瘤2410和正常乳房組織中檢測到了乳房珠蛋白mRNA，但在受檢的其他15種組織中則沒有，這些組織包括正常表達rPSC3和子宮球蛋白的組織(肺、子宮、前列腺)，激素應答性和甾體生成性組織(卵巢、睪丸、胎盤)，及其他分泌性上皮器官(結腸)(圖14)。所以，乳房珠蛋白mRNA的表達具有乳房組織相對特異性。
為了清楚地證明乳房珠蛋白表達的乳房特異性，用全長乳房珠蛋白cDNA在更具有廣泛行和定量性的一組成人和胎兒組織集合樣群的聚A選擇的mRNA中檢測乳房珠蛋白mRNA，參見后文實施例2A。在唾液腺等其他密切相關的頂質分泌腺中完全沒有乳房珠蛋白mRNA表達，在外周血白細胞、淋巴結和骨髓中也沒有。除乳腺外，在受檢的其他43份成人和7份胎兒組織中都未測到乳房珠蛋白mRNA。這證實乳房珠蛋白基因的表達可能是一個極具特異性的乳腺癌標志。
根據(jù)該報道的研究，乳房珠蛋白是一種相對乳房特異性蛋白質。已知在乳腺癌中過表達的另兩種基因是erb-B和細胞周期蛋白D(Jardines等，病理生物學61268-282，1994；Keyomars和Pardee，美國科學院院報901112-1116，1993)。與erb-B或細胞周期蛋白D的過表達不同，乳房珠蛋白的過表達可能反映了更特異性的乳房上皮細胞改變，而不是普遍的生長或有絲分裂速度提高。因此，乳房珠蛋白基因調控異常的出現(xiàn)對于腫瘤的治療易感性或臨床進程具有更特殊的意義。
據(jù)美國專利5,668,267報道，通過Northern印跡雜交在2410腫瘤樣本和15種不同組織學類型I期原發(fā)性乳腺癌的4種(27％)中檢測到乳房珠蛋白mRNA過表達。這一百分比與諸如erb-B擴增和p53突變等其他基因改變的普遍性相當(Slamon等，科學244707-712，1989；Thor等，自然癌癥研究雜志84845-855，1992)。而且，因為我們僅對I期腫瘤進行分析，所以，乳房珠蛋白過表達實際上在這一腫瘤亞組中比其他基因改變更普遍(Alllerd等，自然癌癥研究雜志85200-206，1993)。以上數(shù)據(jù)表明，乳房珠蛋白過表達并不特定于一種腫瘤樣本，實際上在原發(fā)性乳腺癌中比較普遍。而且，所有受檢腫瘤都是I期這一事實表明這種調節(jié)異常發(fā)生于乳腺癌的較早期。
以一步RT/PCR試驗的靈敏度無法測知正常淋巴結或外周血淋巴細胞中乳房珠蛋白的過表達。然而，如后文所述，在轉移性乳腺癌患者的40％淋巴結和60％外周血干細胞收集樣品中檢測到了乳房珠蛋白mRNA。該結果表明，和其他上皮特異性基因一樣，檢測外周淋巴結和血干細胞中乳房珠蛋白的轉錄可用于檢測潛在的乳腺癌轉移(Schoenfeld等，癌癥研究542986-2990，1994)。
為了證明乳房珠蛋白cDNA編碼一種可翻譯蛋白質，將該cDNA克隆用于體外翻譯試驗。圖5顯示乳房珠蛋白cDNA在兔網(wǎng)織紅細胞裂解液中的蛋白質產(chǎn)物。乳房珠蛋白cDNA產(chǎn)生一種約6kD的蛋白質。該表觀分子量比根據(jù)開放式讀碼框理論翻譯所估計的小，但兔和人子宮球蛋白翻譯產(chǎn)物也有相同的發(fā)現(xiàn)。
為了檢測乳房珠蛋白表達在乳腺癌中的普遍性，用對應于乳房珠蛋白C末端序列的一種多肽產(chǎn)生兔多克隆抗乳房珠蛋白抗體，并用該抗體檢測了100種不同階段和組織學類型的原發(fā)性乳腺癌腫瘤，通過免疫組織化學分析來檢測乳房珠蛋白的表達。如后文表1所歸納的，這些腫瘤中80％以上對乳房珠蛋白呈強免疫陽性，染色性與腫瘤的階段無關。這一結果表明，臨床樣品中的乳房珠蛋白檢測可用作原發(fā)性乳腺癌靈敏且特異的標志。
因為申請人認為乳房珠蛋白是一種分泌蛋白，所以估計能在其腫瘤過表達該基因產(chǎn)物的患者的血清中檢測到該蛋白質的表達。因此，乳房珠蛋白可望在臨床上象前列腺特異性抗原(PSA)和其他實體瘤標志那樣來診斷乳腺癌患者(“診斷病理學中的腫瘤標志”，臨床實驗室醫(yī)學101-250，1990)。
乳房珠蛋白是乳腺癌標志的鑒定結果為本發(fā)明的另一方面內(nèi)容即檢測患者乳腺癌的方法提供了基礎?！皺z測”一詞在此用于有關乳腺癌形成性疾病檢測的內(nèi)容中時包括測定患者體內(nèi)乳腺癌的存在，將乳腺癌與其他疾病相區(qū)別，就該病可能的后果以及恢復可能性作出預后估計，疾病狀態(tài)或復發(fā)的監(jiān)測，確定適合患者的優(yōu)選治療分案，以及實現(xiàn)定向的抗腫瘤治療。
監(jiān)測乳腺癌的方法之一包括用一段聚核苷酸與乳腺癌形成性細胞的mRNA雜交。該聚核苷酸含有SEQ IN NO15的互補序列或該互補序列的衍生物。在此，聚核苷酸包括DNA和/或RNA，因此，序列表中以DNA序列表示的核苷酸序列也包括以尿嘧啶取代胸腺嘧啶的相同RNA序列。一段核苷酸序列的衍生物與其來源序列的序列一致性足以使得它能在相同的嚴謹性條件下，與其來源序列一樣地與乳腺癌形成性細胞的乳房珠蛋白mRNA雜交。衍生核苷酸序列不一定物理性地衍生自源核苷酸序列，而可以通過化學合成或DNA復制或逆轉錄或轉錄等各種方法產(chǎn)生。優(yōu)選的衍生核苷酸序列包括SEQ IN NO15互補序列的片段，與SEQIN NO15所示乳房珠蛋白編碼序列的等位變異體的互補序列相同的序列。
為了在乳腺癌檢測系統(tǒng)中檢測編碼乳房珠蛋白的mRNA的存在，需獲得患者樣品。樣品可以是組織活檢樣品或血液、血漿、血清等樣品。可處理樣品以抽提出其中的核酸。較好的是，對由該樣品獲得的核酸進行凝膠電泳或其他大小分離技術。
檢測包括使核酸，具體為樣品中的mRNA與聚核苷酸探針接觸，形成雜交雙鏈?！疤结槨敝改軌蛞蚱渑c靶區(qū)域內(nèi)一段序列的互補性而與靶序列形成雜交結構的的聚核苷酸結構。
可用已知方法檢測形成的雙鏈。通常用標記過的探針來形成雜交雙鏈。或者，探針不標記，但可以通過與一種標記過的配體直接或間接的特異性結合來測定。合適的標記和標記探針及配體的方法是業(yè)內(nèi)已知的，包括，例如，可用已知方法摻入的(例如切口平移或激酶作用)放射性標記，生物素，熒光基團，化學發(fā)光基團(例如dioxetans，特別是被觸發(fā)的dioxetans)，酶，抗體等。
用乳房珠蛋白cDNA進行檢測時，為避免假陽性，可采用高嚴謹性條件。所用探針含乳房珠蛋白編碼序列的互補序列的衍生序列時，可采用嚴謹性較低的條件。雜交嚴謹性由雜交過程和洗滌過程中的諸多因素決定，包括溫度，離子強度，時間和甲酰胺的濃度。這些因素的概述可參見例如Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，第2版，1989)。
為了提高樣品中乳房珠蛋白mRNA檢測的靈敏度，可用逆轉錄/聚合酶鏈反應技術(RT/PCR)來擴增自編碼乳房珠蛋白的mRNA轉錄得到的cDNA。RT/PCR法是業(yè)內(nèi)熟知的(例如，參見Watson和Fleming，同上)?？捎米鲾U增引物的寡核苷酸含有SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。較好的是，乳房珠蛋白的正向擴增引物為5′-AGCACTGCTACGCAGGCTCT-3′(SEQ ID NO16)，反向擴增引物為5′-ATAAGAAAGAGAAGGTGTGG-3′(SEQ ID NO4)。
也可以用其他已知方法(例如連接酶鏈反應)擴增逆轉錄所得cDNA中的乳房珠蛋白靶序列，這些方法包括缺口LCR(G-LCR)及其他變化形式，或自動維持序列擴增(3SR)及其各種變化形式。此外，可通過不對稱缺口LCR(AG-LCR)直接檢測乳房珠蛋白mRNA。參見，例如，Leckie等，“用連接酶鏈反應檢測傳染性疾病”，分子生物學和生物技術，R.A.Myers等編輯，pp.463-466，VCH Publisher，1995)。
在本發(fā)明另一實施例中，可用乳房珠蛋白cDNA序列或其衍生物描述乳腺癌患者樣本中乳房珠蛋白基因的各種改變(即，基因重排，基因擴增或基因缺失)。這提供了一種在不含完整mRNA的患者樣本或樣品中仍能檢測基因結構改變的方法。
在該技術的一種應用中，使乳房珠蛋白cDNA序列或其衍生物與分離自患者腫瘤、正常組織或淋巴細胞的基因阻DNA雜交，并用一種或多種限制性核酸內(nèi)切酶消化。用業(yè)內(nèi)熟知的Southern印跡法，該試驗可確定患者或患者的乳腺瘤是否具有被缺失、重排或擴增的乳房珠蛋白基因。對這些改變的檢測可為預后和患者治療的估計提供重要信息。
在該技術的第二種應用中，可用一對或多對基于乳房珠蛋白cDNA序列或其互補序列的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈反應擴增患者樣品中的乳房珠蛋白基因節(jié)段。對所得PCR產(chǎn)物的分析顯示乳房珠蛋白基因的某特定節(jié)段是否缺失或重排。這樣的信息對預后和治療有用。
檢測乳腺癌的另一種方法包括檢測患者的樣品中有否前體和/或分泌形式的乳房珠蛋白多肽。本領域已知的各種蛋白質檢測方法都可使用。這類方法包括但不限于免疫擴散、免疫電泳，免疫化學法，結合劑-配體(binder-ligand)試驗，免疫組織化學技術，凝集和補體試驗。(例如，參見基礎和臨床免疫學，Sites和Terr編輯，Appleton & Lange，Norwalk，Conn.pp217-262，1991)。優(yōu)選的是結合劑-配體免疫試驗，該試驗包括抗體與乳房珠蛋白的一個或多個表位反應，從而競爭性地取代標記過的乳房珠蛋白多肽或其衍生物。
在此，“乳房珠蛋白多肽”包括非糖基化和糖基化前體形式以及糖基化分泌形式的天然乳房珠蛋白，及其衍生物和片段。天然表示該肽可分離自例如正常和/或患病生物等天然來源，而且未曾人工修飾過。本發(fā)明鑒定的天然乳房珠蛋白多肽包括含SEQ ID NO2的前體形式和含SEQ ID NO17(SEQ ID NO2內(nèi)的氨基酸20-93)的分泌形式。天然乳房珠蛋白多肽還包括SEQ ID NO2的等位變異體。
乳房珠蛋白多肽衍生物指含有一段至少10個氨基酸且與天然乳房珠蛋白一部分基本相同的節(jié)段的多肽。該基本相同節(jié)段以至少約20個氨基酸為佳，至少約50個氨基酸更好，至少約75個氨基酸最好。如果兩條多肽經(jīng)例如BLAST之類序列對準程序(采用缺口罰分和其他參數(shù)的默認設置)，進行最佳對準后具有80％以上序列一致性，則認為它們基本相同，一致性至少90％為佳，至少95％更好，至少99％最好。較好的是，殘基不相同位置上的差異來自保守性氨基酸取代。
保守性氨基酸取代指具有類似側鏈的殘基之間的可互換性。例如，具有脂族側鏈的一組氨基酸是甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸；具有脂族-羥基側鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側鏈的一組氨基酸苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有堿性側鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守性取代氨基酸組是纈氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。
乳房珠蛋白多肽的衍生物最好能與對天然乳房珠蛋白或其片段特異性的單克隆或多克隆抗乳房珠蛋白抗體反應。
“片段”和“肽”在此指氨基酸序列與根據(jù)全長乳房珠蛋白cDNA(例如，SEQID NO1)推導所得氨基酸序列相同，但具有氨基末端和/或羧基末端缺失的乳房珠蛋白多肽。通常，乳房珠蛋白片段或多肽長至少3個氨基酸。乳房珠蛋白片段或多肽以長至少6個氨基酸為宜，約12個更好，約25個更好，約50個以上最好。
本領域已知許多競爭性和非競爭性蛋白質結合免疫試驗。此類試驗所用抗體可以是不標記的，例如凝集試驗所用的抗體，或許多試驗中所用的標記過的抗體。可用的標記包括放射性免疫試驗(RIA)，酶免疫試驗(例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA))，熒光免疫試驗等中所用的放射性核素，酶，熒光劑，化學發(fā)光劑，酶底物或輔因子，酶抑制劑，顆粒，染料等。
可用各種本領域已知的方法制造含B細胞表位的乳房珠蛋白多肽的多克隆或單克隆抗體，以用于免疫試驗。在此，“B細胞表位”指乳房珠蛋白多肽的一種抗原決定簇。該B細胞表位可含有具有獨特空間構象的3個氨基酸。通常，一個B細胞表位由至少5個此類氨基酸構成。測定氨基酸空間構象的方法是本領域已知的，包括例如X射線晶體學和2維核磁共振。
制備某蛋白質的抗體的方法之一是選擇和制備該蛋白質完整或部分的氨基酸序列，化學合成該序列，并將其注射給合適動物，通常是兔或小鼠。
制備乳房珠蛋白多肽的方法包括但不限于化學合成，重組DNA技術或自生物樣品中分離。化學合成含表位的肽可通過例如經(jīng)典Merrifeld固相肽合成法(Merrifeld，美國化學協(xié)會雜志852149，1963)或快速自動多樣肽合成系統(tǒng)上的FMOC法(DuPont Company，Wilmington，DE)(Caprino和Han，有機化學雜志373404，1972)進行。
制備多克隆抗體可以通過腘淋巴結注射抗原免疫兔，然后間隔2周腹膜內(nèi)注射抗原增強。取動物的血液，用純化的乳房珠蛋白分析血清，通常為ELISA。制備單克隆抗體可根據(jù)Milstein和Kohler的方法將免疫小鼠的脾細胞與持續(xù)復制的腫瘤細胞，例如骨髓瘤或淋巴瘤細胞融合。(Milstein和Kohler，自然256495-497，1975；Gulfre和Milstein，酶學中的方法免疫化學技術731-46，Langone和Banatis編輯，Academic Press，1981)。然后，用有限稀釋法克隆由此形成的雜交瘤細胞，用ELISA或RIS分析上清液中抗體的產(chǎn)生。
這樣制得的抗乳房珠蛋白多克隆或單克隆抗體可用于自表達乳房珠蛋白的細胞中分離和純化前體和分泌形式的乳房珠蛋白。例如，如后文所述，一種抗16C末端氨基酸(根據(jù)乳房珠蛋白cDNA推斷)(Glu-Val-Phe-Met-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asp-Ser-Ser-Leu-Cys-Asp-Leu-Phe，SEQ ID NO14)的多克隆抗體能結合前體和分泌形式的乳房珠蛋白，以及體外翻譯系統(tǒng)合成的乳房珠蛋白?？捎脴I(yè)內(nèi)已知的方法，例如親合性層析，用抗乳房珠蛋白抗體來分離乳房珠蛋白。
抗體識別腫瘤細胞表達的靶抗原并與之特異性結合的獨特能力提供了一種治療癌癥的方法。(參見，LoBuglio和Saleh，美國醫(yī)學科學雜志304214-224，1992；Banshawe，高級藥理學2499-121，1993)。因此，本發(fā)明還提供一種預防和治療動物乳腺癌的方法，其基礎是使用針對乳腺癌細胞過表達的乳房珠蛋白的抗體。
可用各種業(yè)內(nèi)已知的方法產(chǎn)生多克隆或單克隆的乳房珠蛋白特異性抗體。例如，可用雜交技術產(chǎn)生小鼠或人單克隆抗體。也可將乳房珠蛋白或其免疫學活性衍生物或片段，或抗獨特型抗體或其片段給予動物，激發(fā)B細胞產(chǎn)生能夠識別乳房珠蛋白過表達細胞的抗體。
用一種或多種癌裂解物質，例如放射性核素、毒素或細胞毒性藥物，標記以上產(chǎn)生的抗體或其片段，然后給予懷疑患有乳腺癌的患者。標記抗體與乳腺癌細胞所表達的乳房珠蛋白結合，于是導致癌細胞死亡。
許多業(yè)內(nèi)已知的癌裂解物質都可用來產(chǎn)生上述標記抗體。例如，可將植物和細菌毒素與抗體偶聯(lián)來制造免疫毒素。這樣的毒素包括蓖麻毒蛋白、白喉毒素和假單胞菌外毒素A。還可以制造化療劑與抗體連接而成的藥物-抗體偶聯(lián)物。適用的化療劑包括，例如，托莫昔芬(tomoxifen)，阿霉素，甲氨蝶呤，苯丁酸氮芥，長春堿和絲裂霉素。此外，還可以制造放射性核素與抗體穩(wěn)定連接的放射性免疫偶聯(lián)物。適合制造放射性免疫偶聯(lián)物的放射性核素包括，例如131I、188Re、186Re、67Cu、90Y和47Sc等β輻射體；211At、212Bi和212Pb等α輻射體；125I和77Br等俄歇電子輻射體；和10B等可裂變核素。
高比例的乳腺瘤表達乳房珠蛋白這一事實是本發(fā)明用乳房珠蛋白抗原激活乳房珠蛋白特異性B和/或T淋巴細胞(Tc)這方面內(nèi)容的基礎。因此，本發(fā)明提供乳房珠蛋白B細胞抗原和Tc細胞抗原；含至少一種B細胞乳房珠蛋白抗原和/或Tc乳房珠蛋白抗原，用于誘導抗乳房珠蛋白表達腫瘤的抗體介導和/或細胞介導免疫反應的疫苗，以及治療乳房珠蛋白表達性腫瘤乳腺癌患者的方法。本發(fā)明方法之一給予患者活化的乳房珠蛋白特異性淋巴細胞。另一種方法給予患者乳房珠蛋白特異性疫苗。
在此，“乳房珠蛋白抗原”包括含有可被乳房珠蛋白特異性B細胞或Tc細胞識別的B細胞表位或Tc細胞表位的天然乳房珠蛋白多肽，或其衍生物和片段。
乳房珠蛋白B細胞抗原具有乳房珠蛋白特異性B細胞表位和TH細胞表位?！癇細胞表位”指若給予動物，可被B細胞上抗乳房珠蛋白免疫球蛋白受體識別，并能在TH細胞的適當協(xié)助下誘導產(chǎn)生抗體的抗原、半抗原、表位或抗原決定簇。B細胞表位具有至少4個氨基酸的序列。較好的是，B細胞表位長至少6-25個氨基酸，長約15-22個氨基酸更好。B細胞表位的氨基酸序列可以與天然乳房珠蛋白片段中的一段連續(xù)氨基酸序列相同或基本相同。B細胞表位的氨基酸序列也可以與代表乳房珠蛋白組裝拓撲決定簇的一段不連續(xù)氨基酸序列相同或基本相同。
“TH細胞表位”指可通過結合MHCII類分子而被T輔助細胞識別的抗原決定簇。T輔助細胞的活化誘導靜息乳房珠蛋白特異性B細胞分化成為高親合力的IgG分泌細胞，即誘導了次級抗體應答。制備并使用含B和TH細胞決定簇的免疫原性肽通過T細胞輔助作用產(chǎn)生高效價的特異性抗體的生成性B細胞是本領域已知的，參見，例如，Cheronis等，美國專利5,573,916，Denton等，癌癥通訊70143-150(1993)，Borras-Cuesta等，歐洲免疫學雜志17，1213-1215(1987)，和Good等，科學2351059-1062(1987)。TH細胞表位可含有乳房珠蛋白或一種異源蛋白質的氨基酸序列，例如，Denton等描述了在用合成肽免疫的小鼠中誘導抗粘蛋白的抗體反應，粘蛋白是一種由分泌性上皮細胞表達的復合糖蛋白，與乳腺癌及其他癌癥相關，所述合成肽含中，來自MUC-1粘蛋白核心的B細胞決定簇區(qū)與已知T輔助細胞決定簇即流感血凝集素A/X-31的111-120序列相連。TH細胞表位含有約6-20個氨基酸的序列，約8-18個殘基為佳，9-15個殘基的更好。
乳房珠蛋白的TC細胞抗原含有一個TC細胞表位和一個MHCI類表位?！癟C細胞表位”指由抗原呈遞細胞表面上的MHCI類分子呈遞時可被乳房珠蛋白特異性TC細胞識別的各種抗原、表位或抗原決定簇?！癕HCI類表位”指可被MHCI類分子識別，并由抗原呈遞細胞(APC)上的MHCI類分子呈遞給乳房珠蛋白特異性TC細胞的氨基酸序列。所述TC細胞抗原和MHCI類表位包含在一段與天然乳房珠蛋白相同或基本相同的約6-11個氨基酸的氨基酸序列中。較好的是，該序列長8或9個氨基酸。
鑒定某蛋白質抗原的B和TC細胞表位的方法是業(yè)內(nèi)已知的。例如，可用標準免疫生物學技術測定乳房珠蛋白特異性B細胞或TC細胞對跨越分泌性乳房珠蛋白的重疊合成肽的應答能力?？梢詫﹁b定為抗原性的這些肽一次性修飾一個或數(shù)個氨基酸，從而優(yōu)化其激活乳房珠蛋白特異性B或TC細胞的能力。
還可以用市售表位圖譜試劑盒制作B細胞表位圖，包括篩選C末端結合在聚乙烯多針支持體(例如Cambridge Research Biochemicals)上的隨機肽。
也可以檢索推定乳房珠蛋白氨基酸序列上符合已知MHCI類或II類分子結合基序的序列。參見，例如Hill等，自然360434(1992)，Pamer等，自然360852(1992)和Hammer等，實驗醫(yī)學雜志1761007(1992)和Falk等，自然351290-296(1991)。例如，可如Peoples等所述(美國科學院院報92432-436(1995))，檢索乳房珠蛋白氨基酸序列上的HLA-A2-結合肽來鑒定可被乳腺瘤特異性CTL識別的抗原性肽。當患者表達HLA-A2時(約50％高加索人表達HLA-A2)，宜選擇HLA-A2作為抗原呈遞分子。可以合成推定HLA-A2結合肽，并通過將合成的肽加載到T2細胞系上測定其抗原性，后者是抗原呈遞有缺陷的T細胞/B細胞融合產(chǎn)物，這樣，T2細胞表面的HLA-A2分子就可以通過外源性HLA-A2結合肽而被加載(Henderson等，科學2551264-1266(1992))。然后，進行標準細胞毒性試驗，包括將加載了肽的T2細胞與衍生自腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的乳房特異性CTL共培養(yǎng)，所述TIL分離自乳房珠蛋白表達性乳腺瘤，參見Peoples等，p.432-433和Toso等，癌癥研究5616-20(1996)。
還可以通過酸洗脫腫瘤細胞表面上的HLAI型分子呈遞的內(nèi)源性肽來鑒定含TC細胞表位的抗原性乳房珠蛋白肽。(參見Peoples等，同上，p.433)。洗脫的肽可用各種業(yè)內(nèi)已知的技術來分離，包括HPLC分離。將不同的肽組分加載到T2細胞上，加載后的T2細胞與乳腺瘤特異性CTL共培養(yǎng)，用標準免疫生物學技術測定哪些肽可被CTL識別。
本發(fā)明乳房珠蛋白抗原的用途之一是過繼性免疫治療。這種療法包括用乳房珠蛋白抗原體外激活和擴增分離自乳房珠蛋白表達腫瘤患者的抗乳房珠蛋白抗體生成性B細胞和/或乳房珠蛋白特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)。該方法也可以用包含乳房珠蛋白B細胞和TC細胞抗原的組合物進行。然后，將激活的淋巴細胞回輸給該患者進行過繼性免疫治療。
本發(fā)明的乳房珠蛋白抗原還可以用作乳房珠蛋白特異性疫苗的組分。該疫苗含有免疫原性激發(fā)量的乳房珠蛋白抗原。在此，免疫原性激發(fā)量表示抗原量能夠在接受者中激發(fā)所需的免疫反應，以緩解或治療乳腺癌。無需過多的試驗，該量可通過本領域熟知的標準過程來確定。
抗原可包含在各種疫苗制劑中用以誘導所需類型(例如抗體和/或細胞介導的)免疫反應。這類制劑是本領域所已知的。參見，例如A.Lanzavecchia，科學260937-944(1993)和Raychandhuri的美國專利5,585,103。用來激發(fā)免疫反應的疫苗例子包含藥學上認可的佐劑，例如鋁鹽；角鯊烯或角鯊烷乳液和胞壁酰二肽乳液；脂質體；和含穩(wěn)化除垢劑、微膠粒形成劑和可生物降解的生物相容性油的組合物(Raychandhuri，同上)。
乳房珠蛋白特異性疫苗還可包含載有乳房珠蛋白抗原的載體細胞。較好的是，所述載體細胞由自身專職抗原呈遞細胞(APC)，例如巨噬細胞、樹突狀細胞、或活化的B或T淋巴細胞，制備得到。參見，Lanzavecchia，同上，p.937。專職APC表達配體B7，它與T細胞上的CD28或CTLA4結合，遞送一個非抗原特異性的共刺激信號，即所謂的信號2，避免T細胞無反應或失活。這樣，疫苗還可含有白介素2或其他共刺激信號，從而抵消無反應誘導作用(Lanzavecchia，同上，p.938)。
另一種乳房珠蛋白特異性疫苗制劑含有一種重組載體，該載體含有編碼表達乳房珠蛋白抗原的核苷酸序列。用感染因子激發(fā)細胞毒T淋巴細胞的方法是本領域已知的(Raychandhuri，同上)。記載的有用牛痘病毒、脊髓灰質炎病毒、腺病毒或逆病毒，以及李斯特菌和BCG等細菌得到的嵌合載體。例如，已知金絲雀痘病毒載體，ALVAC，能誘導強烈的細胞免疫反應，抗其編碼的異源基因產(chǎn)物(Taylor等，病毒學187321-328(1991))。此外，表達MAGE-1基因所編碼MZ2-E人黑素瘤排斥抗原的重組ALVAC可在來自表達MAGE-1 mRNA的乳腺瘤的TIL細胞群中體外激發(fā)MAGE-1 CTL活性(Toso等，同上)。在Wiener等的美國專利5593972所述的另一種方法中，編碼免疫原性靶蛋白的抗原的重組表達載體與促進細胞攝入DNA的試劑一起直接體內(nèi)給予個體(例如給予肌細胞)，或體外給予個體的細胞。
本領域熟練技術人員不難確定如何配制適合獲得所需免疫反應的疫苗。例如，要體內(nèi)誘導抗乳房珠蛋白抗體的產(chǎn)生，乳房珠蛋白特異性疫苗可含至少一種具有B細胞表位和TH細胞表位的乳房珠蛋白B細胞抗原。TH細胞表位最好與意向中疫苗接受者的相應MHC II類單倍型相匹配?；蛘?，也可以采用已知被所有HLA型普遍識別的TH細胞表位，例如破傷風類毒素的“通用”T細胞表位(Panina-Bordignon等，歐洲免疫學雜志192237(1989))。較好的是，疫苗中含有多種不同HLA型MHCII類分子所識別TH表位的乳房珠蛋白B細胞抗原。
乳房珠蛋白特異性疫苗的另一實施例誘導細胞介導的免疫反應，因而含有至少一種能夠激活乳房珠蛋白特異性TC細胞的TC抗原。較好的是，該疫苗含有數(shù)種TC細胞抗原。
還可以配制同時誘導抗體介導和細胞介導反應的乳房珠蛋白特異性疫苗。這樣的實施例同時含有乳房珠蛋白B細胞抗原和T細胞抗原。
可通過給予患者免疫激發(fā)量的本發(fā)明乳房珠蛋白特異性疫苗來治療乳房珠蛋白表達腫瘤患者。疫苗的給予可采用各種已知技術或標準技術。其中包括但不限于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或乳房內(nèi)注射。
以下實施例描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。參照本文說明或具體實施，權利要求范圍內(nèi)的其他實施方式對本領域技術人員來說是顯而易見的。說明與實施例只應視為是舉例性的，本發(fā)明的范圍和精神由實施例后的權利要求確定。
在以下實施例中，細胞系獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，培養(yǎng)在補充了10％胎牛血清的Dulbecco′s必需培養(yǎng)基中。組織活檢樣本獲自人組織協(xié)作網(wǎng)(LiVolsi等，癌癥711391-1394，1993)。
實施例1本實施例說明乳房珠蛋白cDNA的分離。
用標準異硫氰酸胍法分離出細胞系MDA-MB415的總細胞RNA(Belyavsky等，同上)。將這些RNA用于RACE PCR，用Amplifinder試劑盒(Clonetech)根據(jù)廠商說明進行。
以標準反應合成第一鏈cDNA，反應中含1μg RNA，10μM特異性乳房珠蛋白引物D2R(5′-ATAAGAAAGAGAAGGTGTGG-3′)(SEQ ID NO4)，4μl5×RT緩沖液(250mM TrisCl，pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，2μl 100mM DTT，1μl 10mM dNTPs和200單位SuperscriptTMII逆轉錄酶(Gibco/BRL)，反應體積為20μl。反應在45℃進行1小時，然后95℃培養(yǎng)5分鐘終止反應。用400μM NaOH65℃水解RNA 30分鐘，然后用400μM乙酸中和。
然后將該反應化合物加入3體積6M NaCl和10μl處理過的玻璃珠中。以80％EtOH洗珠3次，然后用45μl水洗下核酸。然后，沉淀核酸，再重懸于10μl水中。將該純化后的第一鏈cDNA與廠商提供的錨寡核苷酸(SEQ ID NO95′-CACGAATTCACTATCGATTCTGGAACCTTCAGAGG-3′)連接，用T4 RNA連接酶在27℃反應20小時。取1/10連接反應液進行PCR擴增50μl翻譯體積中含1μM廠商提供的錨引物(SEQ ID NO105′-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3′)，1μM乳房珠蛋白特異性引物D2Rb(SEQ ID NO11，5′-AATCCGTAGTTGGTTTCTCACC-3′)，200μMdNTPs，5單位VentTMDNA聚合酶，和1×聚合酶緩沖液(10mM KCl，20mMTrisCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)。反應物在94℃孵育2分鐘，然后是40輪94℃45秒、50℃1分鐘、72℃90秒的循環(huán)。
兩個下游乳房珠蛋白特異性嵌套寡核苷酸是D2R(SEQ ID NO4)和D2Rb(SEQ ID NO11)。根據(jù)廠商建議，還使用了一個上游乳房珠蛋白特異性對照寡核苷酸，D2F(5′-CTTTCTGCAAGACCTTTGGC-3′)(SEQ ID NO12)。PCR擴增都用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)進行。擴增所得RACE產(chǎn)物以EcoRI消化，連接到質粒pGEM7Z(Promega，Madison，WI)的EcoRI和SmaI位點。
測序都用Taq DNA聚合酶熱循環(huán)測序試劑盒，按照廠商說明(Promega)進行。簡而言之，所用方法如下。
取10pmol序列特異性寡核苷酸用10pmol32P-γATP(3,000Ci/mmol即10Ci/ml)進行末端標記，用T4聚核苷酸激酶在10μl反應體積中37℃進行30分鐘。在17μl廠商提供的測序緩沖液中進行聚合反應100ng質粒模板，1.5pmol標記過的測序引物，和5單位測序級Taq聚合酶。將反應液分裝入一組4支反應試管中，管中含有廠商提供的脫氧核苷酸和雙脫氧A、C、G或T之一。這組4支試管在95℃孵育2分鐘，然后是30輪94℃45秒、45℃30秒、72℃1分鐘的循環(huán)。反應完成后，在各管中加入3μl 80％甲酰胺/溴酚藍染料。樣品在70℃加熱2分鐘，然后加到6％丙烯酰胺/7.5M尿素測序凝膠上，60W恒壓電泳2-4小時。干燥凝膠，曝光KodakXAR5X光膠片2-24小時。
由此獲得的序列是一段403bp片段(SEQ ID NO5)，如圖2中實線所示。早期的研究分離得到了DEST002標簽序列(Watson和Fleming，同上)。該序列是一段206bp片段(SEQ ID NO6)，如圖2中空心線所示。綜合該兩序列的信息，推導出了乳房珠蛋白的全長503bp cDNA(圖2)。
實施例2本實施例證明乳房珠蛋白只在乳腺癌細胞細胞中表達，并在正常乳腺細胞內(nèi)少量表達。
用標準異硫氰酸胍法分離總細胞RNA，用無RNase的DNase處理(Promega)。用寡聚dT21(SEQ ID NO13)和Superstript II逆轉錄酶(Gibco/BRL)，按照廠商說明進行1μg上述總RNA的逆轉錄。
200ng寡聚dT21(SEQ ID NO13)和1μg總RNA在10μl體積中65℃孵育5分鐘。樣品在冰上冷卻后，向其中加入4μl 5×RT緩沖液(250mM TrisCl pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，2μl 100mM DTT，1μl 10mM dNTPs和200單位SuperscriptTMII逆轉錄酶(Gibco/BRL)。反應在45℃進行1小時，然后在95℃孵育5分鐘終止。
取1/10RT反應液進行PCR分析，用乳房珠蛋白特異性引物D2R(5′-ATAAGAAAG AGA AGG TGT GG-3′)(SEQ ID NO4)和d2102(5′-CAG CGG CTT CCT TGATCC TTG-3′)(SEQ ID NO3)，標準反應條件進行40輪94℃×30秒/55℃×1分鐘/72℃×1分鐘的循環(huán)。
按照已知方法(Watson和Fleming，同上)，用全長乳房珠蛋白cDNA探針對20μg總RNA進行Northern分析。通過溴乙錠染色估測各RNA樣品的完整性和等加量。
如圖4所示，在腫瘤樣本2410(來自分離到原初DEST的組織)中很容易檢測到500bp的乳房珠蛋白信使，正常人乳房組織中少得多，無限繁殖化乳房上皮細胞系B5-589或人肺、胎盤、載體及卵巢中則沒有(圖4A)。用RT/PCR擴增后，在15種受檢組織中仍未測到乳房珠蛋白的表達(圖4B)。在這些反應液中檢測到甘油醛3-磷酸酯脫氫酶(GAPDH)信使(圖4B)和EGF受體信使(數(shù)據(jù)未顯示)證明，沒有表達并非RNA降解或其他實驗誤差等所致。因此，乳房珠蛋白mRNA表達具有乳房組織相對特異性。
實施例2A本實施例證實了乳房珠蛋白表達在正常組織中的乳房特異性。
實施例2所用的乳房珠蛋白cDNA探針與商品化制備的歸一化的正常人組織富聚A RNA斑點印跡(Master BlotTM，Clonetech，Palo Alto，CA)雜交。該斑點印跡含有以下人組織的RNA全腦、杏仁體、尾狀核、小腦、大腦皮層、額前葉、海馬趾、延髓、枕骨葉、殼豆狀核、黑質、顳葉、丘腦、nucleus accumbeus、脊索、心臟、主動脈、骨骼肌、結腸、膀胱、子宮、前列腺、胃、睪丸、卵巢、胰腺、垂體、腎上腺、甲狀腺、唾液腺、乳腺、腎、肝、小腸、脾、胸腺、外周血白細胞、淋巴結、骨髓、闌尾、肺、氣管、胎盤、胎腦、胎心、胎腎、胎肝、胎脾、胎胸腺和胎肺。
用Rediprine標記試劑盒(Amersham，Arlington Heights，IL.)按照廠商說明，以32P-α-dCTP(10mCi/ml；＞3000Ci/mmol)放射性標記乳房珠蛋白cDNA探針。斑點印跡與1×106CPM/ml乳房珠蛋白cDNA探針在Rediprine雜交緩沖液(Amersham，Arlington Heights，IL.)中60℃雜交16小時。然后，濾膜在2×SSC/0.1％SDS中室溫下洗滌2次，每次15分鐘，在0.2×SSC/0.1％SDS中60℃洗滌2次，每次1小時。用磷增強屏以洗滌后的濾膜曝光XAR5膠片(Eastman-Kodak，Rochester，NY.)72小時。
只在乳腺的RNA中檢測到乳房珠蛋白mRNA(數(shù)據(jù)未顯示)。正常唾液腺和前列腺中沒有檢測到乳房珠蛋白mRNA表明，與曾被用作乳房特異性標志的GCDP15的頂泌細胞特異性相反，乳房珠蛋白表達與頂泌表型沒有關聯(lián)。Wick等，人類病理學20281-287，1989；Raab等，美國臨床病理學雜志10027-35，1993。以上結果顯示了使用乳房珠蛋白基因表達作為乳腺癌特異性標志的潛在優(yōu)越性。
實施例3本實施例證明乳房珠蛋白cDNA編碼一段可翻譯的核苷酸序列，可由此得到具有預定分子量的蛋白質產(chǎn)物。用TNTTM兔網(wǎng)織紅細胞翻譯試劑盒，用T7 RNA聚合酶(Promega)和35S-甲硫氨酸(＞1000Ci/mmol；10mCi/ml，Amersham)，按照廠商說明，進行體外翻譯。
向25μl TNTTM兔網(wǎng)織紅細胞裂解液中加入2μl廠商制備的反應緩沖液，T7RNA聚合酶，20μM不含甲硫氨酸的氨基酸混合物，40μCi35S-甲硫氨酸(1000Ci/mmol即10mCi/ml)，40單位核糖核酸酶抑制劑，1μg乳房珠蛋白/pGEM7質粒和足量DEPC處理過的水，使得最終的反應體積為50μl。該反應在30℃孵育60分鐘。取5μl該反應液加入20μl SDS凝膠緩沖液，煮沸2分鐘，加到17.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。
與乳房珠蛋白cDNA進行反應的兔網(wǎng)織紅細胞裂解液產(chǎn)生一種6kD蛋白質，不含cDNA的則不產(chǎn)生任何蛋白質。
實施例4本實施例說明乳房珠蛋白在原發(fā)性乳腺癌中過表達的普遍性。
為了測定乳房珠蛋白過表達在乳腺癌中的發(fā)生頻率，我們以乳房珠蛋白cDNA為探針通過Northern印跡雜交檢測了一組15種不同組織學類型的I期原發(fā)性乳腺癌。還在兩名患者的組織中，進行了與同患者正常乳房組織樣品的比較(圖6)。經(jīng)檢測，500bp的乳房珠蛋白mRNA存在于正常乳房組織和腫瘤2410以及另外3種腫瘤中，但其中2種的同患者正常組織中則沒有或幾乎沒有(BO15v.BO16；BO22 v.BO23)(圖6)?？偟恼f來，15種受檢腫瘤中有4種(27％)過表達乳房珠蛋白mRNA。
以上數(shù)據(jù)表明，乳房珠蛋白過表達并不僅限于一種腫瘤樣本，實際上，它在原發(fā)性乳腺瘤中相對普遍。而且，所有受檢腫瘤都是I期這一事實表明，這種調節(jié)紊亂發(fā)生在乳腺癌形成的較早期。
實施例5以下實施例說明用抗乳房珠蛋白多克隆抗體進行的乳房珠蛋白檢測。
將根據(jù)乳房珠蛋白cDNA推定的16C末端氨基酸(Glu-Val-Phe-Met-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asp-Ser-Ser-Leu-Cys-Asp-Leu-Phe，SEQ ID NO14)的相應肽與匙孔蛭血藍蛋白偶聯(lián)，用Freund佐劑注射到兔體內(nèi)，如此制備抗乳房珠蛋白多克隆抗體。間隔3周，對接種后的兔進行加強免疫，在第12周放血，分析血清在乳腺癌細胞系MDA-MB-415和MCF-7培養(yǎng)物的無血清條件培養(yǎng)基中檢測乳房珠蛋白的能力。MDA-MB-415早前曾被認為是過表達乳房珠蛋白信使的細胞系，MCF-7則是不產(chǎn)生乳房珠蛋白mRNA的細胞系。
自24小時培養(yǎng)物收獲條件培養(yǎng)基，并在12％SDS丙烯酰胺凝膠上，在還原性條件下(即，樣品在含二硫蘇醇(DTT)和2-巰基乙醇(BME)的緩沖液中煮沸，以還原二硫鍵)分離，然后印跡到Nytran濾膜上，用上述C末端肽的抗體作為第一抗體進行標準Western印跡分析。在第一抗體結合后，洗滌印跡，加入第二抗體(山羊抗兔抗體)。通過酶聯(lián)化學發(fā)光(ECL Western Blotting Detecting Reagent，Amersham，Arlington Heights，IL)顯現(xiàn)乳房珠蛋白-抗體復合物。
在MDA-MB-415細胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基中，抗乳房珠蛋白多克隆抗體檢測到一條表觀分子量約21kD的條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。在MCF-7細胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基中未檢測到任何條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，與mRNA數(shù)據(jù)一致，MDA-MB-415細胞分泌乳房珠蛋白，MCF-7不分泌。分泌到MDA-MB-415細胞培養(yǎng)物條件培養(yǎng)基中的乳房珠蛋白的表觀分子量大于根據(jù)推定氨基酸序列SEQ ID NO2算得的10.5kDa。因為幾乎所有的分泌蛋白都是糖基化的，用抗乳房珠蛋白多克隆抗體分析MDA-MB-415細胞的胞質溶膠，看是否能檢測到分泌乳房珠蛋白的前體形式。
MDA-MB-415細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)液，離心，收集所得上清液。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌貼壁細胞，用1×Laemmli樣品緩沖液(2％SDS，10％甘油，100mM DTT，60mM Tris，pH6.8，0.001％溴酚藍)裂解。將裂解混合物煮沸5分鐘，然后以10,000g離心5分鐘以沉淀細胞碎片。將細胞裂解液轉移到新的試管中，如下所示地進行Western印跡分析。
培養(yǎng)物上清液和細胞裂解液在12％SDS丙烯酰胺凝膠上，在還原條件下(即，樣品在DTT和BME的緩沖液中煮沸)電泳，然后用標準技術印跡到PVDF膜上。在用于產(chǎn)生抗體的競爭性肽存在和不存在的條件下，用C末端肽的多克隆抗體對印跡進行檢測。
如上所述顯示乳房珠蛋白-抗體復合物。如圖7所示，無競爭性肽(-)時，條件培養(yǎng)基(S)具有代表分泌乳房珠蛋白的21kD條帶。細胞裂解液(C)顯示一條約14kD的主帶，和幾條較高分子量的條帶，其中包括一條21kD帶。在競爭性肽存在下進行Western印跡時(+)，沒有看到分泌形式和胞內(nèi)形式的乳房珠蛋白，表明這些蛋白質含有可被所合成抗體識別的肽。
只在細胞裂解液中檢測到的14kD條帶可能代表乳房珠蛋白的前體或非加工形式。由于乳房珠蛋白的推定氨基酸序列具有相同的N-糖基化位點，即位于SEQID NO2中殘基53-55和68-70的Asn-X-Thr，這觀察到的21kD分泌形式可能代表了蛋白質的某些糖基化形式。
為驗證這一假設，在衣霉素存在和不存在的條件下培養(yǎng)MDA-MB-415細胞，衣霉素抑制真核細胞N連接的糖基化。在兩份相同培養(yǎng)物的一份中加入1μg/ml衣霉素，將兩份樣品都培養(yǎng)過夜。制備出經(jīng)處理和對照培養(yǎng)物的培養(yǎng)基和細胞裂解液，如前所述通過Western印跡進行分析。
如圖8所示，經(jīng)衣霉素處理(+)的培養(yǎng)基(S)沒有可測水平的分泌乳房珠蛋白，說明分泌型乳房珠蛋白是糖基化的。出人意料的是，衣霉素處理MDA-MB-415細胞的裂解液中也沒有胞質溶膠形式的乳房珠蛋白(14kD)(第二右泳道)。我們推測衣霉素對早期糖基化的抑制造成乳房珠蛋白前體的不穩(wěn)定和分解，所以在衣霉素處理細胞的裂解液中無法測得14kD蛋白質。
乳房珠蛋白C末端肽的多克隆抗體還在原發(fā)性人乳腺瘤樣本的細胞裂解液中檢測到了14kDa的乳房珠蛋白前體。如圖9所示，乳房珠蛋白前體存在于腫瘤樣本BO23中，但在同患者的正常乳腺組織樣品中則未測得(B022)。有意義的是，據(jù)Western印跡分析，表達乳房珠蛋白轉錄產(chǎn)物的部分腫瘤樣品(即087R、014、75A和2410)中沒有可測水平的乳房珠蛋白。符合以上數(shù)據(jù)的一種推測是，乳房珠蛋白表達受到轉錄和翻譯水平的差異調控，而這種差異調控決定于腫瘤的發(fā)展階段。
還用抗乳房珠蛋白多克隆抗體在增殖性乳腺的分泌物中檢測乳房珠蛋白。在三月期的第一和第三期、生成時、產(chǎn)后第3、14和21天，手工收集初乳和成熟乳液(500μl樣品)。以等體積的2×laemmli樣品緩沖液(4％SDS，20％甘油，200mMDTT，120mM Tris，pH6.8，0.002％溴酚藍)稀釋樣品。將稀釋后樣品煮沸5分鐘，然后以10,000，4℃離心5分鐘，以沉淀細胞碎片。將變性后的樣品轉移到一支新試管中，保存于-20℃，然后如前所述進行Western印跡分析。
如圖10所示，抗體在孕期(乳房上皮細胞高度增殖期)的乳房分泌樣品中檢測到了21kD的分泌乳房珠蛋白。然而，在哺乳期的開始(乳房上皮細胞分化期)，到產(chǎn)后3天，乳房珠蛋白水平顯著下降，到產(chǎn)后第14天已無法測得。以上結果表明，分泌型乳房珠蛋白與增殖性乳房上皮細胞相關，這一結果與可在人乳腺癌中檢測到分泌性乳房珠蛋白一致。
通過對石蠟固定的乳腺癌患者切片的免疫組化染色，乳腺癌細胞也顯示出與抗乳房珠蛋白肽抗體的反應性(圖11)。免疫組化染色是如下進行的以抗乳房珠蛋白肽的抗體作為第一抗體，用帶有辣根過氧化物酶的山羊抗兔抗體和底物3，3′二氨基四氫氯苯(DAB)檢測乳房珠蛋白-抗體復合物。表達乳房珠蛋白的細胞被染成棕色。
根據(jù)該結果可認為，合成的乳房珠蛋白是一種前體蛋白質，翻譯后修飾，例如N連接的糖基化使其表觀分子量增加，然后分泌；乳房珠蛋白前體形式的穩(wěn)定性取決于N連接的糖基化，而且，乳房珠蛋白是由增殖性乳腺癌細胞分泌的。
實施例6本實施例說明用實施例5所示的抗乳房珠蛋白兔多克隆抗體在原發(fā)性乳腺瘤中檢測乳房珠蛋白。
所得的100份乳腺瘤樣本隨機地選自Vanderbilt大學病理學系和Washington大學癌癥中心的腫瘤庫。將福爾馬林固定、石蠟包裹的組織切成5μm厚，貼在載玻片上，干燥。
為了進行免疫組織化學分析，去除載玻片上的石蠟，在乙醇梯度溶液和水中復水。組織切片與正常山羊血清(Vector Laboratories，Burlingame，CA.)以3％牛血清白蛋白(BSA)/磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的1∶100溶液預培養(yǎng)，然后與稀釋度1∶1000的抗乳房珠蛋白兔多克隆抗體室溫下培養(yǎng)1小時。PBS洗滌數(shù)次后，將切片在含正常山羊血清(1∶1000)，3％BSA和6μg/ml生物素化山羊抗兔IgG(VectorLaboratories，Burlingame，CA.)的PBS中培養(yǎng)1小時。用PBS洗滌4次洗去第二抗體溶液，然后將組織與1∶1000稀釋的鏈霉素過氧化物酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN.)和3％的BSA/PBS溶液一起孵育。孵育30分鐘后，載玻片再用PBS洗滌4次，與含1mg/ml 3，3′二氨基四氫氯苯(Dako，Carpinteria，CA)和0.02％過氧化氫的色原溶液反應3分鐘。載玻片在蒸餾水中略洗滌，用Harris hemotoxylin反染色，壓上蓋玻片。
作為陰性對照，以相同方式處理組織切片，但用稀釋度1∶500的免疫前兔血清取代抗乳房珠蛋白抗血清。或者，為了進行肽競爭實驗，乳房珠蛋白抗血清先與含100μg/ml 16殘基乳房珠蛋白肽的3％BSA/PBS在室溫下孵育1小時，然后加到組織切片上。
免疫陽性評分為0未染色，1少于50％腫瘤細胞弱零星染色，250％以上腫瘤細胞弱染色；3少于50％腫瘤細胞強擴散性細胞質染色，450％以上腫瘤細胞強擴散性細胞質染色。只有評為3或4級的切片可認為是乳房珠蛋白“陽性”。以下表1顯示了評分結果，圖12則顯示3種腫瘤的代表性染色方式。
表1人乳腺癌中的乳房珠蛋白免疫反應性染色腫瘤類型1染色分值24 3 2 10總分小葉 0 1(33％) 1(33％) 01(33％) 3完全分化的 11(78％) 0 1(7％)02(14％) 14中度分化的 28(67％) 5(12％) 3(7％)2(5％) 4(10％) 42低度分化的 24(63％) 9(24％) 2(5％)03×8％) 38DCIS 1(33％)2(67％) 0 00 3總分 64 177 2101001.除小葉腫瘤和原位乳管癌瘤(DCIS)外，全部樣品都是侵入性乳管癌。
2.乳腺瘤組織切片用抗乳房珠蛋白抗體進行染色的免疫陽性級別分為0未染色，1少于50％腫瘤細胞弱零星染色，250％以上腫瘤細胞弱染色；3少于50％腫瘤細胞強細胞質染色，450％以上腫瘤細胞強細胞質染色。就本發(fā)明目的而言，只有評為3或4級的切片可認為是乳房珠蛋白“陽性”。
總體上，80％的受檢乳管癌表現(xiàn)為乳房珠蛋白強擴散或聚焦性細胞染色。有意義的是，完全分化(78％)、中度分化(67％)和低度分化(63％)的腫瘤中，染色頻率相當(表1，圖12)。在3/3原位單純性乳管癌(DCIS)中也看到了強染色(圖12A)。乳房珠蛋白的細胞染色方式以擴散性和細胞質性為主，但部分細胞也表現(xiàn)出靠近細胞核的局部染色。在正常乳房組織中，只在小乳管和小葉中的少數(shù)上皮細胞內(nèi)觀察到乳房珠蛋白染色。
然而，與其他分泌性蛋白質的結果一樣，乳房珠蛋白表達的增加與頂泌化生特征同時發(fā)生。在具有化生性頂泌上皮的良性乳房組織中，上皮和頂泌性胞囊液都具有乳房珠蛋白免疫反應性。用免疫前兔血清孵育(圖12B、12D、12F)或與競爭性C末端肽預培養(yǎng)的抗乳房珠蛋白抗血清(數(shù)據(jù)未顯示)孵育的相同樣本中沒有陽性信號，這證明了上述陽性染色方式的特異性。
然而，在正常前列腺和唾液腺等其他頂泌性組織中沒有測得乳房珠蛋白表達。而且，同時具有頂泌性和非頂泌性特征的乳腺癌細胞表達乳房珠蛋白的頻率和強度大致相當。而且，乳房珠蛋白表達和腫瘤階段之間沒有明顯的關聯(lián)。所以，乳房珠蛋白表達是一種獨特乳腺瘤表型的標志，而且可與其他已知標志一起用于分子水平的乳腺癌鑒定。
實施例5和6的結果表明乳房珠蛋白檢測可作為乳腺癌標志用于癌癥診斷，估計乳腺癌的復發(fā)，監(jiān)測自身的骨髓/干細胞移植物是否被腫瘤細胞污染，以及用抗體介導的復合物使得治療行性預定向于乳腺癌細胞。純化的分離乳房珠蛋白多肽可用于產(chǎn)生抗乳腺癌抗體，和用于發(fā)展其他腫瘤特異性免疫療法。
實施例7本實施例說明淋巴結中的乳房珠蛋白mRNA檢測。
大多數(shù)原發(fā)性乳腺瘤中有乳房珠蛋白表達而淋巴樣組織中沒有，這說明該蛋白可能是一種檢測淋巴結內(nèi)轉移性乳腺癌細胞的高靈敏特異性標志。為了驗證這一觀點，在經(jīng)組織學證明含有乳腺癌轉移或其他非乳腺癌轉移滯留的淋巴結中檢測乳房珠蛋白mRNA的表達。并且，將乳房珠蛋白的表達與角蛋白19(一種上皮細胞特異性標志)的表達相比較，以將乳房珠蛋白信號歸一化成各種淋巴結樣品中的惡性上皮細胞數(shù)。
具有轉移性病灶的匿名淋巴結樣品獲自人組織協(xié)作網(wǎng)((LiVolsi等，癌癥711391-1394，1993)和Washington大學癌癥中心腫瘤庫。組織樣品按每ml試劑100mg組織的濃度在Trizol試劑(Life Technologies，Rockville，MD)中研磨和均質化。按照廠商說明分離RNA，將所得RNA在無RNase的水中重懸為2μg/μl。取20μg各種RNA進行甲醛瓊脂糖凝膠電泳，然后用10×SSC緩沖液和標準方法轉移到Nytran Plus膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)上。
為了產(chǎn)生乳房珠蛋白雜交探針，用Rediprime標記試劑盒按照廠商說明以32P-α-dCTP(10mCi/ml；＞3000Ci/mmol)放射性標記實施例2所用的乳房珠蛋白cDNA。
如下構建角蛋白19的雜交探針。在正常人乳房cDNA的標準PCR擴增反應中，使用角蛋白19特異性的正向寡核苷酸(5′-CGCGGATCCAGGATTGTCCTGCAGAT-3′)(SEQ ID NO18)和反向寡核苷酸(5′-CCGGAATTCCCATCCCTCTACCCAGA-3′)(SEQ ID NO19)，以產(chǎn)生含有核苷酸477至核苷酸1298編碼區(qū)的k19cDNA片段(Stasiak，P.C.和Lane，E.B，核酸研究1510058，1987.)。消化該片段產(chǎn)生EcoRI和BamHI末端，將其克隆到pGEM3Z載體(Promega，Madison，WI)的相應位點，測序證實其序列。如前所述放射性標記所克隆的821bp k19cDNA片段。
Northern印跡濾膜先與1×106CPM/ml乳房珠蛋白雜交探針雜交，用Rapic-Hyb雜交緩沖液(Amersham，Arlington Heights，IL)在60℃進行16小時。然后，膜在0.2×SSC/0.1％SDS中室溫下洗滌2次，在0.2×SSC/0.1％SDS中60℃再洗滌2次。洗滌后的膜用磷增強屏曝光XAR5膠片(Eastman-Kodak，Rochester，NY)72小時。讓膜進行幾個半衰期的衰變，然后不對膜進行預處理，再與1×106CPM/ml角蛋白19雜交探針雜交。使用相同數(shù)量和相同比活性的乳房珠蛋白和角蛋白19cDNA探針，各雜交膜在相同的條件下曝光膠片。
圖13顯示該研究的結果。在21例組織學確定含有乳腺癌轉移的淋巴結(泳道1-20，27)中，9例中可測到乳房珠蛋白的表達(43％)(泳道1、2、7、9、11、12、17、18和27)。然而，其中6例既沒有乳房珠蛋白也沒有角蛋白19的mRNA(泳道3、5、6、10、13、14、16、19和20)，說明這些淋巴結中的腫瘤細胞太少，無法用該方法測知。排除這6例，60％(9/15)淋巴結含有可測的乳房珠蛋白mRNA。至少可在一例中檢測到乳房珠蛋白表達而沒有角蛋白19表達(泳道27)，這說明乳房珠蛋白可能是某一腫瘤亞組更靈敏的標志。而且，角蛋白19在許多非乳房腫瘤轉移中(例如含有喉癌和膽囊癌的淋巴結)普遍表達(泳道21-26)，而只有一例非乳房腫瘤轉移中檢測到乳房珠蛋白表達(泳道22)。這是一例含有低度分化的病源不詳腺癌的腹股溝淋巴結。因為該患者曾有子宮內(nèi)膜癌病史，所以估計這是該病的轉移性復發(fā)。我們最近在幾種原發(fā)性子宮內(nèi)膜癌中檢測到乳房珠蛋白表達(數(shù)據(jù)未顯示)，證明，乳房珠蛋白雖然不在正常子宮內(nèi)膜組織中表達，卻可在子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的一個亞組中表達。在所有沒有癌轉移的淋巴結中(泳道29—33)，都未檢測到角蛋白19和乳房珠蛋白的表達。和預計的一樣，在分離自正常乳房組織的RNA中檢測到了乳房珠蛋白mRNA(泳道34)。
實施例8本實施例說明在外周血干細胞(PBSC)中檢測作為循環(huán)性乳腺癌細胞標志的乳房珠蛋白mRNA。
由15名因轉移性乳腺癌正接受高劑量化療和自身干細胞移植的患者的白細胞提取產(chǎn)物制備外周血白細胞，每份約1×106個。作為陽性對照，將101個表達乳房珠蛋白的MDA-MB175人乳腺癌細胞(Watson等，癌癥研究56860-865，1996.)與106個人OM431黑素瘤細胞混合，得到1∶105稀釋的乳腺癌細胞。用純OM431細胞作為陰性對照。冷凍細胞等份立即用1ml Trizol試劑(LifeTechnologies，Rockville，MD)裂解，按照廠商說明制備總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳估測RNA的完整性和濃度。
將約1mg總RNA轉化為第一鏈cDNA，用T11-17引物和Superscript II預擴增系統(tǒng)(Life Technologies，Rockville，MD)按照廠商程序進行。用RNase H處理，然后將酶滅活后，用無核酸酶的水兩倍稀釋樣品，保存于-20℃。為了估測所合成cDNA的完整性，取10％cDNA進行50μl的PCR反應，其中含最終濃度為1×的Taq DNA聚合酶緩沖液，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，0.6μM甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶(GAPDH)正向擴增引物(5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′)(SEQ ID NO20)，0.6μm GAPDH逆向擴增引物(5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3′)(SEQ ID NO21)，和2.5單位Taq DNA聚合酶(Life Technologies，Rockville，MD)。反應在94℃加熱1分鐘，然后進行30輪94℃30秒，58℃60秒和72℃45秒的循環(huán)。在2％瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物，得到單一、均一、強599nt片段，表明各cDNA的合成反應已完成。然后，取另外10％cDNA反應物進行第二次50μl的PCR反應，其中含最終濃度為1×的TaqDNA聚合酶緩沖液，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，0.6μM乳房珠蛋白正向擴增引物(5′-AGCACTGCTACGCAGGCTCT-3′)(SEQ ID NO16)，0.6μm GAPDH逆向擴增引物(5′-ATAAGAAAGAGAAGGTGTGG-3′)(SEQ ID NO4)，和2.5單位TaqDNA聚合酶(Life Technologies，Rockville，MD)。反應在94℃加熱1分鐘，然后進行45輪94℃30秒，58℃60秒和72℃30秒的循環(huán)。將擴增產(chǎn)物送至另一實驗室進行2％瓊脂糖凝膠電泳，并用0.2μm Nytran Plus膜按照廠商說明的中性轉移法進行Southern印跡(Schleicher & Schuell，Keene，NH.)。如前所述，將所得膜與1×106CPM/ml乳房珠蛋白cDNA探針雜交，洗滌。
圖14是該試驗的結果。15例乳腺癌(CA)病例中，9名患者(60％)的PBSC中可測到乳房珠蛋白mRNA，說明收集的產(chǎn)物中含有乳腺癌細胞污染。其余6例中，因為沒有檢測原發(fā)性腫瘤的乳房珠蛋白表達，所以不知道PBSC中無信號是表示沒有表達乳房珠蛋白的腫瘤細胞(真的沒有腫瘤細胞)，還是因為試驗靈敏度不夠。來自健康供者(NL)的采集樣品中都沒有測到乳房珠蛋白mRNA。含有1∶105乳腺癌細胞的兩份相同陽性對照(+)可得到強烈的雜交信號，因此，本試驗的檢測下限可能遠低于1∶106個細胞。該試驗的測得率和高特異性說明，這可能是更大規(guī)模預測性研究隱蔽性循環(huán)腫瘤細胞預后意義的一種有用工具。例如，乳房珠蛋白表達可用于評價細胞因子激發(fā)(Passos-Coelho等，臨床癌癥學雜志.142569-2575，1996)或腫瘤細胞清除后外周血干細胞產(chǎn)物被腫瘤污染的情況(Passos-Coelho等，癌癥研究.542366-2371，1994)。
綜上所述，可以看出，本發(fā)明可實現(xiàn)所述的諸多優(yōu)點及其他優(yōu)點。
在本發(fā)明范圍內(nèi)可對以上所述的方法和組合物進行多種改變，所以，以上說明和附圖中的內(nèi)容只是說明性的而不是限定性的。
本發(fā)明參考并結合了文中所述的各參考文獻，包括專利和專利申請。本文中對參考文獻的說明只是對作者觀點的概括，并不認定這些參考文獻就是現(xiàn)有技術。申請人保留對所引用文獻準確性和相關性的質疑權。
序列表<110>WATSON，MARK AFLEMING，TIMOTHY P<120>乳房珠蛋白，一種分泌性乳房特異性乳腺癌蛋白<130>6029-1534<140><141><150>08/933，149<151>1997-09-18<150>PCT/US96/08235<151>1996-05-31<150>08/455，896<151>1995-05-31<160>21<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>503<212>DNA<213>智人<400>1gacagcggct tccttgatcc ttgccacccg cgactgaaca ccgacagcag cagcctcacc 60atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct 120ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaagt gtctaagact 180gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 240gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgaggtgttt 300atgcaattaa tatatgacag cagtctttgt gatttatttt aactttctgc aagacctttg 360gctcacagaa ctgcagggta tggtgagaaa ccaactacgg attgctgcaa accacacctt 420ctctttctta tgtcttttta ctacaaacta caagacaatt gttgaaacct gctatacatg 480tttattttaa taaattgatg gca 503<210>2<211>93<212>PRT<213>智人<400>2Met Lys Leu Leu Met Val Leu Met Leu Ala Ala Leu Ser Gln His Cys1 5 10 15Tyr Ala Gly Ser Gly Cys Pro Leu Leu Glu Asn Val Ile Ser Lys Thr20 25 30Ile Asn Pro Gln Val Ser Lys Thr Glu Tyr Lys Glu Leu Leu Gln Glu35 40 45Phe Ile Asp Asp Asn Ala Thr Thr Asn Ala Ile Asp Glu Leu Lys Glu50 55 60Cys Phe Leu Asn Gln Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Val Glu Val Phe65 70 75 80Met Gln Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe85 90<210>3<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>3cagcggcttc cttgatcctt g 21<210>4<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>4ataagaaaga gaaggtgtgg 20<210>5<211>403<212>DNA<213>智人<400>5gacagcggct tccttgatcc ttgccacccg cgactgaaca ccgacagcag cagcctcacc 60atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct 120ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaagt gtctaagact 180gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 240gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgaggtgttt 300atgcaattaa tatatgacag cagtctttgt gatttatttt aactttctgc aagacctttg 360gctcacagaa ctgcagggta tggtgagaaa ccaactacgg att 403<210>6<211>206<212>DNA<213>智人<400>6tttatgcaat taatatatga cagcagtctt tgtgatttat tttaactttc tgcaagacct 60ttggctcaca gaactgcagg gtatggtgag aaaccaacta cggattgctg caaaccacac 120cttctctttc ttatgtcttt ttactacaaa ctacaagaca attgttgaaa cctgctatac 180atgtttattt taataaattg atggca 206<210>7<211>95<212>PRT<213>智人<400>7Met Lys Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Val Thr Ile Pro Ile Cys Cys1 5 10 15Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Cys Ser Ile Leu Asp Glu Val Ile Arg Gly20 25 30Thr Ile Asn Ser Thr Val Thr Leu His Asp Tyr Met Lys Leu Val Lys35 40 45Pro Tyr Val Gln Asp His Phe Thr Glu Lys Ala Val Lys Gln Phe Lys50 55 60Gln Cys Phe Leu Asp Gln Thr Asp Lys Thr Leu Glu Asn Val Gly Val65 70 75 80Met Met Glu Ala Ile Phe Asn Ser Glu Ser Cys Gln Gln Pro Ser85 90 95<210>8<211>91<212>PRT<213>智人<400>8Met Lys Leu Ala Val Thr Leu Thr Leu Val Thr Leu Ala Leu Cys Cys1 5 10 15Ser Ser Ala Ser Ala Glu Ile Cys Pro Ser Phe Gln Arg Val Ile Glu20 25 30Thr Leu Leu Met Asp Thr Pro Ser Ser Tyr Glu Ala Ala Met Glu Leu35 40 45Phe Ser Pro Asp Gln Asp Met Arg Glu Ala Gly Ala Gln Leu Lys Lys50 55 60Leu Val Asp Thr Leu Pro Gln Lys Pro Arg Glu Ser Ile Ile Lys Leu65 70 75 80Met Glu Lys Ile Ala Gln Ser Ser Leu Cys Asn85 90<210>9<211>35<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>9cacgaattca ctatcgattc tggaaccttc agagg 35<210>10<211>38<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>10ctggttcggc ccacctctga aggttccaga atcgatag 38<210>11<211>22<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>11aatccgtagt tggtttctca cc22<210>12<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>12ctttctgcaa gacctttggc 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>13tttttttttt tttttttttt t 21<210>14<211>16<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>14Glu Val Phe Met Gln Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe1 5 10 15<210>15<211>279<212>DNA<213>智人<400>15atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct 60ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaagt gtctaagact 120gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 180gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgaggtgttt 240atgcaattaa tatatgacag cagtctttgt gatttattt279<210>16<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>16agcactgcta cgcaggctct 20<210>17<211>74<212>PRT<213>智人<400> 17Ser Gly Cys Pro Leu Leu Glu Asn Val Ile Ser Lys Thr Ile Asn Pro1 5 10 15Gln Val Ser Lys Thr Glu Tyr Lys Glu Leu Leu Gln Glu Phe Ile Asp20 25 30Asp Asn Ala Thr Thr Asn Ala Ile Asp Glu Leu Lys Glu Cys Phe Leu35 40 45Asn Gln Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Val Glu Val Phe Met Gln Leu50 55 60Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe65 70<210>18<211>26<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>18cgcggatcca ggattgtcct gcagat 26<210>19<211>26<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>19ccggaattcc catccctcta cccaga26<210>20<211>24<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>20ccacccatgg caaattccat ggca 24<210>21<211>24<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述合成<400>21tctagacggc aggtcaggtc cacc 2權利要求
1.一種檢測患者體內(nèi)是否存在乳腺癌細胞的方法，包括檢測患者的樣品中是否存在編碼乳房珠蛋白多肽的mRNA，所述mRNA濃度高于健康者表明存在著乳腺癌細胞。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，檢測步驟還包括(a)提供與SEQ ID NO15特異性雜交的聚核苷酸，(b)該聚核苷酸與樣品在使得該聚核苷酸與乳腺瘤形成細胞mRNA特異性雜交的條件下共培養(yǎng)，和(c)檢測聚核苷酸-mRNA雜交復合物的存在。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中的聚核苷酸含有SEQ ID NO15的互補序列或其片段。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中的聚核苷酸是編碼氨基酸序列為SEQ IDNO2的乳房珠蛋白多肽的cDAN。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中的樣品含有淋巴結組織。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中的檢測步驟還包括(a)用逆轉錄法由mRNA產(chǎn)生編碼乳房珠蛋白多肽的cDNA，(b)提供兩段與cDNA特異性雜交從而確定有待以聚合酶鏈反應法擴增的cDNA區(qū)的寡核苷酸，其中之一在高嚴謹性條件下與SEQ ID NO1雜交，另一段寡核苷酸在高嚴謹性條件下與SEQ ID NO1的互補序列雜交，(c)以這兩段寡核苷酸為引物，用聚合酶鏈反應擴增該cDNA區(qū)域，(d)檢測所擴增cNDA區(qū)的存在。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，所述兩段寡核苷酸之一含有SEQ ID NO4，另一段含有SEQ ID NO16。
8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中的樣品含有外周血白細胞。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中的檢測步驟還包括(a)用不對稱缺口連接鏈反應擴增編碼乳房珠蛋白的mRNA中的靶區(qū)域，和(b)檢測所擴增靶區(qū)域的存在。
10.一種檢測樣品中是否存在乳腺瘤形成細胞的試劑盒，包括裝在容器內(nèi)的兩段作為聚合酶鏈反應引物的寡核苷酸，所述寡核苷酸與編碼SEQ ID NO2的cDNA特異性雜交從而確定待擴增區(qū)域。
11.根據(jù)權利要求10所述的試劑盒，其中所述兩段寡核苷酸之一含有SEQ IDNO4，另一段含有SEQ ID NO16。
12.一種檢測患者體內(nèi)是否存在乳腺癌的方法，包括檢測患者樣品中是否有乳房珠蛋白多肽，所述乳房珠蛋白多肽的濃度高于健康者表明存在著乳腺癌。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中的檢測步驟還包括用一種純化抗體與乳房珠蛋白多肽反應，并檢測乳房珠蛋白多肽與該抗體的結合，所述抗體對含SEQ ID NO17至少5個氨基酸的乳房珠蛋白表位具有特異性。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中所述的乳房珠蛋白多肽含有SEQ IDNO17。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中的純化抗體是多克隆抗體，其中的乳房珠蛋白表位含有SEQ ID NO14。
16.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中的純化抗體是單克隆抗體，其中的乳房珠蛋白表位含有SEQ ID NO14。
17.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中的樣品含有乳腺瘤組織。
18.一種檢測樣品中是否存在乳腺癌細胞的試劑盒，包括裝在容器內(nèi)的純化抗體，該抗體對含SEQ ID NO2至少5個氨基酸的乳房珠蛋白表位具有特異性，而且，該抗體能與含有SEQ ID NO17的乳房珠蛋白多肽或其等位變異體反應。
19.根據(jù)權利要求18所述的試劑盒，其中的乳房珠蛋白表位含有SEQ IDNO14。
20.一種檢測患者是否存在子宮內(nèi)膜癌的方法，包括檢測患者子宮內(nèi)膜組織樣品中是否有乳房珠蛋白表達。
21.一種檢測患者是否存在子宮內(nèi)膜癌細胞的方法，包括檢測患者子宮內(nèi)膜組織或相關淋巴組織樣品中是否存在編碼乳房珠蛋白多肽的mRNA，所述mRNA濃度高于健康者表明存在著子宮內(nèi)膜癌細胞。
22.一種檢測已知患有或曾經(jīng)患有子宮內(nèi)膜癌的患者是否存在子宮內(nèi)膜癌細胞的方法，包括檢測患者樣品中是否存在編碼乳房珠蛋白多肽的mRNA，所述mRNA濃度高于健康者表明存在著子宮內(nèi)膜癌細胞。
23.一種檢測患者是否存在子宮內(nèi)膜癌的方法，包括檢測患者子宮內(nèi)膜組織或相關淋巴組織樣品中是否存在乳房珠蛋白多肽，所述乳房珠蛋白多肽濃度高于健康者表明存在著子宮內(nèi)膜癌。
24.一種檢測已知患有或曾經(jīng)患有子宮內(nèi)膜癌的患者是否存在子宮內(nèi)膜癌的方法，包括檢測患者樣品中是否存在乳房珠蛋白多肽，所述乳房珠蛋白多肽濃度高于健康者表明存在著子宮內(nèi)膜癌。
全文摘要
本發(fā)明公開的是一種純化并分離的DNA序列及其編碼的乳房特異性分泌蛋白質,即乳房珠蛋白。同時還公開了一種基于乳腺癌細胞過量表達和分泌乳房珠蛋白來檢測乳腺癌的方法。該方法檢測和/或定量測定乳房珠蛋白或編碼乳房珠蛋白的mRNA的存在。還公開免疫治療患有乳房珠蛋白過量表達行腫瘤的乳腺癌患者的方法。此類方法涉及用乳房珠蛋白抗原誘導抗腫瘤的體液和/或細胞介導的免疫應答。
文檔編號A61K38/00GK1328567SQ99813780
公開日2001年12月26日 申請日期1999年9月29日 優(yōu)先權日1998年9月29日
發(fā)明者M·A·沃森, T·P·弗萊明 申請人:華盛頓大學