專利名稱：包含膽堿結(jié)合蛋白an－末端截取物的氨基酸的多肽、由該多肽衍生的疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明普遍涉及膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的多肽。本發(fā)明也涉及對細(xì)菌感染，特別是肺炎球菌感染提供保護(hù)作用或激發(fā)產(chǎn)生保護(hù)性抗體的疫苗和用于診斷和被動免疫治療的對抗這種多肽的抗體和拮抗劑。該多肽和/或編碼該多肽的核酸也可以用作肺炎球菌細(xì)菌附著的競爭性抑制劑。最后，本發(fā)明涉及利用該多肽進(jìn)行治療的治療方法。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌是革蘭氏陽性菌，它是引起侵襲性感染如敗血癥、腦膜炎、中耳炎、和大葉性肺炎的主要原因(Tuomanen等人，NEJM 3321280-1284，1995)。肺炎球菌強(qiáng)烈地與上下呼吸道細(xì)胞結(jié)合。象大多數(shù)細(xì)菌一樣，通過與真核生物的碳水化合物結(jié)合的細(xì)菌表面蛋白質(zhì)的呈遞以類似凝集素的方式來完成肺炎球菌與人類細(xì)胞的粘著(Cundell，D.&Tuomanen，E.(1994)Microb Pathog 17361-374)。肺炎球菌與非炎性上皮結(jié)合可看作是無癥狀運(yùn)輸過程。已經(jīng)有人提出，轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性疾病與局部產(chǎn)生炎性因子有關(guān)，所述因子通過激活人類細(xì)胞改變可在人類細(xì)胞上獲得的受體的數(shù)目和類型(Cundell，D.等人(1995)Nature377435-438)。在這種新的環(huán)境中肺炎球菌便有機(jī)會取得優(yōu)勢并且利用了這些未調(diào)整受體之一，血小板激活因子(PAF)受體(Cundell，D.等人(1995)Nature 377435-438)。在PAF受體出現(xiàn)的幾分鐘內(nèi)，肺炎球菌經(jīng)歷粘著性和侵襲性增強(qiáng)的波動。例如通過可溶性受體類似物來抑制細(xì)菌與激活細(xì)胞的結(jié)合可在動物模型中阻斷疾病的進(jìn)展(Idanpaan-Heikkila，I.等人(1997)J.Infect.Dis.，176704-712)。在這點(diǎn)上特別有效的是包含有或沒有附加唾液酸的乳糖-N-新四糖的可溶性碳水化合物，它在體外預(yù)防肺炎球菌附著在人類細(xì)胞上并且在體內(nèi)預(yù)防移生于肺中。膽堿結(jié)合蛋白候選結(jié)構(gòu)附著基因肺炎球菌產(chǎn)生一類能夠與細(xì)菌表面結(jié)合的表面蛋白，這種結(jié)合是通過與細(xì)胞壁磷壁酸或脂磷壁質(zhì)非共價(jià)結(jié)合的。肺炎鏈球菌表面覆蓋著一類CBPs(膽堿結(jié)合蛋白)，這類蛋白與磷脂酰膽堿非共價(jià)結(jié)合。CbpA是一種75kD表面暴露的膽堿結(jié)合蛋白，顯示嵌合結(jié)構(gòu)。具有獨(dú)特的N-末端區(qū)域，即富含脯氨酸的區(qū)域，其后是由10個負(fù)責(zé)結(jié)合膽堿的重復(fù)區(qū)組成的C-端區(qū)域。
CbpA是一種復(fù)合糖的粘附素(配體)，復(fù)合糖上包含存在于真核細(xì)胞表面上的受體。具有CbpA缺陷的突變在鼻咽移生的未成年大鼠模型中顯示降低的毒力。這種結(jié)合涉及修飾磷壁酸的膽堿決定簇并且通過該類蛋白質(zhì)各個成員中的特征膽堿結(jié)合區(qū)域來介導(dǎo)。Lopez等人在他們的自溶酶研究中發(fā)現(xiàn)了這種膽堿結(jié)合區(qū)域并且對其特性進(jìn)行了充分地確定(Ronda等人(1987)Eur.J.Biochem，164621-624)。含有該區(qū)域的其它蛋白包括肺炎球菌噬菌體的自溶素和保護(hù)性抗原，即肺炎球菌表面蛋白A(PspA)(Ronda，C.等人(1987)Eur.J.Biochem，164621-624和McDaniel，L.S.，等人(1992)Microb Pathog，13261-269)。CbpA不能移生于鼻咽區(qū)域，該區(qū)域是與CbpA的共同具有的其它類型成員(C端)并且其與人細(xì)胞結(jié)合的活性是由其特有的N-末端區(qū)域產(chǎn)生的。由于移生的過程和疾病的發(fā)展取決于作為第一步驟的肺炎球菌附著于人細(xì)胞上，通過交叉反應(yīng)性抗體或者通過與模擬該區(qū)的肽的競爭性抑制作用阻斷N-末端區(qū)域的功能對于阻斷疾病來說可能是關(guān)鍵性的。在PCT國際申請PCT/US97/07198中討論了抗肺炎球菌疫苗的膽堿結(jié)合蛋白并且將該P(yáng)CT申請的全部內(nèi)容引入本文供參考。目前抗肺炎鏈球菌的疫苗使用該細(xì)菌23個最普通血清型的莢膜的純化碳水化合物，但該疫苗僅僅有50％的保護(hù)作用(Shapiro等人，NJEM 3251453，1991)并且在2歲以下不具有免疫原性。而且，治療性多肽在被多抗性生物體感染的病例中會提供治療的選擇性。所以，本發(fā)明通過提供保護(hù)性疫苗滿足了這一長期的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種分離的多肽，該多肽包含膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。所述多肽包含SEQ ID NOS 1，3-7或9-11中所述的氨基酸序列，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。而且，本發(fā)明提供一種分離的多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO 24氨基酸的膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列，其中該多肽顯示其三級結(jié)構(gòu)并且也提供制備該多肽的方法。分離的多肽適用于使動物和人對細(xì)菌感染，優(yōu)選對肺炎球菌感染產(chǎn)生免疫作用。
本發(fā)明也涉及具有凝集素活性但沒有膽堿結(jié)合活性的膽堿結(jié)合蛋白A的N-末端截取物。而且，本發(fā)明提供一種免疫原性膽堿結(jié)合蛋白A的N-末端截取物或其片段。
本發(fā)明也涉及分離的核酸，如重組DNA分子或克隆的基因或其簡并變體、突變體、類似物或其片段，其編碼分離的多肽或者其競爭性抑制多肽的活性。優(yōu)選地，分離的核酸(包括簡并物、變體、突變體、類似物或其片段)具有SEQ ID NOS12，14-17，19-22或23所述的序列。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以將如此確定的重組DNA分子或克隆基因的完整DNA序列有效地連接到表達(dá)控制序列上，該表達(dá)控制序列可以被引入到合適的宿主中。因此，本發(fā)明還涉及用克隆的基因或重組DNA分子轉(zhuǎn)化的單細(xì)胞宿主，所述克隆基因或重組DNA分子包含編碼本發(fā)明多肽的DNA序列，特別是由上文所述序列確定的DNA序列或其片段。
對抗分離多肽的抗體包括天然產(chǎn)生的和重組方法制備的抗體。這些抗體可包括通過已知的遺傳技術(shù)制備的多克隆和單克隆抗體，以及雙特異性的(嵌合的)抗體，和包括適于診斷使用及能夠調(diào)節(jié)細(xì)菌粘附包括但不限于起競爭劑作用的其它功能的抗體。
本發(fā)明的再一目的是提供一種治療哺乳動物來控制細(xì)菌或其亞單位的量或活性以便處理或預(yù)防侵入、自生或特發(fā)病態(tài)所產(chǎn)生的不利后果的方法。本發(fā)明提供在治療方法中使用的藥物組合物，其中包含或基于分離的多肽、其亞單位或其結(jié)合配對物。
最后，本發(fā)明提供藥物組合物、疫苗及使用它們的診斷和治療方法。
附圖簡述

圖1.膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)和重組截取物R1(如圖2所示從CbpA的N-末端開始約氨基酸16到氨基酸321)和R2(如圖2所示從CbpA的N-末端開始約氨基酸16到氨基酸444)的圖解。區(qū)域A是如圖2所示從CbpA氨基酸序列的N-末端開始約氨基酸153到氨基酸321；區(qū)域B是如圖2所示從CbpA氨基酸序列的N-末端開始約氨基酸270到氨基酸326；并且區(qū)域C是如圖2所示從CbpA氨基酸序列的N-末端開始約氨基酸327到氨基酸433。
圖2A-B.比較CbpA N-末端區(qū)域的核酸和氨基酸序列各種血清型的同源性。
圖3.重組R1和R2的表達(dá)和純化。
圖4.在小鼠中被動保護(hù)的結(jié)果。對抗重組R2的免疫血清保護(hù)小鼠免受致死性肺炎鏈球菌的激發(fā)。
圖5.抗-R2抗體對粘附到LNnT-HSA包被平板上的R6x的滴定。
圖6.具有阻斷肺炎球菌與LNnT-HSA包被平板粘附活性的抗-Cbp-A和吸附的抗-CbpA抗體的滴定。
圖7.在小鼠中的主動保護(hù)結(jié)果。對抗重組R1的免疫血清保護(hù)小鼠免受致死性肺炎鏈球菌的激發(fā)(激發(fā)物560cfu血清型6B)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種分離的多肽，該多肽包含膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。該多肽適用于使動物對肺炎球菌感染產(chǎn)生免疫作用。這些多肽或其肽片段，當(dāng)用合適的佐劑配制時，用于對抗肺炎球菌和對抗具有交叉反應(yīng)性蛋白的其它細(xì)菌的疫苗中。
本發(fā)明提供一種分離的多肽，該多肽包含膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。在一個實(shí)施方案中，該多肽具有SEQ ID NO 1，3-5，7或9-11所述的任一氨基酸序列，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。在另一實(shí)施方案中，該多肽具有氨基酸KXXE(SEQ ID NO6)。
本發(fā)明提供一種分離的多肽，該多肽包含圖2所述的膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。在一個實(shí)施方案中，該多肽具有圖2所述保守區(qū)的氨基酸序列。例如，保守區(qū)包括但不限于氨基酸序列158-210；158-172；300-321；331-339；355-365；367-374；379-389；409-427和430-447。圖2描述本發(fā)明CbpA N-末端區(qū)域的核酸和氨基酸序列各種血清型的同源性。
另外，本發(fā)明提供一種分離的多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO 24所述氨基酸的膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列，其中所述多肽顯示其三級結(jié)構(gòu)。在一個實(shí)施方案中，所述多肽是其類似物、片段、突變體或變體。所述變體如圖2所示。本發(fā)明也提供一種分離的多肽，該多肽包含具有圖2所述血清型4的約16位到約474位氨基酸或如圖2所述血清型4相應(yīng)氨基酸的膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列，其中所述多肽顯示其三級結(jié)構(gòu)。在一個實(shí)施方案中，三級結(jié)構(gòu)與存在于天然蛋白質(zhì)中的三級結(jié)構(gòu)相對應(yīng)。
制備所述多肽的方法的例子如下用羥胺裂解全長的膽堿結(jié)合蛋白A，其中所述羥胺裂解膽堿結(jié)合蛋白A血清型R6x和血清型4的475位處的氨基酸天冬酰胺(N)或者圖2所示不同血清型中血清型R6x或血清型4的相應(yīng)氨基酸，由此產(chǎn)生膽堿結(jié)合蛋白A的N-末端截取物。產(chǎn)生截?cái)嗟哪憠A結(jié)合蛋白A或其片段并且保持天然三級結(jié)構(gòu)(即，全長膽堿結(jié)合蛋白A的三級結(jié)構(gòu))的其它方法是有所描述的并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。由于所述多肽保持其三級結(jié)構(gòu)，分離的多肽適用于作為免疫原使動物和人對細(xì)菌感染，優(yōu)選肺炎球菌產(chǎn)生免疫作用。
含有膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)血清型4型氨基酸序列的多肽如下ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESYAKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAVSKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPAEQPQPAPAPKAEKPAPAPKPEN(SEQ ID NO 24).
“多肽R2”意指含有膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)血清型4型(見圖1)的N-末端截取物的氨基酸序列的多肽，其具有下列序列ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESYAKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAVSKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPA(SEQ ID NO 1)編碼膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)血清型4型的N-末端截取物的多肽R2的DNA序列GAGAACGAGGGAGCTACCCAAGTACCCACTTCTTCTAATAGGGCAAATGAAAGTCAGGCAGAACAAGGAGAACAACCTAAAAAACTCGATTCAGAACGAGATAAGGCAAGGAAAGAGGTCGAGGAATATGTAAAAAAAATAGTGGGTGAGAGCTATGCAAAATCAACTAAAAAGCGACATACAATTACTGTAGCTCTAGTTAACGAGTTGAACAACATTAAGAACGAGTATTTGAATAAAATAGTTGAATCAACCTCAGAAAGCCAACTACAGATACTGATGATGGAGAGTCGATCAAAAGTAGATGAAGCTGTGTCTAAGTTTGAAAAGGACTCATCTTCTTCGTCAAGTTCAGACTCTTCCACTAAACCGGAAGCTTCAGATACAGCGAAGCCAAACAAGCCGACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAACGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAGAGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTGAAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTGAAGAAACTCTTCCAAGCCCATCCCTGAAACCAGAAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAAACGAGGAAAAAGTTAAGCAAGCAAAAGCGGAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAAAATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTG(SEQ ID NO 12).CbpA血清型4的氨基酸序列ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESYAKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAVSKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPAEQPQPAPAPKAEKPAPAPKPENPAEQPKAEKPADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKTEKPAQPSTPKTGWKQENGMWYFYNTDGSMATGWLQNNGSWYYLNSNGAMATGWLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQYNGSWYYLNANGSMATGWLQYNGSWYYLNANGDMATGWVKDGDTWYYLEASGAMKASQWFKVSDKWYYVNGSGALAVNTTVDGYGVNANGEWVN.(SEQ IDNO 2)編碼CbpA血清型4的氨基酸序列的DNA序列GAGAACGAGGGAGCTACCCAAGTACCCACTTCTTCTAATAGGGCAAATGAAAGTCAGGCAGAACAAGGAGAACAACCTAAAAAACTCGATTCAGAACGAGATAAGGCAAGGAAAGAGGTCGAGGAATATGTAAAAAAAATAGTGGGTGAGAGCTATGCAAAATCAACTAAAAAGCGACATACAATTACTGTAGCTCTAGTTAACGAGTTGAACAACATTAAGAACGAGTATTTGAATAAAATAGTTGAATCAACCTCAGAAAGCCAACTACAGATACTGATGATGGAGAGTCGATCAAAAGTAGATGAAGCTGTGTCTAAGTTTGAAAAGGACTCATCTTCTICGTCAAGTTCAGACTCTTCCACTAAACCGGAAGCTTCAGATACAGCGAAGCCAAACAAGCCGACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAACGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAGAGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTGAAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAACACCTGATAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTGAAGAAACTCTTCCAAGCCCATCCCTGAAACCAGAAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGgCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAAACGAGGAAAAAGTTAAGCAAGCAAAAGCGGAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAAAATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTGAACAACCACAACCAGCGCCGGCTCCAAAAGCAGAAAAACCAGCTCCAGCTCCAAAACCAGAGAATCCAGCTGAACAACCAAAAGCAGAAAAACCAGCTGATCAACAAGCTGAAGAAGACTATGCTCGTAGATCAGAAGAAGAATATAATCGCTTGACTCAACAGCAACCGCCAAAAACTGAAAAACCAGCACAACCATCTACTCCAAAAACAGGCTGGAAACAAGAAAACGGTATGTGGTACTTCTACAATACTGATGGTTCAATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAAtGGCTCAtGGTAcTACcTCAACAGCAATGGCGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCATGGTACTATCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCAACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCGACAGGATGGCTCCAATACAATGGCTCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCGACAGGATGGCTCCAATACAATGGCTCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTGATATGGCGACAGGTTGGGTGAAAGATGGAGATACCTGGTACTATCTTGAAGCATCAGGTGCTATGAAAGCAAGCCAATGGTTCAAAGTATCAGATAAATGGTACTATGTCAATGGCTCAGGTGCCCTTGCAGTCAACACAACTGTAGATGGCTATGGAGTCAATGCCAATGGTGAATGGGTAAACTAA(SEQ ID NO 13).
“多肽R1”意指含有膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)血清型4型的N-末端截取物的16位到321位氨基酸序列的多肽，其具有下列序列ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESYAKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAVSKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETL(SEQ ID NO 3).
編碼多肽R1的DNA序列為GAGAACGAGGGAGCTACCCAAGTACCCACTTCTTCTAATAGGGCAAATGAAAGTCAGGCAGAACAAGGAGAACAACCTAAAAAACTCGATTCAGAACGAGATAAGGCAAGGAAAGAGGTCGAGGAATATGTAAAAAAAATAGTGGGTGAGAGCTATGCAAAATCAACTAAAAAGCGACATACAATTACTGTAGCTCTAGTTAACGAGTTGAACAACATTAAGAACGAGTATTTGAATAAAATAGTTGAATCAACCTCAGAAAGCCAACTACAGATACTGATGATGGAGAGTCGATCAAAAGTAGATGAAGCTGTGTCTAAGTTTGAAAAGGACTCATCTTCTTCGTCAAGTTCAGACTCTTCCACTAAACCGGAAGCTTCAGATACAGCGAAGCCAAACAAGCCGACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAACGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAGAGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTGAAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTGAAGAAACTCTTC(SEQ ID NO 14).
“多肽C/R2”意指在R2內(nèi)包含重復(fù)區(qū)C的多肽，其中重復(fù)區(qū)C具有膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)血清型4型的N-末端截取物的327位到433位氨基酸序列，其具有下列序列KPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKA(SEQ ID NO 4).多肽C/R2的DNA序列AAACCAGAAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAAACGAGGAAAAAGTTAAGCAAGCAAAAGCGGAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAAAATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCA(SEQ ID NO 15)“多肽A/R2”意指在R2內(nèi)包含重復(fù)區(qū)A的多肽，其中重復(fù)區(qū)A具有膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)血清型4型的N-末端截取物的153位到269位氨基酸序列，其具有下列序列TEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADA(SEQ ID NO 5).如圖1所示，多肽R2的A區(qū)與R1中的A區(qū)是相同的。
編碼多肽A/R2的DNA序列為ACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAACGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAGAGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTGAAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCT(SEQ ID NO 16).
可以改變或修飾一個或多個氨基酸殘基的同一性或位置以包括變體，例如缺失物，包含比蛋白質(zhì)全部特定殘基少的殘基，取代物，其中一個或多個特定殘基被其它殘基取代和加成物，其中一個或多個氨基酸殘基被加入到所述多肽的末端或中間部分(見圖2)。這些分子包括摻入對于由所選非哺乳動物宿主表達(dá)來說“優(yōu)選的”密碼子；提供限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)；并且提供促進(jìn)易于表達(dá)載體構(gòu)建的其它起始、末端或中間的DNA序列。具體來說，下列是血清型4中氨基酸取代的例子，其包括但不限于154位的E被K取代；155位的P被L取代；156位的G被E取代；157位的E被K取代；181位的K被E取代；182位的D被A取代；187位的R被Y、H或L取代；194位的I被N取代；200位的E被D取代；202位的E被D取代；209位的E被K取代；212位的K被E取代；218位的V被L取代；220位的V被K或E取代；221位的K被E取代；223位的N被D或K取代；225位的P被S、T或R取代；227位的D被N取代；228位的E被K取代；229位的Q被E、G或D取代；230位的K被T取代；232位的K被N取代；235位的E被K取代；236位的A被E取代；237位的E被K取代；240位的S被N取代；241位的K被E取代；242位的Q被K取代；249位的K被E取代；250位的K被N取代；257位的E被Q或K取代；263位的A被L取代；264位的K被E取代；265位的R被N取代；266位的R被I取代；267位的A被K或V取代；258位的D被T取代；269位的A被D取代；291位的A被T、V、P、G或X取代；294位的G被G、A或E取代；295位的V被D或A取代；295位的P被L或F取代；299位的L被P或Q取代；328位的P被S取代；329位的E被G取代；340位的E被A取代；343位的K被E或D取代；347位的E被K取代；349位的D被A取代；354位的R被H取代；366位的E被D取代；375位的E被K取代；378位的K被E取代；390位的E被G取代；391位的P被S取代；393位的N被D取代；397位的V被I取代；和408位的K被Q取代。
“多肽R2血清型-R6x”是指包含膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)血清型R6x的N-末端截取物的16位到444位氨基酸序列的多肽，其具有下列序列ENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVALNIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVAEAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVKEEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADAKLKEANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSSSLKSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKEAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPA(SEQ ID NO 7)編碼多肽R2血清型R6x的DNA序列GAAAACGAAGGAAGTACCCAAGCAGCCACTTCTTCTAATATGGCAAAGACAGAACATAGGAAAGCTGCTAAACAAGTCGTCGATGAATATATAGAAAAAATGTTGAGGGAGATTCAACTAGATAGAAGAAAACATACCCAAAATGTCGCCTTAAACATAAAGTTGAGCGCAATTAAAACGAAGTATTTGCGTGAATTAAATGTTTTAGAAGAGAAGTCGAAAGATGAGTTGCCGTCAGAAATAAAAGCAAAGTTAGACGCAGCTTTTGAGAAGTTTAAAAAAGATACATTGAAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAAtCTCGAAACGAGGGCACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGAtCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGATGCTAAGTTGAAGGAAGCTAATGTAGCGACTTCAGAtCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTGAAGAAACTCTTCCAAGCTCATCCCTGAAATCAGGAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGACCTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAGACGAGGAAAAAATTAAGCAAGCAAAAGCGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTG(SEQ ID NO 17)CbpA血清型R6x的氨基酸序列ENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVALNIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVAEAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVKEEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADAKLKEANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSSSLKSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKEAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPAEQPQPAPATQPEKPAPKPEKPAEQPKAEKTDDQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKTEKPAQPSTPKTGWKQENGMWYFYNTDGSMATGWLQNNGSWYYLNANGAMATGWLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQNNGSWYYLNANGAMATGWLQYNGSWYYLNSNGAMATGWLQYNGSWYYLNANGDMATGWLQNNGSWYYLNANGDMATGWLQYNGSWYYLNANGDMATGWVKDGDTWYYLEASGAMKASQWFKVSDKWYYVNGSGALAVNTTVDGYGVNANGEWVN(SEQ ID NO 8).編碼CbpA血清型R6x氨基酸序列的DNA序列GAAAACGAAGGAAGTACCCAAGCAGCCACTTCTTCTAATATGGCAAAGACAGAACATAGGAAAGCTGCTAAACAAGTCGTCGATGAATATATAGAAAAAATGTTGAGGGAGATTCAACTAGATAGAAGAAAACATACCCAAAATGTCGCCTTAAACATAAAGTTGAGCGCAATTAAAACGAAGTATTTGCGTGAATTAAATGTTTTAGAAGAGAAGTCGAAAGATGAGTTGCCGTCAGAAATAAAAGCAAAGTTAGACGCAGCTTTTGAGAAGTTTAAAAAAGATACATTGAAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAAtCTCGAAACGAGGGCACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGAtCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGATGCTAAGTTGAAGGAAGCTAATGTAGCGACTtCAGAtCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTGAAGAAACTCTTCCAAGCTCATCCCTGAAATCAGGAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGACCTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAGACGAGGAAAAAATTAAGCAAGCAAAAGCGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGAAGAACAACCACAACCAGCGCCGGCTACTCAACCAGAAAAACCAGCTCCAAAACCAGAGAAGCCAGCTGAACAACCAAAAGCAGAAAAAACAGATGATCAACAAGCTGAAGAAGACTATGCTCGTAGATCAGAAGAAGAATATAATCGCTTGACTCAACAGCAACCGCCAAAAACTGAAAAACCAGCACAACCATCTACTCCAAAAACAGGCTGGAAACAAGAAAACGGTATGTGGTACTTCTACAATACTGATGGTTCAATGGCAACAGGATGGCTCCAAAACAACGGTTCATGGTACTATCTAAACGCTAATGGTGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCATGGTACTATCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCAACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAATACAATGGTTCATGGTACTACCTAAACAGCAATGGCGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAATACAATGGCTCATGGTACTACCTCAACGCTAATGGTGATATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAACGGTTCATGGTACTACCTCAACGCTAATGGTGATATGGCGACAGGATGGCTCCAATACAACGGTTCATGGTATTACCTCAACGCTAATGGTGATATGGCGACAGGTTGGGTGAAAGATGGAGATACCTGGTACTATCTTGAAGCATCAGGTGCTATGAAAGCAAGCCAATGGTTCAAAGTATCAGATAAATGGTACTATGTCAATGGCTCAGGTGCCCTTGCAGTCAACACAACTGTAGATGGCTATGGAGTCAATGCCAATGGTGAATGGGTAAACTAA(SEQ ID NO 18).
“多肽R1血清型R6x”是指包含膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)血清型R6x的N-末端截取物的16位到321位氨基酸序列的多肽，其具有下列序列ENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVALNIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVAEAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVKEEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADAKLKEANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETL(SEQ IDNO 9).編碼多肽R1的DNA序列為GAAAACGAAGGAAGTACCCAAGCAGCCACTTCTTCTAATATGGCAAAGACAGAACATAGGAAAGCTGCTAAACAAGTCGTCGATGAATATATAGAAAAAATGTTGAGGGAGATTCAACTAGATAGAAGAAAACATACCCAAAATGTCGCCTTAAACATAAAGTTGAGCGCAATTAAAACGAAGTATTTGCGTGAATTAAATGTTTTAGAAGAGAAGTCGAAAGATGAGTTGCCGTCAGAAATAAAAGCAAAGTTAGACGCAGCTTTTGAGAAGTTTAAAAAAGATACATTGAAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAATCTCGAAACGAGGGCACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGATGCTAAGTTGAAGGAAGCTAATGTAGCGACTTCAGATCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTGAAGAAACTCTTC(SEQ ID NO 19).
“多肽C/R2血清型R6x”是指在R2內(nèi)包含重復(fù)區(qū)C的多肽(參見圖2)，其中所述重復(fù)區(qū)C具有膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)血清型R6x的N-末端截取物的327位到433位的氨基酸序列，其具有下列序列KSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKEAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKA(SEQ ID NO 10)多肽C/R2血清型R6x的DNA序列AAATCAGGAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGACCTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAGACGAGGAAAAAATTAAGCAAGCAAAAGCGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCA(SEQ ID NO 20).
“多肽A/R2血清型R6x”是指在R2內(nèi)包含重復(fù)區(qū)A的多肽(參見圖2)，其中所述重復(fù)區(qū)A具有膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)血清型R6x的N-末端截取物的155位到265位的氨基酸序列，其具有下列序列PGEKVAEAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVKEEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADA(SEQ ID NO 11)編碼多肽A/R2血清型R6x的DNA序列CCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAAtCTCGAAACGAGGGCACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGATGCT(SEQ ID NO 21).
本發(fā)明涉及一種分離的多肽，其中該分離的多肽由如SEQ ID NOS22或23所述的氨基酸序列所組成，包括其片段、突變體、變體、或類似物，或衍生物。SPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPA(SEQ ID NO 22；血清型 4；323-434位)或PSSSLKSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKEAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKRA(SEQ ID NO 23；血清型 R6x；322-434位).
“多肽B/R2”是指包含圖2所述的膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)血清型4型的N-末端截取物的270位到326位氨基酸序列的多肽?！岸嚯腂/R2血清型-R6x”是指包含圖2所述的膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)血清型R6x的N-末端截取物的264位到326位氨基酸序列的多肽。本發(fā)明研究具有圖1所述的A、B、C、A+B、B+C、A+C區(qū)氨基酸序列的多肽。
此外，本發(fā)明提供一種分離的多肽，該多肽包含膽堿結(jié)合蛋白A的N-末端截取物的氨基酸序列，其中所述多肽具有氨基酸KXXE(SEQ IDNO 6)。
本發(fā)明涉及包含膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列闡述于圖2中。在一個實(shí)施方案中，所述多肽具有一個氨基酸序列，該序列是圖2所述的保守區(qū)。例如，保守區(qū)包括但不限制于氨基酸序列158-172；300-321；331-339；355-365；367-374；379-389；409-427；和430-447。圖2闡述了本發(fā)明所研究的各種血清型CbpA的N末端區(qū)的核酸和氨基酸序列的同源性。
本發(fā)明提供一種分離的多肽，該多肽包含從膽堿結(jié)合蛋白A的N-末端截取的氨基酸序列，其中所述多肽具有凝集素活性并且不與膽堿結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO 1、3-5、7或9-11中所述的任一氨基酸序列，包括其片段、突變體、變體、類似物，或衍生物。
本文所使用的“具有凝集素活性的多肽”是指一種以非共價(jià)鍵與碳水化合物結(jié)合的多肽、肽或蛋白質(zhì)。本文所定義的“粘附素”是指細(xì)菌與人類細(xì)胞的非共價(jià)鍵結(jié)合或足夠穩(wěn)定以經(jīng)得起洗滌的分泌。本文所定義的“結(jié)合LNnT”是指結(jié)合乳糖-N-新四糖包裹的底物多于結(jié)合白蛋白-對照。
本發(fā)明提供一種分離的免疫原性多肽，該多肽包含從膽堿結(jié)合蛋白A的N末端截取的氨基酸序列。本發(fā)明預(yù)測所述免疫原性多肽具有SEO ID NOS 1、3-7或9-11中所述的任一氨基酸序列，包括其片段、突變體、變體、類似物，或衍生物。本發(fā)明提供了一種分離的多肽，該多肽包含圖2所述從膽堿結(jié)合蛋白A的N末端截取的氨基酸序列。在一個實(shí)施方案中，所述多肽具有圖2所述保守區(qū)的氨基酸序列。
本發(fā)明涉及包含上述氨基酸序列的多肽的類似物。所述類似物多肽可能具有不連接或連接到包含所述氨基酸序列的多肽的N或COOH末端的N-末端蛋氨酸或N-末端聚組氨酸。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明研究了由所述多肽的蛋白水解消化產(chǎn)物產(chǎn)生的多肽的肽片段。在另一實(shí)施方案中，所述多肽衍生物上連有一個或多個化學(xué)部分。在另一實(shí)施方案中，所述化學(xué)部分是水溶性聚合物。在另一實(shí)施方案中，所述化學(xué)部分是聚乙二醇。在另一實(shí)施方案中，所述化學(xué)部分是單、二、三或tetrapegylated。在另一實(shí)施方案中，所述化學(xué)部分是N-末端monopegylated。
聚乙二醇(PEG)連接到化合物上是特別有用的，因?yàn)镻EG對哺乳動物具有很低的毒性(Carpenter等人，1971)。例如，美國批準(zhǔn)利用腺苷脫氨基酶的PEG加合物來治療人類嚴(yán)重的合并免疫缺陷綜合癥。與PEG結(jié)合獲得的第二點(diǎn)好處是有效地降低異種化合物的免疫原性和抗原性。例如，人類蛋白質(zhì)的PEG加合物可用于治療其它哺乳動物物種的疾病并且沒有誘發(fā)嚴(yán)重免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)。本發(fā)明化合物可以以微囊包封裝置遞送以便于減少或預(yù)防對抗所述化合物或?qū)箍僧a(chǎn)生所述化合物的細(xì)胞的宿主免疫反應(yīng)。本發(fā)明化合物也可以以包裹在膜中的微囊化形式如脂質(zhì)體遞送。
已經(jīng)描述了許多適用于與蛋白質(zhì)直接反應(yīng)的PEG活性形式。用于與蛋白質(zhì)氨基反應(yīng)的PEG試劑包括羧酸的活性酯或碳酸酯衍生物，特別是其中離去基團(tuán)為N-羥基琥珀酰亞胺、對-硝基苯酚、咪唑或1-羥基-2-硝基苯-4-磺酸酯的化合物。包含馬來酰亞氨基或鹵代乙?；腜EG衍生物是適用于蛋白質(zhì)游離巰基改性的試劑。同樣地，包含氨基肼或酰基肼的PEG試劑可用于與醛反應(yīng)，所述醛是由蛋白質(zhì)中碳水化合物基團(tuán)的高碘酸鹽氧化產(chǎn)生的。
在一個實(shí)施方案中，本文所描述的多肽的氨基酸殘基優(yōu)選以“L”同分異構(gòu)形式存在。在另一實(shí)施方案中，以“D”同分異構(gòu)形式存在的殘基可替代任何L-氨基酸殘基，只要所述多肽能夠保留所需要的凝集素活性的功能特性即可。NH2是指在多肽的氨基端存在的游離氨基。COOH是指在多肽的羧基端存在的游離羧基。本文所使用的縮寫與標(biāo)準(zhǔn)的多肽命名一致，J.Biol.Chem.，2433552-59(1969)。
應(yīng)該注意，本文所有氨基酸殘基序列都是由式子表示的，其中所述式子的左和右取向都是在氨基端到羧基端的常規(guī)方向上。此外，應(yīng)該注意，在氨基酸殘基序列開始或結(jié)尾的破折號表示與另外的一個或多個氨基酸殘基序列連接的肽鍵。
利用公知的固相、液相或多肽縮合技術(shù)或其組合制備的合成多肽可包括天然和非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是標(biāo)準(zhǔn)的Boc(Nα-氨基保護(hù)的Nα-叔丁氧基羰基)氨基酸樹脂，通過Merrifield的最初固相方法中標(biāo)準(zhǔn)的脫保護(hù)、中和、偶聯(lián)和洗滌方法(1963，J.Am.Chem.Soc.852149-2154)合成，或者是由Carpino和Han(1972，J.Org.Chem.373403-3406)首先描述的堿不穩(wěn)定的Nα-氨基保護(hù)的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)氨基酸。因此，本發(fā)明多肽可包含D-氨基酸、D-氨基酸和L-氨基酸的組合和各種用于傳達(dá)特殊性質(zhì)的“設(shè)計(jì)者”氨基酸(例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸和Nα-甲基氨基酸等)。合成氨基酸包括用于合成賴氨酸的鳥氨酸，用于合成苯丙氨酸的氟苯丙氨酸和用于合成亮氨酸或異亮氨酸的正亮氨酸。另外，通過在特定偶聯(lián)步驟指定特定氨基酸，可產(chǎn)生α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β折疊、γ-轉(zhuǎn)角和環(huán)狀肽。
一方面，本發(fā)明所述肽在C-末端可包含特殊的氨基酸，它結(jié)合CO2H或CONH2側(cè)鏈以模擬游離的甘氨酸或甘氨酸-酰胺基團(tuán)?？紤]該特殊殘基的另一方法是具有由接頭組成的或與珠粒鍵合的側(cè)鏈的D或L氨基酸類似物。在一個實(shí)施方案中，假游離的C-末端殘基可為D或L光學(xué)構(gòu)型；在另一實(shí)施方案中，可以使用D和L異構(gòu)體的外消旋混合物。
在另外的實(shí)施方案中，焦谷氨酸可作為肽的N-末端殘基包含在內(nèi)。盡管焦谷氨酸經(jīng)不起通過Edman降解所得序列的檢驗(yàn)，但是通過將取代僅限制到所給出的具有N-末端焦谷氨酸的珠粒上的50％的肽，珠粒上仍將保留足夠的非焦谷氨酸肽用于測序。普通技術(shù)人員會容易地意識到該技術(shù)可用于任何在N-末端摻入耐受Edman降解的殘基的肽的測序。下文詳細(xì)描述了表征表現(xiàn)出所需活性的各個肽的其它方法。在50％的肽中存在特定的N-末端基團(tuán)時，含有被保護(hù)的N-末端基團(tuán)如焦谷氨酸的肽的比活性通過比較完全(100％)被保護(hù)的肽與未被保護(hù)的(0％)肽的活性將會容易地得到證明。
另外，預(yù)計(jì)本發(fā)明制備的肽具有更好定義的結(jié)構(gòu)特性，并且使用肽模擬物和肽模擬鍵如酯鍵來制備具有新特性的肽。在另一實(shí)施方案中，可以產(chǎn)生有還原肽鍵(即，R1-CH2-NH-R2，其中R1和R2是氨基酸殘基或序列)的肽?？梢宰鳛槎膩唵挝灰脒€原肽鍵。這樣的分子將會耐受肽鍵水解，如，蛋白酶活性。這類肽將會提供具有獨(dú)特功能和活性的配體，如，由于對代謝分解或蛋白酶活性具有耐受性而延長了體內(nèi)的半衰期。而且，在某些系統(tǒng)中受約束的肽顯示增強(qiáng)的功能活性是公知的(Hruby，1982，Life Sciences 31189-199；Hruby等人，1990，Biochem J.268249-262)；本發(fā)明提供一種生產(chǎn)受約束肽的方法，該肽在所有其它位置摻入隨機(jī)序列。
可以合成受約束的、環(huán)狀的或剛性化的肽，條件是在肽序列的至少兩個位置插入氨基酸或氨基酸類似物以提供能夠交聯(lián)以在處理后約束、環(huán)化或剛性化該肽形成交聯(lián)物的化學(xué)官能團(tuán)。當(dāng)摻入回轉(zhuǎn)誘導(dǎo)氨基酸時將有利于環(huán)化。能夠使肽交聯(lián)的氨基酸的例子是形成二硫化物的半胱氨酸、形成內(nèi)酯或乳糖酶的天冬氨酸和螯合劑如γ-羧基-谷氨酸(Gla)(Bachem)以螯合過渡金屬并形成交聯(lián)物。通過改良Zee-Cheng和Olson(1980，Biophys，Biochem.Res.Commun.941128-1132)所述的合成方法可以制備保護(hù)的γ-羧基-谷氨酸?？赏ㄟ^如氧化半胱氨酸殘基以形成二硫化物或加入金屬離子以形成螯合物來處理肽序列中含有至少兩個能夠交聯(lián)的氨基酸的肽，使肽交聯(lián)并形成受約束的、環(huán)狀的或剛性化的肽。本發(fā)明提供系統(tǒng)制備交聯(lián)物的策略。例如，如果將4個半胱氨酸殘基摻入肽序列中，可使用不同的保護(hù)基(Hiskey，1981，in The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，Vol.3，Gross and Meienhofer，eds.，Academic PressNew York，137-167頁；Ponsanti等人，1990，Tetrahedron 468255-8266)。第一對半胱氨酸可被脫保護(hù)并氧化，然后可將第二組脫保護(hù)并氧化。在該方法中，可形成特定組的二硫化的交聯(lián)物。另外，可摻入一對半胱氨酸和一對核對的氨基酸類似物以便使交聯(lián)物具有不同的化學(xué)特性。
可以將下列非經(jīng)典氨基酸結(jié)合到肽中以便引入特定構(gòu)象的基序1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸酯(Kazmierski等人，1991，J.Am.Chem.Soc.1132275-2283)；(2S，3S)-甲基-苯丙氨酸、(2S，3R)-甲基-苯丙氨酸、(2R，3S)-甲基-苯丙氨酸和(2R，3R)-甲基-苯丙氨酸(Kazmierski和Hruby，1991，Tetrahedron Lett)；2-氨基四氫萘-2-羧酸(Landis，1989，Ph.D.Thesis，University of Arizona)；羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸酯(Miyake等人，1989，J.Takeda Res.Labs.4353-76)；β-咔啉(D和L)(Kazmierski，1988，Ph.D.Thesis，University of Arizona)；HIC(組胺酸異喹啉羧酸)(Zechel等人，1991，Int.J.Pep.Protein Res.43)；和HIC(組胺酸環(huán)脲)(Dharanipragada)。
下列氨基酸類似物和肽模擬物可被引入肽中以誘導(dǎo)或有利于形成特異的二級結(jié)構(gòu)LL-Acp(LL-3-氨基-2-丙烯酮-6-羧酸)，一種誘導(dǎo)β-轉(zhuǎn)角的二肽類似物(Kemp等人，1985，J.Org.Chem.505834-5838)；誘導(dǎo)β-折疊的類似物(Kemp等人，1988，Tetrahedron Lett.295081-5082)；誘導(dǎo)β-轉(zhuǎn)角的類似物(Kemp等人，1988，Tetrahedron Lett.295057-5060)；誘導(dǎo)α-螺旋的類似物(Kemp等人，1988，TetrahedronLett.294935-4938)；誘導(dǎo)γ-轉(zhuǎn)角的類似物(Kemp等人，1989，J.Org.Chem.54109-115)和由下列參考文獻(xiàn)提供的類似物Nagai和Sato，1985，Tetrahedron Lett.26647-650；DiMaio等人，1989，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1687頁；以及Gly-Ala轉(zhuǎn)角類似物(Kahn等人，1989，Tetrahedron Lett.302317)；酰胺鍵同配物(Jones等人，1988，Tetrahedron Lett.293853-3856)；四唑(Zabrocki等人，1988，J.Am.Chem.Soc.1105875-5880)；DTC(Samanen等人，1990，Int.J.ProteinPep.Res.35501-509)；和Olson等人，1990，J.Am.Chem.Sci.112323-333和Garvey等人，1990，J.Org.Chem.56436中教導(dǎo)的類似物。在Kahn的美國專利5440013(出版于1995年8月8日)中描述了β-轉(zhuǎn)角的和β-凸起的構(gòu)象限制模擬物。
本發(fā)明還提供本發(fā)明多肽或肽的修飾或衍生方法。肽的修飾對普通技術(shù)人員來說是公知的，并且包括磷酸化、羧甲基化和?；Ｐ揎椏赏ㄟ^化學(xué)或酶方式來進(jìn)行。在另一方面，可以制備糖基化或脂肪酰化的肽衍生物。在本領(lǐng)域中，糖基化或脂肪酰化的肽的制備方法是公知的。也可以制備脂肪?；难苌铩＠绲幌抻?，游離氨基(N-末端的或賴氨?；系?可被酰化，如十四烷?；?。在另一實(shí)施方案中，可以將包含結(jié)構(gòu)式為-(CH2)nCH3的脂族側(cè)鏈的氨基酸引入肽中。適于本發(fā)明使用的這種和其它肽-脂肪酸綴合物公開于英國專利GB8809162.4、國際專利申請PCT/AU89/00166和上文中的參考文獻(xiàn)5中。
在編碼這種多肽的核酸中可以進(jìn)行突變使特定的密碼子改變?yōu)榫幋a不同氨基酸的密碼子。這種突變通常通過改變盡可能最少的核苷酸來進(jìn)行。這種類型的取代突變可被進(jìn)行而使所得蛋白質(zhì)中的氨基酸以非保守的方式(即，由屬于具有特定大小或特性的氨基酸類別的氨基酸的密碼子改變?yōu)閷儆诹硪活悇e的氨基酸所特有的密碼子)或以保守方式(即，由屬于具有特定大小或特性的氨基酸類別的氨基酸的密碼子改變?yōu)閷儆谙嗤悇e的氨基酸所特有的密碼子)改變。這種保守改變通常使所得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生較少的變化。非保守改變更有可能改變所得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性或功能。應(yīng)當(dāng)認(rèn)為本發(fā)明包括含有不明顯改變所得蛋白質(zhì)活性或結(jié)合特性的保守改變的序列。序列中氨基酸的取代可選自該類氨基酸的其它成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組胺酸。帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。不希望這種變化影響通過聚丙烯酰胺凝膠電泳確定的表現(xiàn)分子量或等電點(diǎn)。
特別優(yōu)選的取代為-Lys取代Arg和Arg取代Lys，這樣的取代可保持正電荷；-Glu取代Asp和Asp取代Glu，這樣的取代可保持負(fù)電荷；-Ser取代Thr，這樣的取代可保持游離的-OH；和-Gln取代Asn，這樣的取代可保持游離的NH2。
合成的DNA序列允許方便構(gòu)建表達(dá)類似物或“突變蛋白”的基因。Noren等人，Science，244182-188(1989年4月)描述了將非天然氨基酸定點(diǎn)引入蛋白質(zhì)中的一般方法。該方法可用于產(chǎn)生基于非天然氨基酸的類似物。
在本發(fā)明中，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。在文獻(xiàn)中充分說明了這些技術(shù)。例如，參見Sambrook等人，“Molecular CloningA Laboratory Manual”(1989)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”I-III卷[Ausubel，R.M.，ed.(1994)]；“Cell BiologyA Laboratory Handbook”I-III卷[J.E.Celis，ed.(1994)]；“Current Protocols in Immunology”I-III卷[Coligan，J.E.，ed.(1994)]；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait ed.1984)；“Nucleic AcidHybridization”[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)]；“TranscriptionAnd Translation”[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)]；“Animal CellCulture”[R.I.Freshney，ed.(1986)]；“Immobilized Cells AndEnzymes”[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，“A Practical Guide ToMolecular Cloning”(1984)。
在另外的實(shí)施方案中，焦谷氨酸可作為肽的N-末端殘基包含在內(nèi)。盡管焦谷氨酸經(jīng)不起通過Edman降解所得序列的檢驗(yàn)，但是通過將取代僅限制到所給出的具有N-末端焦谷氨酸的珠粒上的50％的肽，珠粒上仍將保留足夠的非焦谷氨酸的肽。普通技術(shù)人員會容易地意識到該技術(shù)可用于任何在N-末端摻入耐受Edman降解的殘基的肽的測序。下文詳細(xì)描述了表征表現(xiàn)出所需活性的各個肽的其它方法。在50％肽中存在特定的N-末端基團(tuán)時，含有被保護(hù)的N-末端基團(tuán)如焦谷氨酸的肽的具體活性會通過比較完全(100％)被保護(hù)的肽與未被保護(hù)(0％)的肽的活性將會容易地得到證明。
用于衍生化的化學(xué)部分適于衍生化的化學(xué)部分可選自水溶性聚合物中。所選擇的聚合物應(yīng)當(dāng)是水溶性的以便其連接的成分不會沉淀在水性環(huán)境如，生理環(huán)境中。優(yōu)選地，對于成品制劑的治療使用來說，聚合物將是可藥用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)諸如聚合物/成分綴合物是否將在治療上使用之類的考慮來選擇所需的聚合物，如果用于治療，則要考慮所需劑量、循環(huán)時間、對蛋白水解作用的耐受性以及其它因素。對于本發(fā)明的一種或多種成分來說，使用本文提供的測定方法是可以確定的。
例如，水溶性聚合物可選自聚乙二醇、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊烷、聚-1，3，6-三氧雜環(huán)己烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或隨機(jī)共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛由于其在水中的穩(wěn)定性可能在生產(chǎn)中具有優(yōu)勢。
聚合物可以具有任意的分子量，并且可以是分枝的或不分枝的。就聚乙二醇來說，為了易于操作和制備，優(yōu)選的分子量在約2kDa到約100kDa之間(術(shù)語“約”表示在聚乙二醇的制備中一些分子比所述的分子量更重而另一些則更輕)?？墒褂闷渌笮〉木垡叶迹@取決于所需的治療全貌(如，所需的持續(xù)釋放期，對生物活性的影響，如果有的話，操作的難易度，抗原性的有無或大小和聚乙二醇對治療性蛋白或類似物的其它已知影響)。
如此連接的聚合物分子的數(shù)量是可變的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定其對功能的影響?？梢詫ο嗤虿煌幕瘜W(xué)部分(例如，聚合物，如不同重量的聚乙二醇)進(jìn)行單衍生化，或者可以將衍生作用進(jìn)行二、三、四或某些組合。聚合物分子與一種或多種成分分子的比例是可變的，它們在反應(yīng)混合物中的濃度也是可變的。一般來說，最佳比(從反應(yīng)的效率來說，沒有過量的未反應(yīng)的一種或多種成分和聚合物)將通過各種因素來確定，如所需的衍生化程度(如，單、二、三等)、所選聚合物的分子量、聚合物是分枝的還是不分枝的以及反應(yīng)條件。
聚乙二醇分子(或其它化學(xué)部分)應(yīng)當(dāng)連接到一種或多種成分上，所述成分被認(rèn)為對蛋白質(zhì)的功能性或抗原性區(qū)域有影響。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，有許多可以使用的連接方法，如參見引入本文供參考的EP0401384(PEG偶合到G-CSF上)，也可參見Malik等人，1992，Exp.Hematol.201028-1035(報(bào)告了用tresyl chloride使GM-CSFpegylation)。例如，聚乙二醇可以經(jīng)氨基酸殘基通過反應(yīng)基團(tuán)如游離氨基或羧基來共價(jià)結(jié)合。反應(yīng)基團(tuán)是那些可以與活化的聚乙二醇分子結(jié)合的基團(tuán)。具有游離氨基的氨基酸殘基包括賴氨酸殘基和N-末端的氨基酸殘基；具有游離羧基的氨基酸殘基包括天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基和C-端的氨基酸殘基。巰基也可用作連接聚乙二醇分子的反應(yīng)性基團(tuán)。出于治療目的，連接在氨基上是優(yōu)選的，如連接在N-末端或賴氨酸基團(tuán)上。
本發(fā)明提供一種分離的核酸，它編碼有含有膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明提供一種分離的核酸，它編碼含有如圖2所述的膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列的多肽。在一個實(shí)施方案中，核酸是SEQ ID NOS 12，14-17和19-21所述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。核酸是DNA、cDNA、基因組DNA、RNA。另外，分離的核酸可有效地連接到RNA轉(zhuǎn)錄的啟動子上。期待使用該核酸來競爭性抑制凝集素活性。
“載體”是一種復(fù)制子，如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒。可與另一DNA節(jié)段連接以便復(fù)制所連接的節(jié)段。
“DNA”指以其單股形式或雙股螺旋存在的脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式。該術(shù)語僅指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，并且不將它限制到任何特定的三級結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語包括雙股DNA，特別是在線性DNA分子(如限制片段)、病毒、質(zhì)粒和染色體中發(fā)現(xiàn)的。在特定雙股DNA分子結(jié)構(gòu)的討論中，本文可按照僅在沿DNA的非轉(zhuǎn)錄股(即，具有與mRNA同源序列的股)的5’到3’方向上給出序列的正常慣例來描述序列。
當(dāng)表達(dá)控制序列控制和調(diào)節(jié)DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯時，將DNA序列“有效地連接”到表達(dá)控制序列上。術(shù)語“有效地連接”包括在被表達(dá)的DNA序列前面具有合適的起始信號(如，ATG)和維持正確的讀框以允許在表達(dá)控制序列的控制下表達(dá)DNA序列并產(chǎn)生由該DNA序列編碼的所需產(chǎn)物。如果需要插入重組DNA分子中的基因不含有合適的起始信號，則可以將這樣的起始信號在該基因前面插入。
另外，本發(fā)明也提供包含上述核酸分子的載體。啟動子可以是或者等同于細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動物的啟動子。另外，載體可以是質(zhì)粒、粘粒、酵母人造染色體(YAC)、噬菌體或真核病毒DNA。
可以使用可用于表達(dá)蛋白的本領(lǐng)域已知的其它為數(shù)眾多的載體骨架。這些載體包括但不限于腺病毒(AV)、腺伴隨病毒(AAV)、猿猴病毒40(SV40)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、莫洛尼鼠類白血病病毒、DNA遞送系統(tǒng)，即脂質(zhì)體和表達(dá)質(zhì)粒遞送系統(tǒng)。此外，一類載體包含由病毒衍生的DNA元件，病毒如牛乳頭瘤病毒、多形瘤病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或Semliki Forest病毒。這些載體可以商購或者由所述序列通過本領(lǐng)域公知的方法來裝配。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)多肽的宿主載體系統(tǒng)，它包含合適宿主細(xì)胞的載體。合適的宿主細(xì)胞包括但不限于原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞(包括革蘭氏陽性細(xì)胞)、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和動物細(xì)胞。許多哺乳動物的細(xì)胞都可用作宿主，包括但不限于小鼠成纖維細(xì)胞NIH 3T3、CHO細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Ltk細(xì)胞、Cos細(xì)胞等。
在表達(dá)本發(fā)明的DNA序列中，可以采用各種各樣的宿主/表達(dá)載體的組合。例如，有用的表達(dá)載體可以由染色體、非染色體和合成DNA序列的節(jié)段組成。合適的載體包括SV40和已知的細(xì)菌質(zhì)粒，如大腸桿菌質(zhì)粒col E1，pCR1，pBR322，pMB9及其衍生物，質(zhì)粒如RP4的衍生物；噬菌體DNAS，如噬菌體λ的各種衍生物，如NM989，和其它噬菌體DNA，如M13和絲狀單股噬菌體DNA；酵母質(zhì)粒如2μ質(zhì)?；蚱溲苌铮徽婧思?xì)胞中可以使用的載體，如在昆蟲或哺乳動物細(xì)胞中可以使用的載體；由質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合衍生的載體，如已被修飾以利用噬菌體DNA或其它表達(dá)控制序列的質(zhì)粒等。
可在這些載體中使用各種各樣的表達(dá)控制序列-控制與其有效連接的DNA序列的表達(dá)的序列-來表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。這些可以使用的表達(dá)控制序列包括如SV40、CMV、牛痘、多形瘤或腺病毒的早期或晚期啟動子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、LTR系統(tǒng)、噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區(qū)域、fd外殼蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶(如，Pho5)的啟動子、酵母α-交配因子的啟動子和其它已知的控制原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒基因表達(dá)的序列及其各種組合。
各種各樣的單細(xì)胞宿主細(xì)胞也可以用于表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。這些宿主可包括公知的真核和原核宿主，如大腸桿菌、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、真菌如酵母的菌株和動物細(xì)胞如CHO，R1.1，B-W和L-M細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(如，COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆蟲細(xì)胞(如，SF9)和組織培養(yǎng)中的人細(xì)胞和植物細(xì)胞。
應(yīng)該理解對于表達(dá)本發(fā)明的DNA序列來說不是所有的載體、表達(dá)控制序列和宿主都能發(fā)揮同樣好的功能。即使表達(dá)系統(tǒng)相同所有宿主也不能發(fā)揮同樣好的功能。然而，在不脫離本發(fā)明范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要過多的實(shí)驗(yàn)就能夠選擇合適的載體、表達(dá)控制序列和宿主來完成所需的表達(dá)。例如，在選擇載體時，必須考慮宿主，因?yàn)檩d體必須在宿主中發(fā)揮功能。也應(yīng)考慮載體的拷貝數(shù)目、控制拷貝數(shù)目的能力和載體所編碼的任何其它蛋白的表達(dá)，如抗生素標(biāo)記物。
在選擇表達(dá)控制序列時，通常將考慮各種因素。例如，這些因素包括系統(tǒng)的相對強(qiáng)度、其控制能力及其與被表達(dá)的特定DNA序列或基因的相容性，特別是考慮潛在的二級結(jié)構(gòu)。將通過考慮下列因素來選擇合適的單細(xì)胞宿主如，它們與所選載體的相容性、其分泌特性、其正確折疊蛋白的能力、其發(fā)酵的要求以及對被表達(dá)的DNA序列所編碼的產(chǎn)物的宿主的毒性和表達(dá)產(chǎn)物純化的難易。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備多肽的方法，它包括使上述宿主載體系統(tǒng)在適宜的允許多肽產(chǎn)生的條件下生長并回收所產(chǎn)生的多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種能夠特異性識別分離的多肽或與其結(jié)合的抗體。所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。此外，所述抗體可以用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記，所述標(biāo)記物是放射性的、可比色的、熒光的或發(fā)光的標(biāo)記物。所述標(biāo)記抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)記抗體是純化的標(biāo)記抗體。標(biāo)記抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。
術(shù)語“抗體”的實(shí)例包括天然存在的和非天然存在的抗體。具體地說，術(shù)語“抗體”包括多克隆和單克隆抗體及其片段。此外，術(shù)語“抗體”包括嵌合抗體和全合成抗體及其片段。所述抗體包括但不限制于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈、Fab片段和Fab表達(dá)文庫。
可以使用本領(lǐng)域已知的各種方法來制備多肽或其衍生物或類似物的多克隆抗體(例如，參見抗體--實(shí)驗(yàn)室手冊，Harlow and Lane，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor，NewYork，1988)。為了制備抗體，可通過給各種宿主動物注射截取的CbpA或其衍生物(例如片段或融合蛋白)使其被免疫，所述宿主動物包括但不限制于兔子、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。在一個實(shí)施方案中，可將多肽綴合到免疫原性載體，例如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)上。依賴于宿主的種類，各種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
為了制備單克隆抗體或其片段、其類似物或其衍生物，可使用由任何在培養(yǎng)物中的傳代細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)(例如，參見抗體--實(shí)驗(yàn)室手冊，Harlow and Lane，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor，New York，1988)。這些技術(shù)包括但不限制于最初由Kohler和Milstein開發(fā)的雜交瘤技術(shù)(1975，Nature 256495-497)以及trioma技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，1983，今日免疫學(xué)472)和制備人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，1985，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，可在無菌動物中，利用最新技術(shù)(PCT/US90/02545)生產(chǎn)單克隆抗體。按照本發(fā)明，人抗體可使用并且可通過使用人雜交瘤(Cote等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802026-2023)或通過在體外用EBV病毒轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞(Cole等人，1985，單克隆抗體和癌癥治療，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)獲得。事實(shí)上，按照本發(fā)明，可使用所開發(fā)的通過將對多肽具有特異性的小鼠抗體分子的基因與具有適宜的生物活性的人抗體分子的基因拼接起來制備“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等人，1984，J.Bacteriol.159-870；Neuberger等人，1984，Nature 312604-608；Takeda等人，1985，Nature 314452-454)；所述抗體包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。所述人或人源化嵌合抗體優(yōu)選用于治療人類疾病(如下所述)，因?yàn)槿嘶蛉嗽椿贵w比異種抗體誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，特別是其本身的過敏反應(yīng)的可能性要小得多。本發(fā)明另一實(shí)施方案是利用構(gòu)建Fab表達(dá)文庫中所述的技術(shù)(Huse等人，1989，Science 2461275-1281)來快速和方便地鑒定具有所需的對多肽的特異性的單克隆Fab片段、或其衍生物或類似物。
包含抗體分子獨(dú)特型的抗體片段可通過已知技術(shù)來產(chǎn)生。例如，這些片段包括但不限于可通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab’)2片段；可通過還原F(ab’)2片段的二硫橋產(chǎn)生的Fab’片段和可通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段。
在抗體的產(chǎn)生中，可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)來篩選所需抗體，如，放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴(kuò)散沉積素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、原位免疫測定(例如使用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記)、蛋白質(zhì)印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測定(如，凝膠凝集測定、血細(xì)胞凝集測定)、補(bǔ)體結(jié)合測定、免疫熒光測定、蛋白質(zhì)A測定和免疫電泳測定等。在一個實(shí)施方案中，通過檢測原發(fā)抗體上的標(biāo)記來檢測抗體結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，通過檢測繼發(fā)抗體或試劑與原發(fā)抗體的結(jié)合來檢測原發(fā)抗體。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記繼發(fā)抗體。本領(lǐng)域中已知有多種免疫測定中檢測結(jié)合的方法并且在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
為了在體外進(jìn)行檢測，可用標(biāo)記物標(biāo)記抗體，標(biāo)記物如酶、熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、放射性同位素、染料、膠體金、乳膠粒和化學(xué)發(fā)光劑。另外，為了在體內(nèi)進(jìn)行檢測，可用如放射性同位素(優(yōu)選锝或碘)；磁共振位移試劑(如釓和錳)；或不透射線的試劑來標(biāo)記抗體。
這些研究中最常用的標(biāo)記物是放射性元素、酶、當(dāng)暴露于紫外光下時有熒光的化學(xué)藥品等。許多熒光材料都是已知的并且可用作標(biāo)記物。它們包括如熒光素、若丹明、金胺、德克薩斯紅、AMCA藍(lán)和熒光黃。具體的檢測材料是在山羊中制備的并經(jīng)異硫氰酸酯與熒光素綴合的抗兔抗體。多肽也可用放射性元素或用酶標(biāo)記。可通過目前可利用的計(jì)數(shù)方法來檢測放射性標(biāo)記物。優(yōu)選的同位素可選自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
同樣也可以使用酶標(biāo)記物并且可通過任何目前采用的比色、分光光度、熒光分光光度、電流或氣流技術(shù)來檢測。通過與橋接分子如碳化二亞胺、異硫氰酸酯、戊二醛等反應(yīng)，將酶與所選顆粒綴合。在這些方法中可以使用的許多酶都是已知的并且可以使用。優(yōu)選的是過氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加過氧化物酶和堿性磷酸酶。通過舉例的方式提及美國專利3654090、3850752和4016043中公開了候補(bǔ)的標(biāo)記材料和方法。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以制備適于醫(yī)學(xué)專家使用的商購試驗(yàn)試劑盒以確定預(yù)定的結(jié)合活性或者預(yù)定的與被懷疑的靶細(xì)胞結(jié)合活性能力的存在或缺乏。根據(jù)以上所討論的試驗(yàn)技術(shù)，一類試劑盒至少包含標(biāo)記的多肽或其結(jié)合配對物，例如其特異性抗體和用法說明，當(dāng)然，這取決于所選方法，如“競爭性的”、“夾心的”、“DASP”等。該試劑盒也可以包含外圍試劑如緩沖劑、穩(wěn)定劑等。
因此，可以制備證明有利于預(yù)定的細(xì)菌結(jié)合活性的細(xì)胞的存在或能力的試驗(yàn)試劑盒，它包含(a)預(yù)定量的至少一種標(biāo)記的免疫化學(xué)反應(yīng)性成分，該成分是通過將本發(fā)明的多肽或其特異性結(jié)合配對物直接或間接連接到可檢測標(biāo)記物上獲得的；(b)其它試劑；和(c)使用所述試劑盒的說明。
本發(fā)明提供拮抗劑或阻斷劑，它包括但不限于肽片段、模擬物、核酸分子、核酶、多肽、小分子、碳水化合物分子、單糖、寡糖或抗體。本發(fā)明也包括競爭性阻斷或抑制肺炎球菌的藥劑。本發(fā)明提供一種藥劑，它包含無機(jī)化合物、核酸分子、寡核苷酸、有機(jī)化合物、肽、肽模擬化合物或抑制該多肽的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供一種疫苗，它包含具有SEQ ID NOS1，3-7，9-11，22和23中所述氨基酸序列的多肽和可藥用佐劑或載體。所述多肽可包含圖2所述的膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。本發(fā)明提供一種疫苗，它包含多肽和可藥用佐劑或載體，所述多肽具有包含圖2所述保留區(qū)的氨基酸序列。例如，保留區(qū)包括但不限于氨基酸序列158-172；300-321；331-339；355-365；367-374；379-389；409-427和430-447。本發(fā)明提供一種疫苗，它包含編碼該多肽的分離的核酸和可藥用佐劑或載體。
可通過用免疫原量的多肽或其衍生物或片段和佐劑進(jìn)行免疫(接種疫苗)來誘導(dǎo)抗革蘭氏陽性菌，特別是肺炎球菌的自動免疫，其中所述多肽或其抗原衍生物或片段是所述疫苗的抗原組分。
可在與制備疫苗的佐劑的混合物中制備本發(fā)明多肽或其衍生物或片段。優(yōu)選地，用作所述疫苗抗原組分的本發(fā)明多肽的衍生物或其片段是粘附素。更優(yōu)選地，用作所述疫苗抗原組分的多肽或肽衍生物或其片段是與所有或很多革蘭氏陽性菌種的菌株共有的或與密切相關(guān)的細(xì)菌菌種共有的抗原。最優(yōu)選地，所述疫苗的抗原組分是粘附素，它是一種共同抗原。
可通過本領(lǐng)域已知的方法，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、微量注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂轉(zhuǎn)染(溶菌體融合)、基因槍的應(yīng)用或DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將包含本發(fā)明以核酸為主藥的疫苗的載體引入需要的宿主(例如參見Wu等人，1992，J.Biol.Chem.267963-967；Wu和Wu，1988，J.Biol.Chem.26314621-14624；Hartmut等人，1990年3月15日中請的加拿大專利申請2,012,311)。
所述疫苗可通過任何非腸道途徑給藥，所述非腸道途徑包括但不限制于肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)等。優(yōu)選地，因?yàn)槔硐氲囊呙缃臃N結(jié)果是闡明與抗原并因此與病原生物體的免疫反應(yīng)，所以直接或通過尋靶或選擇病毒載體間接給予到淋巴組織，例如淋巴結(jié)或脾是理想的。因?yàn)槊庖呒?xì)胞在不斷地復(fù)制，所以它們是以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為主藥的核酸疫苗的理想的靶細(xì)胞，因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒需要復(fù)制細(xì)胞。
可通過將抗本發(fā)明多肽的抗血清、多克隆抗體或中和單克隆抗體給予懷疑受到革蘭氏陽性菌，優(yōu)選鏈球菌，并且更優(yōu)選肺炎球菌感染的受治療動物而使該動物獲得被動免疫。盡管被動免疫不會帶來長期的保護(hù)作用，但它可能是治療尚未接種疫苗的受治療者細(xì)菌感染的有價(jià)值的工具。對于革蘭氏陽性抗生素耐藥菌株的治療來說，被動免疫是特別重要的，因?yàn)闆]有其它治療可以利用。優(yōu)選地，所給予的用于被動免疫治療的抗體是自體抗體。例如，如果所述受治療者是人，為了使針對抗體的免疫反應(yīng)的可能性降低到最小，優(yōu)選地，所述抗體是由人體獲得的或者是“人源化的”。本發(fā)明主動性或被動性疫苗或給予粘附素可用于保護(hù)受治療動物使其免受革蘭氏陽性菌，優(yōu)選鏈球菌，并且更優(yōu)選肺炎球菌的感染。
本發(fā)明提供一種藥物組合物，它包含一定量本文所描述的多肽和可藥用載體或稀釋劑。
例如，這種用于阻止肺炎球菌附著到粘膜表面的藥物組合物可包括抗凝集素區(qū)和/或可溶性過剩凝集素區(qū)蛋白質(zhì)的抗體。通過任一機(jī)理阻斷附著都能阻斷感染的最初步驟，由此減少移生作用。這又轉(zhuǎn)過來減少人與人之間的傳播并預(yù)防癥狀性疾病的發(fā)展。
本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)已經(jīng)接觸到或感染了肺炎球菌的受治療者的免疫反應(yīng)的方法，它包括給予所述受治療者一定量的藥物組合物，由此誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
本發(fā)明提供一種預(yù)防受治療者被肺炎球菌感染的方法，它包括給予所述受治療者一定量的阻止肺炎球菌附著有效量的藥物組合物，由此預(yù)防肺炎球菌感染。
本發(fā)明提供一種預(yù)防受治療者被肺炎球菌感染的方法，它包括給予所述受治療者一定量預(yù)防包含抗體和可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物，由此預(yù)防肺炎球菌感染。
本發(fā)明提供一種治療感染了或接觸到肺炎球菌的受治療者的方法，它包括給予所述受治療者治療有效量本發(fā)明的疫苗，由此治療所述受治療者。
本發(fā)明提供一種抑制已經(jīng)接觸到或感染了肺炎球菌的受治療者宿主細(xì)胞移生的方法，它包括給予所述受治療者一定量的包含由SEQ IDNOS 1，3-5，7或9-11中所述氨基酸序列組成的多肽的藥物組合物，由此誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。所述阻斷移生作用的治療性肽是由呼吸粘膜遞送的。包含由圖2中所述氨基酸序列組成的多肽的藥物組合物。
本文所使用的“藥物組合物”是指通過例如阻止肺炎球菌移生提供治療效果或益處的、治療有效量的本發(fā)明多肽產(chǎn)品以及適宜的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、輔劑和/或載體。本文所使用的“治療有效量”是指提供對所述疾病治療效果和給藥方案的量。所述組合物是液體或凍干或用其它方法干燥的制劑并且包括由各種緩沖劑內(nèi)含物(例如Tris-HCl、醋酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子濃度組成的稀釋劑、添加劑如阻止表面吸收的白蛋白或明膠、去污劑(例如吐溫20、吐溫80、Pluronic F68、膽汁酸鹽)、增溶劑(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(例如、硫柳汞、苯甲醇、對羥基苯甲酸酯類)、填充物質(zhì)或張力調(diào)節(jié)劑(例如乳糖、甘露糖醇)、聚合物如聚乙二醇共價(jià)連接到蛋白質(zhì)上、與金屬離子絡(luò)合或?qū)⑺鑫镔|(zhì)摻入聚合物如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝膠等的特定制劑中或加到其上、或者加到脂質(zhì)體、微乳液、微團(tuán)、單層或多層囊泡、紅細(xì)胞血影或原生質(zhì)球上。所述組合物將影響治療劑的物理狀態(tài)、溶解度、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放率和體內(nèi)清除率。組合物的選擇將依賴于具有治療活性的蛋白質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)。例如，由膜結(jié)合型活性物衍生的產(chǎn)物可能需要含去污劑的制劑。控釋或緩釋組合物包括在親脂性貯庫(例如脂肪酸、蠟、油)中的制劑。本發(fā)明也包括由聚合物(例如泊咯沙姆或poloxamines)包被的微粒組合物和偶聯(lián)到針對組織特異性受體、配體或抗原的抗體上或偶聯(lián)到組織特異性受體的配體上的活性物。本發(fā)明組合物的其它實(shí)施方案包括微粒形式的保護(hù)性包衣、蛋白酶抑制劑或滲透增強(qiáng)劑用于各種途徑包括非腸道、肺、鼻和口服給藥。
此外，本文所使用的“可藥用載體”是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且包括但不限制于0.01-0.1M并且優(yōu)選0.05M的磷酸鹽緩沖劑或0.8％的鹽水。因此，所述可藥用載體可以是水或非水溶液、懸浮液和乳液。非水溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射有機(jī)酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、懸浮液或乳液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化林格氏溶液或固定油。靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑如那些以林格氏葡萄糖為主藥的電解質(zhì)補(bǔ)充劑等。也可以存在防腐劑和其它添加劑如抗微生物劑、抗氧化劑、對照劑、惰性氣體等。
術(shù)語“佐劑”是指增強(qiáng)對抗原的免疫反應(yīng)的化合物或混合物。佐劑可充當(dāng)緩慢釋放抗原的組織庫并且也可以充當(dāng)非特異性增強(qiáng)免疫反應(yīng)的淋巴系統(tǒng)激活劑(Hood等人，Immunology，Second Ed.，1984，Beniamin/CummingsMenlo Park，California，p.348)。通常，在不存在佐劑的情況下，單獨(dú)用抗原進(jìn)行初級激發(fā)將不能引起體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)。佐劑包括但不限制于完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、皂甙、無機(jī)凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳液、鑰孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人佐劑如BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)。優(yōu)選地，所述佐劑是可藥用的。
控釋或緩釋組合物包括在親脂性貯庫(例如脂肪酸、蠟、油)中的制劑。本發(fā)明也包括由聚合物(例如泊咯沙姆或poloxamines)包被的微粒組合物和偶聯(lián)到針對組織特異性受體、配體或抗原的抗體上或偶聯(lián)到組織特異性受體的配體上的化合物。本發(fā)明組合物的其它實(shí)施方案包括微粒形式的保護(hù)性包衣、蛋白酶抑制劑或滲透增強(qiáng)劑用于各種途徑包括非腸道、肺、鼻和口服給藥。
當(dāng)給藥時，化合物通常迅速從粘膜表面或循環(huán)中清除并且因此可引起相對短效的藥理學(xué)活性。所以，要求經(jīng)常給予相對大劑量的生物活性化合物來維持療效。已知通過共價(jià)連接水溶性聚合物如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素鈉、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸修飾的化合物在靜脈注射后明顯顯示比相應(yīng)的未修飾化合物更長的半衰期(Abuchowski等人，1981；Newmark等人，1982；和Katre等人，1987)。該修飾也可以增加所述化合物在水溶液中的溶解度、消除聚集作用、增強(qiáng)化合物的物理和化學(xué)穩(wěn)定性并且大大降低化合物的免疫原性和反應(yīng)性。結(jié)果，與未修飾化合物相比，可通過給予更少次數(shù)或更低劑量的所述聚合物-化合物加合物獲得所需要的體內(nèi)生物學(xué)活性。
劑量足夠的量包括但不限制于大約為1μg/kg-1000mg/kg。所述量可以為10mg/kg。組合物的可藥用形式包括可藥用載體。
如上所述，本發(fā)明提供包含藥物組合物的治療組合物，其中所述藥物組合物包含載體、疫苗、多肽、核酸和抗體、抗-抗體和與肺炎球菌競爭病原活性如附著到宿主細(xì)胞上的藥劑。
包含活性組分的治療組合物的制備是本領(lǐng)域公知的。典型地，所述組合物可制備成遞送到鼻咽部的多肽氣霧劑或可注射的液體溶液或懸浮液，然而，也可以制備成適用于在注射前溶于或懸浮于液體中的固體形式。該制劑也可以被乳化。通常，將活性治療成分與可藥用并且可與活性成分相容的賦形劑混合。例如適宜的賦形劑是水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。此外，如果需要，所述組合物可包含少量增強(qiáng)活性成分有效性的輔助物質(zhì)如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑。
可將活性組分配制成以中和的可藥用鹽形式存在的治療組合物?？伤幱名}包括酸加成鹽(用多肽或抗體分子的游離氨基形成的)，它是與無機(jī)酸如鹽酸或磷酸，或有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等形成的。由游離羧基形成的鹽也可以衍生于無機(jī)堿如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物或有機(jī)堿如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
當(dāng)組合物中至少大約75％(重量)的所述蛋白質(zhì)、DNA、載體(依賴于A和B所屬種類的范疇)是“A”時，包含“A”(其中“A”是單一的蛋白質(zhì)、DNA分子、載體等)的組合物基本上不含“B”(其中“B”包含一個或多個污染蛋白質(zhì)、DNA分子、載體等)。優(yōu)選地，在組合物中，“A”包含至少大約90％(重量)的A+B，最優(yōu)選地，至少大約99％(重量)。
本文所使用的術(shù)語“治療有效量”是指足夠減少至少大約15％，優(yōu)選至少大約50％，更優(yōu)選至少大約90％并且最優(yōu)選預(yù)防宿主的活性、功能和反應(yīng)方面的臨床上明顯不足的量。另外，治療有效量足夠引起宿主臨床上明顯病癥的改善。在本發(fā)明的上下文中，宿主反應(yīng)方面的不足可由持續(xù)或傳播細(xì)菌感染來證明。宿主臨床上明顯病癥的改善包括細(xì)菌載荷的減少、細(xì)菌從移生的宿主細(xì)胞中的清除、與感染有關(guān)的發(fā)燒或炎癥的減少或者與細(xì)菌感染有關(guān)的任何癥狀的減少。
按照本發(fā)明，可通過非腸道、透過粘膜，例如通過口、鼻、肺或直腸，或者透皮引入本發(fā)明治療組合物的成分。優(yōu)選地，給藥途徑是非腸道的，例如通過靜脈內(nèi)注射并且也包括但不限制于動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)和顱內(nèi)給藥。可優(yōu)選通過口或肺遞送來激活粘膜免疫；因?yàn)榉窝浊蚓ǔＲ粕诒茄屎头握衬ぶ校哉衬っ庖呖赡苁翘貏e有效的預(yù)防性治療。當(dāng)在本發(fā)明治療組合物中使用時，術(shù)語“單位劑量”是指適宜作為單次劑量用于人的物理上分立的單位，各單位包含為產(chǎn)生所需要治療效果而計(jì)算的預(yù)定量的活性物質(zhì)和所需要的稀釋劑，即載體。
在另一實(shí)施方案中，所述活性化合物可在泡囊特別是脂質(zhì)體中遞送(參見Langer，科學(xué)2491527-1533(1990)；Treat等人，脂質(zhì)體在傳染病和癌癥的治療中，Lopez-Berestein和Fidler(編者)，Liss，紐約，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，出處同上，pp.317-327；參見上文)。
在另一實(shí)施方案中，所述治療化合物可在控釋系統(tǒng)中遞送。例如，可利用靜脈輸注、可植入的滲透泵、透皮貼片、脂質(zhì)體或其它給藥方式給予所述多肽。在一個實(shí)施方案中，可以使用泵(參見Langer，如上所述；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等人，外科88507(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一實(shí)施方案中，可使用高分子材料(參見控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，Langer和Wise(編者)，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1974)；控釋藥物的生物利用度、藥品設(shè)計(jì)和性能，Smolen和Ball(編者)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；也參見Levy等人，科學(xué)228190(1985)；During等人，Ann.Neurol.25351(1989)；Howard等人，J.Neurosurg.71105(1989))。在另一實(shí)施方案中，可將控釋系統(tǒng)放置在治療靶，即腦的附近，因此僅需要小部分所述系統(tǒng)劑量(例如參見Goodson，控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，如上所述，vol.2，pp.115-138(1984))。優(yōu)選地，將控釋裝置引入治療對象不適宜免疫激活部位或腫瘤的附近。在Langer的評論中討論了其它控釋系統(tǒng)(科學(xué)2491527-1533(1990))。
優(yōu)選地，以給予上述活性組分作為細(xì)菌感染有效治療方案的治療對象是人，但是也可以是任何動物。因此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都能迅速領(lǐng)會，本發(fā)明所述方法和藥物組合物特別適于給予任何動物，特別是哺乳動物并且包括但不限制于家養(yǎng)動物如貓或犬，農(nóng)場動物如但不限制于牛、馬、山羊、綿羊和豬，野生動物(不管是野外的還是在動物園中的)，研究動物如小鼠、大鼠、兔子、山羊、綿羊、豬、狗、貓等，即供獸醫(yī)使用。
在本發(fā)明治療方法和組合物中，提供治療有效劑量的活性組分。治療有效劑量可由普通醫(yī)學(xué)工作者根據(jù)病人的特點(diǎn)(年齡、體重、性別、狀況、并發(fā)癥，其它疾病等)確定，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。此外，隨著進(jìn)行其它常規(guī)研究，將出現(xiàn)有關(guān)治療各種病人各種疾病適宜的劑量水平的更具體的資料，并且根據(jù)治療情況、被治療者的年齡和一般健康狀況，普通技術(shù)人員能夠確定適宜的給藥劑量。通常，對于靜脈內(nèi)注射或輸注來說，劑量可以低于腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)或其它給藥途徑。給藥計(jì)劃表可依賴于循環(huán)半衰期和所使用的制劑而改變。將治療有效量的所述組合物以與劑量制劑相容的方式給予。所需要給予的活性組分的精確量依賴于醫(yī)師的判斷并且是每個個體所特有的。然而，適宜的劑量可大約為每天每公斤體重0.1-20，優(yōu)選大約為0.5-10并且更優(yōu)選1-幾微克活性組分并且依賴于給藥途徑。適宜的初次給藥和加強(qiáng)注射的方案也是可改變的，但是其特征是在初次給藥后，間隔一小時或多小時，通過隨后注射或其它給藥途徑給予多次量?；蛘?，可以考慮連續(xù)靜脈內(nèi)輸注的方法來足以維持血中10納摩爾-10微摩爾的濃度。
與其它化合物一起給予就細(xì)菌感染的治療而言，可以與一種或多種用于治療細(xì)菌感染的藥物組合物一起給予本發(fā)明活性組分，所述藥物組合物包括但不限制于(1)抗生素；(2)細(xì)菌粘附素的可溶性碳水化合物抑制劑；(3)細(xì)菌粘附素的其它小分子抑制劑；(4)細(xì)菌代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)或轉(zhuǎn)化的抑制劑；(5)細(xì)菌溶胞的刺激物或(6)針對其它細(xì)菌抗原上的抗菌抗體或疫苗。其它有效的活性組分包括抗炎劑如甾體或非甾體抗炎藥物。可同時給藥(例如本發(fā)明活性組分和抗生素混合物的給予)，或者可依次給藥。
因此，在具體的實(shí)施方案中，所述治療組合物可進(jìn)一步包括治療有效量的活性組分和一種或多種下列活性組分抗生素、甾族化合物等。制劑的實(shí)例如下制劑靜脈內(nèi)制劑I組分 mg/ml頭孢噻肟 250.0多肽 10.0葡萄糖USP45.0亞硫酸氫鈉USP3.2
乙二胺四乙酸二鈉USP0.1注射用水適量加至 1.0ml靜脈內(nèi)制劑II組分 mg/ml氨芐青霉素 250.0多肽 10.0亞硫酸氫鈉USP 3.2乙二胺四乙酸二鈉USP0.1注射用水適量加至 1.0ml靜脈內(nèi)制劑III組分 mg/ml慶大霉素(硫酸鹽) 40.0多肽 10.0亞硫酸氫鈉USP 3.2乙二胺四乙酸二鈉USP0.1注射用水適量加至 1.0ml靜脈內(nèi)制劑IV組分 mg/ml多肽 10.0葡萄糖USP 45.0亞硫酸氫鈉USP 3.2乙二胺四乙酸二鈉USP0.1注射用水適量加至 1.0ml靜脈內(nèi)制劑V組分 mg/ml多肽拮抗劑 5.0亞硫酸氫鈉USP 3.2
乙二胺四乙酸二鈉USP 0.1注射用水適量加至 1.0ml因此，在要求減少或抑制由細(xì)菌介導(dǎo)的細(xì)菌與宿主細(xì)胞、或其抗體、或其配體或該配體的抗體結(jié)合引起的感染的特定實(shí)例中，引入多肽來阻斷細(xì)菌與宿主細(xì)胞的相互作用。
本文也考慮通過肺遞送本發(fā)明的具有凝集素活性并且發(fā)揮本發(fā)明粘附素抑制劑(或其衍生物)作用的多肽。將粘附素抑制劑(或其衍生物)遞送到哺乳動物的肺中，在肺中，它能干擾細(xì)菌，即鏈球菌并且優(yōu)選肺炎球菌與宿主細(xì)胞結(jié)合。在本領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)了其它關(guān)于通過肺遞送的蛋白質(zhì)制劑的報(bào)道[Adjei等人，藥物研究，7565-569(1990)；Adjei等人，International Journal of Pharmaceutics，63135-144(1990)(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等人，Journal of Cardiovascular Pharmacology，13(suppl.5)；143-146(1989)(內(nèi)皮素-1)；Hubbard等人，Annals of InternalMedicine，Vol.III，pp.206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等人，J.Clin.Invest.841145-1146(1989)(α1-蛋白酶)；Oswein等人，“蛋白質(zhì)的氣霧化作用”，Proceedings of Symposium on Respiratory Drug DeliveryII，Keystone，Colorado，March，(1990)(重組人生長激素)；Debs等人，J.Immunol.1403482-3488(1988)(干擾素-γ和腫瘤壞死因子α)；Platz等人，美國專利5,284,656(粒細(xì)胞集落刺激因子)]。在1995年9月19日頒布給Wong等人的美國專利5,451,569中描述了用于通過肺遞送藥物的方法和組合物。
所有這樣的裝置均要求使用適于分配粘附素抑制劑(或其衍生物)的制劑。典型地，各制劑對于所使用的裝置類型是特異性的并且除了治療中所使用的通常的稀釋劑、佐劑和/或載體外，可包括應(yīng)用適宜的推進(jìn)劑材料。也可以考慮使用脂質(zhì)體、微囊或微球、包合配合物或其它類型的載體。依賴于化學(xué)修飾的類型或所使用裝置的類型，也可以將通過化學(xué)方法修飾的粘附素抑制劑制備在不同的制劑中。
典型地，適用于利用噴射式或超聲波式噴霧器來應(yīng)用的制劑將包含以每ml溶液大約0.1-25mg生物活性粘附素抑制劑的濃度溶解在水中的粘附素抑制劑(或其衍生物)。所述制劑也可以包括緩沖劑和單糖(例如用于穩(wěn)定粘附素抑制劑和調(diào)節(jié)滲透壓)。所述噴霧器制劑也可以包含表面活性劑，用于減少或預(yù)防形成氣霧劑時由溶液霧化引起的粘附素抑制劑在表面聚集。
利用計(jì)量劑量的吸入器裝置來應(yīng)用的制劑通常包含細(xì)碎的粉劑，其中所述粉劑包含在表面活性劑的幫助下懸浮在推進(jìn)劑中的粘附素抑制劑(或其衍生物)。所述推進(jìn)劑可以是用于該目的的任何常規(guī)物質(zhì)如氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或其組合。適宜的表面活性劑包括脫水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性劑。
液體氣霧劑制劑在生理上可接受的稀釋劑中包含粘附素抑制劑和分散劑。本發(fā)明干粉氣霧劑制劑由細(xì)碎的固體形式的粘附素抑制劑和分散劑組成。對于液體或干粉氣霧劑制劑來說，必須將所述制劑氣霧化。即，必須將所述制劑破碎成液體或固體微粒以便確保氣霧化的劑量真正到達(dá)鼻通道或肺粘膜。本文所使用的術(shù)語“氣霧劑微?！庇糜诿枋鲞m用于鼻或肺給藥，即能夠到達(dá)粘膜的液體或固體微粒。其它考慮如遞送裝置的結(jié)構(gòu)、制劑中的其它組分和微粒特點(diǎn)是重要的。通過肺給藥的這些特征是本領(lǐng)域公知的并且制劑的使用、霧化方法和遞送裝置的結(jié)構(gòu)至多要求由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)。在特定的實(shí)施方案中，所述微粒的中數(shù)動態(tài)直徑將為5微米或更小以便確保所述藥物微粒到達(dá)肺泡[Wearley，L.L.，Crit.Rev.in Ther.Drug CarrierSystems 8333(1991)]。
氣霧劑遞送系統(tǒng)如加壓計(jì)量劑量的吸入器和干粉吸入器公開于Newman，S.P.，氣霧劑和肺，Clarke，S.W.和Davia，D.(編者)，pp.197-22中并且可與本發(fā)明聯(lián)合使用。
在另一實(shí)施方案中，如下文所詳細(xì)討論的，本發(fā)明的氣霧劑制劑除了粘附素抑制劑外，可包括其它治療學(xué)或藥理學(xué)活性組分，如包括但不限制于抗生素、甾體化合物、非甾體抗炎藥等。
液體氣霧劑制劑本發(fā)明提供用于治療由細(xì)菌，例如鏈球菌，特別是肺炎球菌感染的患者的氣霧劑制劑和劑量形式。通常所述劑量形式在可藥用稀釋劑中包含粘附素抑制劑?？伤幱孟♂寗┌ǖ幌拗朴跓o菌水、鹽水、緩沖的鹽水、葡萄糖溶液等。在特定實(shí)施方案中，可以在本發(fā)明或本發(fā)明的藥物制劑中使用的稀釋劑是磷酸鹽緩沖的鹽水或通常pH在7.0-8.0范圍的緩沖的鹽水溶液或水。
本發(fā)明的液體氣霧劑制劑可不包含或包含可藥用甾體、稀釋劑、增溶劑或乳化劑、表面活性劑和賦形劑。所述制劑可包括載體。所述載體是可溶解在循環(huán)系統(tǒng)中并且是生理上可接受的大分子，其中生理可接受是指本領(lǐng)域技術(shù)人員允許將所述載體作為治療方案的一部分注射給患者，優(yōu)選地，所述載體在循環(huán)系統(tǒng)中是相對穩(wěn)定的，具有適宜的血漿清除半衰期。所述大分子包括但不限制于大豆卵磷脂、油酸和脫水山梨糖醇三油酸酯，優(yōu)選脫水山梨糖醇三油酸酯。
本實(shí)施方案的制劑也可以包括用于維持pH、穩(wěn)定溶液或用于調(diào)節(jié)滲透壓的其它藥劑。所述藥劑的實(shí)例包括但不限制于鹽如氯化鈉或氯化鉀和碳水化合物如葡萄糖、半乳糖或甘露糖等。
本發(fā)明進(jìn)一步考慮包含粘附素抑制劑和另一種治療有效藥物如抗生素、甾體化合物、非甾體抗炎藥等的液體氣霧劑制劑。
氣霧劑干粉制劑也考慮將本發(fā)明的氣霧劑制劑制備成包含細(xì)碎粉劑形式的粘附素抑制劑和分散劑的干粉制劑。
通過粉末吸入器裝置分配的制劑將包括含有粘附素抑制劑(或其衍生物)的細(xì)碎干粉并且也可包含促進(jìn)粉末從裝置中分散量如占制劑重量50-90％的填充劑，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇。最有利地，應(yīng)該將粘附素抑制劑(或其衍生物)制備成平均粒徑10mm(或微米)，最優(yōu)選0.5-5mm的微粒形式以便最有效地遞送到遠(yuǎn)端肺。在另一實(shí)施方案中，所述干粉制劑可包括含有粘附素抑制劑、分散劑和填充劑的細(xì)碎干粉。與本發(fā)明制劑聯(lián)合使用的填充劑可包含促進(jìn)粉末從裝置中分散量的乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇。
本發(fā)明進(jìn)一步考慮包含粘附素抑制劑和另一種治療有效藥物如抗生素、甾體化合物、非甾體抗炎藥等的干粉制劑。
本文所涉及的口服固體劑量形式通常描述于Remington’sPharmaceutical Science，18th Ed.1990(Mark Publishing Co.Easton PA18042)第18章，將其引入本文供參考。固體劑量形式包括片劑、膠囊劑、丸劑、錠劑或糖錠劑、扁囊劑或小藥丸。脂質(zhì)體或類蛋白質(zhì)包囊也可以用于制備本發(fā)明組合物的制劑(例如美國專利4,925,673中報(bào)道的類蛋白質(zhì)微球)。脂質(zhì)體包囊可以使用并且所述脂質(zhì)體可用各種聚合物衍生(例如美國專利5,013,556)。Marshall，K.在由G.S.Banker和C.T.Rhodes編輯的Modern Pharmaceutics第10章，1979中描述了治療劑的可能的固體劑量形式，將其引入本文供參考。通常，所述制劑將包含所述組分(或其通過化學(xué)方法修飾的形式)和用于避免胃環(huán)境破壞和允許在腸中釋放生物活性物質(zhì)的惰性組分。
特別地，本文也考慮上述衍生組分的口服劑量形式。所述組分可通過化學(xué)方法修飾使得經(jīng)口遞送所述衍生物是有效的。通常，所述化學(xué)修飾是使至少一個部分連接到所述組分分子上，其中所述部分可能(a)抑制蛋白水解；和(b)從胃或腸攝入血流中。也期望增加所述組分的整體穩(wěn)定性和增加體循環(huán)時間。所述部分的實(shí)例包括聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis，1981，“可溶性聚合物-酶加合物”InEnzymes as Drugs，Hocenberg和Roberts，編者，Wiley-Interscience，New York，NY，pp.367-383；Newmark等人，1982，J.Appl.Biochem.4185-189?？墒褂玫钠渌酆衔锸蔷?1，3-二氧戊環(huán)和聚-1，3，6-tioxocane。如上所述，藥用優(yōu)選的是聚乙二醇部分。
對于所述組分(或其衍生物)來說，釋放部位可以是胃、小腸(十二指腸、空腸或回腸)或大腸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得在胃中不溶解而在十二指腸或腸道其它部位釋放所述物質(zhì)的制劑。優(yōu)選地，所述釋放將通過保護(hù)蛋白質(zhì)(或其衍生物)或通過將生物活性物質(zhì)釋放到胃環(huán)境以外如腸中，避免胃環(huán)境的有害作用。
為了確保獲得充分的胃耐受性，不能滲透到至少pH5.0環(huán)境中的包衣是必需的。用作腸衣的更普通的惰性組分的實(shí)例是乙酸偏苯三酸纖維素(CAT)、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP55、聚乙酸鄰苯二甲酸乙烯酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、乙酸鄰苯二甲酸纖維素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和蟲膠。這些包衣可以以混合膜的形式使用。
包衣或包衣混合物也可用于沒有準(zhǔn)備好預(yù)防被胃環(huán)境破壞的片劑。這可以包括糖衣或使片劑容易吞咽的包衣。膠囊劑可由用于遞送干治療劑，即干粉的硬殼(如明膠)組成；對于液體形式的治療劑來說，可以使用軟明膠殼。扁囊劑的殼材料可以是稠淀粉或其它可食用紙。對于丸劑、錠劑、模壓片或片劑的磨碎物來說，可以使用濕法制粒技術(shù)。
肽治療劑可以以顆粒或粒徑大約為1mm的小藥丸形式包含在由細(xì)小的多粒子組成的制劑中。通過膠囊給藥的所述物質(zhì)的制劑也可以是粉劑、輕輕壓制的充填劑或者甚至可以是片劑?？赏ㄟ^壓制法制備治療劑。
也可以包含著色劑和調(diào)味劑。例如，可將蛋白質(zhì)(或其衍生物)制備成制劑(如通過脂質(zhì)體或微球包囊)，然后進(jìn)一步包含在可食用產(chǎn)品，如含有著色劑和調(diào)味劑的冷藏飲料中。
可以用惰性材料稀釋或增加治療劑的體積。這些稀釋劑可包括碳水化合物，特別是甘露糖醇、α-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改性的葡聚糖和淀粉。某些無機(jī)鹽也可以用作填充劑包括三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。一些可通過商業(yè)渠道獲得的稀釋劑為Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
在固體劑量形式的治療劑制劑中可包含崩解劑。用作崩解劑的材料包括但不限制于淀粉，包括以淀粉為基礎(chǔ)的商業(yè)用崩解劑Explotab。也可以使用羥基乙酸淀粉鈉、安伯來特、羧甲基纖維素鈉、超支鏈淀粉、藻酸鈉、明膠、桔子皮、酸性羧甲基纖維素、天然海綿狀物和膨潤土。另一種形式的崩解劑是不溶性陽離子交換樹脂。粉狀樹膠可用作崩解劑和粘合劑并且這些可包括粉狀樹膠如瓊脂、卡拉牙膠或西黃耆膠。藻酸及其鈉鹽也可以用作崩解劑。粘合劑可用于將治療劑粘合在一起形成硬片劑并且包括來自天然產(chǎn)物如阿拉伯膠、西黃耆膠、淀粉和明膠的材料。其它的粘合劑包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)都可在乙醇溶液中用于將治療劑制粒。
在治療劑的制劑中可包含潤滑劑用于預(yù)防在制備制劑過程中發(fā)生粘著?？稍谥委焺┖湍＞弑谥g使用一層潤滑劑，并且這些潤滑劑包括但不限制于硬脂酸包括其鎂鹽和鈣鹽、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。也可以使用水溶液潤滑劑如十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鎂、各種分子量的聚乙二醇，Carbowax 4000和6000。
可加入助流劑，它可以改善藥物在制備制劑過程中的流動性并且有助于壓片過程中的重排。助流劑可包括淀粉、滑石粉、焦二氧化硅和水合硅鋁酸鹽。
為了有助于治療劑溶解到水環(huán)境中，可加入表面活性劑作為潤濕劑。表面活性劑可包括陰離子去污劑如十二烷基硫酸鈉、琥珀酸二辛酯磺酸鈉和二辛基磺酸鈉。也可以使用陽離子去污劑并且可包括苯扎氯銨或芐索氯銨?？勺鳛楸砻婊钚詣┌谥苿┲械臐撛诘姆请x子去污劑包括lauromacrogol 400、polyoxyl 40 stearate、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、單硬脂酸甘油酯，多乙氧基醚40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可單獨(dú)或以不同比例的混合物形式存在于蛋白質(zhì)或其衍生物的制劑中。
例如潛在地增強(qiáng)多肽(或其衍生物)攝取的添加劑是脂肪酸如油酸、亞油酸和亞麻酸。
肺遞送本文也考慮通過肺遞送本發(fā)明的多肽(或其衍生物)。當(dāng)吸入時，所述多肽(或其衍生物)被遞送到哺乳動物的肺中并且覆蓋肺泡的粘膜表面。有關(guān)這方面的其它報(bào)道包括Adjei等人，1990，藥物研究，7565-569；Adjei等人，1990，International Journal of Pharmaceutics，63135-144(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等人，1989，Journal ofCardiovascular Pharmacology，13(suppl.5)143-146(內(nèi)皮素-1)；Hubbard等人，1989，Annals of Internal Medicine，Vol.III，pp.206-212(a1-抗胰蛋白酶)；Smith等人，1989，J.Clin.Invest.841145-1146(a-1-蛋白酶)；Oswein等人，1990，“蛋白質(zhì)的氣霧化”，Proceedings ofSymposium on Respiratory Drug Delivery II，Keystone，Colorado，March，(重組人生長激素)；Debs等人，1988，J.Immunol.1403482-3488(干擾素-g和腫瘤壞死因子-α)和Platz等人，美國專利5,284,656(粒細(xì)胞集落刺激因子)。在1995年9月19日頒發(fā)給Wong等人的美國專利5,451,569中描述了用于通過肺遞送藥物的方法和組合物。
在本發(fā)明實(shí)施中考慮使用各種用于通過肺遞送治療劑產(chǎn)品的機(jī)械裝置，包括但不限制于霧化器、計(jì)量劑量的吸入器和粉劑吸入器，所有這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。
典型地，適用于利用噴射式或超聲波式噴霧器來應(yīng)用的制劑將包含以每ml溶液大約0.1-25mg生物活性蛋白質(zhì)的濃度溶解在水中的多肽(或其衍生物)。所述制劑也可以包含緩沖劑和單糖(例如用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)滲透壓)。所述噴霧器制劑也可以包含表面活性劑，用于減少或預(yù)防形成氣霧劑時由溶液霧化引起的蛋白質(zhì)在表面聚集。
利用計(jì)量劑量的吸入器裝置來應(yīng)用的制劑通常包含細(xì)碎的粉劑，其中所述粉劑包含在表面活性劑的幫助下懸浮在推進(jìn)劑中的多肽(或其衍生物)。所述推進(jìn)劑可以是用于該目的的任何常規(guī)材料如氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或其組合。適宜的表面活性劑包括脫水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性劑。
由粉末吸入器裝置分配的制劑將包括含有多肽(或其衍生物)的細(xì)碎干粉并且也可包含促進(jìn)粉末從裝置中分散量，例如占制劑重量的50-90％的填充劑，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇。最有利地，應(yīng)該將蛋白質(zhì)(或其衍生物)制備成平均粒徑為10mm(或微米)，最優(yōu)選0.5-5mm的微粒形式以便最有效地遞送到遠(yuǎn)端肺中。
鼻遞送本文也考慮通過鼻或鼻咽遞送多肽(或其衍生物)。通過鼻遞送使得在將治療劑產(chǎn)品給予到鼻后，多肽直接通過上呼吸道粘膜，不必使所述產(chǎn)品沉積在肺中。用于通過鼻遞送的制劑包括與葡聚糖或環(huán)糊精形成的制劑。
下列實(shí)施例用于更充分地說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。然而，它們不以任何方式限制本發(fā)明范圍。
實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)部分實(shí)施例1膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)的肽截取物產(chǎn)生包含CbpA N-末端截取片段的多肽(血清型4)。用PCR引物SJ533和SJ537擴(kuò)增全長CbpA，基于CbpA多肽衍生的N-末端氨基酸序列來設(shè)計(jì)引物。5’正向引物SJ533＝5’GGC GGA TCC ATG GA(A，G)AA(C，T)GA(A，G)GG3’。這種簡并引物是由氨基酸序列XENEG設(shè)計(jì)的，結(jié)合有BamHI和NcoI限制位點(diǎn)以及ATG起始密碼子。3’反向引物SJ537＝5’GCC GTC GAC TTA GTT TAC CCA TTC ACCATT GGC 3’。該引物結(jié)合有SalI限制位點(diǎn)以便克隆，并且結(jié)合有來自CbpA的天然終止密碼子，該引物基于4型和R6x序列。
在50℃退火溫度下用高保真性酶(Boehringer Mannheim)以及用引物SJ533和SJ537擴(kuò)增30次來由作為模板的基因組DNA產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。所得PCR產(chǎn)物用QIA快速PCR純化試劑盒(Qiagen，Inc.)純化，然后用BamHI和SalI限制酶消化并克隆到用BamHI、XbaI和SmaI限制酶消化的pQE30表達(dá)載體(Qiagen，Inc.)中。多肽R2利用位于第二重復(fù)區(qū)(即，圖1所示的C區(qū))末端的天然存在的PvuII位點(diǎn)(4型序列的核酸1228)來產(chǎn)生CbpA基因的截取形式，僅僅含有該基因的5’部分。為了產(chǎn)生截取克隆，用PvuII和XbaI消化全長克隆PMI580(4型)或PMI581(R6x)，所得片段被連接到表達(dá)載體PQE30中并轉(zhuǎn)化到合適的宿主中。表達(dá)和純化該蛋白質(zhì)。在該例中，表達(dá)載體所利用的終止密碼子位于插入物的下游，所以被表達(dá)的蛋白由于在克隆位點(diǎn)的5’末端有附加的核酸而比插入物的預(yù)測尺寸要大。在SEQ IDNO 1中描述了多肽R2的氨基酸序列。多肽R1使用類似的策略來表達(dá)CbpA N-末端區(qū)域中的第一重復(fù)區(qū)，即多肽R1的A區(qū)。這里利用了兩個氨基重復(fù)區(qū)之間的天然存在的XmnI位點(diǎn)(4型序列的核酸856)。用XmnI和AatII消化CbpA全長克隆PMI580。用AatII和SmaI消化載體pQE30。再一次連接兩個型號的片段，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中并篩選插入的克隆。選擇一個陽性克隆并由該色斑純化重組蛋白質(zhì)。
使用大腸桿菌pQE30載體并用Qia表達(dá)系統(tǒng)(Qiagen)來表達(dá)和純化所有多肽。使用抗組氨酸抗體和蛋白質(zhì)特異性抗體，通過宿主和Western分析檢測His標(biāo)記的蛋白質(zhì)的氨基端。R1和R2的純化為了誘導(dǎo)產(chǎn)生并純化來自大腸桿菌的重組蛋白質(zhì)，單一集落選自含有重組質(zhì)粒的平板培養(yǎng)的細(xì)菌并在6.0ml含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨芐青霉素的LB緩沖液中于37℃溫度下培養(yǎng)過夜。將該6ml培養(yǎng)物加到1L具有上述濃度下的抗生素的LB中。在37℃溫度下振搖培養(yǎng)物直到A600＝～0.400。在該1L培養(yǎng)物中加入1M IPTG到最終濃度為1mM。然后在37℃下振搖培養(yǎng)物3-4小時。在J-6B型離心機(jī)中以4000rpm轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)此1L培養(yǎng)物15分鐘。棄去上清液并在-20℃溫度下貯存丸狀沉淀。
將1L丸狀沉淀重新懸浮在25ml的50mM NaH2PO4、10mM Tris、6MGuCl、300mM NaCl，pH8.0(緩沖液A)中。將該混合物在室溫下旋轉(zhuǎn)30分鐘并使用微型管尖以50％Cuty Cycle和7的輸出功率在VibraCell超聲處理器(Sonics and Materials，Inc.，Danbury，CT)上超聲兩次共30秒。混合物在JA20旋轉(zhuǎn)裝置中以10K轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)5分鐘并取出上清液。將上清液加載到與GradiFrac系統(tǒng)(Pharmacia Biotech，Upsala，瑞典)連接的10ml Talon(Clonetech，Palo Alto，CA)樹脂柱上。將該柱用100ml緩沖液A平衡并用另外的200ml該緩沖液洗滌。以100ml的總體積使用100％50mM NaH2PO4、8M脲、20mM MES，pH6.0(緩沖液B)作為最終靶緩沖液按照pH梯度來洗脫。以約30％緩沖液B洗脫蛋白質(zhì)。收集洗脫峰并合并。
為了重折疊，使用具有1400分子量截?cái)嘀档耐肝龉茉谑覝叵掠?L體積的PBS透析約3小時。然后在4℃溫度下在2L的PBS中將樣品透析過夜。使用Centriprep-30旋轉(zhuǎn)柱通過將PBS加到旋轉(zhuǎn)的余留物中并重新旋轉(zhuǎn)來在蛋白質(zhì)濃縮期間完成另外的緩沖液交換。使用BCA蛋白質(zhì)測定方法確定蛋白質(zhì)濃度并使用Coomassie染色的4-20％SDS-PAGE凝膠來顯示純度(圖3)。實(shí)施例2多肽R1和R2的凝集素活性LNnt是一種存在于真核細(xì)胞上的肺炎球菌受體的碳水化合物類似物。已經(jīng)顯示CbpA缺損的肺炎球菌突變體不能粘附到真核細(xì)胞或固定化糖上，表明CbpA是粘著配體。CbpA是一種模塊蛋白，它可被劃分為兩個區(qū)N-末端功能區(qū)和C-末端膽堿結(jié)合區(qū)(圖1)。分析多肽R1和R2的生物學(xué)活性以確定完整的CbpA的活性是否集中在唯一的N末端(由R2模擬的)或其片段(由R1模擬的)中。確定了在缺乏膽堿結(jié)合區(qū)(CBD)時僅有的N-末端區(qū)(R2)是否包含凝集素結(jié)合生物活性。使用全長CbpA和多肽R2(缺失脯氨酸富含區(qū)中PvuII位點(diǎn)以外的CBD區(qū)的截取物)進(jìn)行了試驗(yàn)。
測定中用已知的可被CbpA識別的糖綴合物L(fēng)NnT-白蛋白、3’唾液酸乳糖-白蛋白和陰性對照白蛋白包被組織培養(yǎng)孔。然后用白蛋白封閉培養(yǎng)板、洗滌并在15分鐘內(nèi)加入全長CbpA多肽R2或者多肽R1(0.8μg/ml)，然后不用洗滌，在30分鐘內(nèi)加入熒光素標(biāo)記的R6肺炎球菌，洗滌并目視記數(shù)粘附細(xì)菌。
在沒有添加任何肽的情況下R6和碳水化合物的結(jié)合是陽性對照并且標(biāo)定為100％(表1)。在三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，全長CbpA或多肽R2競爭性地抑制肺炎球菌與LNnT包被的表面結(jié)合。與對照相比，全長CbpA抑制率為71％、64％和63％；多肽R2抑制率為65％、53％和74％。CbpA和R2的等同活性表明膽堿結(jié)合區(qū)對于CbpA的LNnT凝集素活性來說不是必需的，并且R2是候選的LNnT凝集素。
相對于與LNnT的結(jié)合來說，與全長CbpA(74和66％)相比，R2不抑制肺炎球菌與3’唾液酸乳糖的結(jié)合(79％和101％)。這表明CBD缺失時喪失了唾液酸的識別活性。相比之下，R1似乎具有識別唾液酸的活性，享有CbpA的特性但在R2中明顯掩蓋了這種特性。這表明多肽折疊成功能區(qū)受該多肽組成和長度的影響。發(fā)現(xiàn)在其它菌株中序列有輕微的變化(見圖2)。假定R1和R2之間具有高度的序列同源性，進(jìn)一步的可能是對于凝集素活性同時需要R1和R2或者R1和R2是兩種特異性稍微不同的凝集素(±唾液酸)。
表1CbpA的可溶性形式對R6肺炎球菌與純化糖綴合物的結(jié)合的抑制作用
N＝LNnt進(jìn)行3次試驗(yàn)，每次3個孔N＝唾液酸乳糖進(jìn)行2次試驗(yàn)，每次3個孔凝集素活性與細(xì)胞結(jié)合活性的相關(guān)性含有碳水化合物(糖蛋白和糖脂)和細(xì)菌的攜帶人細(xì)胞的表面分子通過碳水化合物與這些糖綴合物結(jié)合，盡管蛋白質(zhì)或脂的骨架非常不同。因此，在體外具有凝集素活性的攜帶細(xì)菌的多肽可以粘附到人細(xì)胞表面。體外凝集素活性和細(xì)胞結(jié)合作用之間的這種直接的關(guān)聯(lián)對于肺炎球菌來說是已知的。例如，LNnt競爭性抑制肺炎球菌與TNF激活的A549人肺細(xì)胞的結(jié)合并阻止肺炎球菌在體內(nèi)的發(fā)展。為了證實(shí)CbpA截取物的凝集素活性可反映細(xì)胞結(jié)合活性，試驗(yàn)了CbpA和截取物對肺炎球菌與肺細(xì)胞結(jié)合的抑制作用(表2)。全長CbpA和多肽R2競爭性抑制肺炎球菌與肺細(xì)胞的粘附，與對照相比，其抑制率分別為58％和63％。多肽R1無效，表明R2的LNnt結(jié)合活性對于肺炎球菌與肺細(xì)胞的結(jié)合來說是必需的并且也解釋了這種關(guān)系。
表2R6肺炎球菌與TNF激活的人肺細(xì)胞的結(jié)合
N＝每個試驗(yàn)進(jìn)行2次，每次2或3個孔LNnT凝集素活性取決于R2CbpA的N-末端區(qū)包含各自有大約110個氨基酸的兩個重復(fù)區(qū)(見圖1，多肽R2中的A區(qū)和C區(qū))。為了研究兩個區(qū)對生物活性R1的相對貢獻(xiàn)，將僅僅含有A區(qū)的與R2和全長CbpA進(jìn)行比較。在粘附測定中試驗(yàn)時，多肽R1完全未抑制與LNnT的粘附(野生型的91、92和112％)。然而，多肽R1顯示出對與唾液酸乳糖的結(jié)合有某些抑制作用(對照的68和40％)。這表明LNnT的凝集素活性需要多肽R2并且R2是候選的LNnT凝集素區(qū)。相比之下，R1似乎具有識別唾液酸的活性。CbpA N-末端區(qū)的抗體阻斷細(xì)胞結(jié)合假定CbpA的N-末端區(qū)結(jié)合細(xì)胞，對N-末端區(qū)活性的干擾會阻止或逆轉(zhuǎn)細(xì)菌與細(xì)胞和純化的糖綴合物的結(jié)合。一種這樣的干擾機(jī)制是抗體。
表3抗CbpA R2抗體對R6肺炎球菌與LNnt包被表面結(jié)合的抑制作用
5μl未稀釋的兔抗體+5μl 2×107R6x預(yù)培養(yǎng)物，室溫下6×30分鐘，然后加到LNnT包被孔中進(jìn)行粘附測定。顯示了兩次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
試驗(yàn)了產(chǎn)生于CbpA重組N-末端區(qū)(R2)的抗血清阻斷肺炎球菌粘附LNnT的能力。在室溫下培養(yǎng)兔多克隆抗CbpA抗血清(5μl)和5μl2×107標(biāo)記的細(xì)菌30分鐘。將混合物在固定化LNnT上涂敷30分鐘，然后用PBS洗滌3次以除去未結(jié)合的細(xì)菌。用顯微鏡數(shù)與培養(yǎng)板結(jié)合的細(xì)菌并以6個孔的平均值加標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示結(jié)果。表3所示結(jié)果表明針對R2多肽所產(chǎn)生的抗血清阻斷了肺炎球菌與LNnT的結(jié)合。圖5顯示免疫前與抗CbpA R2抗體抑制肺炎球菌R6x與模型受體LNnT結(jié)合的滴定曲線。1∶100和1∶200稀釋度的抗R2對肺炎球菌粘附的阻斷率超過70％。進(jìn)一步稀釋到1∶400消除了表明該作用特異性的活性。
用于制備表3和圖5所示抗CbpA抗血清的CbpA是針對血清型4的CbpA產(chǎn)生的。在粘附抑制測定中使用的肺炎球菌R6x菌株是由血清型2衍生的。抗體阻斷異種血清型細(xì)菌粘附的能力表明血清型之間的交叉保護(hù)活性。這種活性對于有效的疫苗免疫原來說是非常需要的。CbpA N-末端天然構(gòu)象抗體的活性按Rosenow等人所述方法，可由其天然宿主(肺炎球菌)在膽堿親和柱上純化CbpA。另外，多聚組氨酸標(biāo)記可以連接到基因的末端以便通過幾個組氨酸殘基延伸轉(zhuǎn)錄的蛋白。這些殘基便于在鎳親和基質(zhì)上純化。與較短的截取物相反，全長多肽的純化有利于保留天然三級結(jié)構(gòu)。通過這些生化方法特別是由肺炎球菌也可由大腸桿菌或其它宿主細(xì)菌純化的CbpA保留其天然三級結(jié)構(gòu)。用作免疫原，天然折疊的CbpA產(chǎn)生抗體，它們潛在地不同于通過用可發(fā)生不同的折疊的截取物免疫產(chǎn)生的抗體。類似地，用作治療劑的CbpA可具有不同于截取物的三級結(jié)構(gòu)，所述截取物會改善其阻斷粘附的能力?；谶@些考慮，作為允許其折疊成它的天然三級結(jié)構(gòu)然后通過生化方法切掉C末端(CBD)生產(chǎn)CbpA可能是有利的全長蛋白質(zhì)的。例如，用羥胺處理將在血清型R6x和血清型4膽堿結(jié)合蛋白A的氨基酸位點(diǎn)475切割CbpA，分離N和C末端。N末端片段適于用作治療劑或免疫原。
另外，天然CbpA可用作免疫原和活性結(jié)構(gòu)的抗血清。通過吸附除去BD抗體來在該混合物中富含生物活性的抗N末端抗體。通過在R1下與1×108CbpA缺陷性細(xì)菌一起培養(yǎng)200μl血清1小時來制備這種抗體。在該突變體上的其它膽堿結(jié)合蛋白吸附抗CBD抗體，然后通過離心和除去細(xì)菌來從抗血清中移出所述抗體。
為了證明吸附的抗CbpA抗體的生物活性，確定吸附的抗血清阻斷肺炎球菌粘附到模型受體LNnT上的能力。與1∶600稀釋的抗血清一起培養(yǎng)R6x肺炎球菌然后加到用LNnT白蛋白包被的孔中。
表4吸附的抗CbpA抗血清阻斷粘附
這些結(jié)果表明其天然構(gòu)象的Cbp/AN末端區(qū)域的抗體強(qiáng)烈阻斷粘附。該活性大于圖5中截取物的活性，截取物在1∶600稀釋度時沒有活性。圖5中的滴定研究進(jìn)一步表明吸附的抗CbpA抗血清的這種活性。通過三角形顯示肺炎球菌4型與LNnT包被孔基線粘附的。用各種稀釋度的未吸附(正方形)或吸附(菱形)的抗血清預(yù)先培養(yǎng)肺炎球菌表明使粘附減少。兩種抗血清在粘附上類似減少的事實(shí)表明大多數(shù)N-末端CbpA殘基的抗體(即，通過吸附除去膽堿結(jié)合區(qū)的抗體)的阻斷活性不降低生物活性。實(shí)施例3抗R2抗血清的被動保護(hù)兔免疫血清的產(chǎn)生在Covance(Denver，PA)產(chǎn)生了抗多肽R2(CbpA截取物)和CbpA的兔免疫血清。收集免疫前血清后，用250μg在完全弗氏佐劑中的含有氨基末端重復(fù)區(qū)(上文制備483∶58)的R2使新西蘭白兔免疫。在第21天給該兔125μg在不完全弗氏佐劑中的R2進(jìn)行加強(qiáng)并在第31天抽血。第二只兔子用純化的CbpA進(jìn)行類似的免疫。小鼠的被動保護(hù)腹膜內(nèi)注射100μl 1∶2稀釋的在無菌PBS中的兔抗R2或免疫前血清(免疫前和第31天的免疫血清)使C3H/Hej小鼠(5只/組)被動免疫。給予血清1小時后，用1600CFU肺炎鏈球菌血清型6B(菌株SP317)攻擊小鼠。監(jiān)測小鼠14天的存活情況。用針對多肽R2產(chǎn)生的兔免疫血清免疫的小鼠在攻擊后有80％存活(圖4)。所有用免疫前兔血清免疫的小鼠到第7天都死亡。
該數(shù)據(jù)表明特異于CbpA的抗體對系統(tǒng)肺炎球菌感染具有保護(hù)作用。該數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明膽堿結(jié)合區(qū)對于保護(hù)來說不是必需的，因?yàn)樘禺愑诮厝〉牡鞍踪|(zhì)多肽R2的抗體(缺失保守的膽堿結(jié)合重復(fù)區(qū))對于保護(hù)來說是足夠的。另外，針對CbpA血清型4的血清對血清型6B的攻擊有保護(hù)作用。實(shí)施例4抗R1抗血清的自動保護(hù)作用腹膜內(nèi)注射CbpA截取蛋白質(zhì)R1(15μg在50μl PBS中，加50μl完全弗氏佐劑)使C3H/HeJ小鼠(10只/組)免疫。一組10只假免疫的小鼠接受PBS和佐劑。第二次免疫在4周后給予，腹膜內(nèi)注射15μg有不完全弗氏佐劑的蛋白質(zhì)(假免疫的接受PBS和IFA)。在第3、6和9周抽取血液(后眼眶取血)進(jìn)行免疫反應(yīng)分析。在9周時從10只CbpA免疫的小鼠中收集的血清的ELISA終點(diǎn)抗CbpA截取物滴度為4,096,000。在假免疫小鼠的血清中未檢測到抗體。在第10周用560CFU肺炎鏈球菌血清型6B(菌株SPSJ2p，由P.Flynn，St.Jude Children’sResearch Hospital，Memphis，TN提供)攻擊小鼠。在14天內(nèi)檢測小鼠的存活情況。用CbpA截取蛋白質(zhì)R1免疫的小鼠在攻擊后有80％存活。所有假免疫的小鼠在第8天死亡(圖7)。
該數(shù)據(jù)表明用CbpA重組片段免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生能夠抵抗系統(tǒng)性肺炎球菌感染和死亡的特異性抗體。該數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明膽堿結(jié)合區(qū)對于保護(hù)作用不是必需的，因?yàn)槊庖咴墙厝〉牡鞍踪|(zhì)R1。另外，結(jié)果暗示一個氨基端重復(fù)區(qū)可能足以誘導(dǎo)保護(hù)反應(yīng)。也表明了交叉保護(hù)作用，因?yàn)榛谘逍? DNA序列產(chǎn)生了重組肺炎球菌蛋白質(zhì)，用血清型6B分離物攻擊后觀察到了保護(hù)作用。實(shí)施例5預(yù)防幼年大鼠的鼻咽菌落集群在體外，CbpA的N末端區(qū)競爭性抑制肺炎球菌附著。為了證明具有該活性的肽的治療實(shí)用性，給予幼年大鼠截取的肽，然后用肺炎球菌攻擊并評價(jià)鼻咽的菌落集群情況。
用10μl含有0.8μg多肽R2或R1或不含蛋白質(zhì)的PBS經(jīng)鼻腔處理大鼠。15分鐘后，經(jīng)鼻腔引入3型肺炎球菌(菌株SIII)(10μl含有1×105cfer)。為了確定多肽競爭性抑制肺炎球菌粘附和移生的能力，在72小時時洗滌鼻腔并且確定每個動物中回收的肺炎球菌的數(shù)目，每組4只動物。僅僅接受SIII的大鼠每10μl有2200、6500、6900和8700(平均6075)個菌落。用截取物R2處理的動物顯示最大的減少(3600、3500、2500、2100)，平均10μl有2925個細(xì)菌(對照的48％)。用截取物R1處理的動物也顯示菌落集群減少(5000、4800、3500、1600)，平均為3725(對照的61％)。
該實(shí)驗(yàn)表明將本發(fā)明的肽給予在治療研究中指定的動物可使該動物抵抗隨后的肺炎球菌攻擊。討論通過實(shí)驗(yàn)表明，多肽R21)作為疫苗抗原給藥時誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體并且是一種用于疫苗制劑的優(yōu)選組合物；和2)作為肽遞送到呼吸道和/或鼻咽受侵襲體中時，競爭性地預(yù)防肺炎球菌附著并且是一種用于對抗移生作用或侵襲性疾病防治劑的優(yōu)選組合物。而且，CbpA截取物起凝集素作用而沒有CBD。識別兩種碳水化合物L(fēng)NnT，由含有圖1中兩個N-末端重復(fù)區(qū)(A和C)的肽識別和唾液酸，由僅僅含有單個N-最末端重復(fù)區(qū)(A)的肽識別。含有N-末端重復(fù)區(qū)多肽R1和R2的截取物在細(xì)胞培養(yǎng)測定中也表明有凝集素活性。
多肽R2活性的重要特征包括1)多肽R2和全長CbpA在識別純化糖綴合物受體類似物、肺細(xì)胞和動物模型中有完全相關(guān)的生物活性。對于它們的抗體也證明了相關(guān)性；和2)4型衍生劑和在體外測定中使用其它血清型(如，6B和2)的細(xì)菌之間具有交叉保護(hù)作用，這對于可以使用的疫苗、預(yù)防和治療方式來說是重要的。
盡管本文通過提及各種具體的材料、方法和實(shí)施例描述和說明了本發(fā)明，但可以理解本發(fā)明不局限于材料的特定組合和為此目的所選擇的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到可以暗含某些細(xì)節(jié)的各種變化。同樣地，在本文中引用的任何參考文獻(xiàn)從與本發(fā)明公開內(nèi)容的相關(guān)程度來看均被考慮引入本文供參考。
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Koenig，Scott<120>包含膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸的多肽，由該多肽衍生的疫苗及其應(yīng)用<130>1340-1-017 msc<140>09/056，019<141>1998-04-07<160>39<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>406<212>PRT<213>肺炎鏈球菌<400>1Glu Asn Glu Gly Ala Thr Gln Val Pro Thr Ser Ser Asn Arg Ala Asn1 5 10 15Glu Ser Gln Ala Glu Gln Gly Glu Gln Pro Lys Lys Leu Asp Ser Glu20 25 30Arg Asp Lys Ala Arg Lys Glu Val Glu Glu Tyr Val Lys Lys Ile Val35 40 45Gly Glu Ser Tyr Ala Lys Ser Thr Lys Lys Arg His Thr Ile Thr Val50 55 60Ala Leu Val Asn Glu Leu Asn Asn Ile Lys Asn Glu Tyr Leu Asn Lys65 70 75 80Ile Val Glu Ser Thr Ser Glu Ser Gln Leu Gln Ile Leu Met Met Glu85 90 95Ser Arg Ser Lys Val Asp Glu Ala Val Ser Lys Phe Glu Lys Asp Ser100 105 110Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Thr Lys Pro Glu Ala Ser Asp115 120 125Thr Ala Lys Pro Asn Lys Pro Thr Glu Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu130 135 140Ala Lys Lys Lys Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gln Lys145 150 155 160Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu
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165 170 175Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu180 185 190Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val195 200 205Lys Val Lys Ala Asn Glu Pro Arg Asp Lys Gln Lys Ile Lys Gln Ala210 215 220Glu Ala Glu Val Glu Ser Lys Gln Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Lys225 230 235 240Ile Lys Thr Asp Arg Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala245 250 255Asp Ala Lys Glu Gln Gly Lys Pro Lys Gly Arg Pro Lys Arg Gly Val260 265 270Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys Ser275 280 285Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser Leu Lys290 295 300Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys305 310 315 320Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr325 330 335Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu340 345 350Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Pro355 360 365Arg Asn Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Lys370 375 380Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys385 390 395 400Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys405 410 415Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Thr Glu420 425 430Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Gln Pro Lys435 440 445Ala Glu Lys Pro Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu450 45權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，包含膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 1中描述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。
3.權(quán)利要求1的分離多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 3中描述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。
4.權(quán)利要求1的分離多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 6中描述的。
5.權(quán)利要求1的分離多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 7中描述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。
6.權(quán)利要求1的分離多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 9中描述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。
7.一種分離的多肽，包含膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列，具有SEQ ID NO 24所述的氨基酸，其中該多肽顯示其三級結(jié)構(gòu)。
8.權(quán)利要求7的分離多肽，其中所述三級結(jié)構(gòu)與存在于天然蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)相對應(yīng)。
9.權(quán)利要求7的分離多肽，其中所述多肽通過用羥胺裂解全長膽堿結(jié)合蛋白A來制備，其中羥胺在氨基酸475處裂解膽堿結(jié)合蛋白A，由此產(chǎn)生膽堿結(jié)合蛋白A的N-末端截取物。
10.權(quán)利要求1的多肽的分離類似物。
11.權(quán)利要求10的分離多肽，其中類似物包含具有N-末端蛋氨酸或N-末端聚組氨酸的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求1的分離多肽，其中所述片段是多肽的蛋白水解消化產(chǎn)物。
13.一種分離的多肽，包含膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列，其中多肽具有凝集素活性而不結(jié)合膽堿。
14.一種分離的免疫原性多肽，包含膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求14的免疫原性多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 1中描述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。
16.權(quán)利要求14的免疫原性多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 3中描述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。
17.權(quán)利要求14的免疫原性多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 7中描述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。
18.權(quán)利要求14的免疫原性多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 9中描述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。
19.一種編碼多肽的分離的核酸，所述多肽包含膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。
20.權(quán)利要求19的分離的核酸，其中核酸是SEQ ID NO 12中描述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。
21.權(quán)利要求19的分離的核酸，其中核酸是SEQ ID NO 14中描述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。
22.權(quán)利要求19的分離的核酸，其中核酸是SEQ ID NO 17中描述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。
23.權(quán)利要求19的分離的核酸，其中核酸是SEQ ID NO 19中描述的，包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。
24.權(quán)利要求19的分離的核酸，其中核酸是DNA。
25.權(quán)利要求19的分離的核酸，其中核酸是cDNA。
26.權(quán)利要求19的分離的核酸，其中核酸是基因組DNA。
27.權(quán)利要求19的分離的核酸，其中核酸是RNA。
28.權(quán)利要求19的分離的核酸，它可有效地連接到轉(zhuǎn)錄RNA啟動子上的。
29.一種載體，包含權(quán)利要求19的核酸分子。
30.權(quán)利要求29的載體，其中啟動子包括細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動物啟動子。
31.權(quán)利要求30的載體，其中所述載體是質(zhì)粒、粘粒、酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌噬菌體或真核病毒DNA。
32.一種生產(chǎn)多肽的宿主載體系統(tǒng)，它在合適的宿主細(xì)胞中包含權(quán)利要求30的載體。
33.權(quán)利要求32的宿主載體系統(tǒng)，其中合適的宿主細(xì)胞包含原核或真核細(xì)胞。
34.一種細(xì)胞系，它包含權(quán)利要求19的核酸。
35.一種獲得純化形式多肽的方法，該方法包括(a)將權(quán)利要求19的載體引入合適的宿主細(xì)胞中；(b)培養(yǎng)所得宿主細(xì)胞以便產(chǎn)生多肽；(c)回收步驟(b)中產(chǎn)生的多肽；和(d)純化步驟(c)中回收的多肽。
36.一種能夠特異性結(jié)合權(quán)利要求1或7的多肽的抗體。
37.權(quán)利要求36的抗體，其中抗體是單克隆抗體。
38.權(quán)利要求36的抗體，其中抗體是多克隆抗體。
39.權(quán)利要求36的抗體，其中抗體是嵌合(雙特異性)抗體。
40.一種藥物組合物，它含有一定量的權(quán)利要求1的多肽和可藥用載體或稀釋劑。
41.一種在暴露于或感染了肺炎球菌的個體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，包括給予所述個體一定量的權(quán)利要求40的藥物組合物，由此誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
42.一種預(yù)防個體被肺炎球菌感染的方法，包括給予所述個體有效預(yù)防肺炎球菌附著量的權(quán)利要求40的藥物組合物，由此預(yù)防肺炎球菌感染。
43.權(quán)利要求42的方法，其中藥物組合物被釋放到呼吸道或鼻咽中。
44.一種預(yù)防個體被肺炎球菌感染的方法，包括給予所述個體一定量的含有權(quán)利要求36的抗體和可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物，由此預(yù)防肺炎球菌感染。
45.一種疫苗，它包含權(quán)利要求1的多肽和可藥用佐劑或載體。
46.權(quán)利要求45的疫苗，其中多肽具有SEQ ID NOS1、3-7、9-11、22和23所述的任一氨基酸序列。
47.權(quán)利要求45的疫苗，其中多肽包含圖2所述的膽堿結(jié)合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。
48.一種疫苗，它包含具有含圖2所述保守區(qū)的氨基酸序列的多肽和可藥用佐劑或載體。
49.權(quán)利要求48的疫苗，保守區(qū)選自158-172、300-321、331-339、355-365、367-374、379-389、409-427和430-447的氨基酸序列。
50.一種疫苗，它包含編碼權(quán)利要求1多肽的分離核酸和可藥用佐劑或載體。
51.一種疫苗，它包含權(quán)利要求19的分離核酸和可藥用佐劑或載體。
52.一種疫苗，它包含權(quán)利要求29的載體和可藥用佐劑或載體。
53.一種治療感染了或暴露于肺炎球菌的個體的方法，包括給予所述個體治療有效量的權(quán)利要求45-51或52的疫苗，由此治療個體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種包含膽堿結(jié)合蛋白AN－末端截取物的氨基酸序列的分離多肽,其中的氨基酸是SEQ IDNOS:1、3－7或9－11所述的,也包括其片段、突變體、變體、類似物或衍生物。而且,本發(fā)明提供一種包含膽堿結(jié)合蛋白AN－末端截取物的氨基酸序列的分離多肽及其制備方法,其中的氨基酸是SEQ ID NO 24所述的,該多肽保留其天然的三級結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供一種包含膽堿結(jié)合蛋白AN－末端截取物的氨基酸序列的分離多肽,其中多肽具有凝集素活性而不結(jié)合膽堿。本發(fā)明提供一種分離的免疫原性多肽,含有膽堿結(jié)合蛋白AN－末端截取物的氨基酸序列。本發(fā)明提供一種編碼多肽的分離的核酸,所述多肽包含膽堿結(jié)合蛋白AN－末端截取物的氨基酸序列。最后,本發(fā)明提供藥物組合物、疫苗和用其進(jìn)行診斷和治療的方法。
文檔編號A61K39/395GK1342088SQ99810854
公開日2002年3月27日 申請日期1999年4月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月7日
發(fā)明者E·I·托曼恩, H·R·馬舒爾, T·M·維澤曼, L·S·約翰遜, S·科尼格 申請人:圣朱德兒童研究醫(yī)院, 醫(yī)學(xué)免疫公司