專利名稱：離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體及生物體內(nèi)成分的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療領(lǐng)域中診斷或檢查時(shí)使用的適當(dāng)離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體及生物體內(nèi)成分的檢測方法。
另外，腫瘤，特別是惡性黑素瘤是預(yù)后效果非常不好、浸潤能力和轉(zhuǎn)移能力非常高的疾病，一旦轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，治療非常困難，所以期待開發(fā)出新的治療手段。這種惡性黑素瘤是通過檢查外科中切除的組織中是否存在黑素瘤細(xì)胞等腫瘤標(biāo)記物來進(jìn)行確診的。作為檢查方法，采用使用由手術(shù)后病灶剖面制成的按印涂片的按印熒光法和使用病灶組織的免疫染色法。在組織染色法中，使用各種黑素瘤標(biāo)記物抗體(抗黑素瘤抗體)。
但是，由于這種外科上切除細(xì)胞的方法不僅給患者帶來痛苦和恐懼心理，而且能夠增加腫瘤轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)，因而不希望這樣。另外，由于試料的采集必須在特定的場合下由熟練的醫(yī)生進(jìn)行，所以不適于集體檢查診斷等篩分法。另外，測定血清中和尿中的5-S-半胱氨酰多巴等多巴和腫瘤標(biāo)記物等的方法雖然作為癥狀惡化階段疾病程度和有無轉(zhuǎn)移等癥狀的指標(biāo)，但是作為早期診斷方法不合適。在這種狀況下，人們期待開發(fā)出并不那么需要現(xiàn)有檢查中所必須的高度熟練和經(jīng)驗(yàn)，而且對腫瘤等能夠進(jìn)行安全、早期診斷的方法。
另一方面，目前作為貼劑，已知含有水楊酸類消炎鎮(zhèn)痛藥和硝酸甘油等心絞痛治療藥等藥品的醫(yī)療用貼劑、用于刺激性試驗(yàn)的皮膚接觸性試驗(yàn)以及用于確定性變應(yīng)性皮炎等的致敏物的變應(yīng)原檢測用貼劑。特開昭63-106558號公報(bào)公開了一種角質(zhì)層標(biāo)本的制作方法，將皮膚的角質(zhì)層附著粘著性物質(zhì)上之后，貼付于涂敷有粘合劑的透明板上，接著浸漬在有機(jī)溶劑中，溶解除去前期的粘著物質(zhì)，使上述角質(zhì)層固定在上述透明板上。另外，在同一申請人的特開昭63-113358號公報(bào)中公開了使用上述角質(zhì)層標(biāo)本檢查角質(zhì)層狀態(tài)的方法，這里實(shí)施的檢查主要是測定角質(zhì)層物性的檢查。而且，同一申請人的特開平4-121664號公報(bào)中公開了一種通過粘性薄膜剝離角質(zhì)層，轉(zhuǎn)移，接著用有機(jī)溶劑洗滌，提取角質(zhì)層中含有的脂質(zhì)，分析該脂質(zhì)的方法。
但是，上述特開昭63-106558號公報(bào)和特開昭63-13358號公報(bào)的方法中，為了固定剝離的角質(zhì)細(xì)胞，有必要用有機(jī)溶劑溶解粘著層。因此，不能檢測出對有機(jī)溶劑不穩(wěn)定的物質(zhì)。另外，角質(zhì)層脂質(zhì)等用有機(jī)溶劑提取的物質(zhì)已不存在于角質(zhì)層標(biāo)本中，以與角質(zhì)層在皮膚中存在狀態(tài)相同的狀態(tài)檢查是不可能的。另外，上述特開平4-121664號公報(bào)的方法中，不用有機(jī)溶劑提取的物質(zhì)是不可能進(jìn)行分析的。
另外，特開平-76518號公報(bào)中公開了一種疾病的診斷方法，它是對用粘著帶剝離固定的組織、細(xì)胞或其他物質(zhì)或載體上吸附固定的組織或細(xì)胞分泌的物質(zhì)等用免疫學(xué)方法等進(jìn)行測定。該方法在腫瘤特別是惡性黑素瘤的初期，沒有必要對組織等進(jìn)行外科性切除，而且不會(huì)給患者帶來痛苦和恐懼心理，采集生物體組織、細(xì)胞或其分泌物等診斷腫瘤。
另一方面，離子電滲是使用外界刺激性的電促進(jìn)頭皮吸收的系統(tǒng)，其原理主要是基于通電后陽極和陰極之間產(chǎn)生的電場中，帶正電的分子由陽極向陰極移動(dòng)，帶負(fù)電的分子由陰極向陽極移動(dòng)的力量，促進(jìn)藥物分子透過皮膚屏障。[參照J(rèn)ournal of Controlled Release，18卷，1992年，213-220頁；Advanced Drug Delivery Review，9卷，1992年，119頁；Pharmaceutical Research，3卷，1986年，318-326頁]。
作為利用這種離子電滲進(jìn)行診斷的用例，已知以診斷囊胞性纖維病為目的投給毛果蕓香堿((J.Pediatr)69卷，1966年，285頁；(SouthMed.J.)59卷，1966年，197頁；(Arch.Dis.Child)40卷，1965年，684頁)。另外，近年來為了讓糖尿病患者自己測定血糖，提出了使用非侵襲性的離子電滲檢測血液中的葡萄糖的技術(shù)(參照國際公開號WO96/00110號公報(bào)；Pharmaceutical Resarch，12卷，1995年，1869-1873頁；Journal of Controlled Release，38卷，1996年，159-165頁；同一雜志，42卷，1996年，29-36頁)。該方法通過離子電滲形成對流，從而使血液中漏出的葡萄糖移動(dòng)到裝置中設(shè)置的溶液層中進(jìn)行采樣。
以前的方法中，使用粘著帶的方法在采集特別是生物體組織和細(xì)胞的分泌物，即肽或蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)時(shí)，有必要長時(shí)間貼付，在順應(yīng)性方面不能說是令人滿意的。而且，長時(shí)間貼付恐怕也會(huì)有皮膚刺激性，這不易給患者施用并會(huì)使患者感到不舒適。另外，象這種方法僅依賴于被測物質(zhì)的被動(dòng)擴(kuò)散時(shí)，個(gè)體間的差異較大，會(huì)造成誤診，在性能方面也不能說是充分的。
另外，以前采用離子電滲的方法中，可以檢測出低分子物質(zhì)，但檢測出肽和蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)時(shí)，為了回收被測物質(zhì)，不僅需要復(fù)雜的操作，而且要在試樣溶液中將其稀釋，因此在測定靈敏度上缺乏實(shí)用性。
因而，以前不存在能夠迅速而且高靈敏度地檢測出目的物質(zhì)的裝置或檢測方法。因此，存在不能根據(jù)疾病的種類在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行正確診斷的問題。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠迅速而且高靈敏度地檢測出生物體成分的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)以及檢測方法。
具體地說，例如在診斷腫瘤等疾病時(shí)，使用配置有對構(gòu)成腫瘤等標(biāo)記物的蛋白質(zhì)、肽、核苷酸等具有較高吸附性的檢測用部件的診斷用裝置結(jié)構(gòu)進(jìn)行離子電滲。而且，通過電的驅(qū)動(dòng)力使生物體內(nèi)成分吸附固定在檢測用部件上，之后從裝置中剝離檢測用部件，用免疫學(xué)方法或化學(xué)方法等測定吸附固定的腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤標(biāo)記物或腫瘤相關(guān)物質(zhì)。
也就是說，本發(fā)明涉及的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體包括離子電滲用電極、通過離子電滲吸附生物體內(nèi)成分的檢測用部件、上述電極和檢測用部件之間設(shè)置的導(dǎo)電層。這里檢測用部件例如由多孔性膜構(gòu)成，其每1cm2的蛋白質(zhì)吸附能力為20μg以上，顯示較高的吸附性。另外，檢測用部件的厚度優(yōu)選為5-200μm。
另外，檢測用部件能夠吸附作為生物體內(nèi)成分的生物體組織、血液和細(xì)胞中的至少一種?；蛘?，能夠吸附生物體組織、血液和細(xì)胞中至少一種分泌的物質(zhì)。這里分泌的物質(zhì)例如是肽或蛋白質(zhì)。
進(jìn)一步，檢測用部件能夠吸附腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤標(biāo)記物或其他腫瘤相關(guān)物質(zhì)。這里，腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤標(biāo)記物或其他腫瘤相關(guān)物質(zhì)選自黑素瘤細(xì)胞、黑素瘤標(biāo)記物(NKI/C3)、黑素瘤標(biāo)記物(PAL/Ml)、黑素瘤標(biāo)記物(S-100α和β)、癌胎兒性抗原(CEA)、神經(jīng)芽腫(CE7)、神經(jīng)芽腫(AD2)、致惡性腫瘤素、α-胎兒性蛋白(AFP)、胃蛋白酶原、堿性胎兒蛋白(BFP)、胰腺癌胎兒性抗原(POA)、胎兒性前清蛋白(EPA)、碳水化合物抗原(CA19-9)、胰腺癌相關(guān)抗原(CA50)、癌抗原(CSLEX-1)、胰腺癌相關(guān)抗原(Sialyl SSEA-1)、胰腺癌相關(guān)抗原(Dupan-2)、癌抗原(NCC-ST-439)、碳水化合物抗原(Sialyl Tn)、癌抗原(CA72-4)、癌抗原(KMO-1)、胰腺癌相關(guān)抗原(Span-1)、碳水化合物抗原(CA125)、癌抗原(CA15-3)、扁平細(xì)胞癌(SCC)、精原蛋白(seminoprotein)(γ-Sm)、前列腺特異抗原(PA)、鐵蛋白、組織多肽抗原(TPA)、腫瘤相關(guān)抗原(CYFRA-21-1)、免疫酸性蛋白(IAP)、免疫抑制酸性蛋白、前列腺酸性蛋白(PAP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、酶、氨基酸、含有粘多糖的粘液、多巴、多巴胺以及激素類。
本發(fā)明涉及的離子電滲裝置用涂藥器由具有凹面的襯墊、設(shè)置在襯墊凹面底部的電極、設(shè)置在襯墊凹面上部的生物體內(nèi)成分檢測用部件以及設(shè)置在電極和生物體內(nèi)成分檢測用部件之間設(shè)置的導(dǎo)電層構(gòu)成。與生物體內(nèi)成分檢測用部件相應(yīng)的部分具備帶開口的粘性片材。
本發(fā)明涉及的生物體內(nèi)成分的檢測方法中，采用離子電滲使生物體內(nèi)成分吸附在檢測用部件上，通過用免疫學(xué)方法或化學(xué)方法檢測吸附在該檢測用部件上的生物體內(nèi)成分。
本發(fā)明涉及的離子電滲系統(tǒng)由離子電滲裝置、參比裝置以及電源，離子電滲裝置包括通過離子電滲吸附生物體內(nèi)成分的檢測用部件、裝置用電極以及設(shè)置在裝置用電極和檢測用部件之間的導(dǎo)電層，參比裝置包括與裝置用電極對應(yīng)設(shè)置的參比電極，電源將上述裝置用電極和參比電極之間電連接。這里，檢測用部件具有例如平均孔徑0.001-20μm的多孔性結(jié)構(gòu)。
這樣，本發(fā)明的離子電滲裝置可以迅速而且高靈敏度地檢測出生物體內(nèi)成分，對于各種疾病的診斷是非常有用的。
圖2是說明牛血清白蛋白對診斷用裝置所使用的檢測用部件的吸附性的圖。
圖3是說明人胰島素對診斷用裝置所使用的檢測用部件的吸附性的圖。
圖4(a)-(d)是分別表示檢測用部件上人癌胎兒性抗原的免疫學(xué)染色結(jié)果的圖。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式以下，參照圖面詳細(xì)地說明本發(fā)明。
本發(fā)明涉及的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體包括離子電滲用電極、通過離子電滲吸附生物體內(nèi)成分的檢測用部件以及設(shè)置在離子電滲用電極和檢測部件之間的導(dǎo)電層。而且，使用對皮膚或粘膜適用的各種涂藥器，采用免疫學(xué)方法或化學(xué)方法檢測通過離子電滲移動(dòng)的生物體內(nèi)成分。


圖1(a)是具備本發(fā)明涉及的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體的涂藥器的一個(gè)實(shí)例的剖面圖。如圖所示，襯墊1形成圓筒狀的凹面。例如使用聚丙烯制內(nèi)徑為18mm的物質(zhì)作為襯墊1。襯墊1的底部設(shè)有沖切成圓形的箔型銀電極2。箔型銀電極2例如直徑為10mm，厚度為0.04mm。襯墊1的凹面部分設(shè)有電解質(zhì)層作為導(dǎo)電層3。另外，箔型銀電極2上設(shè)有連接端子4，它可以通過襯墊1中心部開的小孔與電源相連。在這樣構(gòu)成的裝置中設(shè)置能夠吸附生物體內(nèi)成分的檢測用部件6。檢測用部件6的材料等將在后面詳細(xì)敘述，例如可使用直徑20mm，厚度0.016mm的親水性尼龍膜。檢測用部件6預(yù)先貼付在比其直徑小一些直徑為18mm的具有開口的粘性片材5上，離子電滲開始時(shí)，使檢測用部件6與皮膚或粘膜接觸使用。
本發(fā)明涉及的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體的形態(tài)可以是任何一種形態(tài)，例如長方形、圓形、橢圓形、正方形、心形、菱形等，對此并沒有限定。另外，大小、顏色只要具有實(shí)用性并沒有特別的限定。
本發(fā)明的離子電滲裝置的通電可以如圖1(b)所示，通過使用電源30在裝置10的電極2和與之對應(yīng)設(shè)置的參比裝置20的參比電極7之間施加直流電壓進(jìn)行。電源只要是可以施加連續(xù)直流電壓或脈沖直流電壓的物質(zhì)即可，更優(yōu)選使用可以施加矩形脈沖直流電壓的物質(zhì)。脈沖直流電壓的頻率優(yōu)選在0.1至200kHz，更優(yōu)選在1至100kHz，特別優(yōu)選在5至80kHz的范圍內(nèi)適當(dāng)選擇。脈沖直流電壓的on/off的比在1/100至20/1，優(yōu)選在1/50至15/1，更優(yōu)選在1/30至10/1的范圍內(nèi)適當(dāng)選擇。通電時(shí)間為連續(xù)通電24小時(shí)以下，更優(yōu)選12小時(shí)以下，特別優(yōu)選6小時(shí)以下。
這種離子電滲裝置中，例如被測物質(zhì)是等電點(diǎn)在4附近的蛋白質(zhì)，在皮膚和粘膜等生物體內(nèi)具有負(fù)電荷，使用離子電滲時(shí)向陽極側(cè)移動(dòng)。因此，檢測用裝置設(shè)置在陽極側(cè)。而且，離子電滲裝置通電后，采用免疫學(xué)方法或化學(xué)方法檢測吸附固定在檢測用部件上的生物體組織、血液和細(xì)胞或其分泌物等。
本發(fā)明涉及的裝置結(jié)構(gòu)中，其結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)方法，即襯墊只要是電絕緣體或?qū)嵤┝私^緣處理的物質(zhì)，沒有特別的限定，優(yōu)選使用氯乙烯、聚乙烯、聚烯烴、聚酯、聚氨酯、聚乙烯醇、偏二氯乙烯聚酰胺以及乙烯-醋酸乙烯共聚物等塑料性薄膜或含有鋁的層壓箔片等。襯墊的厚度沒有特別的限定，優(yōu)選約為1μm-5000μm，特別優(yōu)選10μm-600μm。
本發(fā)明使用的電極只要是通常離子電滲中可以使用的導(dǎo)電性電極材料即可，沒有特別的限定。這種導(dǎo)電材料例如銀、氯化銀、鋁、鋅、銅、鐵、碳、鉑、鈦、不銹鋼等。其中，銀或氯化銀的電阻等電特性優(yōu)良，使用如果使用漿狀材料制造，價(jià)格便宜而且生產(chǎn)率高。
對本發(fā)明的裝置結(jié)構(gòu)中的導(dǎo)電層并沒有特別的限定。一般優(yōu)選以對皮膚或粘膜等貼付部位生理性刺激小的組成成分和pH范圍使用，為了通過離子電滲使被測物質(zhì)向診斷用裝置移動(dòng)，優(yōu)選使用考慮了被測物質(zhì)即標(biāo)記物蛋白質(zhì)、肽等的等電點(diǎn)的電解質(zhì)組成和pH。而且，本發(fā)明所使用的導(dǎo)電層的保持方法可以是凝膠型或溶液型代表的基質(zhì)型或貯器型等，并沒有特別的限定。這種基質(zhì)型導(dǎo)電性凝膠例如瓊脂、明膠、黃原膠、槐樹豆膠、角叉菜膠、殼膠、羅望籽果膠、凝膠多糖、果膠、farceleran、瓜爾膠、海藻酸、海藻酸鈉、tara gum、刺梧桐膠、纖維素、其衍生物等、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚異丁烯、等合成高分子類和共聚物等，可以單獨(dú)使用也可以2種以上組合使用。而且，作為溶液型代表的貯器型電解質(zhì)保持手段，可使用各種具有多孔性或毛細(xì)管結(jié)構(gòu)的部件(以下，有時(shí)簡稱為多孔性材料)。這種多孔性材料可以使用有機(jī)多孔性材料(例如由纖維素等天然纖維、醋酸纖維素等半合成纖維、聚乙烯、聚丙烯、尼龍、聚酯等合成纖維等形成的纖維集合體，紙等片材，紡布或無紡布等布，多孔性聚丙烯、多孔性聚苯乙烯、多孔性聚甲基丙烯酸甲酯、多孔性尼龍、多孔性聚砜、多孔性氟樹脂等多孔性合成樹脂，海綿等吸水性樹脂等)以及無機(jī)多孔性材料(例如陶瓷多孔體、具有多孔性或毛細(xì)管結(jié)構(gòu)的陶瓷等)等。在上述各種保持手段中，必要時(shí)也可以添加電解質(zhì)、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、增粘劑、潤濕劑、表面活性劑、溶解助劑等，或使之含浸在其中。
本發(fā)明涉及的裝置結(jié)構(gòu)的檢測用部件可以吸附固定生物體組織、血液或細(xì)胞或它們的分泌物等，更優(yōu)選處于電場時(shí)也可以維持其吸附力。另外，檢測用部件是親水性的，對蛋白質(zhì)、肽等具有較高的吸附性能，對用來檢測吸附固定的物質(zhì)所使用的水、醇、甲醛等穩(wěn)定，優(yōu)選在這些溶液中不會(huì)從檢測用部件上脫離、溶解的物質(zhì)。對于這種檢測用部件沒有特別的限定，可以使用對蛋白質(zhì)、肽等有高吸附力的具有多孔性或毛細(xì)管結(jié)構(gòu)的各種親水性多孔材料或?qū)嵤┝擞H水處理的疏水性多孔材料。
優(yōu)選的檢測用部件可以舉出有機(jī)多孔性材料(例如由纖維素等天然纖維、硝酸纖維素或醋酸纖維素等半合成纖維、聚乙烯、聚丙烯、尼龍、聚酯等合成纖維等形成的纖維集合體，紙等片材，紡布或無紡布等布，多孔性聚丙烯、多孔性聚苯乙烯、多孔性聚甲基丙烯酸甲酯、多孔性尼龍、多孔性聚砜、多孔性氟樹脂、多孔性聚偏二氟乙烯等多孔性合成樹脂等)。
本發(fā)明所使用的檢測用部件具有對蛋白質(zhì)、肽顯示較高吸附性，其吸附量也大的特點(diǎn)。檢測用部件對蛋白質(zhì)的吸附量每1cm2為20μg以上，優(yōu)選每1cm2為40μg以上，更優(yōu)選每1cm2為50μg以上。另外，蛋白質(zhì)的吸附量可以通過使用代表性蛋白質(zhì)能夠簡便測定的慣用方法，例如將1.3cm2的檢測用部件在室溫下浸漬于含有示蹤量的用125I標(biāo)識的牛血清白蛋白或人胰島素的溶液(蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml磷酸鹽緩沖液)400μl中90分鐘后，用磷酸鹽緩沖液洗滌，通過測定殘留放射活性計(jì)算出來。另外，也可以使用被測物質(zhì)計(jì)算吸附量。
這些檢測用部件具有多孔性結(jié)構(gòu)，其細(xì)孔徑只要在被測物質(zhì)的保持量和目的物質(zhì)的測定方面不會(huì)損害檢測性能即可，可以在生物體可接受的范圍內(nèi)選擇，例如平均孔徑為0.001-20μm，優(yōu)選0.01-10μm，更優(yōu)選0.01-1μm。
另外，檢測用部件的厚度只要在被測物質(zhì)的保持量和目的物質(zhì)的測定方面不會(huì)損害檢測性能即可，可以在生物體可接受的范圍選擇，最好是約0.1-500μm，優(yōu)選約1-300μm，更優(yōu)選約5-200μm。
其次，說明本發(fā)明涉及的檢測方法。采用本發(fā)明的裝置結(jié)構(gòu)，檢測用部件上吸附固定的生物體組織、血液或細(xì)胞或它們的分泌物是腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤標(biāo)記物或其他腫瘤相關(guān)物質(zhì)等，通過用免疫學(xué)方法或化學(xué)方法對上述檢測用部件進(jìn)行染色或測定，可以診斷腫瘤等。采用本發(fā)明的裝置結(jié)構(gòu)以及檢查方法可以檢測出的腫瘤的例子有皮膚癌、口腔癌、乳腺癌以及直腸癌等。皮膚癌的例子可以舉出惡性黑素瘤、基底細(xì)胞癌、扁平上皮癌等，口腔癌的例子可以舉出舌癌、頰粘膜癌、喉癌等。
另外，上述腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤標(biāo)記物和其他腫瘤相關(guān)物質(zhì)可以選自黑素瘤細(xì)胞、黑素瘤標(biāo)記物(NKI/C3)、黑素瘤標(biāo)記物(PAL/Ml)、黑素瘤標(biāo)記物(S-100α和β)、癌胎兒性抗原(CEA)、神經(jīng)芽腫(CE7)、神經(jīng)芽腫(AD2)、致惡性腫瘤素、α-胎兒性蛋白(AFP)、胃蛋白酶原、堿性胎兒蛋白(BFP)、胰腺癌胎兒性抗原(POA)、胎兒性前清蛋白(EPA)、碳水化合物抗原(CA19-9)、胰腺癌相關(guān)抗原(CA50)、癌抗原(CSLEX-1)、胰腺癌相關(guān)抗原(Sialyl SSEA-1)、胰腺癌相關(guān)抗原(Dupan-2)、癌抗原(NCC-ST-439)、碳水化合物抗原(Sialyl Tn)、癌抗原(CA72-4)、癌抗原(KMO-1)、胰腺癌相關(guān)抗原(Span-1)、碳水化合物抗原(CA125)、癌抗原(CA15-3)、扁平細(xì)胞癌(SCC)、精原蛋白(seminoprotein)(γ-Sm)、前列腺特異抗原(PA)、鐵蛋白、組織多肽抗原(TPA)、腫瘤相關(guān)抗原(CYFRA-21-1)、免疫酸性蛋白(IAP)、免疫抑制酸性蛋白、前列腺酸性蛋白(PAP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、酶、氨基酸、含有粘多糖的粘液、多巴、多巴胺以及激素類。
黑素瘤標(biāo)記物的檢測可以考慮特異性和靈敏度使用各種黑素瘤抗體。黑素瘤抗體只要是惡性黑素瘤特異性高的抗體即可，可以是任意一種物質(zhì)。通過貼付在病變部位，剝離固定或吸附固定有組織、血液和細(xì)胞等的本發(fā)明的診斷用裝置結(jié)構(gòu)，采用使用上述抗體的EIA法、使用各種標(biāo)識粒子(膠乳、金膠體)的免疫測定法以及熒光免疫測定法，以細(xì)胞染色的形式可以檢測出組織、血液或細(xì)胞中有無腫瘤標(biāo)記物。另外，5-S-半胱氨酰多巴的場合，本發(fā)明的診斷用裝置結(jié)構(gòu)的檢測用部件經(jīng)甲醛處理后，可以用熒光顯微鏡檢測出來。這時(shí)，通過被染色的細(xì)胞的顏色濃度及其個(gè)數(shù)可以進(jìn)行定性的判斷。另外，也可以使用上述方法以外的任意一種公知檢測方法，測定本發(fā)明裝置結(jié)構(gòu)上吸附固定的組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、肽等。
以下結(jié)合試驗(yàn)例更詳細(xì)地說明本發(fā)明的實(shí)施例、比較例，但是本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。試驗(yàn)例1-3中討論了診斷用裝置所使用的檢測用部件對蛋白質(zhì)的吸附特性、擴(kuò)散性以及在電場中的保持性能。試驗(yàn)例4中選擇試驗(yàn)例1-3中的診斷用裝置的檢測用部件，評價(jià)對乳腺癌腫瘤標(biāo)記物—人癌胎兒性抗原(人CEA)的免疫學(xué)染色法的染色性能帶來的影響。而且，試驗(yàn)例5中使用本發(fā)明的診斷用離子電滲裝置，討論從皮膚檢測乳腺癌標(biāo)記物—人CEA。另外，以牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司生產(chǎn))、人胰島素(Sigma公司產(chǎn)生產(chǎn))和人CEA(生化學(xué)工業(yè))作為代表性蛋白質(zhì)、肽以及診斷用標(biāo)記物的例子。(試驗(yàn)例1)為了評價(jià)診斷用裝置的檢測用部件的特性，選擇由各種材料構(gòu)成的多孔膜，討論對蛋白質(zhì)的吸附特性。另外，蛋白質(zhì)的吸附量是通過使用代表性蛋白質(zhì)能夠簡便測定的慣用方法，將1.3cm2的各種檢測用部件在室溫下浸漬于含有示蹤量的用125I標(biāo)識的牛血清白蛋白(I-BSA，0.827mCi/mg，ICN Pharmaceutical Inc.)或人胰島素(0.912μ Ci/μg，ICN Pharmaceutical Inc.)的溶液(蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml磷酸鹽緩沖液)400μl中90分鐘后，用磷酸鹽緩沖液洗滌，通過用γ-計(jì)數(shù)器測定殘留放射活性從而計(jì)算出來。各實(shí)施例以及比較例中所采用的檢測用部件的材料如下所示。
實(shí)施例1硝酸纖維素膜(Biolad公司生產(chǎn)，硝酸纖維素薄膜)實(shí)施例2尼龍膜(Pall公司生產(chǎn)，Biodyne A)實(shí)施例3疏水性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Biolad公司生產(chǎn)，PVDF薄膜)比較例1親水性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司生產(chǎn)，親水性Durapore)另外，疏水性PVDF膜在試驗(yàn)之前在100％的甲醇中浸潤數(shù)秒進(jìn)行親水處理，之后用磷酸鹽緩沖液浸潤。
圖2是表示實(shí)施例1-3和比較例1中牛血清白蛋白(BSA)對診斷用裝置所使用的檢測用部件的吸附性的圖(平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3)。另外，圖3是表示同樣在實(shí)施例1-3和比較例1中人胰島素對診斷用裝置所使用的檢測用部件的吸附性的圖(平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3)。BSA的吸附量如圖2所示，在實(shí)施例1中為約80μg/cm2，實(shí)施例2中為約50μg/cm2，實(shí)施例3中為約170μg/cm2。另外，使用蛋白質(zhì)吸附性低的部件的比較例1中為5μg/cm2以下。另一方面，人胰島素的吸附量如圖3所示，在實(shí)施例1中為約100μg/cm2，實(shí)施例2中為約80μg/cm2，實(shí)施例3中為約150μg/cm2。另外，比較例1中為5μg/cm2以下。硝酸纖維素、尼龍、疏水性PVDF對代表性蛋白質(zhì)和肽-BSA和人胰島素具有高吸附能力。(試驗(yàn)例2)其次，討論各種檢測用部件中各種蛋白質(zhì)的擴(kuò)散性。采用與試驗(yàn)例1相同的方法，也就是將1.3cm2的各種檢測用部件在室溫下浸漬于含有示蹤量的用125I標(biāo)識的BSA的溶液(蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml磷酸鹽緩沖液)400μl中90分鐘后，用磷酸鹽緩沖液洗滌，用γ-計(jì)數(shù)器測定殘留放射活性。之后，再在磷酸鹽緩沖液中浸漬24小時(shí)，同樣用γ-計(jì)數(shù)器測定殘留的放射活性。各實(shí)施例和比較例中使用的檢測用部件的材料如下所示。
實(shí)施例4硝酸纖維素膜(Biolad公司生產(chǎn)，硝酸纖維素薄膜)實(shí)施例5尼龍膜(Pall公司生產(chǎn)，Biodyne A)實(shí)施例6疏水性PVDF膜(Biolad公司生產(chǎn)，PVDF薄膜)比較例2親水性PVDF膜(Millipore公司生產(chǎn)，親水性Durapore)另外，疏水性PVDF膜在試驗(yàn)前與上述試驗(yàn)例1同樣進(jìn)行親水處理。
實(shí)施例4-6和比較例2得到的結(jié)果如表1所示。
表1

表1表示牛血清白蛋白對診斷用裝置所使用的檢測用部件的擴(kuò)散性(平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3)。如表1所示，實(shí)施例4、5、6中，24小時(shí)后的吸附量都幾乎不減少，確認(rèn)吸附的蛋白質(zhì)在溶液中不擴(kuò)散。另外，比較例2確認(rèn)幾乎沒有初期吸附，24小時(shí)后吸附量進(jìn)一步減少。(試驗(yàn)例3)另外，討論診斷用裝置中檢測用部件的吸附性能，特別是在電場中的特性。使用作為代表性蛋白質(zhì)的BSA、人胰島素，以及一種診斷用標(biāo)記物人CEA，評價(jià)各種檢測用部件在電場中的吸附性能。對于BSA、人胰島素、人CEA，在100-150V下進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(使用10-25％聚丙烯酰胺梯度凝膠)。另外，電泳時(shí)各種蛋白質(zhì)的用量為2.5μg。使電泳后的凝膠與實(shí)施例和比較例的2張轉(zhuǎn)印膜重疊，再放上第3張作為支持膜的硝酸纖維素膜，在150mA下轉(zhuǎn)印3小時(shí)。轉(zhuǎn)印的蛋白質(zhì)用酰氨黑染色液染色。各實(shí)施例和比較例所使用的檢測用部件的材料如下所示。
實(shí)施例7硝酸纖維素膜(Biolad公司生產(chǎn)，硝酸纖維素薄膜)實(shí)施例8尼龍膜(Pall公司生產(chǎn)，Biodyne A)實(shí)施例9疏水性PVDF膜(Biolad公司生產(chǎn)，PVDF薄膜)比較例3親水性PVDF膜(Millipore公司生產(chǎn)，親水性Durapore)另外，疏水性PVDF膜在試驗(yàn)前與上述試驗(yàn)例1和2同樣進(jìn)行親水處理。
實(shí)施例7-9和比較例3得到的結(jié)果如表2所示。
表2

表2表示診斷用裝置所使用的檢測用部件對于牛血清白蛋白、人胰島素和人癌胎兒性抗原在電場中的保持能力。如表2所示，對于BSA(分子量約6萬)，在實(shí)施例7-9中，主要保持在轉(zhuǎn)印膜(1)上，轉(zhuǎn)印膜(2)上僅能檢測出少量。對于人胰島素(分子量約6000)，與BSA具有同樣的趨勢，主要保持在轉(zhuǎn)印膜(1)上，轉(zhuǎn)印膜(2)上僅能檢測出少量。而且，對于人CEA(分子量約18萬)，保持在轉(zhuǎn)印膜(1)上，在轉(zhuǎn)印膜(2)上檢測不出來。另一方面，比較例3在電場中BSA、人胰島素和人CEA通過轉(zhuǎn)印膜，完全不能吸附保持。因此，硝酸纖維素、尼龍、疏水性PVDF對任何蛋白質(zhì)和肽都具有高吸附性、低擴(kuò)散性，并在電場中也具有較強(qiáng)的保持能力。(試驗(yàn)例4)其次，討論各種檢測用部件對人CEA的免疫學(xué)染色的影響。分別將人CEA 0.1、1.0、10ng滴加在各種檢測用部件上，干燥固定后，進(jìn)行下述免疫學(xué)染色。對固定有人CEA的各種檢測用部件進(jìn)行阻滯處理后，浸潤在一次抗體溶液(小鼠抗人CEA單克隆抗體、克隆EB-016，日本生物實(shí)驗(yàn)研究所)中。用硼酸緩沖液洗滌后，浸潤在生物素標(biāo)識二次抗體溶液(生物素標(biāo)識抗小鼠IgF(ab’)2、DAKO JAPAN Co.、Ltd.)中。洗滌后，浸漬在過氧化物酶標(biāo)識鏈球菌抗生物素蛋白(streptoavidin)溶液(生化學(xué)工業(yè))中，用硼酸洗滌后，用DAB(diaminobenzidinetetrahydrochloride)作為基質(zhì)，使之顯色。各實(shí)施例和比較例所使用的檢測用部件的材料如下所示。
實(shí)施例10硝酸纖維素膜(Biolad公司生產(chǎn)，硝酸纖維素薄膜)實(shí)施例11尼龍膜(Pall公司生產(chǎn)，Biodyne A)實(shí)施例12疏水性PVDF膜(Biolad公司生產(chǎn)，PVDF薄膜)比較例4親水性PVDF膜(Millipore公司生產(chǎn)，親水性Durapore)另外，疏水性PVDF膜在試驗(yàn)前與上述試驗(yàn)例1和2同樣進(jìn)行親水處理。
實(shí)施例10-12和比較例4得到的結(jié)果如表3所示。
表3

表3表示各種檢測用部件對人癌胎兒性抗原(人CEA)的免疫學(xué)染色法的染色性能的影響。如表3所示，實(shí)施例10、11中可以檢測出lng以上的人CEA。實(shí)施例12中，可以檢測出10ng以上的人CEA，但在1ng以下則檢測不出來。另外，比較例4中完全沒有染色，可以認(rèn)為是在免疫染色的操作過程中流出造成的。(試驗(yàn)例5)使用本發(fā)明涉及的裝置，通過體外實(shí)驗(yàn)研究從皮膚檢測人CEA。另外，使用Yucatan Micropigs的表皮層作為皮膚模型。在角質(zhì)層一側(cè)使用診斷用裝置(陽極，銀電極)，真皮層一側(cè)設(shè)置添加有人CEA(10μg/ml，磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4))的無紡布層，再與參比電極(陰極氯化銀電極)連接。另外，作為診斷用裝置的檢測用部件，使用具有高吸附能力、低擴(kuò)散性、高保持能力以及高染色性能尼龍膜(Pall公司生產(chǎn)，Biodyne A)。以頻率50kHz、on/off比為50％的脈沖直流電壓、0.5mA/cm2通電1小時(shí)。免疫學(xué)檢測采用與上述試驗(yàn)例4同樣的染色方法進(jìn)行。另外，將人CEA 0.1、1.0、10ng滴加在檢測用部件上，作為基準(zhǔn)值。
實(shí)施例13添加人CEA，實(shí)施離子電滲的場合比較例5添加人CEA，不實(shí)施離子電滲的場合比較例6僅用磷酸鹽緩沖液實(shí)施離子電滲的場合實(shí)施例13和比較例5、6得到的結(jié)果如表4所示。
表4

表4表示使用本發(fā)明的診斷用離子電滲裝置，人癌胎兒性抗原(人CEA)從皮膚檢測出的人CEA濃度和染色性。另外，圖4(a)-(b)是表示檢測用部件上人癌胎兒性抗原的免疫學(xué)染色結(jié)果的圖。如表4和圖4(a)-(b)所示，實(shí)施例13中檢測用部件的多個(gè)部位檢測出人CEA，與基準(zhǔn)值相比判斷檢測量，檢測出10ng以上的人CEA。染色結(jié)果表明通過Yucatan Micropigs表皮內(nèi)的毛孔或汗腺等，人CEA轉(zhuǎn)移到檢測用部件上。另一方面，比較例5、6中沒有檢測出人CEA(基準(zhǔn)值0.1ng以下)。這樣，通過皮膚也可以檢測出腫瘤標(biāo)記物，表明本診斷用裝置結(jié)構(gòu)以及染色方法具有實(shí)用性。
因此，本發(fā)明提供的采用離子電滲的裝置結(jié)構(gòu)對診斷腫瘤等是有用的。使用本發(fā)明的裝置結(jié)構(gòu)，不需要進(jìn)行皮膚或粘膜表面的外科切除或穿刺吸引，不會(huì)給患者帶來痛苦，可以在短時(shí)間內(nèi)非常容易地采集試樣。因此，可以檢查診斷皮膚癌、口腔癌、乳腺癌和直腸癌等腫瘤塊。而且，可以減少外科處理等引起的復(fù)發(fā)。另外，使用本發(fā)明的裝置結(jié)構(gòu)，對于難以判斷的極初期腫瘤，也可以確認(rèn)腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤相關(guān)標(biāo)記物或其他腫瘤相關(guān)物質(zhì)的有無，使腫瘤的早期診斷成為可能。而且，采用本發(fā)明的裝置結(jié)構(gòu)，將皮膚或粘膜表面的組織、細(xì)胞或它們的分泌物或其他物質(zhì)吸附固定在檢測用部件上，將其直接作為試樣使用，因此與現(xiàn)有技術(shù)相比可以迅速而且容易地進(jìn)行診斷，在經(jīng)濟(jì)上也是實(shí)用的。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明涉及的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)和檢測方法對迅速而且高靈敏度地檢測出生物體內(nèi)成分是有用的，適用于醫(yī)療領(lǐng)域的離子電滲。
權(quán)利要求
1.離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體，其特征在于，包括離子電滲用電極、通過離子電滲吸附生物體內(nèi)成分的檢測用部件、上述電極和檢測用部件之間設(shè)置的導(dǎo)電層。
2.如權(quán)利要求1所述的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體，其特征在于，上述檢測用部件由多孔性膜構(gòu)成。
3.如權(quán)利要求1或2所述的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體，其特征在于，上述檢測用部件每1cm2的蛋白質(zhì)吸附能力為20μg以上。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體，其特征在于，上述檢測用部件的厚度為5-200μm。
5.如權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體，其特征在于，上述檢測用部件能夠吸附生物體組織、血液和細(xì)胞中的至少一種。
6.如權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體，其特征在于，上述檢測用部件能夠吸附生物體組織、血液和細(xì)胞中至少一種分泌的物質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體，其特征在于，上述分泌的物質(zhì)是肽或蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體，其特征在于，上述檢測用部件能夠吸附腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤標(biāo)記物或其他腫瘤相關(guān)物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體，其特征在于，上述腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤標(biāo)記物或其他腫瘤相關(guān)物質(zhì)選自黑素瘤細(xì)胞、黑素瘤標(biāo)記物(NKI/C3)、黑素瘤標(biāo)記物(PAL/Ml)、黑素瘤標(biāo)記物(S-100α和β)、癌胎兒性抗原(CEA)、神經(jīng)芽腫(CE7)、神經(jīng)芽腫(AD2)、致惡性腫瘤素、α-胎兒性蛋白(AFP)、胃蛋白酶原、堿性胎兒蛋白(BFP)、胰腺癌胎兒性抗原(POA)、胎兒性前清蛋白(EPA)、碳水化合物抗原(CA19-9)、胰腺癌相關(guān)抗原(CA50)、癌抗原(CSLEX-1)、胰腺癌相關(guān)抗原(Sialyl SSEA-1)、胰腺癌相關(guān)抗原(Dupan-2)、癌抗原(NCC-ST-439)、碳水化合物抗原(Sialyl Tn)、癌抗原(CA72-4)、癌抗原(KMO-1)、胰腺癌相關(guān)抗原(SPan-1)、碳水化合物抗原(CA125)、癌抗原(CA15-3)、扁平細(xì)胞癌(SCC)、精原蛋白(seminoprotein)(γ-Sm)、前列腺特異抗原(PA)、鐵蛋白、組織多肽抗原(TPA)、腫瘤相關(guān)抗原(CYFRA-21-1)、免疫酸性蛋白(IAP)、免疫抑制酸性蛋白、前列腺酸性蛋白(PAP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、酶、氨基酸、含有粘多糖的粘液、多巴、多巴胺以及激素類。
10.離子電滲用涂藥器，其特征在于，由具有凹面的襯墊、設(shè)置在上述襯墊凹面底部的電極、設(shè)置在上述襯墊凹面上部的生物體內(nèi)成分檢測用部件以及設(shè)置在電極和生物體內(nèi)成分檢測用部件之間的導(dǎo)電層構(gòu)成。
11.如權(quán)利要求11所述的離子電滲用涂藥器，其特征在于與上述生物體內(nèi)成分檢測用部件相應(yīng)的部分具備帶開口的粘性片材。
12.生物體內(nèi)成分的檢測方法，其特征在于，采用離子電滲使生物體內(nèi)成分吸附在檢測用部件上，通過用免疫學(xué)方法或化學(xué)方法檢測吸附在該檢測用部件上的生物體內(nèi)成分。
13.如權(quán)利要求12所述的生物體內(nèi)成分檢測方法，其特征在于上述檢測是通過對上述生物體內(nèi)成分染色或測定進(jìn)行的。
14.離子電滲系統(tǒng)，其特征在于，由離子電滲裝置、參比裝置以及電源構(gòu)成，離子電滲裝置包括通過離子電滲吸附生物體內(nèi)成分的檢測用部件、裝置用電極以及設(shè)置在上述裝置用電極和檢測用部件之間的導(dǎo)電層，參比裝置包括與上述裝置用電極對應(yīng)設(shè)置的參比電極，電源將上述裝置用電極和上述參比電極之間電連接起來。
15.如權(quán)利要求14所述的離子電滲系統(tǒng)，上述檢測用部件具有平均孔徑0.001-20μm的多孔性結(jié)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明涉及可以迅速而且高靈敏度檢測出生物體內(nèi)成分的離子電滲裝置結(jié)構(gòu)體。在這種結(jié)構(gòu)中,具有凹面的襯墊(1)的底部設(shè)有電極(2),凹面部分設(shè)有導(dǎo)電層(3)。電極(2)上設(shè)有連接端子(4),它可以通過襯墊(1)底部開的小孔與電源相連。在這樣結(jié)構(gòu)中,設(shè)置能夠吸附生物體內(nèi)成分的檢測用部件(6)。檢測用部件(6)預(yù)先貼付在其相應(yīng)部分具有開口的粘性片材(5)上,離子電滲開始時(shí),使檢測用部件(6)與皮膚或粘膜接觸使用。
文檔編號A61B5/1477GK1308503SQ99808414
公開日2001年8月15日 申請日期1999年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月5日
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