專利名稱：神經(jīng)纖維網(wǎng)素反義寡核苷酸序列及其用于調(diào)控細(xì)胞生長的方法
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背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及與哺乳動物神經(jīng)纖維網(wǎng)素(或VEGF165R)的mRNA互補的寡核苷酸，該寡核苷酸可調(diào)控哺乳動物的細(xì)胞生長。本發(fā)明也涉及在抑制哺乳動物腫瘤細(xì)胞生長及抑制哺乳動物血管生成中使用這類化合物的方法。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含藥物上可接受的賦形劑及有效量的本發(fā)明化合物。
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目前的技術(shù)水平新微血管的增生被稱為血管生成或者新血管生成，對小的局部腫瘤擴張成大的惡性生長的轉(zhuǎn)變具有決定性的影響。若排除血液供給的適當(dāng)發(fā)展，腫瘤的生長則急劇減弱。
視網(wǎng)膜的新生血管疾病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)性視網(wǎng)膜病變及與年齡有關(guān)的斑點變性，在美國及世界各地均是引起眼盲的主因。在糖尿病過程中，其視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)變化而導(dǎo)致血管滲漏及血管脫落最后導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺氧癥狀。這種視網(wǎng)膜新血管生成的影響之一是導(dǎo)致出血和視網(wǎng)膜剝離。早產(chǎn)性視網(wǎng)膜病變乃是引起幼兒眼盲的常見原因。當(dāng)發(fā)育中的視網(wǎng)膜增加代謝需求時，視網(wǎng)膜血管停止發(fā)育成末梢視網(wǎng)膜而導(dǎo)致局部缺血及局部缺氧的情形。缺氧的結(jié)果引發(fā)其后的視網(wǎng)膜新血管生成而導(dǎo)致永久性視力損失。眼睛新血管生成也是鐮狀細(xì)胞性視網(wǎng)膜病變，新血管性青光眼，視網(wǎng)膜血管閉塞及其它缺氧性疾病的基本病因。最近的實驗數(shù)據(jù)顯示，血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)與視網(wǎng)膜新血管生成之間有高度相關(guān)性(28)。
腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的數(shù)個血管生成因子中，顯示血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)為腫瘤血管生成及新血管生成的主要介體。人類VEGF單體有5種不同的同種型，其中以VEGF121和VEGF165含量最多(1，2)。VEGF活性在于其與內(nèi)層有腫瘤血管分布的內(nèi)皮細(xì)胞上存在的高親和性酪氨酸激酶受體的結(jié)合作用。兩種這樣的受體已被分離KDR/Flk-1(3，4)，其看來是VEGF信號與Flt-1的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)物(5，6)。
最近克隆出的神經(jīng)纖維網(wǎng)素或VEGF165R或血管內(nèi)皮生長因子受體為由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的VEGF165的新的同種型特異性受體(9)，而該受體最早是以介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞引導(dǎo)的腦衰蛋白/信號素(collapsin/semaphorin)的受體被分離出來的(7，8)。人類神經(jīng)纖維網(wǎng)素的核酸序列已被報導(dǎo)(9，11，21，22)。神經(jīng)纖維網(wǎng)素?fù)?dān)當(dāng)VEGF165與KDR/Flk-1結(jié)合的共同受體，并且調(diào)控接下來的生物活性，即腫瘤誘發(fā)的血管生成。在被試驗的很少數(shù)中，其也在腫瘤衍生的細(xì)胞，如MDA-MB-231乳癌細(xì)胞及PC3前列腺癌細(xì)胞中高度表達(dá)(9，10)。其中也顯示VEGF可結(jié)合Hela，黑素瘤及NIH 3T3細(xì)胞。
反義技術(shù)已被廣泛采用，不僅是一種有用的研究工具(12)，而且是獲得用于治療許多人類疾病(包括癌癥)的新的治療用化合物的合理手段(13，14)。反義寡核苷酸可與mRNA序列特異性雜交并且抑制對人類癌癥的引發(fā)和/或進(jìn)展具有重要性的蛋白質(zhì)表達(dá)。因此，需要鑒定直接針對神經(jīng)纖維網(wǎng)素的反義寡核苷酸，其作用是以較高特異性及較低毒性抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素/VEGF165R的表達(dá)和產(chǎn)生。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及反義寡核苷酸，其可調(diào)控哺乳動物的神經(jīng)纖維網(wǎng)素基因的表達(dá)和神經(jīng)纖維網(wǎng)素/VEGF165R的產(chǎn)生，并涉及包含此類反義寡核苷酸的藥物組合物。本發(fā)明也涉及利用此類反義寡核苷酸抑制哺乳動物的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中所涉及的新毛細(xì)血管增生或血管生成或新血管生成。
因此，本發(fā)明組合物的一個方面涉及約3至約100個核苷酸的反義寡核苷酸，其包含與哺乳動物的神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA互補的核苷酸。該反義寡核苷酸可具有核酸酶抗性，且具有一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。該反義寡核苷酸可能進(jìn)一步包含其它不與神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA互補的核苷酸。
本發(fā)明組合物另一方面涉及約20至約100個核苷酸的反義寡核苷酸，其包括選自示于表1中SEQ ID NOs1-30的序列，該寡核苷酸可抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素表達(dá)。
本發(fā)明組合物另一方面涉及包含約20至約100個核苷酸的寡核苷酸序列的載體，該寡核苷酸包括選自示于表1中SEQ ID NOs1-30的序列，其可抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素表達(dá)。
本發(fā)明組合物另一方面涉及一種藥物組合物，其包含藥物上可接受的賦形劑及有效量的約20至約100個核苷酸的反義寡核苷酸，其中包括選自示于表1的SEQ ID NOs1-30的序列，該寡核苷酸可抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素表達(dá)。
本發(fā)明方法一方面涉及用于抑制哺乳動物腫瘤生長的方法，其包括對疑有腫瘤的哺乳動物施用有效量的反義寡核苷酸，該寡核苷酸的大小約3至約100個核苷酸并且包含一段在抑制腫瘤生長的條件下與哺乳動物神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA互補的序列。該反義寡核苷酸可與化療藥物共同投藥。
本發(fā)明方法另一方面涉及一種抑制哺乳動物腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，其包括對疑有腫瘤的哺乳動物施用有效量的反義寡核苷酸，其大小約3至約100個核苷酸且包含在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下可與哺乳動物神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA互補的序列。該反義寡核苷酸可與化療藥物同時使用。
本發(fā)明方法另一方面涉及一種抑制哺乳動物的血管生成或新血管生成的方法，其包括對該哺乳動物施用有效量的反義寡核苷酸，其大小約3至約100個核苷酸，且可在抑制新血管生成的條件下，與哺乳動物神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA互補。
本發(fā)明方法另一方面涉及一種抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素表達(dá)的方法，其包括使對神經(jīng)纖維網(wǎng)素具有特異性的核酸與反義寡核苷酸接觸，該反義寡核苷酸大小約20至約100個核苷酸并且包括一段選自示于表1中SEQ ID NOs1-30的序列，該寡核苷酸可抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素表達(dá)。
圖示簡述

圖1A-F是經(jīng)由施用指定的反義寡核苷酸抑制不同細(xì)胞系集落形成能力的百分比圖。圖1A為人類黑素瘤細(xì)胞系C8161的抑制百分比；圖1B為人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)459的抑制百分比；圖1C為人類黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058的抑制百分比；圖1D為人類結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29的抑制百分比；圖1E為人類前列腺癌細(xì)胞系PC-3的抑制百分比；及圖1F為人類胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1的抑制百分比。
圖2A和2B是施用下列反義寡核苷酸后的人類黑素瘤癌細(xì)胞系A(chǔ)2058(圖2B)或人類乳癌細(xì)胞系MDA-MB-231(圖2A)的RNA的Northern印跡法放射自顯影圖GTI3601[SEQ ID NO1]；GTI3602[SEQ ID NO2]；GTI3603[SEQ ID NO3]；GTI3604[SEQ ID NO4]；GTI3610[SEQ ID NO10]；GTI3611[SEQ ID NO11]；及GTI3612[SEQID NO12]。
圖3A在投藥(反義寡核苷酸GTI3602[SEQ ID NO2])或不投藥(生理食鹽水)的小鼠右脅注射人類HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞后腫瘤體積隨時間的變化圖。
圖3B為投藥(反義寡核苷酸GTI3602[SEQ ID NO2])或不投藥(生理食鹽水)的小鼠右脅注射人類HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞后20天內(nèi)的腫瘤重量變化圖。
圖4為經(jīng)過反義寡核苷酸GTI3611[SEQ ID NO11]或GTI3602[SEQ ID NO2]處理或未經(jīng)處理(對照組)之后人類黑素瘤細(xì)胞系C8161在每只小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的平均數(shù)量圖。
圖5為人類神經(jīng)纖維網(wǎng)素cDNA的核苷酸序列。[SEQ ID NO33]。
圖6為大鼠神經(jīng)纖維網(wǎng)素cDNA的核苷酸序列。[SEQ ID NO34]。
圖7為小鼠神經(jīng)纖維網(wǎng)素cDNA的核苷酸序列。[SEQ ID NO35]。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及與哺乳動物神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA互補的寡核苷酸，該寡核苷酸可調(diào)控細(xì)胞生長。
神經(jīng)纖維網(wǎng)素為血管內(nèi)皮生長因子或VEGF的受體。已發(fā)現(xiàn)VEGF可調(diào)控腫瘤誘發(fā)的血管生成。神經(jīng)纖維網(wǎng)素也可在腫瘤衍生的細(xì)胞中高度表達(dá)，如MDA-MD-231乳癌細(xì)胞和組織培養(yǎng)細(xì)胞如Hela和NIH 3T3細(xì)胞。此點表示，除了其在刺激血管生成中的作用之外，神經(jīng)纖維網(wǎng)素可能以一種自體分泌的形式來增強腫瘤細(xì)胞存活，分化或游動性而作為腫瘤細(xì)胞本身的VEGF活性的唯一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物。另一種可能性則是神經(jīng)纖維網(wǎng)素可能具有儲存或螯合的功能。定義本文中采用下列名詞的定義如下本文使用的“反義寡核苷酸”一詞是指與所要的mRNA互補的核苷酸序列。優(yōu)選的是，該反義寡核苷酸與哺乳動物神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA或VEGF165R mRNA中可有效地作為抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素表達(dá)的靶的部分互補。該反義寡核苷酸應(yīng)可與mRNA任何5′非翻譯區(qū)域，該mRNA的編碼區(qū)域或3′非翻譯區(qū)域互補。最優(yōu)選的是，該反義寡核苷酸與述于圖5的核苷酸序列互補。
在不受限于任何理論或反應(yīng)機理的情形下，一般認(rèn)為反義寡核苷酸的活性取決于該寡核苷酸與其靶核酸的結(jié)合(例如，與至少一段基因組區(qū)域，基因或其mRNA轉(zhuǎn)錄本結(jié)合)，從而以雜交扣留的方式或以使用RNA酶H破壞靶RNA的方式破壞靶的功能(當(dāng)與RNA雜交時活化RNA酶H的能力)，進(jìn)而抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素表達(dá)。
“寡核苷酸”一詞是指由天然堿基、糖，和糖間(主鏈)鍵組成的核苷酸的寡聚物或聚合物或核苷單體。該名詞也包括經(jīng)修飾或經(jīng)取代的寡聚物，其包含功能類似的非天然單體或其部分。此類經(jīng)修飾或經(jīng)取代的寡聚物在如增強細(xì)胞吸收，或在核酸酶存在下增加穩(wěn)定性等性質(zhì)上可能優(yōu)于天然存在的形式。本名詞也包括嵌合型寡核苷酸，具包含兩個或多個化學(xué)性不同的區(qū)域。例如，嵌合型寡核苷酸可包含至少一個可提供有益性質(zhì)(例如，增加核酸酶抗性，增加細(xì)胞吸收)的經(jīng)修飾的核苷酸的區(qū)域，或者兩個或多個本發(fā)明的寡核苷酸可連接形成嵌合型寡核苷酸。
本發(fā)明的反義寡核苷酸可以是核糖核酸或脫氧核糖核酸，而且可包含天然或合成的堿基單體，其包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶。寡核苷酸也可包含經(jīng)修飾的堿基如黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-甲基，2-丙基及其它烷基的腺嘌呤，5-鹵代尿嘧啶，5-鹵代胞嘧啶，6-氮雜尿嘧啶，6-氮雜胞嘧啶及6-氮雜胸腺嘧啶，假尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，8-鹵代腺嘌呤，8-氨基腺嘌呤，8-巰基腺嘌呤，8-巰基烷基腺嘌呤，8-羥基腺嘌呤及其它8-取代的腺嘌呤、8-鹵代鳥嘌呤、8-氨基鳥嘌呤，8-巰基鳥嘌呤，8-硫烷基鳥嘌呤，8-羥基鳥嘌呤及其它8-取代的鳥嘌呤，其它氮雜和去氮雜尿嘧啶，胸腺嘧啶，胞嘧啶或鳥嘌呤，5-三氟甲基尿嘧啶及5-三氟胞嘧啶。該修飾作用也可包括附接其它化學(xué)基團(tuán)，如甲基，乙基，丙基至該寡核苷酸不同部位，包括糖，堿基或主鏈成分。
本發(fā)明反義寡核苷酸也可在磷酸主鏈，短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間鍵中包含經(jīng)修飾的磷氧雜原子。例如，該反義寡核苷酸可包含膦酸甲酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，和嗎啉代寡聚物。該反義寡核苷酸可在連接4至6個3′-末端核苷酸之間包含硫代磷酸酯鍵。該硫代磷酸酯鍵可連接所有核苷酸。硫代磷酸酯鍵可為混合的RP及SP對映異構(gòu)體，或可為呈RP或SP型的立體規(guī)整型或幾近立體規(guī)整型。
反義寡核苷酸也可具有糖擬似物。該寡核苷酸可具有至少一個核苷酸，其包含經(jīng)修飾的堿基和/或糖，如2′-O-取代的核糖核苷酸。為了本發(fā)明的目的，“2′-O-取代的”一詞意指戊糖部分的2′位置經(jīng)一個含1-6個飽和或未飽和碳原子的-O-低級烷基取代，或經(jīng)一個含有2-6個碳原子的-O-芳基或烯丙基取代，其中該烷基，芳基或烯丙基可未取代或經(jīng)取代，例如經(jīng)鹵素，羥基，三氟甲基，氰基，硝基，?；Ｑ趸?，烷氧基，羧基，烷氧羰基，或氨基取代。本發(fā)明的寡核苷酸可在其5′末端含4或5個2′-O-烷基化的核糖核苷酸和/或于其3′末端包含4或5個2′-O-烷基化的核糖核苷酸。
本發(fā)明的反義寡核苷酸也可包含核苷酸類似物，其中核苷酸的架構(gòu)發(fā)生了根本上的改變。此類核苷酸類似物的實例為肽核酸(PNA)，其中該DNA的脫氧核糖(或RNA的核糖)磷酸主鏈改換為類似肽中主鏈的聚酰胺主鏈(Nielsen等29；Good和Nielsen30；Buchardt，已故，等31，美國專利5,766,855；Buchardt，已故，等32，美國專利5,719,262)。PNA類似物已證實對酶的降解具有抗性，可于活體內(nèi)及活體外延長其壽命。由于PNA股與DNA股之間缺少電荷相斥力，因此PNAs與互補DNA序列的結(jié)合力比與天然核酸分子的結(jié)合力強。
本發(fā)明寡核苷酸也可包括其它含有聚合物主鏈，環(huán)狀主鏈，或者無環(huán)主鏈的核苷酸。例如，該核苷酸可包含嗎啉代主鏈架構(gòu)(美國專利5,034,50633)。
本發(fā)明寡核苷酸當(dāng)經(jīng)過修飾而不致被DNA及RNA核酸酶降解，或置入一種運輸媒體中以保護(hù)寡核苷酸免于受到DNA或RNA核酸酶降解時，則具有“核酸酶抗性”。核酸酶抗性寡核苷酸包括例如膦酸甲酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，和嗎啉代寡聚物。賦予核酸酶抗性的適當(dāng)運輸媒體包括例如脂質(zhì)體。
本發(fā)明寡核苷酸也可包含化學(xué)基團(tuán)，如用于改進(jìn)寡核苷酸藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)，或用于改進(jìn)寡核苷酸藥物動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)。
該反義寡核苷酸選自與神經(jīng)纖維網(wǎng)素基因互補的序列。優(yōu)選的是，該序列在形成雙螺旋體，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和均寡聚物/序列重復(fù)段等方面具有最小的可能性，但對結(jié)合神經(jīng)纖維網(wǎng)素基因序列則具有高至中度的潛力。這些性質(zhì)可使用計算機模仿程序OLIGO引物分析軟件，第5版[由國家生物科學(xué)公司(National Biosciences，Inc.，普里茅斯，麻塞諸塞州)發(fā)行]測定。此計算機程序可定性估測該5項參數(shù)。
或者，該反義寡核苷酸也可根據(jù)對于兩種或多種哺乳動物之間的神經(jīng)纖維網(wǎng)素基因來說該序列高度保守來選擇。這些性質(zhì)可使用威斯康辛大學(xué)計算機組(GCG)軟件(Devereux J.等人35)的BLASTN程序(Altschul，等人34)以及國家生物科學(xué)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫來確定。
該反義寡核苷酸可包括突變，例如取代，插入和缺乏。優(yōu)選的是具有突變的序列少于10％。
該反義寡核苷酸一般包含至少約3個核苷酸或核苷酸類似物，優(yōu)選包含至少約5個核苷酸，更優(yōu)選至少約7個核苷酸，更優(yōu)選至少約9個核苷酸，最優(yōu)選至少約20個核苷酸。該反義寡核苷酸少于約100個核苷酸或核苷酸類似物較佳，少于約50個核苷酸或核苷酸類似物更佳，少于約35個核苷酸或核苷酸類似物最佳。
優(yōu)選的是，該反義寡核苷酸包含下表1所示的序列。
表1具有與人類神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA互補的序列的反義寡核苷酸
表1的反義寡核苷酸選自與人類神經(jīng)纖維網(wǎng)素/VEGF165R mRNA互補的序列，使該序列形成雙螺旋體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)和均寡聚物/序列重復(fù)段的可能性最小，但與神經(jīng)纖維網(wǎng)素/VEGF165R mRNA序列結(jié)合的潛力高。此外，可避免錯誤導(dǎo)向人類及小鼠中其它經(jīng)常出現(xiàn)或重復(fù)的序列。這些性質(zhì)是采用計算機模仿程序OLIGO引物分析軟件，第5版(由國際生物科學(xué)公司，普里茅斯，麻塞諸塞州發(fā)行)測定。
表1的“Tm”是指根據(jù)其最近鄰熱力學(xué)值計算的寡核苷酸雙螺旋的熔點。在此溫度下50％的核酸分子維持雙螺旋，50％的核酸分子變性。該“ΔG”是寡核苷酸的自由能，其為寡核苷酸雙螺旋穩(wěn)定性的測定值。
“烷基”一詞指碳原子數(shù)優(yōu)選為1至20個，更優(yōu)選為1至6個的單價烷基。此名詞的實例如甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，正己基，及其類似物。
“芳基”一詞是指6至14個碳原子的不飽和芳香族碳環(huán)基，具有單環(huán)(例如苯基)或多重縮合(稠合)環(huán)(例如，萘基或蒽基)。優(yōu)選的芳基包括苯基，萘基及其類似物。
“鹵”或“鹵素”一詞指氟、氯、溴和碘，優(yōu)選氟或氯。
關(guān)于上列包含一個或多個取代基的任何基團(tuán)，應(yīng)該理解此類基團(tuán)當(dāng)然不包含立體結(jié)構(gòu)上不實際和/或不可能合成的任何取代或取代形式。此外，本發(fā)明化合物包括所有因此類化合物取代所產(chǎn)生的立體化學(xué)異構(gòu)體。
“藥物上可接受的”一詞指一種無毒材料，其不干擾該活性成分的生物活性的有效性。該材料可與生物系統(tǒng)如細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或生物體相容。
術(shù)語“藥物上可接受的鹽”指可維持本發(fā)明反義寡核苷酸的生物有效性及性質(zhì)而且不是生物學(xué)上或其它方面不需要的鹽。在許多情況下，本發(fā)明反義寡核苷酸可因含有氨基和/或羧基或其它類似基團(tuán)而形成酸式鹽和/或堿式鹽。
藥物上可接受的堿加成鹽可由無機和有機堿制備。衍生自無機堿的鹽包括例如鈉、鉀、鋰、銨，鈣及鎂鹽。衍生自有機堿的鹽包括(但不限于)伯、仲和叔胺類的鹽，例如烷基胺，二烷基胺，三烷基胺，取代的烷基胺，二(取代的烷基)胺，三(取代的烷基)胺，鏈烯基胺，二鏈烯基胺，三鏈烯基胺，取代的鏈烯基胺，二(取代的鏈烯基)胺，三(取代的鏈烯基)胺，環(huán)烷基胺，二(環(huán)烷基)胺，三(環(huán)烷基)胺，取代的環(huán)烷基胺，二取代環(huán)烷基胺，三取代環(huán)烷基胺，環(huán)烯基胺，二(環(huán)烯基)胺，三(環(huán)烯基)胺，取代的環(huán)烯基胺，二取代環(huán)烯基胺，三取代環(huán)烯基胺，芳基胺，二芳基胺，三芳基胺，雜芳基胺，二雜芳基胺，三雜芳基胺，雜環(huán)基胺，二雜環(huán)基胺，三雜環(huán)基胺，混合的二胺及三胺類，其中該胺類至少有兩個選自下列的不同取代基烷基，取代烷基，烯基，取代的烯基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，環(huán)烯基，取代環(huán)烯基，芳基，雜芳基，雜環(huán)基，及其類似物。其也包括胺類，其中2或3個取代基與氨基氮一起形成雜環(huán)或雜芳基。
適宜的胺類實例包括例如異丙胺，三甲胺，二乙胺，三(異丙基)胺，三(正丙基)胺，乙醇胺，2-二甲氨基乙醇，三甲醇氨基甲烷，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，咖啡因，普魯卡因，哈胺，膽堿，甜菜堿，乙二胺，葡糖胺，N-烷基葡糖胺，可可堿，嘌呤，哌嗪，哌啶，嗎啉，N-乙基哌啶，及其類似物。也應(yīng)該理解，其它羧酸衍生物將適用于本發(fā)明，例如，羧酸酰胺，包括甲酰胺，低級烷基甲酰胺，二烷基甲酰胺，及其類似物。
藥物上可接受的酸加成鹽可由無機及有機酸制備。衍生自無機酸的鹽類包括鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，及其類似物的鹽類。衍生自有機酸的鹽類包括乙酸，丙酸，羥基乙酸，丙酮酸，草酸，蘋果酸，丙二酸，琥珀酸，馬來酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，對-甲苯磺酸，水楊酸，及其類似物的鹽類。
“神經(jīng)纖維網(wǎng)素基因”一詞指可編碼能夠作為信號素或者VEGF受體的蛋白質(zhì)的任何基因。優(yōu)選的是，此神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA的序列基本上類似于圖5，6或7所示的序列。
“互補”一詞意指該反義寡核苷酸序列可與其靶序列，即該神經(jīng)纖維網(wǎng)素基因(或mRNA)結(jié)合。優(yōu)選的是，該反義寡核苷酸在生理條件下與該核酸序列結(jié)合，例如，經(jīng)由華生-克里克(Watson-Crick)堿基配對法(寡核苷酸與單股核酸間的相互作用)或經(jīng)由胡斯丁(Hoogsteen)堿基配對法(寡核苷酸及雙股核酸間的相互作用)或者經(jīng)由任何其它方法，包括若寡核苷酸與RNA結(jié)合，則形成假結(jié)。經(jīng)由華生-克里克或胡斯丁堿基配對法，在生理條件下的結(jié)合實際是通過觀察核酸序列功能的干擾情形來測定的。
該反義寡核苷酸序列與靶序列具有至少75％同一性較佳，以至少90％同一性更佳，以與靶序列具有至少95％同一性最佳，其僅容許少數(shù)堿基缺口或堿基錯配。同一性的測定可以使用例如威斯康辛大學(xué)計算機組(GCG)軟件的BLASTN程序。該反義寡核苷酸序列與神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA雜交的熔點優(yōu)選為至少45℃，更優(yōu)選為至少約50℃，最優(yōu)選為至少約55℃，此熔點是使用本文所述的OLIGO引物分析軟件程序第5版所確定的。
“抑制生長”一詞指使至少一種腫瘤細(xì)胞型態(tài)的生長受到至少10％的減少或抑制，以至少50％更佳，以至少75％最佳。腫瘤細(xì)胞生長減少的測定可以測量該腫瘤于裸鼠中的大小或者該腫瘤細(xì)胞于活體外無法形成集落的能力的方式進(jìn)行。
“抑制血管生成”一詞指減少或抑制新血管生成。此可使用本領(lǐng)域已知的方法測定。一種氧誘發(fā)視網(wǎng)膜新血管生成的小鼠模型已經(jīng)確立，處理組動物的發(fā)生率為100％，且可以定量(45，46)。使用此模型可測定神經(jīng)纖維網(wǎng)素的抑制與視網(wǎng)膜新血管生成的抑制之間的相關(guān)性。也可由Northern印跡法及原位雜交分析法測定神經(jīng)纖維網(wǎng)素表達(dá)水平的變化來確認(rèn)此結(jié)果。
“抑制轉(zhuǎn)移”一詞指減少或抑制發(fā)展成轉(zhuǎn)移性腫瘤的數(shù)目，以至少10％較佳，以至少50％更佳。其可采用述于實施例中的方法和本領(lǐng)域中已知的其它方法測定。
“抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素的表達(dá)”一詞指當(dāng)對細(xì)胞施用反義寡核苷酸時，其可降低神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA的水平或由細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)纖維網(wǎng)素蛋白質(zhì)的水平。
“哺乳動物”一詞意指所有哺乳動物，包括人類，羊，牛，馬，豬、狗、貓、及小鼠等，優(yōu)選的是指人類。
“疑有腫瘤的哺乳動物”意指該哺乳動物可能具有增生病變或腫瘤，或者已被診斷具有增生病變或腫瘤，或過去曾被診斷患有增生病變或腫瘤，但該腫瘤已手術(shù)割除而該哺乳動物仍疑似潛藏一些殘存的腫瘤細(xì)胞。反義寡核苷酸的制備本發(fā)明反義寡核苷酸可利用傳統(tǒng)及熟知的技術(shù)制備。例如，該寡核苷酸可使用固相合成方法制備，特別是使用可購得的儀器如由加拿大應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Mississauga，加拿大)所銷售的儀器。該寡核苷酸也可使用本領(lǐng)域中已知的方法，以酶解天然存在的神經(jīng)纖維網(wǎng)素基因而制備。
這些寡核苷酸可使用本領(lǐng)域已知的方法制備，如氨基磷酸酯或者氫膦酸酯化學(xué)制備，其可以人工進(jìn)行或以自動合成儀器執(zhí)行(如烏曼(Uhlmann)等人(43)及阿格瓦(Agrawal)等人(44)所述)。反義寡核苷酸的分離及純化本文所述的反義寡核苷酸的分離及純化若需要時可以任何合適的分離或純化方法進(jìn)行，如，例如過濾，萃取、結(jié)晶，柱層析，薄層層析，厚層層析，制備型低壓或高壓液相層析，或者上述方法的組合。然而，其它等同的分離方法當(dāng)然也可采用。
可根據(jù)該反義寡核苷酸的序列并使用本領(lǐng)域中已知的步驟構(gòu)建包含該反義寡核苷酸序列的表達(dá)載體。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可構(gòu)建載體，使包含達(dá)到該反義寡核苷酸序列所需要的轉(zhuǎn)錄作用所需的所有表達(dá)元件。因此，本發(fā)明提供的載體包括一段轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，其與一段編碼反義寡核苷酸的序列操縱性地連接。適宜的轉(zhuǎn)錄及翻譯元件可來自不同來源，包括細(xì)菌，真菌，病毒，哺乳動物或昆蟲基因。適當(dāng)元件的選擇乃是根據(jù)所選用的宿主細(xì)胞而定。
報道基因可包括于此載體中。適宜的報道基因包括β-半乳糖苷酶(例如lacZ)，氯霉素、乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢火蟲螢光素酶，或免疫球蛋白或其部分。可以追蹤該報道基因的表達(dá)來監(jiān)控該反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)錄。
該載體可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的眾多方法中的任一種方法導(dǎo)入細(xì)胞或組織中。此類方法一般可見于Sambrook等人24；Ausubel等人25；張等人36；Vega等人37；以及“載體分子克隆載體及其應(yīng)用”38，并包括，例如，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染，脂轉(zhuǎn)染法，電穿孔法，及以重組病毒載體感染。
以感染方式導(dǎo)入核酸的作法提供幾個優(yōu)點。可得到較高效率及對組織型態(tài)的特異性。病毒主要于特定的細(xì)胞型態(tài)中感染及繁衍。因此，該病毒的特異性可使載體于活體內(nèi)或組織中或細(xì)胞的混合培養(yǎng)物中針對特定的細(xì)胞型態(tài)。病毒載體也可經(jīng)由特異性受體或配位體修飾，通過受體介導(dǎo)的事件改變靶特異性。
本發(fā)明寡核苷酸可為一種可裂解mRNA的核糖酶。該核糖酶最好具有與本發(fā)明寡核苷酸序列具同源性且具有裂解mRNA所必需的催化中心的序列。例如，可選用可破壞神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA的同源性核糖酶序列。本發(fā)明采用的核糖酶種類可選自本領(lǐng)域內(nèi)已知的種類。已鑒定出數(shù)種核糖酶結(jié)構(gòu)族群，包括第I組內(nèi)含子，RNA酶P，肝炎δ病毒核酶，錘頭核酶及源自煙葉環(huán)斑病病毒衛(wèi)星RNA(sTRSV)負(fù)鏈的發(fā)夾核酶(Sullivan 1994，美國專利5,225,34739)。錘頭核酶和發(fā)夾核酶基元最常用于基因療法中mRNA的反式切割(Sullivan 1994)。發(fā)夾核酶優(yōu)選用于本發(fā)明。一般而言，該核酶長度為30至100個核苷酸。
本發(fā)明寡核苷酸可以不溶解。例如，該寡核苷酸可結(jié)合于適宜的載體。適宜的載體實例為瓊脂糖，纖維素，葡聚糖，交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)，瓊脂糖(Sepharose)，羧甲基纖維素聚苯乙烯，濾紙，離子交換樹脂，塑膠膜，塑膠管，玻璃珠，多胺-甲基乙烯基醚-馬來酸共聚物，氨基酸共聚物，乙烯-馬來酸共聚物，尼龍，絲等。該載體可呈例如管狀，試驗板狀，珠狀物圓盤狀，球狀等。
該不溶的寡核苷酸的制法可采用已知的化學(xué)或物理方法，由該物質(zhì)與適宜的不溶性載劑反應(yīng)，例如，進(jìn)行溴化氰偶合法。藥物調(diào)配物當(dāng)反義寡核苷酸作為藥物使用時，該反義寡核苷酸通常以藥物組合物的形式進(jìn)行投藥。此類化合物可經(jīng)由數(shù)種途徑投藥，包括口服，直腸，透皮，皮下，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)及鼻內(nèi)。這些化合物以注射組合物或口服組合物形式皆有效。此類組合物乃依據(jù)藥物領(lǐng)域中熟知的方式制備，并且包含至少一種活性化合物。例如，該藥物組合物是經(jīng)靜脈內(nèi)投藥。該藥物組合物應(yīng)可直接投藥至欲治療的腫瘤中。
本發(fā)明也包括藥物組合物，其包含作為活性成分的一種或多種反義寡核苷酸與藥物上可接受的載體或賦形劑結(jié)合。制造本發(fā)明組合物時，活性成分通常與賦形劑混合，以賦形劑稀釋或封裝于此種載體中，此種載體可呈膠囊，小藥包，紙包或其它容器的形式。當(dāng)該賦形劑作為稀釋劑時，其可為固體，半固體或液體物質(zhì)，該物質(zhì)充當(dāng)活性成分的媒介物，載體或介質(zhì)。因此，該組合物可呈片劑，丸粒，粉劑，扁囊錠，小藥包，扁囊劑，酏劑，懸浮液，乳液，溶液，糖漿，氣霧劑(呈固體或含于液體介質(zhì)中)，軟膏(其包含例如至多10％(重量)的活性化合物)，軟及硬明膠膠囊，栓劑，無菌注射液，及無菌包裝粉劑。
在制備調(diào)配物時，可能需要研磨該活性化合物，以便在與其它成分混合以前提供適當(dāng)顆粒大小。若該活性化合物基本上不溶，通常研磨至小于200篩目的顆粒大小。如果活性化合物基本上是水溶性的，則一般通過研磨調(diào)節(jié)顆粒大小以提供于調(diào)配物中基本上均勻的分布，例如約40篩目。
一些適宜的賦形劑的實例包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，淀粉，阿拉伯樹膠，磷酸鈣，藻酸鹽，黃蓍膠，明膠，硅酸鈣，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素，無菌水，糖漿及甲基纖維素。該調(diào)配物可另外包括潤滑劑如滑石，硬脂酸鎂，及礦物油；潤溫劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑如羥基苯甲酸甲酯及丙酯；甜味劑；及調(diào)味劑。可使用本領(lǐng)域中已知的方法配制本發(fā)明的組合物，使之給患者服用后可提供迅速持久的或延遲的釋放。
該組合物最好配制成單位劑型，每一劑量包含約1％至約95％，更常用約5％至約90％的活性成分?！皢挝粍┬汀币辉~指作為單一劑量適于人類對象和其它哺乳動物的物理性不連續(xù)單位，每一單位包含預(yù)先計算確定可產(chǎn)生所需療效的用量的活性物質(zhì)，與適宜的藥物賦形劑組合。
該反義寡核苷酸的有效劑量范圍相當(dāng)廣，而且一般以藥物有效量服用。有效量即當(dāng)施藥時可緩解癥狀的量。該有效量優(yōu)選為可抑制腫瘤細(xì)胞生長的量。該有效量以約0.1毫克/公斤體重至約20毫克/公斤體重為宜。然而應(yīng)該理解，實際上反義寡核苷酸的投藥劑量將由醫(yī)師根據(jù)有關(guān)條件決定，包括欲治療的病癥，選擇的投藥途徑，實際投藥的化合物，個別患者的年齡，重量，及反應(yīng)，患者癥狀的嚴(yán)重性，等等。療程可能持續(xù)數(shù)天至數(shù)個月或直至達(dá)到減輕該疾病的目的。該反義寡核苷酸可與其它已知療法合并投藥。當(dāng)與一種或多種其它療法共同投藥時，該寡核苷酸可與其它治療藥物同時投藥，也可依次投藥。若依次投藥，負(fù)責(zé)的醫(yī)師將決定施用該寡核苷酸與其它療法并用的適當(dāng)順序。
制備固體組合物如片劑時，由主要活性成分/反義寡核苷酸與藥物賦形劑混合，形成固體預(yù)配制組合物，其包含本發(fā)明化合物的均勻混合物。當(dāng)提及這些預(yù)配制組合物為均質(zhì)時，其意指該活性成分乃均勻分布于該組合物中，以致可以將該組合物容易地再分成同等有效的劑型例如片劑，丸粒及膠囊。
本發(fā)明片劑或丸?？赏扛舶禄蛄硗鈴?fù)合成可提供延長作用的優(yōu)點的劑型。例如，該片劑或丸粒可包含內(nèi)部劑量及外部劑量成分，后者為前者的包膜形式。此二種成分可以腸溶性涂層分隔，該腸溶性涂層用于抵抗在胃中崩解并且容許該內(nèi)部成分完整地通過直達(dá)十二指腸或得以延后釋出。多種物質(zhì)皆可用于此類腸溶性涂層或包衣，此類物質(zhì)包括數(shù)種聚合性酸和聚合性酸與如蟲膠，鯨蠟醇，和纖維素乙酸酯的混合物。
包含本發(fā)明新穎組合物的可供口服或注射用的液體劑型包括水溶液，適當(dāng)調(diào)味的糖漿，水性或油性懸浮液，及用食用油如玉米油，棉籽油，芝麻油，椰子油或花生油，以及酏劑和類似的藥物媒介物的加味乳液。
用于吸入或吹入的組合物包括含在藥物上可接受的水性或有機溶劑中或其混合物中的溶液和懸浮液，及粉劑。該液體或固體組合物可能包含本文所述的適當(dāng)?shù)乃幬锷峡山邮艿馁x形劑。該組合物優(yōu)選經(jīng)口或鼻呼吸管道投藥，以達(dá)到局部或全身效果。最好含在藥物上可接受的溶劑中的組合物可使用惰性氣體制成噴霧劑。噴霧溶液可由噴霧器直接吸入或可將該噴霧器附接于面罩蓬或間歇性正壓力呼吸機上。溶液，懸浮液或粉劑組合物可使用于適當(dāng)方式傳送調(diào)配物的裝置投藥，優(yōu)選的是經(jīng)由口腔或鼻腔投藥。
本發(fā)明藥物組合物可呈脂質(zhì)體形式，其中寡核苷酸除了與其它的藥物上可接受的載體組合外，還與親兩性劑如脂質(zhì)組合，該脂質(zhì)以聚集形式如膠束，不溶性單層，液晶或于水溶液中的薄片層存在。適合脂質(zhì)體調(diào)配物的脂質(zhì)包括(但不限于)單酸甘油酯，二酸甘油酯，硫酸腦苷脂，脫脂酸卵磷脂，磷脂，皂角苷，膽汁酸及其類似物。一種特別有用的脂質(zhì)載體為脂轉(zhuǎn)染試劑。此類脂質(zhì)體調(diào)配物的制法在本領(lǐng)域技藝范圍內(nèi)，例如，國際專利WO97/21808(28)。該藥物組合物可進(jìn)一步包括化合物如環(huán)糊精及其類似物，其可加強寡核苷酸傳送至細(xì)胞中或緩釋的聚合物中。
另一種適用于本發(fā)明方法的優(yōu)選調(diào)配物采用透皮傳送裝置(“貼劑”)。此類透皮貼劑可用于以控制量持續(xù)或間歇注入本發(fā)明的反義寡核苷酸。用于輸送藥劑的透皮貼劑的構(gòu)成及用法是本領(lǐng)域中熟知的。請參閱，例如，美國專利5,023,25240，該專利是以提及的方式并于本文。此類貼劑可構(gòu)成用于持續(xù)性傳送，脈沖式傳送或依需求傳送藥劑。
另一種優(yōu)選的傳送方法涉及以“短槍”傳送未包覆的反義寡核苷酸通過皮膚表層。“未包覆”的反義寡核苷酸的傳送是本領(lǐng)域中熟知的。請參閱，例如，F(xiàn)elgner等人，美國專利5,580,85941。在以“短槍”方式傳送該反義寡核苷酸以前，可將該反義寡核苷酸包裝在脂小泡中。
下列制劑實施例說明本發(fā)明代表性藥物組合物。
制劑實施例1制備包含下列成分的硬明膠膠囊成分用量(毫克/粒膠囊)活性成分 30.0淀粉 305.0硬脂酸鎂 5.0混合上述成分，并以每顆膠囊340毫克的量裝填至硬明膠膠囊中。
制劑實施例2使用下列成分制備片劑調(diào)配物成分用量(毫克/藥片)活性成分 25.0微晶纖維素200.0膠體二氧化硅 10.0硬脂酸5.0摻合上列成分并壓縮成片劑，每片重240毫克。
制劑實施例3制備包含下列成分的干粉吸入性調(diào)配物成分重量百分比(％)活性成分 5乳糖 95混合該活性成分及乳糖，并將混合物裝填至于粉吸入裝置中。
制劑實施例4依下列方法制備各含30毫克活性成分的片劑成分用量(毫克/藥片)活性成分 30.0毫克淀粉 45.0毫克微晶纖維素35.0毫克聚乙烯吡咯烷酮4.0毫克(含在無菌水中的10％水溶液)羥甲基淀粉鈉 4.5毫克硬脂酸鎂 0.5毫克滑石1.0毫克總共 120毫克使活性成分，淀粉及纖維素通過20號篩目美國濾網(wǎng)過篩并均勻混合。將聚乙烯吡咯烷酮溶液和所形成的粉末混合，然后通過16號篩目美國濾網(wǎng)過篩。將所產(chǎn)生的顆粒置于50℃至60℃間干燥，通過16號篩目美國濾網(wǎng)過篩。將羧甲基淀粉鈉，硬脂酸鎂及滑石預(yù)先通過30號篩目美國濾網(wǎng)過篩，然后加入至前述顆粒中，混合后，以制片機壓縮成片劑，每片重120毫克。
制劑實施例5依下列方式制備每顆含40毫克藥物的膠囊成分用量(毫克/膠囊)活性成分 40.0毫克淀粉 109.0毫克硬脂酸鎂1.0毫克總共 150毫克摻合該活性成分，淀粉及硬脂酸鎂，通過20號篩目的美國濾網(wǎng)過篩，以每顆150毫克的量裝填至硬明膠膠囊中。
制劑實施例6依下列方式制備每顆包含25毫克活性成分的栓劑成分?jǐn)?shù)量活性成分 25毫克飽和脂肪酸甘油酯，加至2,000毫克該活性成分通過60號篩目美國濾網(wǎng)過篩并使其懸浮于預(yù)先使用最低溫熔化的飽和脂肪酸甘油酯中。然后將該混合物倒入公稱2.0克容量的栓劑模具中，并使之冷卻。
制劑實施例7依下列方法制備每5.0毫升包含50毫克藥物的懸浮液成分用量活性成分 50.0毫克黃原膠4.0毫克羧甲基纖維素鈉(11％) -微晶纖維素(89％) 50.0毫克蔗糖 1.75克苯甲酸鈉 10.0毫克香料及色素適量純水加至 5.0毫升摻合該活性成分，蔗糖及黃原膠，通過10號篩目的美國濾網(wǎng)過篩，然后與由微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉預(yù)先制成的水溶液混合。使用部分水稀釋苯甲酸鈉，香料及色素并且一邊攪拌一邊添加。最后添加足量水，達(dá)到所需體積。
制劑實施例8成分用量(毫克/粒膠囊)活性成分 15.0毫克淀粉 407.0毫克硬脂酸鎂 3.0毫克總共 425.0毫克摻合該活性成分、淀粉及硬脂酸鎂，通過20號篩目的美國濾網(wǎng)過篩，并以每顆425.0毫克的量裝填至硬明膠膠囊中。
制劑實施例9依下列方法制備調(diào)配物成分用量活性成分 5.0毫克玉米油1.0毫升制劑實施例10依下列方法制備局部調(diào)配物成分用量活性成分 1-10克乳化用蠟 30克液體石蠟 20克白色軟石蠟加至100克加熱白色軟石蠟至熔化。將該液體石蠟與乳化用蠟合并并攪拌直至溶解。添加該活性成分并且持續(xù)攪拌直至分散。冷卻該混合物直至固化。
其它適用于本發(fā)明的調(diào)配物可見于“雷氏藥物科學(xué)”23一書(Remington’s Pharmaceutical Sciences23)。
該反義寡核苷酸或包含該反義寡核苷酸的藥物組合物可包裝至便利的試劑盒，此試劑盒提供裝填至適宜的容器所需要的材料。
呈醫(yī)療調(diào)配物形式的本發(fā)明的反義寡核苷酸適用于治療與血管生成和新血管生成相關(guān)的疾病和病變及病癥，其包括(但不限于)視網(wǎng)膜新血管生成及腫瘤生長。此類方法中，將抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素表達(dá)的有效治療劑量的寡核苷酸投藥給細(xì)胞。此細(xì)胞可為細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物的一部分，或是哺乳動物，如人類的整個軀體。
本發(fā)明寡核苷酸及核酶可調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長。因此，所提供用于干擾或抑制哺乳動物腫瘤細(xì)胞生長的方法包括利用本發(fā)明反義寡核苷酸與腫瘤或腫瘤細(xì)胞接觸。在未受于理論或反應(yīng)機理限制下，據(jù)信該反義寡核苷酸可以兩種方式抑制腫瘤生長。其可以自體分泌的方式直接作用于腫瘤細(xì)胞而抑制腫瘤生長。第二種方式或另外一種方式即該反義寡核苷酸可抑制與腫瘤生長有關(guān)的新血管生成，從而減少對腫瘤的血液供給。
“接觸”一詞指添加寡核苷酸，核酶等至細(xì)胞懸浮液或組織樣本，或直接或間接施用寡核苷酸等至動物體內(nèi)的細(xì)胞或組織。
這些方法可用于治療增生性病變，包括許多種不同型態(tài)的癌或腫瘤，如肉瘤，黑素瘤，腺瘤，實體組織癌瘤，缺氧性腫瘤，口腔，咽，喉及肺的鱗狀細(xì)胞癌瘤，泌尿生殖器癌，如子宮頸和膀胱癌，血癌，結(jié)腸癌，乳癌，胰腺癌，腎臟癌，腦癌，皮膚癌，肝癌，頭和頸癌，神經(jīng)系統(tǒng)癌，以及良性病變?nèi)缛轭^狀瘤。
這些方法可用于治療新血管病變，如糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)性視網(wǎng)膜病變和與年齡有關(guān)的斑點性退化。
本發(fā)明寡核苷酸也可用于治療抗藥性腫瘤?？顾幮阅[瘤實例為可抵抗如5-氟尿嘧啶，絲裂霉素C，氨甲蝶呤或羥脲的腫瘤和表達(dá)高含量P-糖蛋白的腫瘤，已知其對多種抗癌藥物如秋水仙素，長春花堿和阿霉素具有抗性；或如Dreeley等人42文中所述可表達(dá)多重抗藥性蛋白質(zhì)的腫瘤。因此，本發(fā)明寡核苷酸可并用或另外增加使用已知的抗癌化合物或化療劑?；焺┦强梢种颇[瘤生長的化合物。此類藥劑包括(但不限于)5-氟尿嘧啶，絲裂霉素C，胺甲蝶呤及羥脲?；焺┑耐端幜靠蔀橛行Я浚醋阋砸种颇[瘤生長的量，或少于有效量。
已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明寡核苷酸可減少轉(zhuǎn)移性腫瘤生長，如MDA-MB-231乳腺癌，HT-29結(jié)腸腺癌，A549肺癌，和A2058黑素瘤癌細(xì)胞。本發(fā)明的實施方案提供一種減少哺乳動物轉(zhuǎn)移性腫瘤生長的方法，包括施用一定量的與神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA互補的寡核苷酸，或示于表1的寡核苷酸。
本發(fā)明寡核苷酸可減少血管生成。本發(fā)明的一個實施方案提供治療新血管病變的方法。
該寡核苷酸可采用病毒載體或非病毒載體傳送。序列可并入盒或構(gòu)建體中，使本發(fā)明寡核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選該構(gòu)建體包含適宜的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，以使該寡核苷酸可于此細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。
因此，本發(fā)明提供一種載體，其包含一段與編碼本發(fā)明寡核苷酸的序列操縱性連接的轉(zhuǎn)錄控制序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供選自適當(dāng)真核及原核細(xì)胞的宿主細(xì)胞，使用這些載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
合適載體是已知的并且優(yōu)選包含達(dá)到序列所需的轉(zhuǎn)錄作用所必需的表達(dá)元件。噬菌粒為此類有益載體的具體實例，因為其可用作為質(zhì)粒載體或噬菌體載體。載體的實例包括病毒如噬菌體，桿狀病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，DNA病毒，脂質(zhì)體和其它重組載體。該載體也可包含用于原核宿主系統(tǒng)或真核宿主系統(tǒng)的元件。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道何種宿主系統(tǒng)可與特定載體相容。
該載體可經(jīng)由穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染，脂轉(zhuǎn)染法，電穿孔法及以重組病毒載體感染等方式導(dǎo)入細(xì)胞。
可在該載體中增加其它特征，以確保其安全性和/或增強其療效。此類特征包括，例如，能用于負(fù)選擇經(jīng)重組病毒感染的細(xì)胞的標(biāo)記物。此類負(fù)選擇標(biāo)記物的實例為TK基因，其對抗病毒性9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤具有敏感性。也包括限定于特定細(xì)胞型態(tài)中表達(dá)的特征。此類特征包括，例如，對所需細(xì)胞型態(tài)具有特異性的啟動子和調(diào)節(jié)元件。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為適用于活體內(nèi)導(dǎo)入所需核酸的另一個載體實例，因其提供如側(cè)感染和尋靶特異性等優(yōu)點。側(cè)感染為單感染細(xì)胞可藉以產(chǎn)生許多子代病毒粒子以感染毗鄰細(xì)胞的過程。其結(jié)果是大面積被迅速感染。
本發(fā)明方法所用的載體可根據(jù)尋靶所需的細(xì)胞型態(tài)選擇。例如，若治療乳癌，則可使用對表皮細(xì)胞具有特異性的載體。同樣地，若治療造血系統(tǒng)細(xì)胞，則對血液細(xì)胞具有特異性的病毒載體是優(yōu)選的。用途本發(fā)明反義寡核苷酸適用于多種用途。其可用于抑制哺乳動物細(xì)胞中神經(jīng)纖維網(wǎng)素基因的表達(dá)，其結(jié)果是抑制細(xì)胞生長。其可用于抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或新血管生成。該寡核苷酸可用作為雜交探針，以檢測哺乳動物細(xì)胞中神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA存在與否。當(dāng)采用該寡核苷酸作為探針時，可用合適的檢測基團(tuán)(如放射性同位素，配位體，特異性結(jié)合配對的另一成員，如，生物素)進(jìn)行標(biāo)記。最后，該寡核苷酸可用作為分子量標(biāo)記物。
為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明及其優(yōu)點，給出下列具體實施例，但它們并不以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求書的范圍。
實施例在下列實施例中，所有溫度均以攝氏溫度表示(除非另外指明)且所有百分比均為重量百分比(除非另外指明)。
在下列實施例中，下列縮寫的含義如下述。倘若某一縮寫未被定義，則是其普遍接受的含義。
AS ＝ 反義cDNA＝ 互補脫氧核糖核酸ODN ＝ 寡核苷酸μM ＝ 微摩爾濃度mM ＝ 毫摩爾濃度M ＝ 摩爾濃度ml ＝ 毫升μl ＝ 微升mg ＝ 毫克μg ＝ 微克PAGE＝ 聚丙烯酰胺凝膠電泳rpm ＝ 每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)ΔG ＝ 自由能，寡核苷酸雙螺旋穩(wěn)定性的量度kcal＝ 千卡FBS ＝ 胎牛血清DTT ＝ 二硫蘇糖醇SDS ＝ 十二烷基硫酸鈉PBS ＝ 磷酸鹽緩沖生理食鹽水PMSF＝ 苯甲基磺酰氟GAPDH ＝ 3-磷酸甘油醛脫氫酶IgG ＝ 免疫球蛋白GkDa ＝ 千道爾頓PCR ＝ 聚合酶鏈反應(yīng)Tris-HCl＝ 三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸TRIzol ＝ 總RNA分離試劑VEGF＝ 血管內(nèi)皮生長因子分子生物學(xué)一般方法本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)和未明確說明的分子生物技術(shù)一般是依照Sambrook等人24；Ausubel等人25；和Perbal26等人著作的說明進(jìn)行的。寡核苷酸該反義寡核苷酸選自與神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA互補的序列，此類序列形成雙螺旋，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和均寡聚物/序列重復(fù)的可能性最小，但具有高潛力可結(jié)合神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA序列。此外，也避免錯誤導(dǎo)向人類和小鼠中其它常常出現(xiàn)的或重復(fù)的序列。此類性質(zhì)是使用計算機模仿程序OLIGO引物分析軟件，第5版(國際生物科學(xué)公司，普里茅斯，麻塞諸塞州)測定的。根據(jù)此分析法設(shè)計了硫代磷酸酯反義寡核苷酸，然后依據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制造。細(xì)胞系自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)取得七種不同的人類癌細(xì)胞系包括肺癌(A549)，黑素瘤(C8161)，乳細(xì)胞腺癌(MDA-MB-231)，轉(zhuǎn)移性胰腺癌(AsPC-1)，結(jié)腸腺癌(HT-29)，人類黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058，人類胰腺癌PC3。這些細(xì)胞系維持在補充了10％胎牛血清(FBS)的α-MEM培養(yǎng)基(Bibco BRL，蓋瑟斯堡，馬里蘭州)中。實施例1 與神經(jīng)纖維網(wǎng)素互補的反義寡核苷酸對癌細(xì)胞系生長的抑制采用過去曾說明的方法(Choy等人18)估測經(jīng)過不同反義寡核苷酸處理后的癌細(xì)胞系的集落形成能力。具體地說，取等分的腫瘤細(xì)胞懸浮液接種至60毫米組織培養(yǎng)皿中，密度約1×104個，并且在補充了10％FBS的α-MEM培養(yǎng)基中，于37℃溫育過夜。細(xì)胞以5ml PBS洗滌一次，并且于陽離子性脂質(zhì)(脂轉(zhuǎn)染試劑，終濃度，5μg/ml，Gibco-BRL，蓋瑟斯堡，馬里蘭州)存在下，以0.2μM指定的反義寡核苷酸處理4小時。以PBS清洗該細(xì)胞一次清除該反義寡核苷酸，而后將該細(xì)胞置于生長培養(yǎng)基(補充了10％ FBS的α-MEM培養(yǎng)基)中于37℃下培養(yǎng)7至10天。細(xì)胞集落以亞甲基藍(lán)染色并通過直接計數(shù)評分(如Choy等人18以及Huang和Wright20所述)。抑制百分比的計算法是與在不含反義寡核苷酸下生長的細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的集落數(shù)比較而得。所有的實驗均重復(fù)4次。
該反義寡核苷酸對人類腫瘤細(xì)胞系的集落形成能力產(chǎn)生抑制效應(yīng)。每種反義寡核苷酸的抑制百分比示于圖1A為人類黑素瘤細(xì)胞系C8161；圖1B為人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549；圖1C為人類黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058；圖1D為人類結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29；圖1E為人類前列腺癌細(xì)胞系PC-3；及圖1F為人類胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1。實施例2 經(jīng)與神經(jīng)纖維網(wǎng)素互補的反義寡核苷酸處理后降低的mRNA含量將人類黑素瘤癌細(xì)胞(A2058)或乳癌細(xì)胞(MDA-MB-231)培養(yǎng)至70％-80％的次融合程度，而后于陽離子性脂質(zhì)(脂轉(zhuǎn)染試劑，終濃度5μg/ml，Gibco-BRL)和Opti-MEM(Gibco-BRL)的存在下，以0.2μM與神經(jīng)纖維網(wǎng)素互補的硫代磷酸酯反義寡核苷酸處理4小時。以PBS清洗細(xì)胞一次，并置于含10％FBS的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco-BRL)中溫育16小時。使用TRIzol試劑(Gibco-BRL)制備總RNA并依Hurta和Wright(27)文中所述的方法經(jīng)過少許修改，進(jìn)行Northern印跡分析法。該印跡與正向引物(5′-CGC TCC CGC CTG AAC TAC CC-3′)[SEQID NO31]，反向引物(5′-TCC CAC CCT GAA TGA TGA TG-3′)[SEQID NO32]，并使用人類直腸結(jié)腸腺癌5′-延伸段加上cDNA文庫(Clonetech，帕洛阿圖，加州)作為模板合成32P標(biāo)記的598個堿基對的PCR片段雜交。人類神經(jīng)纖維網(wǎng)素/VEGF165R mRNA表達(dá)為約7kb核苷酸轉(zhuǎn)錄本(Soker等人9)。在雜交前，利用亞甲基藍(lán)染色印跡證實等量RNA荷載。
圖2A和2B顯示該反義寡核苷酸降低神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA含量至對照組細(xì)胞的至少50％。實施例3 以與神經(jīng)纖維網(wǎng)素互補的反義寡核苷酸靜脈處理對小鼠體內(nèi)人類腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用CD-1無胸腺裸鼠購自查理士河實驗室(蒙特晏，加拿大)。將HT-29人類結(jié)腸癌細(xì)胞(一般為3×106個細(xì)胞含于100μl PBS中)皮下注射至6-7周大的CD-1無胸腺裸鼠的右肋中。每一實驗組包括5只小鼠。在腫瘤大小達(dá)到體積約100立方毫米后(一般為注射腫瘤細(xì)胞5日后)，采用大丸劑輸注施用該反義寡核苷酸GTI3602[SEQ ID NO2]至其尾靜脈，每隔一天10mg/kg劑量。對照組動物在相同時段僅接受生理食鹽水。此后一般持續(xù)處理14天。
圖3A顯示該反義寡核苷酸GTI3602對CD-1裸鼠中HT-29腫瘤生長的影響。以腫瘤體積受抑制程度估算抗腫瘤活性，腫瘤體積是在14天的期間內(nèi)平均每隔兩天以測徑器測量的。圖中每一點代表每個實驗組中5只小鼠計算得到的平均腫瘤體積。采用協(xié)方差分析來比較各處理組內(nèi)小鼠于一段時間內(nèi)的回歸曲線。當(dāng)斜率均相等時，由該分析衍生出同等斜率或同等截距的特定假說。所有分析均采用SAS(統(tǒng)計分析系統(tǒng))第6.12版。當(dāng)與生理食鹽水對照組比較時，施用該反義寡核苷酸抑制腫瘤生長的p值≤0.0001。
處理結(jié)束時(通常是在最后一次處理后24小時)處死該實驗動物，并測量腫瘤重量。圖3B出示腫瘤平均重量。該反義寡核苷酸顯示出對腫瘤生長的顯著抑制作用。采用單向方差分析比較處理組的平均值。若此組整體效應(yīng)非常顯著，則使用最小平方平均值進(jìn)行演繹多重比較，以發(fā)現(xiàn)具顯著差異的處理組對。當(dāng)比較腫瘤重量時，該反義寡核苷酸在統(tǒng)計學(xué)上也比生理食鹽水對照展現(xiàn)出顯著的抑制作用。實施例4 反義寡核苷酸對實驗性轉(zhuǎn)移的抑制作用依前述的方法(Fan等人，199610)估算經(jīng)過不同反義寡核苷酸處理的C8161人類黑素瘤細(xì)胞的實驗性轉(zhuǎn)移。取等分的細(xì)胞懸浮液以2×106的密度接種至100毫米的組織培養(yǎng)皿中并于補充了10％ FBS的α-MEM培養(yǎng)基中，于37℃下溫育過夜。以10ml PBS洗滌細(xì)胞一次，并于陽離子性脂質(zhì)(脂轉(zhuǎn)染試劑，終濃度5μg/ml，Gibco-BRL)存在下處理4小時。用PBS洗滌細(xì)胞一次以除去該反義寡核苷酸，然后以胰蛋白酶處理細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，將懸浮于0.1ml PBS中的約1×105個細(xì)胞注射到6-8周大的CD-1無胸腺雌性裸鼠的尾靜脈中。5周后估算肺腫瘤數(shù)目，切除各小鼠的肺后，以苦味酸染料溶液(75％苦味酸，20％甲醛，5％冰醋酸)染色。
圖4出示在以各種不同反義寡核苷酸處理腫瘤細(xì)胞后，于該雌性裸鼠體內(nèi)所減少的肺腫瘤數(shù)目。
權(quán)利要求
1.一種反義寡核苷酸，其約20個至約100個核苷酸，并且包括選自示于表1的SEQ ID NOs1-30的序列，該寡核苷酸可抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其進(jìn)一步包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
3.權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其進(jìn)一步包含其它不與神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA互補的核苷酸。
4.一種載體，其包含約20個至約100個核苷酸的寡核苷酸序列，該核苷酸序列包含選自示于表1的SEQ ID NOs1-30的序列，該寡核苷酸可抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素表達(dá)。
5.一種藥物組合物，其包括藥物上可接受的賦形劑及有效量的約20個至約100個核苷酸的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含選自于表1的SEQ ID NOs1-30的序列，該寡核苷酸可抑制神經(jīng)纖維網(wǎng)素表達(dá)。
6.一種抑制哺乳動物腫瘤生長的方法，包括對疑有腫瘤的哺乳動物施用有效量的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸的大小約3個至約100個核苷酸并且包含在抑制腫瘤生長的條件下與哺乳動物神經(jīng)纖維網(wǎng)素mRNA互補的序列。
7.權(quán)利要求6的方法，其進(jìn)一步包括對哺乳動物施用化療劑的步驟。
8.權(quán)利要求6的方法，其中該寡核苷酸包含選自示于表1的SEQID NOs1-30的序列。
9.權(quán)利要求6的方法，其中該寡核苷酸具有核酸酶抗性。
10.一種抑制哺乳動物腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，包括對疑有轉(zhuǎn)移性腫瘤的哺乳動物施用有效量的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸的大小約3個至約100個核苷酸并且包含在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下可與哺乳動物神經(jīng)纖維網(wǎng)素基因互補的序列。
11.權(quán)利要求10的方法，其進(jìn)一步包括對哺乳動物施用化療劑的步驟。
12.權(quán)利要求10的方法，其中該寡核苷酸具有核酸酶抗性。
13.權(quán)利要求10的方法，其中該寡核苷酸包括選自示于表1的SEQ ID NOs1-30的序列。
14.一種抑制新血管生成的方法，其包括對哺乳動物施用有效量的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸的大小約3個至約100個核苷酸并且包含在抑制新血管生成的條件下與哺乳動物神經(jīng)纖維網(wǎng)素基因互補的序列。
15.權(quán)利要求14的方法，其中該寡核苷酸具有核酸酶抗性。
16.權(quán)利要求14的方法，其中該寡核苷酸包括選自示于表1的SEQ ID NOs1-30的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及與神經(jīng)纖維網(wǎng)素基因互補的寡核苷酸,其可調(diào)控哺乳動物的腫瘤細(xì)胞生長及血管生成。本發(fā)明也涉及在抑制哺乳動物的腫瘤細(xì)胞生長和血管生成中使用這類化合物的方法。本發(fā)明還涉及藥物組合物,其包含藥物上可接受的賦形劑及有效量的本發(fā)明化合物。
文檔編號A61P35/00GK1298445SQ99805388
公開日2001年6月6日 申請日期1999年4月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月23日
發(fā)明者J·A·賴特, A·H·揚, Y·S·李 申請人:吉倪塞思技術(shù)公司