專利名稱：一種包含il－6拮抗劑活性成分的炎性腸道疾病的預(yù)防或治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包含白細(xì)胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為活性成分的炎性腸道疾病的預(yù)防或治療劑。本發(fā)明還涉及一種包含IL-6拮抗劑活性成分的節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)防或治療劑。
IL-6通過細(xì)胞上兩種蛋白質(zhì)傳遞其生物學(xué)信號(hào)。其中一種是IL-6受體，其為分子量約為80kD的IL-6結(jié)合蛋白(Taga,T等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(1987)166,967-981;Yamasaki,K等人，科學(xué)(Science)(1987)241,825-828)。IL-6受體不僅以膜結(jié)合形式存在，具有表達(dá)于細(xì)胞表面的跨膜結(jié)構(gòu)域，而且可以是主要包括胞外區(qū)的可溶性IL-6受體。
另外一種蛋白質(zhì)為分子量約130kD的膜結(jié)合蛋白gp130，它參與非配體結(jié)合的信號(hào)傳導(dǎo)。IL-6和IL-6受體形成IL-6/IL-6受體復(fù)合物，在與gp130結(jié)合之后傳遞其生物學(xué)信號(hào)給細(xì)胞(Taga,7等人，細(xì)胞(Cell)(1989)58,573-581)。
IL-6的拮抗劑是指抑制IL-6生物學(xué)活性傳導(dǎo)的物質(zhì)。到目前為止已知的IL-6拮抗劑有抗IL-6抗體(抗-IL-6抗體)、抗IL-6受體的抗體(抗-IL-6受體抗體)、抗gp130抗體(抗-gp130抗體)以及抗改構(gòu)的IL-6、IL-6或IL-6受體的部分肽段的抗體等。
抗-IL-6受體的抗體已有幾篇報(bào)道描述(Novick D.等人，雜交瘤(Hybridoma)(1991)10,137-146;Huang,Y.W.等人，雜交瘤(1993)12,621-630；國際專利公開文本W(wǎng)O 95/)09673；法國專利申請(qǐng)F(tuán)R 2694767；美國專利US 5216287)。已知人源化PM-1抗體可通過將小鼠PM-1抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(Hirata,Y等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunology)(1989)143,2900-2906)移植到一種人模板抗體中獲得(國際專利公開文本W(wǎng)O 92-19759)。
炎性腸道疾病(IBD)是一種非特異的炎癥，表現(xiàn)為潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎。在疾病初期已有免疫學(xué)紊亂介入，但這并不能闡明其病原學(xué)。然而可以認(rèn)為，聚集在損害部位的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞也參與了粘膜的損害，并且炎性介質(zhì)尤其是細(xì)胞因子(如IL1β、TNFα和IL-6)引起特別的關(guān)注。
由于IL-6屬于炎性介質(zhì)，因而它與疾病程度的關(guān)系或與是否可作為IBD的特異指數(shù)的關(guān)系已經(jīng)引起關(guān)注。在節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎病人中IL-6的血清水平均有增長，并且該水平與疾病的狀態(tài)有關(guān)(Holtkamp,W.等人，臨床胃腸病學(xué)雜志(J.Clin.Gastroenterology)(1995)20,1230126;Niederau,C.等人，肝-胃腸病學(xué)(Hepto-Gastroenterdogy)(1997)44,90-107)。以PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))產(chǎn)物作為對(duì)組織中IL-6 mRNA含量的測(cè)定表明，其含量與潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎的疾病程度密切相關(guān)(Stevens,C等人，Dig.Dis.Sci.(1992)37,818-826)。關(guān)于IBD活動(dòng)期IL-6的增長，分析其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，當(dāng)固有層的單核細(xì)胞受到商陸細(xì)胞分裂原的刺激之后，其產(chǎn)量與疾病狀況有很好的相關(guān)性。(Reinecker,H-C等人，臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)(Clin.Exp.Immunol.)(1993)94,174-181)。
隨后，在來自固有層的單核細(xì)胞培養(yǎng)物中以及病人粘膜的組織培養(yǎng)物中觀察到IL-6產(chǎn)量與疾病程度的相關(guān)性。在前者的觀察中還顯示出粘膜組織產(chǎn)生IL-6的細(xì)胞數(shù)目也有所增加。單核細(xì)胞中最重要的產(chǎn)IL-6的細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，并且證實(shí)有大量的CD68陽性巨噬細(xì)胞在IBD病人活動(dòng)期在固有層中大量產(chǎn)生IL-6(Kusugami,K.等人,Dig.Dis.Sci.(1995),40,949-959)。
此外還發(fā)現(xiàn)IL-6的產(chǎn)生與節(jié)段性回腸炎病人的內(nèi)窺鏡觀察相關(guān)(Reinund,J.-M.等人，腸道(Gut)(1996)39,684-689)。此外，還有一些報(bào)道血清中不僅IL-6而且可溶性IL-6受體的濃度與疾病程度密切相關(guān)(Mitsuyma,K等人，腸道(1995)36,45-49)。
至于除了IL-6的其它炎性介質(zhì)，IL-1β的產(chǎn)量也已知與疾病狀況相關(guān)。另一方面，這并不總是正確，因?yàn)門NF-α可能在疾病處于低活性時(shí)產(chǎn)量往往較高。(Reinecker,H.-C等人，臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)(1993)94,174-181;Reimund,J.-M.等人，腸道(1996)39,684-639)。
當(dāng)今治療IBD的方法包括將飲食和所開的藥物相結(jié)合，如水楊酰偶氮磺胺吡啶、腎上腺皮質(zhì)激素等。然而一些病人由于副作用無法耐受這些藥物，就長期用藥而言會(huì)由此產(chǎn)生一些問題。
另一方面，通過抑制細(xì)胞因子活性改善疾病狀況作為一種新的IBD治療方法正在進(jìn)行嘗試。其主要靶標(biāo)為IL-1和TNF-α(Van Deventer,S.J.H.腸道(1997)40,443-448)；對(duì)于IL-1，一種IL-1受體拮抗劑(Comineui F.等人，胃腸病學(xué)(1992)103,65-71)和一種IL-1抑制劑CGP 47969A(Casini-Raggi等人，胃腸病學(xué)(1995)109,812-818)等正在進(jìn)行臨床或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物水平的研究。對(duì)于TNF-α，已經(jīng)給節(jié)段性回腸炎病人施用了特異的單克隆抗體，并觀察到細(xì)胞因子活性減弱以及潰瘍治愈。(VanDullemen,H.M.等人，胃腸病學(xué)(1995)109,129-135)。然而，IL-6拮抗劑能夠治療IBD，以特異地抑制IL-6的生物學(xué)活性并不為人所知。
因此，本發(fā)明提供(1)一種包含IL-6拮抗劑作為活性成分的炎性腸道疾病的預(yù)防或治療劑。
本發(fā)明也提供(2)一種包含針對(duì)IL-6受體的抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預(yù)防或治療劑。
本發(fā)明也提供(3)一種包含針對(duì)IL-6受體的單克隆抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預(yù)防或治療劑。
本發(fā)明也提供(4)一種包含針對(duì)人IL-6受體的單克隆抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預(yù)防或治療劑。該針對(duì)人IL-6受體的單克隆抗體優(yōu)選為PM-1抗體。
本發(fā)明也提供(5)一種包含針對(duì)小鼠IL-6受體的單克隆抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預(yù)防或治療劑。該針對(duì)小鼠IL-6受體的單克隆抗體優(yōu)選為MR16-1抗體。
本發(fā)明也提供(6)一種包含針對(duì)IL-6受體的重組抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預(yù)防或治療劑。該針對(duì)IL-6受體的重組抗體優(yōu)選為具有人抗體的恒定區(qū)(C區(qū))。
本發(fā)明也提供(7)一種包含針對(duì)IL-6受體的嵌合或人源化抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預(yù)防或治療劑。
本發(fā)明也提供(8)一種包含人源化PM-1抗體作為活性成分的炎性腸道疾病的預(yù)防或治療劑。
本發(fā)明也提供(9)一種包含以上(1)-(8)描述的IL-6拮抗劑作為活性成分的節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)防或治療劑。
本發(fā)明也提供(10)一種包含以上(1)～(8)所述的IL-6拮抗劑作為活性成分的抑制炎性腸道疾病病人體重減輕的藥物。
本發(fā)明也提供(11)一種包含以上(3)～(8)所述的IL-6拮抗劑作為活性成分的抑制炎性腸道疾病病人體重減輕的藥物。本發(fā)明的實(shí)施方案本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑可以是任何來源、任何種類、任何形式，只要它們具有對(duì)炎性腸道疾病的預(yù)防或治療效果，或者具有控制炎性腸道疾病病人體重減輕的效果。
IL-6拮抗劑阻抑IL-6介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，抑制IL-6的生物學(xué)活性。作為IL-6拮抗劑，優(yōu)先提到的為抗-IL-6抗體、抗-IL-6受體抗體、抗-gP130抗體、改構(gòu)IL-6、改構(gòu)的可溶性IL-6受體、IL-6或IL-6受體的部分肽段、以及具有以上相同活性的低分子量物質(zhì)。
本發(fā)明中使用的抗-IL-6抗體可作為多克隆或單克隆抗體采用已知方法獲得。用作本發(fā)明的抗-IL-6抗體，優(yōu)選特別是哺乳動(dòng)物來源的單克隆抗體。哺乳動(dòng)物來源的單克隆抗體包括雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體，以及由包含基因工程抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生產(chǎn)的重組抗體。這些抗體通過與IL-6結(jié)合，阻斷IL-6和IL-6受體的結(jié)合，并由此阻斷IL-6生物學(xué)活性的信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)。
這些抗體的實(shí)施例包括MH 166(Matsuda等人，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.(1988)18,951-956)和SK2抗體(Sato,K等人，The 21stNihon Mennekigakkai Soukai(日本免疫學(xué)會(huì)年會(huì))，學(xué)術(shù)記錄(1991)21,166)等抗體。
生產(chǎn)抗-IL-6抗體的雜交瘤可基本上采用以下已知的方法進(jìn)行構(gòu)建。因此，IL-6可用作免疫的傳統(tǒng)方法中的致敏抗原。由此獲得的免疫細(xì)胞在傳統(tǒng)的細(xì)胞融合方法中與已知的親本細(xì)胞融合，然后通過常規(guī)的篩選方法篩選出生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞，制備所需雜交瘤。
特別地，抗-IL-6抗體可按以下方式獲得。例如，為獲得抗體用作致敏抗原的人IL-6可運(yùn)用IL-6基因/氨基酸序列獲得，該序列發(fā)表在歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem(1987)168,543-550;免疫學(xué)雜志(1988)140,1534-1541；或農(nóng)業(yè)生物化學(xué)(Agr.Biol.Chem.)(1990)54,2685-2688)。
通過將IL-6基因插入一已知的表達(dá)載體系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化適宜的宿主細(xì)胞后，IL-6蛋白質(zhì)可從宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)上清液中純化出來。純化的IL-6蛋白質(zhì)可用作致敏抗原?；蛄硗膺x擇IL-6蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白用作致敏抗原。
本發(fā)明中使用的抗-IL-6受體的抗體可作為多克隆或單克隆抗體采用已知的方法獲得。用作本發(fā)明的抗-IL-6抗體，優(yōu)選單克隆抗體尤其是哺乳動(dòng)物來源的單克隆抗體。哺乳動(dòng)物來源的單克隆抗體包括那些雜交瘤生產(chǎn)的，以及那些由包含基因工程抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞所生產(chǎn)的單克隆抗體。這些抗體通過與IL-6受體結(jié)合，抑制IL-6與IL-6受體的結(jié)合，由此阻斷IL-6的生物學(xué)活性向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)。
這種抗體的實(shí)例包括MR16-1抗體(Tamura,T.,等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90,11924-11928),PM-1抗體(Hirata等人，免疫學(xué)雜志(1989)143,2900-2906)，或AUK12-20抗體，AUK 64-7抗體或AUK 146-15抗體(國際專利公開號(hào)WO 92-19759)等等。其中PM-1抗體最為優(yōu)選。
生產(chǎn)PM-1抗體的雜交瘤細(xì)胞系已遵照布達(dá)佩斯協(xié)議的條款于1990年7月10日以PM-1國際保藏于國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)1～3 Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki pref.日本，保藏號(hào)BP-2998。此外，生產(chǎn)MR16-1抗體的雜交瘤細(xì)胞系已經(jīng)遵照布達(dá)佩斯協(xié)議條款于1997年3月13日以MR16-1國際保藏于國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)1～3 Higashi 1-chome、Tsukuba-shi、Ibaraki pref.日本保藏號(hào)BP-5875。
生產(chǎn)抗-IL-6受體的單克隆抗體的雜交瘤基本上可按照下面描述的已知方法進(jìn)行構(gòu)建。因此IL-6受體可按照免疫的常規(guī)方法用作致敏抗原。由此獲得的免疫細(xì)胞以常規(guī)的細(xì)胞融合方法與親本細(xì)胞融合，然后通過常規(guī)的篩選方法篩選出單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞，以制備所需的雜交瘤。
特別地，抗-IL-6受體的抗體可按以下方式進(jìn)行制備。例如，為獲得抗體用作致敏抗原的人IL-6受體可以采用歐洲專利申請(qǐng)?zhí)朎P 325474公開的IL-6受體基因序列/氨基酸序列而獲得，小鼠IL-6受體可采用日本未審的專利公開號(hào)3(1991)-155795所公開的小鼠IL-6受體基因序列/氨基酸序列而獲得。
有兩種類型的IL-6受體蛋白質(zhì)表達(dá)在細(xì)胞膜上的IL-6受體和脫離于細(xì)胞膜的IL-6受體(可溶性IL-6受體)(YasukaWa,K.等人，生物化學(xué)雜志(J.Biochem.)(1990)108,673-676)?？扇苄訧L-6受體主要包括與細(xì)胞膜結(jié)合的IL-6受體的胞外區(qū)，因此不同于膜結(jié)合的IL-6受體，因?yàn)楹笳呷狈缒^(qū)或跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。任何IL-6受體均可用作IL-6受體蛋白質(zhì)，只要它可用于本發(fā)明中生產(chǎn)IL-6受體抗體的致敏抗原。
當(dāng)IL-6受體的基因序列插入一已知的表達(dá)載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化適宜的宿主細(xì)胞后，所需的IL-6受體蛋白質(zhì)可由已知方法從宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)上清液中純化出來。因而純化的IL-6受體蛋白質(zhì)可用作致敏抗原。另外可選擇地，表達(dá)IL-6受體或IL-6受體蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)之融合蛋白的細(xì)胞可用作致敏抗原。
具有包含編碼人IL-6受體的cDNA之質(zhì)粒pIBIBSF2R的大腸桿菌，已遵照布達(dá)佩斯協(xié)議的條款于1989年1月9日以HB101-pIBIBSF2R國際保藏于國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所，保藏于工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)1～3,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki pref.日本，保藏號(hào)BP-2232。
本發(fā)明采用的抗-gp 130抗體可作為多克隆或單克隆抗體使用已知方法獲得。用作本發(fā)明的抗-gp130的抗體優(yōu)選單克隆抗體尤其是哺乳動(dòng)物來源的單克隆抗體。哺乳動(dòng)物來源的單克隆抗體包括那些雜交瘤生產(chǎn)的，以及那些經(jīng)包含基因工程抗體基因的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體。這些抗體經(jīng)與gp130結(jié)合，抑制IL-6/IL-6受體復(fù)合物與gp130的結(jié)合，由此阻斷IL-6生物學(xué)活性向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)。
這樣的抗體包括AM64抗體(日本未審專利公開號(hào)(kokai)3(1991)-219894)、4B11抗體和2H4抗體(US 5571513)、B-S12抗體和B-P8抗體(日本未審專利公開號(hào)(kokai)B(1996)-291199)。
生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤基本上可采用下面描述的方法建立。因而gp130可用作致敏抗原并以常規(guī)免疫方法用于免疫。由此獲得的免疫細(xì)胞在常規(guī)細(xì)胞融合過程中與已知的親本細(xì)胞融合，然后通過常規(guī)篩選方法篩選出所需的生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤。
特別地，單克隆抗體可通過以下方式獲得。例如，用作生產(chǎn)抗體的致敏抗原的gp130可通過歐洲專利申請(qǐng)?zhí)朎P 411946公開的gP130基因序列/氨基酸序列獲得。
當(dāng)gp130基因插入一已知的表達(dá)載體系統(tǒng)后，轉(zhuǎn)化一適宜的宿主細(xì)胞，gp130蛋白質(zhì)即可從宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)上清液中純化出來。純化的gp130蛋白質(zhì)可用作致敏抗原。另外可選擇地，gp130蛋白質(zhì)和另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白可用作致敏抗原。
盡管對(duì)由致敏抗原免疫的哺乳動(dòng)物并沒有特別的限制，但選擇應(yīng)優(yōu)先考慮其與用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的相容性，它們通常包括嚙齒類動(dòng)物例如小鼠、大鼠、倉鼠等等。
用致敏抗原免疫動(dòng)物通常采用已知的方法進(jìn)行。例如，一般的方法包括給哺乳動(dòng)物腹膜內(nèi)或皮下注射致敏抗原。特別地，已稀釋并懸浮于適量磷酸緩沖鹽液(PBS)或生理鹽水中的致敏抗原，按需要與適宜量的傳統(tǒng)佐劑混合，例如福氏完全佐劑。乳化后，優(yōu)選地將其每4至21天分幾次施用于哺乳動(dòng)物。另外可選擇地，在致敏抗原免疫哺乳動(dòng)物時(shí)采用一種合適的載體。
免疫后證實(shí)血清中的所需抗體滴度確有增加，便從哺乳動(dòng)物中取出免疫細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。優(yōu)選的免疫細(xì)胞特別包括脾細(xì)胞。
與上述的免疫細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合的另一種親本細(xì)胞哺乳動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選地包括多種已知的細(xì)胞系，例如p3X63Ag8.653(Kearney,J.F等人，免疫學(xué)雜志(1979)1231548-1550)、p3X63Ag BU.1(當(dāng)今微生物學(xué)與免疫學(xué)專題(1978)811-7)、NS-1(Kohler,G．和Milstein,C.,歐洲免疫學(xué)雜志(1976)6511-519)、MPC-11(Margulies,D.H.等人，細(xì)胞(1976)8405～415)、SP2/0(Shulman,M.等人，自然(1978)276269-270)、FO(de st.Groth,S.F.等人，免疫學(xué)方法(Immunal.Methods)(1980)351～21,S194(TroWbridge,I.S.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，(1978)148313-323)、R210(Galfre,G等人，自然(1979)277131-133)等等。
上述經(jīng)免疫的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞之間的細(xì)胞融合基本上可根據(jù)已知的方法進(jìn)行，例如Milstein等人描述的方法(Kohler,G.和Milstein,C.,酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)(1981)733-46)等等。
更為特別地，上述的細(xì)胞融合在常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行，例如添加有細(xì)胞融合促進(jìn)劑的液體培養(yǎng)基。可以用作細(xì)胞融合促進(jìn)劑的例如聚乙二醇(PEG)、仙臺(tái)病毒(HVJ)等等。此外，可根據(jù)需要添加例如二甲基亞砜之類的佐劑以加強(qiáng)融合的效率。
采用的免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞優(yōu)選的比例為，例如免疫細(xì)胞比骨髓瘤細(xì)胞多1至10倍。用于上述細(xì)胞融合的培養(yǎng)基包括例如適宜以上骨髓瘤細(xì)胞系生長的RPMI 1640培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基，以及用于此類細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基，并且可添加如胎牛血清(FCS)的血清添加劑。
細(xì)胞融合時(shí)，將上述指定量的免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中充分混勻，并加入預(yù)熱至約37℃的PEG溶液，例如平均分子量約1000至6000的PEG溶液，加至終濃度30％至60％(w/v)并混勻，以獲得所需的融合細(xì)胞(雜交瘤)。然后通過重復(fù)順序添加適宜的培養(yǎng)基并離心，可以去除不適合雜交瘤生長的上清液、融合劑等因素。
該雜交瘤通過在常規(guī)的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)進(jìn)行選擇，例如，選擇培養(yǎng)基HAT培養(yǎng)基(一種包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)。一般在HAT培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)期，通常幾天至幾星期，這期間足以殺死除所需雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)。采用常規(guī)的有限稀釋法篩選并克隆產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤。
除了通過用抗原免疫除人以外的動(dòng)物獲得上述雜交瘤，還可能用所需抗原或表達(dá)所需抗原的細(xì)胞體外致敏人淋巴細(xì)胞，所得的致敏B淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞(例如U266)融合，以獲得具有結(jié)合所需抗原或表達(dá)所需抗原細(xì)胞的活性的所需人抗體。(見日本已審專利公開號(hào)(kokoku)1(1989)-59878)。此外，一種具有一整套人抗體基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物經(jīng)抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞免疫后，可獲得上述方法中的所需人抗體。(見國際專利公開號(hào)WO93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO96/34096和WO 96/33735)。
由此建立的生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤可以在常規(guī)培養(yǎng)基中亞培養(yǎng)，或可在液氮中長期保存。
為了從該雜交瘤中獲得單克隆抗體，可采用以下方法以常規(guī)方法培養(yǎng)該雜交瘤并從上清液中獲得抗體，或者將該雜交瘤注入與其相容的哺乳動(dòng)物腹腔中生長并從腹水中獲得抗體。前者方法適于獲得高純度的抗體，而后者方法適于大批量生產(chǎn)抗體。
特別地，生產(chǎn)抗-IL-6受體的抗體的雜交瘤可通過使用日本未審專利公開號(hào)(kokai)3(1989)-139293中的方法建立。一種方法為，將生產(chǎn)PM-1抗體的雜交瘤腹膜內(nèi)注射BALB/C小鼠，以獲得從腹水中純化的PM-1抗體，其雜交瘤已于1990年7月10日遵照布達(dá)佩斯協(xié)議的條款國際保藏于日本國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所、工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)，1-3Higashi 1-chome，Tsukuba-shi,Ibaraki pref.,保藏號(hào)為BP-2998。另一種方法為該雜交瘤培養(yǎng)于適宜的培養(yǎng)基，例如含10％胎牛血清和5％BM-Condimed H1(寶靈曼公司生產(chǎn))的RPMI 1640培養(yǎng)基、雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL公司生產(chǎn))、PFHM-Ⅱ培養(yǎng)基(GIBCO-BRL公司生產(chǎn))等等，然后從上清液中純化PM-1抗體。
通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)的重組抗體可以用作本發(fā)明中的單克隆抗體，該技術(shù)中來自雜交瘤的抗體基因克隆并整合入一適合的載體中，重組的載體再轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。參見(例如BorrebaeckC.A.K.和Larrick J.W.著作的“治療用的單克隆抗體”，由MACMILLAN出版有限公司1990年發(fā)表于英國)。
特別地，編碼所需抗體可變區(qū)(Ⅴ)的mRNA從生產(chǎn)抗體的細(xì)胞如雜交瘤中分離出來。通過采用例如胍－超離心方法(ChirgWin,J.M.等人，生物化學(xué)(1979)18,5294-5299)、AGPC方法(Chomczynski,P.等人，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)(1987(162,156-159)制備總RNA，然后用mRNA純化試劑盒等(Pharmacia生產(chǎn))從總RNA中純化分離mRNA。另外可選擇地，mRNA可直接用快速制備mRNA純化試劑盒(Pharmacia生產(chǎn))制備。
抗體可變區(qū)cDNA可用反轉(zhuǎn)錄酶由mRNA合成。cDNA可用AMV反轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒等進(jìn)行合成。另外可選擇地，為合成和擴(kuò)增cDNA，可使用應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的5’－擴(kuò)增RACE試劑盒(Clontech生產(chǎn))和5’-RACE方法(Frohman,M.A.等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1988)85,8998-9002；Belyavsky,A等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)(1989)17,2919-2932)。目的DNA片段從獲得的PCR產(chǎn)物中純化出并可與載體DNA連接。此外，由此構(gòu)建重組載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并從中挑選克隆以制備所需的重組載體。目的DNA的核苷酸序列可通過已知方法如雙脫氧法確定。
一旦獲得編碼所需抗體可變區(qū)的DNA，就可與編碼所需抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連，然后整合入一表達(dá)載體中。另外可選擇地，編碼抗體Ⅴ區(qū)的DNA整合入一個(gè)已經(jīng)包含編碼抗體C區(qū)的DNA的表達(dá)載體中。
為了生產(chǎn)本發(fā)明中使用的抗體，將抗體基因如下述方法整合入一表達(dá)載體中，以便在表達(dá)調(diào)控區(qū)例如增強(qiáng)子和/或啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。隨后，表達(dá)載體可以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在其中進(jìn)行表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明，人工改構(gòu)的重組抗體，例如嵌合抗體和人源化抗體可用于降低對(duì)人的異源抗原性。這些改構(gòu)抗體可用已知方法生產(chǎn)。
獲得嵌合抗體可通過，如下方法，將由此獲得的編碼抗體可變區(qū)的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，然后整合入一表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞從中生產(chǎn)抗體(參見歐洲專利申請(qǐng)?zhí)朎P125023和國際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 92/19759)。使用這種已知方法可獲得本發(fā)明中有用的嵌合抗體。
例如，包含編碼嵌合PM-1抗體的L鏈V區(qū)或H鏈V區(qū)DNA的質(zhì)粒分別命名為pPM-K3或pPM-h1，含有質(zhì)粒的大腸桿菌已遵照布達(dá)佩斯協(xié)議的條款于1991年2月11日分別以保藏號(hào)NCIMB40366和NCIMB 40362國際保藏于國家工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司。
人源化抗體也稱為重構(gòu)人抗體，已通過將除人以外哺乳動(dòng)物抗體(如小鼠抗體)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植入一人抗體的CDR制造出來。制備這種抗體的一般重組DNA技術(shù)也已所知(參見歐洲專利申請(qǐng)?zhí)朎P 125023和國際專利公開號(hào)WO 92-19759)。
特別地，設(shè)計(jì)用于將鼠抗體的CDR和人抗體的框架區(qū)(FR)連接起來的DNA序列已經(jīng)合成，該序列來自幾段分開的寡核苷酸，并含有與另一段末端重疊的部分。如此獲得的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，然后整合入表達(dá)載體中，再轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以生產(chǎn)抗體(參見歐洲專利申請(qǐng)?zhí)朎P 239400和國際專利公開號(hào)WO92-19759)。
針對(duì)連接CDR的人抗體的框架區(qū)，選擇形成有利的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)決定區(qū)。如果需要，抗體可變區(qū)的框架區(qū)氨基酸可被替換，以便重構(gòu)人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)可形成適宜的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)(Sato,K等人，癌癥研究(Cancer Res.(1993)53,851-856)。
例如，嵌合抗體或人源化抗體均采用了人抗體的C區(qū)。作為人抗體的C區(qū)可能提到Cγ，例如，可采用Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4。修飾人抗體的C區(qū)可促進(jìn)抗體的穩(wěn)定性及產(chǎn)率。
嵌合抗體由除人以外哺乳動(dòng)物抗體的可變區(qū)和人抗體的C區(qū)構(gòu)成，而人源化抗體由來源于除人以外哺乳動(dòng)物抗體的互補(bǔ)決定區(qū)和來源于人抗體的框架區(qū)和C區(qū)構(gòu)成。因此，這些抗體在人體中的抗原性降低，以便用作本發(fā)明中的抗體。
本發(fā)明中應(yīng)用的人源化抗體的優(yōu)選實(shí)施方案包括人源化的PM01抗體。(參見國際專利公開號(hào)WO 92-19759)。
上述構(gòu)建的抗體基因可用已知的方法表達(dá)并獲得產(chǎn)物。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，完成表達(dá)可采用，包含常規(guī)使用的有用的啟動(dòng)子、待表達(dá)的抗體基因和3’下游有效連接多聚A信號(hào)的DNA載體或者包含上述DNA的載體。啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的實(shí)例包括人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。
此外，可用于本發(fā)明的表達(dá)抗體的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子有病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和類人猿病毒40(SV40)，以及來源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，例如人延伸因子α(HEF1α)。
例如，通過Mulligan等人的方法動(dòng)物SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(Mulligan,R.C.等人，自然，(1979)277,108-114)，或者M(jìn)izushima等人的方法使用HEF1α啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(Mizushima,S和Nagata,S.,核酸研究(1990)18,5322)，可容易地完成表達(dá)。
對(duì)于大腸桿菌，通過有效地連接常規(guī)使用的有用的啟動(dòng)子，抗體分泌的信號(hào)序列和將要表達(dá)的抗體基因進(jìn)行表達(dá)。作為啟動(dòng)子，例如，可能會(huì)提到LacZ啟動(dòng)子和araB啟動(dòng)子。當(dāng)使用LacZ啟動(dòng)子時(shí)，可采用Ward等人的方法(Ward,E.S.等人，自然，(1989)341,544-546；Ward,E.S.等人，F(xiàn)ASEB J.(1992)6,2422-2427)；當(dāng)使用araB啟動(dòng)子時(shí)，可采用Better等人的方法(Better,M.等人，科學(xué)(1988)240,1041～1043)。
當(dāng)抗體分泌并產(chǎn)生于大腸桿菌周質(zhì)空間時(shí)，可采用pelB信號(hào)序列(Lei,s.p.等人，細(xì)菌學(xué)雜志(1987)169,4379-4383)。分離出聚集于周質(zhì)空間的抗體之后，抗體結(jié)構(gòu)在使用前適當(dāng)?shù)刂匦抡郫B(例如參見WO 96/30394)。
那些來源于SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的復(fù)制起點(diǎn)可用作復(fù)制起點(diǎn)。此外，關(guān)于宿主細(xì)胞系統(tǒng)中基因拷貝數(shù)的擴(kuò)增，表達(dá)載體可包括氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇性標(biāo)記。
至于本發(fā)明使用的抗體的生產(chǎn)，可使用任何生產(chǎn)體系。抗體制品的生產(chǎn)體系包括體外或體內(nèi)生產(chǎn)體系。作為體外生產(chǎn)體系，可能提及使用真核細(xì)胞的生產(chǎn)體系和使用原核細(xì)胞的生產(chǎn)體系。
當(dāng)使用真核細(xì)胞時(shí)，有選用了動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞的生產(chǎn)體系。已知的動(dòng)物細(xì)胞包括(1)哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、Hela細(xì)胞和Vero細(xì)胞；(2)兩棲類動(dòng)物細(xì)胞，例如非洲爪蟾屬(Xenopus)卵細(xì)胞，或(3)昆蟲細(xì)胞例如sf9、sf21和Tn5。已知的植物細(xì)胞包括例如煙草(Nicotiana tabacum)，其可經(jīng)受愈傷組織培養(yǎng)。已知的真菌細(xì)胞包括酵母，例如酵母屬，更具體的釀酒酵母(Saccharomyces cereviceae)，或絲狀真菌，例如曲霉屬(Aspergillus)，更具體的黑曲霉(Aspergillus niger)。
當(dāng)使用原核細(xì)胞時(shí)，有選用了細(xì)菌細(xì)胞的生產(chǎn)體系。已知的細(xì)菌細(xì)胞包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
通過將所需抗體基因轉(zhuǎn)化進(jìn)這些細(xì)胞，并體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，便可獲得抗體。按已知方法進(jìn)行培養(yǎng)。例如，DMEM、MEM、RPMI1640和IMDM可以用作培養(yǎng)基，并且血清添加劑如胎牛血清(FCS)可結(jié)合使用。此外，還可通過將抗體基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞注入動(dòng)物等腹腔以體內(nèi)方式生產(chǎn)抗體。
作為體內(nèi)生產(chǎn)體系，將提及那些使用動(dòng)物和使用植物的生產(chǎn)體系。當(dāng)使用動(dòng)物時(shí)，有采用哺乳動(dòng)物和昆蟲的生產(chǎn)體系。
山羊、豬、綿羊、小鼠和?？捎米鞑溉閯?dòng)物生產(chǎn)體系(VickiGlaser，生物技術(shù)應(yīng)用(SPE CTRUM Biotechnology Applications)(1993))。同樣蠶可以用作昆蟲。
當(dāng)使用植物時(shí)，例如可采用煙草。
抗體基因轉(zhuǎn)入這些動(dòng)物或植物，并從這些動(dòng)物或植物中產(chǎn)生抗體并回收。例如，抗體基因插入編碼乳汁中固有產(chǎn)生的蛋白(如山羊β酪蛋白)的基因中間，制備融合基因。將包含插入抗體基因的融合基因之DNA片段注入山羊胚，胚轉(zhuǎn)變成一只母山羊。接受胚產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因山羊或其后代，從其乳汁中可獲得所需的抗體。為了增加轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)的包含所需抗體的乳汁量，可給轉(zhuǎn)基因山羊適量的激素(Ebert,K.M.等人，生物/技術(shù)(Bio/Technology)(1994)12,699-702)。
當(dāng)使用蠶時(shí)，用插入所需抗體基因的桿狀病毒感染蠶，便可從蠶的體液中獲得所需的抗體(Maeda,S.等人，自然(1985)315,592-594)。而且，當(dāng)使用煙草時(shí)，所需的抗體基因插入植物表達(dá)載體，例如pMON 530，并且載體感染細(xì)菌如根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。然后細(xì)菌感染煙草(如Nicotianatabacum)煙草并從煙草葉中獲得所需抗體(Julian,K.-C.Ma等人，歐洲免疫學(xué)雜志(1994)24.131-138)。
當(dāng)體外或體內(nèi)生產(chǎn)體系生產(chǎn)抗體時(shí)，如上所述，編碼抗體的重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA可分別整合入一個(gè)表達(dá)載體并同時(shí)轉(zhuǎn)化宿主，或者編碼H鏈和L鏈的DNA可整合入單個(gè)表達(dá)載體中并以此轉(zhuǎn)化宿主(參見國際專利公開號(hào)WO 94-11523)。
本發(fā)明中使用的抗體可以是抗體片段或是其修飾的版本，只要它們可優(yōu)選使用即可。例如，F(xiàn)ab、F(ab’)2、Fv，或是Fv的H鏈和L鏈由一適合的連接物連接的單鏈Fv(ScFv)，都可作為抗體片段提及。
特別地，抗體由酶處理(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)產(chǎn)生抗體片段，或者編碼這些抗體片段的基因構(gòu)建后整合入表達(dá)載體中，并在適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見，例如CO,M.S.等人，免疫學(xué)雜志(1994)152,2968-2976；Better,M.和Horwitz,A.H.,酶學(xué)方法(1989)178,476-496；Plueckthun,A.和Skerra,A.,酶學(xué)方法(1989)178,476-496；Lamoyi,E.,酶學(xué)方法(1986)121,652-663；Rousseaux,J.等人，酶學(xué)方法(1986)123,663-669；Bird,R.E.等人，TIBTECH(1991)9,131-137)。
scFv可通過連接抗體的H鏈V區(qū)與L鏈V區(qū)獲得。scFv中H鏈的V區(qū)和L鏈的V區(qū)優(yōu)選地由連接物連在一起，這連接物優(yōu)選為肽連接物(Huston,J.S.等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1988)85，5879-5883)。scFv中H鏈的V區(qū)和L鏈的V區(qū)可來源于任何上述的抗體。任何包含12～19個(gè)氨基酸殘基的單鏈肽都可以用作連接V區(qū)的肽連接物。
編碼ScFv的DNA可以這樣獲得使用編碼上述抗體H鏈或H鏈V區(qū)的DNA和編碼上述抗體L鏈或L鏈V區(qū)的DNA作為模板；通過PCR技術(shù)使用與其兩末端相特異的引物對(duì)，擴(kuò)增上述序列中編碼目的氨基酸序列的部分DNA；進(jìn)一步擴(kuò)增編碼肽連接的部分的DNA，以及確定了該DNA的兩端可分別與H鏈和L鏈連接的引物對(duì)。
一旦建立了編碼scFv的DNA，就可通過常規(guī)方法獲得包含該DNA的表達(dá)載體和由該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主，并且可利用常規(guī)方法使用轉(zhuǎn)化的宿主獲得scFv。
通過與上述的方法相似的方式獲得抗體基因并允許在宿主中表達(dá)，即可獲得的這些抗體片段。在本申請(qǐng)的權(quán)利要求書中使用的“抗體”包括這些抗體片段。
與例如聚乙二醇(PEG)的多種分子結(jié)合的抗體可用作修飾抗體。本申請(qǐng)的權(quán)利要求書中使用的“抗體”包含這些修飾抗體。這些修飾抗體可通過對(duì)如此獲得的抗體進(jìn)行化學(xué)修飾而獲得。本領(lǐng)域中已經(jīng)建立了這些方法。
如上述生產(chǎn)和表達(dá)的抗體可從宿主細(xì)胞內(nèi)部或外部分離出來，并可純化至均一。本發(fā)明中使用的抗體的分離和純化可通過親和層析完成。這種親和層析使用的柱可以是蛋白A柱和蛋白G柱。蛋白A柱使用的載體范例為Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等等?；蛘撸蔁o任何限制地使用常規(guī)應(yīng)用的分離純化蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明中使用的抗體的分離和純化，可適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合除上述親和層析以外的層析、過濾、超濾、鹽析、透析等方法來完成。層析包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾等等。這些層析可應(yīng)用于高效液相層析(HPLC)?；蛘?，可應(yīng)用反相HPLC。
以上獲得抗體的濃度可通過測(cè)定光吸收值或者酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)等方法確定。因此，當(dāng)進(jìn)行測(cè)定光吸收值時(shí)，將樣品用PBS(-)適當(dāng)?shù)叵♂?，然后測(cè)定280nm時(shí)的光吸收值，并用光吸收系數(shù)1.35 OD=1mg/ml進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)使用ELISA方法時(shí)，按以下方法進(jìn)行測(cè)定。因此，100μl由0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAGO生產(chǎn))加至96孔板(Nunc生產(chǎn))，4℃孵育過夜以固定抗體。封閉后，每孔加入100μl適當(dāng)稀釋的本發(fā)明的抗體或包含抗體的樣品，或100μl作為標(biāo)準(zhǔn)物的人IgG(CAPPEL生產(chǎn))，室溫孵育1小時(shí)。
清洗后，加入100μl稀釋5000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗－人IgG抗體(BIO SOURCE生產(chǎn))，室溫孵育1小時(shí)。清洗后加入底物溶液并孵育，隨后用3550型微板讀數(shù)儀(Bio-Rad生產(chǎn))測(cè)定405nm時(shí)的光吸收值，并計(jì)算目的抗體的濃度。
本發(fā)明中改構(gòu)的IL-6具有與IL-6受體結(jié)合的活性，但并不傳遞IL-6的生物學(xué)活性。因而，盡管改構(gòu)的IL-6與IL-6競爭性結(jié)合IL-6受體，卻并不傳遞IL-6的生物學(xué)活性，由此便阻斷了IL-6的信號(hào)傳導(dǎo)。
通過替換IL-6氨基酸序列中的氨基酸殘基引入突變可以構(gòu)建改構(gòu)的IL-6。改構(gòu)IL-6的來源IL-6可以具有任何起源，但考慮到其抗原性，優(yōu)選人IL-6。
特別地，使用已知的氨基酸序列分子建模程序，例如WHATIF(Vriend等人，分子圖譜雜志(J.Mol.Graphics(1990),8,52-56)預(yù)測(cè)IL-6的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并評(píng)價(jià)待替換的氨基酸殘基的整體效果。當(dāng)適宜的氨基酸殘基確定之后，通過常規(guī)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，使用包含編碼人IL-6基因的核苷酸序列的載體，并由此獲得編碼改構(gòu)IL-6的基因。該基因然后在需要時(shí)整合進(jìn)適宜的表達(dá)載體，根據(jù)上述重組抗體的表達(dá)、生產(chǎn)和純化方法從中獲得改構(gòu)的IL-6。
改構(gòu)IL-6的具體實(shí)例公開于Brakenhoff等人，生物化學(xué)雜志(1994)269,86-93和Savino等人，EMBO雜志(1994)13,1357-1367,WO 96-18648和WO 96-17869。
本發(fā)明中使用的IL-6或IL-6受體的部分肽段分別具有與IL-6受體結(jié)合或與IL-6結(jié)合的活性，但不能傳遞IL-6的生物學(xué)活性。因此IL-6或IL-6受體分別與IL-6受體或IL-6結(jié)合并由此將其捕捉。結(jié)果，它們并不傳遞IL-6的生物學(xué)生，并阻斷IL-6的信號(hào)傳導(dǎo)。
IL-6或IL-6受體的部分肽是這樣的肽，其包含IL-6或IL-6受體氨基酸序列中參與結(jié)合IL-6受體和IL-6的區(qū)域中的部分或全部氨基酸序列。這種肽段一般包含10～80、優(yōu)選20～50、更優(yōu)選20～40個(gè)氨基酸殘基。
IL-6或IL-6受體的部分肽段的構(gòu)建可通過明確IL-6或IL-6受體氨基酸序列中參與結(jié)合IL-6受體和IL-6的區(qū)域，并通過如遺傳工程技術(shù)或肽合成方法等常規(guī)方法生產(chǎn)一些或全部氨基酸序列來完成。
為了用遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)IL-6或IL-6受體的部分肽，將編碼目的肽之DNA序列整合入表達(dá)載體，并通過表達(dá)、生產(chǎn)和純化該重組抗體獲得其肽段。
IL-6或IL-6受體部分肽的生產(chǎn)可通過肽合成方法實(shí)現(xiàn)，即使用肽合成普遍使用的方法例如固相合成或液相合成。
特別地，可使用的方法參見Zoku-Iyakuhin no Kaihatsu(藥品進(jìn)展序集，14卷，Peputido Gousei(肽合成)，Haruaki Yajima、Hirokawa Shoten編著，1991。例如，使用的固相合成方法包括例如一個(gè)反應(yīng)，其中待合成肽C末端相應(yīng)的氨基酸與一個(gè)不溶于有機(jī)溶劑的支持物結(jié)合，然后氨基酸(其中α-氨基基團(tuán)或側(cè)鏈官能團(tuán)由一個(gè)適宜的保護(hù)基團(tuán)保護(hù))每次從C-末端向N-末端方向縮合一個(gè)氨基酸。另一個(gè)反應(yīng)中與樹脂結(jié)合的氨基酸或肽的α-氨基基團(tuán)的上述保護(hù)基團(tuán)被去除。這兩個(gè)反應(yīng)交替重復(fù)以延伸肽鏈。依賴使用的保護(hù)基團(tuán)的類型可將固相肽合成方法分為Boc方法和Fmoc方法。
完成目的肽合成之后，進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)和從支持物上切除肽鏈的反應(yīng)。關(guān)于肽鏈的切除，通常在Boc方法中使用氟化氫或三氟甲烷磺酸，在Fmoc方法中使用TFA。例如在Boc方法中，上述肽樹脂在存在苯甲醚時(shí)在氟化氫中處理。隨后，去除保護(hù)基團(tuán)，通過從支持物上切除回收合成肽。通過凍干合成的肽可獲得粗肽。另一方面，例如在Fmoc方法中，按照同上相似的方式完成去保護(hù)反應(yīng)和從支持物上切除肽的反應(yīng)。
由此獲得的粗肽可應(yīng)用HPLC進(jìn)行分離和純化。肽的洗脫可在優(yōu)化條件下在通常用于蛋白質(zhì)純化的水－乙腈溶劑體系中進(jìn)行。將色譜曲線中峰值所對(duì)應(yīng)的級(jí)分收集并凍干。如此純化的肽級(jí)分通過質(zhì)譜分析分子量、分析氨基酸組分、或分析氨基酸序列等進(jìn)行鑒定。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽的具體實(shí)施例公開于日本未審專利公開號(hào)(kokai)7(1995)-324097、日本未審專利公開號(hào)(kokai)8(1996)-311098和美國專利US 5210075。
本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑的活性可用已知的常規(guī)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。特別地，培養(yǎng)IL-6依賴型細(xì)胞MH 60.BSF2，加入IL-6，并在與IL-6拮抗劑共存條件下通過向IL-6依賴型細(xì)胞中摻入H3-胸苷以評(píng)價(jià)其活性?；蛘撸瑫r(shí)向表達(dá)IL-6受體的U266細(xì)胞中加入125I標(biāo)記的IL-6和IL-6拮抗劑，通過測(cè)定與IL-6受體表達(dá)細(xì)胞所結(jié)合的125I標(biāo)記的IL-6，評(píng)價(jià)其活性。在以上分析系統(tǒng)中，除了有IL-6受體拮抗劑的實(shí)驗(yàn)組以外，還建立了不包含IL-6拮抗劑的陰性對(duì)照組，并且比較它們獲得的結(jié)果以評(píng)價(jià)IL-6受體拮抗劑抑制IL-6的活性。
為了證實(shí)本發(fā)明完成的效果，將本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑施用于形成了炎性腸道疾病的動(dòng)物，炎性腸道疾病的形成是通過注射CD4陽性和CD45RB強(qiáng)陽性的細(xì)胞(CD4+CD45RBhigh細(xì)胞)，并可評(píng)價(jià)IL-6拮抗劑抑制體重減輕和改善炎性腸道疾病病情得分的效果。作為本發(fā)明額外的效果，其可抑制厭食，減輕腹痛，改善腹瀉，或防止炎性腸道疾病的復(fù)發(fā)。
使用例如以下實(shí)施例描述的方法，可以分離通過IL-6拮抗劑轉(zhuǎn)入動(dòng)物的CD4+CD45RBhigh細(xì)胞。CD4+CD45RBhigh細(xì)胞來源的動(dòng)物可以是實(shí)驗(yàn)中普遍使用的動(dòng)物，如小鼠和大鼠。
如下面實(shí)施例所述，在形成炎性腸道疾病的動(dòng)物中施用IL-6受體抗體，導(dǎo)致體重減輕的抑制和改善炎性腸道疾病程度得分，因此表明如抗-IL-6受體抗體的IL-6拮抗劑發(fā)揮了治療炎性腸道疾病的效果。
本發(fā)明處理的對(duì)象為哺乳動(dòng)物。處理對(duì)象優(yōu)選為人。
本發(fā)明的預(yù)防或治療劑可以口服或非腸道途徑、系統(tǒng)地或局部地施用。例如，靜脈注射如滴注、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射、栓劑、洗腸劑、口服腸溶衣藥片等以及給藥方式可以根據(jù)病人的年齡和狀況適當(dāng)?shù)剡x擇。選擇有效劑量的范圍為每次每kg體重給藥0.01mg～100mg?；蛘呖蛇x擇劑量范圍為每個(gè)病人1～1000mg，優(yōu)選5～50mg。
本發(fā)明的炎性腸道疾病的預(yù)防或治療劑依據(jù)給藥途徑可包含藥學(xué)可接受的載體或添加劑。這些載體或添加劑的例子包括水、藥物可接受的有機(jī)溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、甘油二脂、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、十八烷醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、藥物可接受的表面活性劑等等。根據(jù)劑型可選擇上述的添加劑或其組合，但不局限于此。
本發(fā)明治療的疾病對(duì)象為炎性腸道疾病。炎性腸道疾病包括潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎。這些疾病主要發(fā)生于20歲左右的青年，但至今對(duì)其致病抗原或炎癥病理學(xué)機(jī)制了解很少。然而，目前正在采用多種細(xì)胞和細(xì)胞因子進(jìn)行廣泛的研究以闡明其機(jī)制。
過去的幾年中在對(duì)引起炎性腸道疾病的細(xì)胞的分析中觀察到一些進(jìn)展。因此，很顯然通過將純化的CD4陽性、CD45RB強(qiáng)陽性細(xì)胞(CD4+CD45RBhigh)轉(zhuǎn)入免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)就可建立炎性腸道疾病的動(dòng)物模型。(Morrissey,P.J.等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(1993)178,237-244；Leach,M.W.等人，美國病理學(xué)雜志(Am.J.Pathol.)(1996)148,1503-1515；Aranda,R等人，免疫學(xué)雜志(1997)158,3464-3473)。
另一方面已有顯示，CD4陽性、CD45RB弱陽性細(xì)胞(CD4+CD45RBlow)不能誘導(dǎo)炎性腸道疾病，反而抑制由CD4陽性、CD45RB強(qiáng)陽性細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎性腸道疾病(Powrie,F.R.等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(1994)179,589-600)。已知每個(gè)細(xì)胞CD45RB的表達(dá)與細(xì)胞因子產(chǎn)生模式有關(guān)。因此認(rèn)為，CD4陽性、CD45RB強(qiáng)陽性細(xì)胞為1型輔助(Th1)樣細(xì)胞，產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α,而CD4陽性、CD45RB弱陽性細(xì)胞為2型輔助(Th2)樣細(xì)胞，產(chǎn)生IL-4、IL-10等等(Lee,W.等人，免疫學(xué)雜志(1990)144,3288-3295)。
因此認(rèn)為炎性腸道疾病的發(fā)病主要與Th1和Th2的平衡紊亂有關(guān)，并由另一事實(shí)所證實(shí)，即由基因打靶方法生產(chǎn)的IL-10缺陷小鼠產(chǎn)生類似于人潰瘍性結(jié)腸炎的慢性炎性腸道疾病(Kuhn,R.等人，細(xì)胞(1993)75,263-274)。
實(shí)施例中使用的動(dòng)物模型其結(jié)腸的組織學(xué)特征非常類似于潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎病人(Leach,M.W.等人，美國病理學(xué)雜志，(1996)148,1503-1515)。潰瘍性結(jié)腸炎中經(jīng)常可看到從直腸開始大面積連續(xù)損傷，并且粘膜上皮也特別地受到損傷。本發(fā)明的模型中臨床病理學(xué)非常相似，即盡管損傷主要位于結(jié)腸和延伸腺體里但其損傷部位覆蓋廣泛。
另一方面，節(jié)段性回腸炎是一種深度炎癥，并不定位于粘膜，而是分散于消化道任何部位，從口腔到肛門。從組織學(xué)角度其特征為非干酪性壞死肉芽腫炎癥。這一模型非常類似于節(jié)段性回腸炎，即發(fā)現(xiàn)炎癥并不定位于巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和多核巨細(xì)胞聚集的粘膜層，并且通常為肉芽腫形式，很少發(fā)現(xiàn)隱窩囊腫。
因此，臨床研究早已報(bào)道了有關(guān)潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎特征共存的病例(Tanaka,M.等人，肝臟-胃腸病學(xué)(1990)37,18-31)。在炎性腸道疾病中發(fā)現(xiàn)上皮內(nèi)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ的表達(dá)增強(qiáng)(Trejdosiewicz,L.K.等人，Dig.Dis.Sci.,(1989)34,1449-1456)，并且本發(fā)明模型情況也如此。本模型中，出現(xiàn)上皮組織特征性加厚，并認(rèn)為與潰瘍性結(jié)腸炎病人中所見的細(xì)胞生長增強(qiáng)有關(guān)(Serafini,E.P.等人，腸(1981)22,648-652)。
本模型與臨床炎性腸道疾病非常相似，嚴(yán)重病例中可誘發(fā)體重減輕。在使用本模型的實(shí)驗(yàn)中，組織學(xué)損壞顯著好轉(zhuǎn)并且未觀察到體重減輕，表明IL-6拮抗劑對(duì)炎性腸道疾病(如潰瘍性結(jié)腸炎或節(jié)段性回腸炎)有治療效果。
將洗過的小鼠脾細(xì)胞懸浮于含2％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整為1.1×108/ml。向其中加入1/9體積抗鼠CD4抗體(L3T4微珠，Miltenyi Biotec生產(chǎn))，并在冰上與細(xì)胞結(jié)合15分鐘(細(xì)胞密度1×108ml)。下一步使用Mini MACS分離系統(tǒng)(Miltenyi Biotec生產(chǎn))進(jìn)行柱處理，收集CD4陽性細(xì)胞級(jí)分。細(xì)胞計(jì)數(shù)后懸浮于加有2％FCS的磷酸緩沖鹽液中，并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為4×107/ml。
在CD4陽性細(xì)胞懸液中加入1/100體積PE標(biāo)記的大鼠抗－小鼠CD4(L3T4)抗體(0.2mg/ml.克隆RM4-5,Pharmingen生產(chǎn))和1/100體積FITC標(biāo)記的大鼠抗－小鼠CD45RB抗體(0.5mg/ml，克隆16A,Pharmingen生產(chǎn))。冰上保持20分鐘后使抗體結(jié)合到細(xì)胞上。向標(biāo)記細(xì)胞中加入加有2％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，離心沖洗后重懸于含2％FCS的磷酸緩沖鹽液中，貯存于陰冷黑暗處。
從標(biāo)記的CD4陽性細(xì)胞中使用流式細(xì)胞儀(FACS Vantage，Becton Dickinson生產(chǎn))選出CD4陽性和CD45RB強(qiáng)陽性細(xì)胞群(CD4+CD45RBhigh細(xì)胞)。該細(xì)胞群相應(yīng)于在CD4和CD45RB陽性細(xì)胞中相應(yīng)具有CD45RB的高表達(dá)的上50％細(xì)胞群。離心后獲得的細(xì)胞重懸于磷酸緩沖鹽液至濃度4×106/ml。CD45RB陽性細(xì)胞的純度為97％，其存活率為98％。
將這種高度純化的細(xì)胞以4×105/ml(4×106/ml，每只100μl)濃度腹膜內(nèi)注射入C.B-17scid小鼠以制備炎性腸道疾病模型(Leach,M.W.等人，美國病理學(xué)雜志(1996)148,1503-1515,Aranda,R.等人，免疫學(xué)雜志(1997)158,3464,3473)。按照處理方法分以下三組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)移、未施用抗-IL-6受體抗體組，5只小鼠；(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)移、施用抗-IL-6受體抗體組，3只小鼠；(3)細(xì)胞非轉(zhuǎn)移組，3只小鼠。
抗-IL-6受體抗體MR16-1如下給藥。首先，用磷酸緩沖鹽液將抗體調(diào)至20mg/ml，在注射上述細(xì)胞前15～30分鐘腹膜內(nèi)注射抗體，每只小鼠100μl。一星期以后，用磷酸緩沖鹽液調(diào)至10mg/ml，每只小鼠腹膜內(nèi)給藥100μl。每星期重復(fù)一次直到細(xì)胞轉(zhuǎn)移后第8個(gè)星期。未施用抗體組以相似方式注射磷酸緩沖鹽液。
細(xì)胞轉(zhuǎn)移8至9周后給小鼠稱重，取出結(jié)腸組織(降結(jié)腸部分)浸入OCT化合物中。樣品于-80℃冷凍。用切片機(jī)(cytostat)將樣品塊切成6μm厚的冷凍片，固定于10％福爾馬林溶液。固定部分由蘇木精-伊紅方法雙重染色用于組織學(xué)分析。
通過在細(xì)胞轉(zhuǎn)移導(dǎo)入以誘導(dǎo)炎性腸道疾病之前和細(xì)胞轉(zhuǎn)移8～9星期之后測(cè)定體重變化(細(xì)胞轉(zhuǎn)移前后比率)和組織學(xué)分析，進(jìn)行藥效的評(píng)價(jià)。關(guān)于組織學(xué)分析，根據(jù)以下4階段炎性腸道疾病的得分對(duì)每只小鼠的組織進(jìn)行評(píng)估(這里指腸道疾病的得分)(Ito,H.等人，自身免疫學(xué)雜志(J.Autoimmunity)(1997)10,455-459)。
炎性腸道疾病的得分
0級(jí)(無病癥)與正常BALB/C小鼠無顯著差別，1級(jí)(輕度)觀察到上皮組織輕微肥大，2級(jí)(中度)介于1級(jí)和3級(jí)之間，3級(jí)(重度)上皮組織明顯肥大，伴隨大范圍炎性細(xì)胞浸潤和杯形細(xì)胞缺陷。


圖1顯示了體重變化和炎性腸道疾病得分的結(jié)果。
植入CD4陽性和CD45RB強(qiáng)陽性細(xì)胞的小鼠產(chǎn)生炎性腸道疾病，并觀察到明顯的組織學(xué)炎癥。它們還顯示出與疾病開始有關(guān)的乏力，平均體重減少11％。另一方面，抗-IL-6受體抗體施用組中觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯的抑制體重減輕，并且維持與細(xì)胞轉(zhuǎn)移前相同的體重。此外，炎性腸道疾病的組織學(xué)得分也顯示出炎性腸道疾病的改善。
關(guān)于體重變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)首先進(jìn)行ANOVA(方差分析，SPSS for Windows版本6,SPSS公司)分析，以確證顯著性，隨后用Bonferroni方法進(jìn)行多重比較，其中觀察到顯著性水平為5％。
這種模型與人炎性腸道疾病非常相似，因此表明抗-IL-6受體的抗體作為炎性腸道疾病(如潰瘍性結(jié)腸炎或節(jié)段性回腸炎)的預(yù)防或治療劑是有效的。
表1抗-IL-6受體的抗體抑制體重減輕和炎性腸道疾病惡化

體重變化由均值=群體標(biāo)準(zhǔn)差表示。
炎性腸道疾病分值由群體均值表示參考實(shí)施例1.人可溶性IL-6受體的制備通過PCR方法，使用包含編碼根據(jù)Yamasaki等人方法獲得的IL-6受體(Yamaski,K.等人，科學(xué)(1988)241,825-828)的cDNA之質(zhì)粒pBSF2R.236，制備可溶性IL-6受體。質(zhì)粒pBSF2R.236由限制酶SphI消化，獲得IL-6受體的cDNA，然后插入mp18(Amersham公司生產(chǎn))。使用設(shè)計(jì)插入IL-6受體cDNA一個(gè)終止密碼子的合成寡聚引物，采用體外突變系統(tǒng)(Amershan生產(chǎn))通過PCR方法，在IL-6受體cDNA中產(chǎn)生一個(gè)突變。該方案導(dǎo)致在氨基酸345位插入一個(gè)終止密碼子。并產(chǎn)生編碼可溶性IL-6受體的cDNA。
為了在CHO細(xì)胞中表達(dá)可溶性IL-6受體的cDNA，將其連接到質(zhì)粒pSV(Pharmacia生產(chǎn))中獲得質(zhì)粒pSVL 344。由HindⅢ-SalⅠ酶切的可溶性IL-6受體cDNA插入包含dhfr cDNA的質(zhì)粒pECEdhfr中，以獲得能在CHO細(xì)胞中表達(dá)的質(zhì)粒pECEdhfr 344。
使用磷酸鈣沉淀法(Chen C.等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)(1987)7,2745-2751)將10μg質(zhì)粒pECEdhfr 344轉(zhuǎn)染到dhfr-CHO細(xì)胞系DXB-11(Urland等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1980)77,4216-4220)。轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在無核苷的αMEM選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)3星期，該培養(yǎng)基中含有1mM谷氨酰胺、10％透析的FCS、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。
選擇的CHO細(xì)胞通過有限稀釋法篩選獲得單個(gè)CHO細(xì)胞克隆。CHO細(xì)胞克隆在20nM-200nM氨甲喋呤(MTX)中擴(kuò)增獲得生產(chǎn)人可溶性IL-6受體的CHO細(xì)胞系5E27。CHO細(xì)胞系5E27培養(yǎng)在含5％FBS的Iscov改良Dulbecco’s培養(yǎng)基(IMDM，Gibco生產(chǎn))中。收集培養(yǎng)上清液，并用ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清液中可溶性IL-6受體的濃度。結(jié)果證實(shí)培養(yǎng)上清液中含有可溶性IL-6受體。參考實(shí)施例2.人IL-6抗體的制備用10μg重組IL-6(Hirano等人，免疫學(xué)信件(Immunol.Lett.)1741,1988)和福氏完全佐劑免疫BALB/C小鼠，并且每星期重復(fù)一次直到血清中可檢測(cè)出抗-IL-6抗體。從局部淋巴結(jié)中取出免疫細(xì)胞，然后用聚乙二醇1500與骨髓瘤細(xì)胞系P3U1融合。根據(jù)Oi等人應(yīng)用HAT培養(yǎng)基的方法(細(xì)胞免疫學(xué)中的篩選方法，W.H.Freeman和Co.,舊金山，351，1980)篩選雜交瘤，建立生產(chǎn)人IL-6抗體的雜交瘤。
生產(chǎn)人IL-6抗體的雜交瘤按以下方法進(jìn)行IL-6結(jié)合實(shí)驗(yàn)。因此，由柔韌的聚乙烯制造的96孔微量滴定板(Dynatech實(shí)驗(yàn)室公司，Alexandra,VA)包被100μl山羊抗小鼠Ig(10μl/ml,Cooper生物醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)，Malvern,PA)，4℃過夜。隨后用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS室溫處理2小時(shí)。
PBS沖洗后每孔加入100μl雜交瘤培養(yǎng)上清液，4℃孵育過夜。洗板后每孔加入125I標(biāo)記的重組IL-6至濃度為2000cpm/0.5ng/孔，然后用γ計(jì)數(shù)儀(Beckman Gamma 9000,Beckman儀器，F(xiàn)ullerton,CA)在洗板后測(cè)定每孔的放射性。216個(gè)雜交瘤克隆中32個(gè)為IL-6結(jié)合實(shí)驗(yàn)陽性。最終從這些克隆中獲得穩(wěn)定的MH166.BSF2。由該雜交瘤生產(chǎn)的抗-IL-6抗體MH166具有IgG1κ亞型。
然后采用IL-6依賴型小鼠雜交瘤克隆MH60.BSF2檢測(cè)MH166抗體對(duì)雜交瘤生長的中和活性。分散MH60.BSF2細(xì)胞至1×104/200μl/孔，并加入含MH166抗體的樣品，培養(yǎng)48小時(shí)，加入0.5μCi/孔3H-胸苷(New Engliand Nuclear，波士頓，MA)繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。將細(xì)胞置于玻璃濾紙上用自動(dòng)收獲器(LaboMash科學(xué)公司，Tokyo,Japan)處理。兔抗-IL-6抗體用作對(duì)照。
結(jié)果，MH166抗體以劑量依賴的方式抑制了由IL-6誘導(dǎo)的MH60.BSF2細(xì)胞對(duì)3H-胸苷的摻入。由此表明MH166抗體中和了TT-6的活性。參考實(shí)施例3.人抗-IL-6受體的抗體的制備由Hirata等人的方法(Hirata,Y.等人，免疫學(xué)雜志143,2900-2906,1989)制備的抗-IL-6受體的抗體根據(jù)吸附原則與CNBr活化的Sepharose 4B(Pharmacia精細(xì)化工生產(chǎn)，Piscataway,NJ)結(jié)合，IL-6受體(Yamasaki,K.等人，科學(xué)(1988)241,825-828)獲得純化。人骨髓瘤細(xì)胞系U266用含1％毛地黃皂苷(Wako化工生產(chǎn))、10mM三乙醇胺(pH7.8)和0.15M NaCl(毛地黃皂苷緩沖液)的1mM鹽酸對(duì)氨基苯甲烷磺酸氟溶解，并與結(jié)合在Sepharose 4B珠上的MT18抗體混合。然后用毛地黃皂苷緩沖液沖洗珠體6次以制備部分純化的IL-6受體。
用以上從3×109U266細(xì)胞中獲得的部分純化的IL-6受體每隔10天免疫一次BALB/C小鼠，共免疫4次，然后用標(biāo)準(zhǔn)方法制備雜交瘤。根據(jù)以下描述的方法檢測(cè)陽性生長孔雜交瘤培養(yǎng)上清液與IL-6受體結(jié)合的活性。5×107U266細(xì)胞用35S－蛋氨酸(2.5mCi)標(biāo)記，并用以上毛地黃皂苷緩沖液溶解。溶解的U266細(xì)胞與0.04ml與Sepharose 4B珠結(jié)合的MT18抗體混合，然后用毛地黃皂苷緩沖液洗6次。用0.25ml毛地黃皂苷緩沖液(pH3.4)洗脫35S-蛋氨酸標(biāo)記的IL-6受體，并用0.025ml 1M Tris(pH7.4)中和。
0.05ml雜交瘤培養(yǎng)上清液與0.01ml蛋白G Sepharose(Pharmacia生產(chǎn))混合。沖洗后Sepharose與上述制備的0.005ml35S-標(biāo)記的IL-6受體溶液孵育。用SDS-PAGE方法分析免疫沉淀，并查找與IL-6受體反應(yīng)的雜交瘤培養(yǎng)上清液。結(jié)果建立了陽性雜交瘤克隆PM-1。由PM-1雜交瘤生產(chǎn)的抗體具有IgG1κ亞型。
使用人骨髓瘤細(xì)胞系U266研究雜交瘤PM-1生產(chǎn)的抗體其抑制IL-6與人IL-6受體結(jié)合的活性。從大腸桿菌制備的人重組IL-6(Hirano等人，免疫學(xué)通信(741-45,1988)采用Bolton-Hunter試劑(New England Nuclear,Boston,MA)(Taga,T.等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(1987)166,967-981)用125I標(biāo)記。4×105U266細(xì)胞與70％(V/V)PM-1雜交瘤培養(yǎng)上清液以及14,000cmp125I-標(biāo)記的IL-6室溫共培養(yǎng)1小時(shí)。70μl樣品鋪在一個(gè)400μl聚乙烯微量離心管中300μl FCS上。離心后測(cè)定細(xì)胞的放射性。
結(jié)果顯示雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體抑制IL-6與IL-6受體的結(jié)合。參考實(shí)施例4.小鼠抗-IL-6受體的抗體制備根據(jù)Saito，等人，免疫學(xué)雜志(1993)147,168-173中描述的方法制備抗小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
生產(chǎn)小鼠可溶性IL-6受體的CHO細(xì)胞培養(yǎng)于包含10％FCS的IMDM培養(yǎng)基。用小鼠可溶性IL-6受體抗體RS12(參見Saito等人，出處同上)和裝有Affigel 10凝膠(Biorad生產(chǎn))的親和柱從培養(yǎng)上清液中純化小鼠可溶性IL-6受體。
小鼠可溶性IL-6受體(50μg)與福氏完全佐劑混合后注射到Wistar大鼠的腹腔內(nèi)。施用2星期后用福氏不完全佐劑對(duì)動(dòng)物增強(qiáng)免疫。45天時(shí)處死大鼠，以約2×108脾細(xì)胞與1×107小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3U1用50％的PEG1500(Boehringer Mannheim)按常規(guī)方法融合，然后用HAT培養(yǎng)基篩選。
將雜交瘤培養(yǎng)上清液加至用兔抗大鼠IgG抗體(Cappel生產(chǎn))包被的板上之后，加入小鼠可溶性IL-6受體。隨后用兔抗小鼠IL-6受體的抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的綿羊抗兔IgG，通過ELISA篩選出生產(chǎn)抗-小鼠可溶性IL-6受體的抗體的雜交瘤。當(dāng)確證生產(chǎn)目的抗體后，對(duì)雜交瘤克隆亞篩選2次，直到獲得單一雜交瘤克隆。該克隆命名為MR16-1。
雜交瘤生產(chǎn)的抗體對(duì)小鼠IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中和活性，通過摻使用MH60.BSF2細(xì)胞檢測(cè)3H-胸苷的摻入(Matsuda,T.等人，免疫學(xué)雜志(1988)18,951-956)得到檢驗(yàn)。MH60.BSF2細(xì)胞以1×104細(xì)胞/200μl/孔在96孔微量板上制備。10pg/ml小鼠IL-6和MR16-1抗體或RS12抗體以12.3～1000ng/ml加至每孔，然后在5％CO2及37℃條件下培養(yǎng)44小時(shí)，之后加入1μCi/孔3H-胸苷。4小時(shí)后測(cè)定摻入的3H-胸苷。結(jié)果MR16-1抗體抑制了MH60.BSF2細(xì)胞對(duì)3H-胸苷的摻入。
因此證明雜交瘤MR16-1生產(chǎn)的抗體抑制IL-6與IL-6受體的結(jié)合。
工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明，表明IL-6拮抗劑如抗-IL-6受體的抗體對(duì)炎性腸道疾病有治療效果。因此表明IL-6拮抗劑可用作對(duì)節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎的治療劑。
權(quán)利要求
1．一種包含白細(xì)胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為活性成分的炎性腸道疾病的預(yù)防或治療劑。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的預(yù)防或治療劑，其中IL-6拮抗劑為針對(duì)IL-6受體的抗體。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的預(yù)防或治療劑，其中針對(duì)IL-6受體的抗體為一種針對(duì)IL-6受體的單克隆抗體。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的預(yù)防或治療劑，其中針對(duì)IL-6受體的抗體為一種針對(duì)人IL-6受體的單克隆抗體。
5．根據(jù)權(quán)利要求3的預(yù)防或治療劑，其中針對(duì)IL-6受體的抗體是一種針對(duì)小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
6．根據(jù)權(quán)利要求2～5中任何一項(xiàng)的預(yù)防或治療劑，其中針對(duì)IL-6受體的抗體是一種重組抗體。
7．根據(jù)權(quán)利要求4的預(yù)防或治療劑，其中針對(duì)人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
8．根據(jù)權(quán)利要求5的預(yù)防或治療劑，其中針對(duì)小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
9．根據(jù)權(quán)利要求2～4中任何一項(xiàng)的預(yù)防或治療劑，其中針對(duì)IL-6受體的抗體為針對(duì)IL-6受體的嵌合抗體或人源化抗體。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的預(yù)防或治療劑，其中針對(duì)IL-6受體的人源化抗體為人源化PM-1抗體。
11．根據(jù)權(quán)利要求1～10中任何一項(xiàng)的預(yù)防或治療劑，其中炎性腸道疾病為節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎。
12．一種抑制炎性腸道疾病中體重減輕的藥劑，所述藥劑包含IL-6拮抗劑作為活性成分。
13．一種抑制炎性腸道疾病中體重減輕的藥劑，所述藥劑包含針對(duì)IL～6受體的抗體作為活性成分。
14．一種預(yù)防或治療炎性腸道疾病的方法，該方法包含給對(duì)象施用白細(xì)胞介素-6(IL-6)拮抗劑。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中IL-6拮抗劑為針對(duì)IL-6受體的抗體。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中針對(duì)IL-6受體的抗體為一種針對(duì)IL-6受體的單克隆抗體。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中針對(duì)IL-6受體的抗體為一種針對(duì)人IL-6受體的單克隆抗體。
18．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中針對(duì)IL-6受體的抗體為一種針對(duì)小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
19．根據(jù)權(quán)利要求15～18中任何一項(xiàng)的方法，其中針對(duì)IL-6受體的抗體是一種重組抗體。
20．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中針對(duì)人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
21．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中針對(duì)小鼠IL-6受體的單克隆抗體為MR16-1抗體。
22．根據(jù)權(quán)利要求15～17中任何一項(xiàng)的方法，其中針對(duì)IL-6受體的抗體為針對(duì)IL-6受體的嵌合抗體或人源化抗體。
23．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中針對(duì)IL-6受體的人源化抗體為人源化PM-1抗體。
24．根據(jù)權(quán)利要求14～23中任何一項(xiàng)的方法，其中炎性腸道疾病為節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎。
25．一種抑制炎性腸道疾病中體重減輕的方法，該方法包含給對(duì)象施用IL-6拮抗劑。
26．一種抑制炎性腸道疾病體重減輕的方法，該方法包含給對(duì)象施用針對(duì)IL-6受體的抗體。
27．白細(xì)胞介素-6(IL-6)拮抗劑用于制備炎性腸道疾病預(yù)防或治療劑的用途。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中IL-6拮抗劑為針對(duì)IL-6受體的抗體。
29．根據(jù)權(quán)利要求28的用途，其中針對(duì)IL-6受體的抗體為針對(duì)IL-6受體的單克隆抗體。
30．根據(jù)權(quán)利要求29的用途，其中針對(duì)IL-6受體的抗體為針對(duì)人IL-6受體的單克隆抗體。
31．根據(jù)權(quán)利要求29的用途，其中針對(duì)IL-6受體的抗體為針對(duì)小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
32．根據(jù)權(quán)利要求28～31中任何一項(xiàng)的用途，其中針對(duì)IL-6受體的抗體是一種重組抗體。
33．根據(jù)權(quán)利要求30的用途，其中針對(duì)人IL-6受體的單克隆抗體為PM-1抗體。
34．根據(jù)權(quán)利要求31的用途，其中針對(duì)小鼠IL-6受體的單克隆抗體為MR16-1抗體。
35．根據(jù)權(quán)利要求28～30中任何一項(xiàng)的用途，其中針對(duì)IL-6受體的抗體為針對(duì)IL-6受體的嵌合抗體或人源化抗體。
36．根據(jù)權(quán)利要求35的用途，其中針對(duì)IL-6受體的人源化抗體為人源化PM-1抗體。
37．根據(jù)權(quán)利要求27～36中任何一項(xiàng)的用途，其中炎性腸道疾病為節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎。
38．IL-6拮抗劑用于生產(chǎn)抑制炎性腸道疾病中體重減輕的藥劑的用途。
39．針對(duì)IL-6受體的抗體用于生產(chǎn)抑制炎性腸道疾病中體重減輕的藥劑的用途。
全文摘要
一種炎性腸道疾病如節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)防或治療劑,該藥劑包含作為活性成分的白細(xì)胞介素－6(IL－6)拮抗劑,如針對(duì)IL－6受體的抗體。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1297357SQ99805209
公開日2001年5月30日 申請(qǐng)日期1999年3月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月17日
發(fā)明者岸本忠三, 伊藤裕章, 山本光成 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社, 岸本忠三