專利名稱：半抗原修飾的腫瘤細胞膜和制備及應(yīng)用半抗原修飾的腫瘤細胞膜的方法
有關(guān)政府基金的參考文獻此處描述的本發(fā)明是在國家衛(wèi)生研究所-國家癌癥研究所基金號CA-39248的許可或授權(quán)下的工作中進行的。美國政府可具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
Fujiwara等人，免疫學(xué)雜志，1984132，1571表示，某些半抗原化的腫瘤細胞，即與半抗原三硝基苯(TNP)結(jié)合的腫瘤細胞，能在鼠系統(tǒng)中誘導(dǎo)對未修飾的腫瘤細胞的系統(tǒng)性免疫，只要該小鼠首先在無半抗原特異的抑制T細胞的情況下對該半抗原致敏。被治療小鼠的脾細胞在未治療的受者動物中完全并特異地阻止了腫瘤的生長。Flood等人，免疫學(xué)雜志，1987，138，3573顯示，用TNP結(jié)合的紫外線誘導(dǎo)的“退化”腫瘤加以免疫的小鼠能排斥TNP結(jié)合的“進行性”腫瘤，這是非免疫性的。而且，這些小鼠隨后耐受未結(jié)合的“進行性”腫瘤的攻擊。在另一個實驗系統(tǒng)中，F(xiàn)ujiwara等人，免疫學(xué)雜志，1984，133，510證明，在環(huán)磷酰胺預(yù)處理后用三硝基氯苯(TNCB)致敏的小鼠通過對腫瘤細胞的原位半抗原處理能治愈較大(10mm)的腫瘤；隨后，這些動物特異地耐受未結(jié)合的腫瘤細胞的攻擊。
Fujiwara等人的教導(dǎo)由于包括下列的幾個原因而不同于本發(fā)明A．Fujiwara的組合物中使用的細胞來源于誘導(dǎo)的可移植鼠腫瘤，而不是來源于自發(fā)的人類腫瘤；B．Fujiwara的組合物用于免疫預(yù)防，而本發(fā)明使用免疫治療；C．Fujiwara的組合物作為局部治療施用，而本發(fā)明的組合物通過全身接種施用；D．Fujiwara的組合物不引起腫瘤退化，而本發(fā)明的組合物至少在相當(dāng)一部分所治療患者中引起退化和／或使存活時間延長；和E．Fujiwara施用腫瘤細胞，而本發(fā)明教導(dǎo)腫瘤細胞膜的施用。
最近證明了存在能與未修飾的組織交叉反應(yīng)的T細胞。Weltzien及同事顯示，從用TNP修飾的同源淋巴細胞免疫的小鼠中產(chǎn)生的I類MHC限制性T細胞克隆能應(yīng)答MHC相關(guān)的、TNP修飾的“自身”肽。Ortmann，B．等人，免疫學(xué)雜志，1992，148，1445。另外，已經(jīng)明確，用TNP修飾的淋巴細胞免疫小鼠引起可在體外顯示次級增殖反應(yīng)和對TNP修飾細胞有細胞毒性反應(yīng)的脾T細胞的發(fā)展。Shearer，G．M．，歐洲免疫學(xué)雜志，1974，4，527。由用DNP或TNP修飾的自體細胞免疫引起的、以應(yīng)答未修飾的自體細胞的淋巴細胞的潛能是相當(dāng)有意義的，因為這可能與兩種臨床問題有關(guān)1)藥物誘導(dǎo)的自身免疫病，2)癌癥免疫治療。對于前者，曾經(jīng)建議用口服藥作為半抗原，它與正常的組織蛋白質(zhì)結(jié)合形成可被T細胞識別的免疫復(fù)合物。Tsutsui，H．等人，免疫學(xué)雜志，1992，149，706。隨后，能發(fā)展為自身免疫病，例如，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，甚至在取消不喜歡的藥物之后仍持續(xù)。這將意味著可與未修飾的組織交叉反應(yīng)的T淋巴細胞的最終產(chǎn)生。
這些實驗的共同特征是在不誘導(dǎo)抑制細胞的環(huán)境下用半抗原致敏。環(huán)磷酰胺預(yù)處理的、TNCB致敏的小鼠的脾細胞顯示抗輻射性“增強的輔助功能”，即，它們特異地增強抗TNP細胞毒性的體外產(chǎn)生。而且，一旦這些增強的輔助功能被體外接觸TNP結(jié)合的自體淋巴細胞所激活，則它們也能增強對非相關(guān)抗原包括腫瘤抗原的細胞毒性(Fujiwara等人，1984)。Flood等人(1987)，同上文，顯示這種增強的輔助活性由具有Lyt-1+、Lyt-2-、L3T4+、I-J+表型的T細胞所介導(dǎo)，并提出這些細胞是反抑制細胞，一種新類型的免疫調(diào)節(jié)T細胞。
對黑素瘤患者的免疫治療顯示，在用初級抗原匙孔戚血藍蛋白致敏三天前施用高劑量(1000mg／M2)或低劑量(300mg／M2)的環(huán)磷酰胺，顯著增強了對該抗原的遲發(fā)型過敏反應(yīng)的獲得(Berd等人，癌癥研究(Cancer Res．)，1982，42，4862；癌癥研究，1984，44，1275)。低劑量環(huán)磷酰胺預(yù)處理使轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者應(yīng)答自體黑素瘤疫苗注射，產(chǎn)生對自體黑素瘤細胞的遲發(fā)型過敏反應(yīng)(Berd等人，癌癥研究，1986，46，2572；癌癥研究，1988，6，335)。環(huán)磷酰胺施用導(dǎo)致外周血淋巴細胞非特異性T抑制功能的降低(Berd等人，癌癥研究，1984，44，5439；癌癥研究，1987，47，3317)，這可能是由于耗貧了CD4+、CD45R+抑制誘導(dǎo)T細胞(Berd等人，癌癥研究，1988，48，1671)。該免疫治療方案的抗腫瘤作用似乎受開始施用疫苗與形成對腫瘤細胞的遲發(fā)型過敏反應(yīng)之間的過長間隔所限制(Berd等人，美國癌癥研究學(xué)會學(xué)報(Amer．Assoc．Cancer Res．)，1988，29，408(#1626))。因此，仍需要提高這種疫苗的治療效率以使其更具免疫原性。
大多數(shù)腫瘤免疫學(xué)家現(xiàn)在贊同，T淋巴細胞-負(fù)責(zé)腫瘤免疫的白細胞-向腫瘤塊中的浸潤是免疫系統(tǒng)破壞腫瘤的先決條件。因此，許多注意力已經(jīng)集中于已知如NCI的Stephen Rosenberg博士所開創(chuàng)的“TIL”治療。Rosenberg博士和其他人從人類轉(zhuǎn)移癌中提取出少量T淋巴細胞，這些T淋巴細胞天然存在，通過與白細胞介素2(IL2)-T淋巴細胞的一種生長因子-一起體外培養(yǎng)能大大增加其數(shù)量。Topalian等人，臨床腫瘤學(xué)雜志(J．Clin．Oncol．)，1988，6，839。然而，這種治療還不是十分有效的，因為注射的T細胞的能力僅限于向腫瘤部位的“回歸”。
在大量研究中在治療上利用了高濃度IL2誘導(dǎo)淋巴細胞成為非特異性細胞毒性殺傷細胞的能力(Lotze等人，生物學(xué)反應(yīng)雜志(J．Biol．Response)，1982，3，475；West等人，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New Engl．J．Med．)，1987，316，898)。然而，由于高劑量靜脈內(nèi)IL2的強毒性，使該方法具有局限性。已將少量注意力投向以下現(xiàn)象，相當(dāng)?shù)蜐舛鹊腎L2能通過誘導(dǎo)抗原活化T細胞的擴充而作為免疫佐劑(Talmadge等人，癌癥研究，1987，47，5725；Meuer等人，柳葉刀(Lancet)，1989，1，15)。因此，仍然需要理解并努力開發(fā)IL2作為免疫佐劑的用途。
據(jù)認(rèn)為，人類黑素瘤表達可被T淋巴細胞識別的獨特表面抗原。Old，L．J．，癌癥研究，1981，41，361；Van der Bruggen，P．等人，科學(xué)，1991，254，1643；Mukherji，B．等人，免疫學(xué)雜志，1986，136，1888；和Anichini，A．等人，免疫學(xué)雜志，1989，142，3692。然而，在體內(nèi)誘導(dǎo)對這些抗原的有效T細胞介導(dǎo)反應(yīng)的困難限制了在本發(fā)明人進行工作之前的免疫療法。
提出了幾種模型來解釋似乎什么是對人類腫瘤相關(guān)抗原的耐受性。包括1)下調(diào)初期抗腫瘤反應(yīng)的腫瘤抗原特異性抑制細胞。Mukherji等人，同上文；Berendt，M．J．和R．J．North．，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J．Exp．Med．)，1980，151，69。
2)人類腫瘤細胞不能引發(fā)T輔助細胞或為這些T細胞提供共刺激信號。Fearon，E．R．等人，細胞(Cell)，1990，60，397；Townsend，S．E．和J．P．Allison，科學(xué)，1993，259，368；和3)主要組織相容性產(chǎn)物在腫瘤細胞上降低的表面表達，這限制了其被T細胞的識別。Ruiter，D．J．，癌癥生物學(xué)研討會(Seminars in CancerBiology)，1991，2，35。這些假說中還沒有一個在臨床系統(tǒng)中證實。
無論這些解釋是否真實，仍繼續(xù)需要對多種惡性腫瘤的更有效治療。
對于急性骨髓性白血病(AML)，將AML的治療分為一個或兩個初期誘導(dǎo)階段和幾個緩解后過程，也稱為鞏固化學(xué)治療。初期誘導(dǎo)化學(xué)治療根據(jù)所用的方案可在55-88％的患者中誘導(dǎo)完全的應(yīng)答。然而，這些患者中的大多數(shù)復(fù)發(fā)，長期(5年+)存活的AML患者僅為20-30％。在第一次緩解期間在治療方案中加上高劑量化學(xué)治療和骨髓移植(BMT)結(jié)果能引起適度的改善。例如，經(jīng)受同種異體BMT的患者在5年存活率上有5-10％的增長。然而，BMT的嚴(yán)格合格標(biāo)準(zhǔn)(例如年齡、HLA匹配供體的可獲得性)嚴(yán)重限制了可治療的患者的數(shù)量。一旦AML患者復(fù)發(fā)，只有30％的機會實現(xiàn)第二次緩解，并且極少患者能最后成為無病的。對復(fù)發(fā)的治療形式包括與實現(xiàn)第一次緩解所用的類似的方案(誘導(dǎo)治療，隨后是幾個療程的鞏固化學(xué)治療)，盡管也能使用高劑量的單一藥劑和BMT(Keating等人)。
骨髓移植方面的經(jīng)驗提示，免疫排斥可能在疾病的控制中起作用。移植物抗宿主疾病(GVHD)和復(fù)發(fā)是用BMT治療的患者死亡的兩個主要原因。如果發(fā)生弱的GVHD，則復(fù)發(fā)的危險降低(Horowitz等人)。因此曾經(jīng)假定移植的淋巴細胞能夠免疫排斥宿主白血病細胞(移植物抗白血病反應(yīng)，GVL)。對特定白血病細胞抗原的T細胞反應(yīng)能介導(dǎo)該GVL反應(yīng)，盡管免疫原性人白血病抗原尚未得到證明(對于黑素瘤同樣如此)。已知人AML細胞強烈表達Ⅰ類和Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)抗原(Ashman等人；Andreasen等人)，這是分別誘導(dǎo)CD8-和CD4-介導(dǎo)的T細胞反應(yīng)的先決條件。然而，針對白血病細胞的T細胞反應(yīng)的誘導(dǎo)尚未成功。
有幾種免疫學(xué)方法曾用于急性白血病的治療(Foon等人；Caron和Scheinberg)。這些方法分為非特異的方法，如卡介苗(BCG)、白細胞介素2、左旋咪唑、結(jié)核桿菌的甲醇抽提殘余物；和特異性的方法，如單克隆抗體和疫苗(收集的白血病細胞、無細胞提取物和培養(yǎng)的細胞)。這些研究中的大多數(shù)在已經(jīng)緩解的患者中進行，其中免疫治療可成功用于控制剩余的疾病。
二十世紀(jì)六十年代后期和二十世紀(jì)七十年代早期，英格蘭St．Barthlomew醫(yī)院的R．Powles研究組進行了一系列在化學(xué)治療誘導(dǎo)的緩解后用疫苗治療AML患者的研究(Powles，1974；Powles等人，1977)。他們使用同種異體AML細胞，以BCG作為佐劑。進行了幾次試驗，全部是小樣本容量(N=10-15)。與單獨的化學(xué)療法相比，使用化學(xué)療法與免疫療法的組合使存活期有所延長，而無復(fù)發(fā)的存活不延長。未觀察到嚴(yán)重的毒性；未見自身免疫(例如，對正常骨髓的毒性)?；叵肫饋?，這些試驗有許多技術(shù)問題1)使用同種異體的而不是自體的白血病細胞；2)疫苗中白血病細胞的劑量是過量的(高達109細胞／劑量)；3)BCG劑量極高，并且BCG施用被時間和白血病細胞疫苗的位置所分開；4)當(dāng)患者接受細胞毒性藥物時施用疫苗(維持或鞏固化學(xué)治療)。
上述治療的有限成功的免疫化學(xué)基礎(chǔ)還有待思考，但正在檢驗幾種假說。Kim和Jang(1992)建議，對特定表位的T細胞反應(yīng)的缺乏可能不是由于T細胞所有成分的缺乏，而是由于產(chǎn)生特定表位的困難。Martin等人(1993)通過假定存在由于對“自身”肽親和力較低而可逃脫胸腺選擇的自身反應(yīng)性T細胞，解釋了他們的結(jié)果。
治療人類癌癥的常規(guī)嘗試尚未成功。如上所述例舉的組合物的施用不能可靠地誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的免疫的發(fā)展，如遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)、T細胞浸潤和炎性免疫應(yīng)答所示。
因此，不管在癌癥治療中報道的基于免疫作用提出的多種理論的嘗試數(shù)量如何，仍需要一種組合物，其在施用于哺乳動物后，能引發(fā)浸潤腫瘤的T淋巴細胞、引發(fā)對腫瘤的炎性免疫應(yīng)答、并引發(fā)對腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。申請人現(xiàn)在已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，使用從同源或同種異體腫瘤細胞中分離的膜具有這些希望的特性。
一方面，本發(fā)明涉及一種分離的半抗原修飾的哺乳動物(優(yōu)選地為人)腫瘤細胞膜。該半抗原可選自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙?；?N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸熒光素、砷酸苯異硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磷酰膽堿、磺胺酸、阿散酸和二硝基苯-S-芥及其組合。
另一方面，本發(fā)明涉及一種單獨含有半抗原修飾的哺乳動物腫瘤細胞膜或同時含有半抗原修飾的哺乳動物腫瘤細胞的組合物。
再另一方面，本發(fā)明提供一種含有治療有效量的哺乳動物(優(yōu)選地人)腫瘤細胞膜的疫苗組合物，用于向患有與該腫瘤細胞膜相同類型的惡性腫瘤的哺乳動物施用。
本發(fā)明的另一方面，該組合物含有一種佐劑，如卡介苗、QS-21、脫毒的內(nèi)毒素和細胞因子如白細胞介素2、白細胞介素4、γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素12、白細胞介素15和GM-CSF。
本發(fā)明的膜和組合物(當(dāng)對患有與分離該膜的腫瘤細胞相同類型惡性腫瘤的哺乳動物(優(yōu)選地人)施用時)至少具有下列性質(zhì)之一(ⅰ)引發(fā)浸潤所治療的哺乳動物腫瘤的T淋巴細胞，(ⅱ)引發(fā)對該哺乳動物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答，(ⅲ)引發(fā)對該哺乳動物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。本發(fā)明的膜和組合物也具有在體外刺激T細胞的性質(zhì)。
再另一方面，本發(fā)明涉及一種治療癌癥的方法，包括向哺乳動物(優(yōu)選地人)施用一種含有治療有效量的半抗原修飾的人腫瘤細胞膜的組合物，其中該哺乳動物患有與該腫瘤細胞膜相同類型的惡性腫瘤。
另外，本發(fā)明涉及一種方法，包括引發(fā)具有浸潤該哺乳動物(優(yōu)選地人)腫瘤的性質(zhì)的T淋巴細胞，和任選地，測定浸潤該哺乳動物腫瘤的T淋巴細胞。本發(fā)明進一步涉及一種方法，包括引發(fā)對該哺乳動物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答，和任選地，測定該炎性免疫應(yīng)答，或者涉及一種方法，包括引發(fā)對該哺乳動物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，和任選地，測定該遲發(fā)型過敏反應(yīng)。本發(fā)明也涉及一種在體外刺激T細胞的方法。
在本發(fā)明的再另一方面，本發(fā)明涉及一種制備半抗原修飾的腫瘤細胞膜的方法。發(fā)明詳述在此引用的所有專利、專利申請和參考文獻都引入作為參考。如果出現(xiàn)矛盾，以本公開內(nèi)容為準(zhǔn)。
本發(fā)明涉及一種分離的修飾的和未修飾的腫瘤細胞膜、一種含有這種膜的新型組合物、分離和制備該膜和含有該膜的組合物的方法、和使用本發(fā)明的膜和組合物的方法。
本發(fā)明的膜和組合物可用于治療哺乳動物優(yōu)選地人的癌癥，包括轉(zhuǎn)移和原發(fā)性癌癥、實體瘤和非實體瘤，如直腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、腎癌和前列腺癌。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期癌癥可以用分離修飾的膜、本發(fā)明的組合物和方法來治療，優(yōu)選的是Ⅲ期和Ⅳ期，再更優(yōu)選的是Ⅲ期。患有前述類型的轉(zhuǎn)移癌的哺乳動物，特別是人，可以用本發(fā)明的膜、組合物和方法治療。在一個實施方案中，用本發(fā)明治療家畜如貓、犬、馬和?？频某蓡T。
本發(fā)明的膜和組合物也可用于引發(fā)具有浸潤哺乳動物腫瘤的性質(zhì)的T淋巴細胞，引發(fā)對哺乳動物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答，引發(fā)對哺乳動物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，和／或在體外刺激T淋巴細胞。
應(yīng)當(dāng)理解，本說明書中有關(guān)應(yīng)用分離的腫瘤細胞的任何公開內(nèi)容同樣適用于腫瘤細胞膜的應(yīng)用，或適用于腫瘤細胞和腫瘤細胞膜的組合。腫瘤細胞膜及其組合物本發(fā)明的分離的修飾的腫瘤細胞膜由哺乳動物優(yōu)選地人的腫瘤細胞制備。在本發(fā)明的一個實施方案中，從貓、犬、馬或?？苿游锏哪[瘤中分離腫瘤細胞膜。
對于本發(fā)明，腫瘤細胞的定義中包括完整的和破裂的腫瘤細胞。分離膜的腫瘤細胞可以是活細胞、減毒細胞或被殺傷的細胞。本發(fā)明中能使用在對患者施用后不生長和分裂從而基本上保持非生長狀態(tài)的腫瘤細胞。如果對患者單獨施用或與分離的腫瘤細胞膜結(jié)合施用，則這些細胞是優(yōu)選的。應(yīng)當(dāng)理解，“非生長狀態(tài)的細胞”意思是在體內(nèi)不分裂的活的、減毒的或被殺傷的、完整或破裂的(或者同時有完整和破裂的)細胞。懸浮非生長狀態(tài)的細胞的常規(guī)方法為技術(shù)人員所知，并可用于本發(fā)明。例如，可以在使用前照射細胞使其不能生長和分裂。腫瘤細胞可以以例如2500R照射，以阻止細胞在施用后生長。另外，也可從能在體內(nèi)生長并分裂的腫瘤細胞中分離腫瘤細胞膜。優(yōu)選地，在該情況中，腫瘤細胞膜制品未被能在體內(nèi)分裂的腫瘤細胞所污染。
腫瘤細胞膜分離自與欲治療的癌癥相同類型的腫瘤細胞。例如，用于治療卵巢癌的膜分離自卵巢癌細胞。優(yōu)選地，腫瘤細胞來源于欲治療的同一患者。腫瘤細胞優(yōu)選地是與患者同源的(例如自體的)，但也可以是同種異體的。為定義為“同源的”，腫瘤細胞不需與所治療患者的腫瘤細胞或非腫瘤體細胞完全(即100％)遺傳學(xué)上相同。(分離出膜的)腫瘤細胞與患者之間的MHC分子遺傳同一性通常是充分的。另外，在用作膜來源的腫瘤細胞上的特定抗原與患者腫瘤細胞上存在的抗原之間可有遺傳同一性。遺傳同一性可以按照本領(lǐng)域公知的方法測定。同源的腫瘤細胞意思也可是一種經(jīng)遺傳改變(例如利用重組DNA技術(shù))而使其在例如患者特定MHC分子和／或患者癌細胞上特定抗原方面遺傳學(xué)上相同的細胞。也可使用來源于相同種的動物而遺傳學(xué)上不同的腫瘤細胞，如同種異體細胞，制備本發(fā)明的腫瘤細胞膜。腫瘤細胞可以是但不限于從活檢標(biāo)本或從組織培養(yǎng)物中分離的細胞。從同種異體細胞和干細胞分離的膜也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
腫瘤細胞膜可包括所有細胞膜，如外膜、核膜、線粒體膜、液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基復(fù)合體膜和溶酶體膜。在本發(fā)明的一個實施方案中，超過大約50％的膜是腫瘤細胞質(zhì)膜。優(yōu)選地，超過大約60％的膜由腫瘤細胞質(zhì)膜組成，超過大約70％是更優(yōu)選的，80％是甚至更優(yōu)選的，90％是甚至更優(yōu)選的，95％是甚至更優(yōu)選的，99％是最優(yōu)選的。
優(yōu)選地，分離的膜基本上不含細胞核和細胞。例如，如果在大約2×108細胞當(dāng)量(c．e．)的膜物質(zhì)中含有少于大約100個細胞和／或細胞核，則膜制品為基本上不含細胞核或細胞。細胞當(dāng)量是從所示數(shù)量的細胞中分離的膜的數(shù)量。基本上不含細胞和／或細胞核的分離的腫瘤細胞膜可以含有淋巴細胞和／或淋巴細胞膜。
優(yōu)選地，分離的腫瘤細胞膜是細胞外膜，即，腫瘤細胞質(zhì)膜。本發(fā)明的膜制品可含有完整的外膜或其部分。含有一部分外膜的本發(fā)明分離的膜包含有外膜的至少一種MHC分子部分和／或一種熱激蛋白部分。膜片段的大小不是重要的。
同種異體腫瘤細胞膜也可在本發(fā)明的方法中與同源(例如自體)抗原呈遞細胞一起使用。該方法允許用來源于非患者自身腫瘤的腫瘤細胞膜來免疫患者。同源抗原呈遞細胞加工同種異體膜，使得患者的細胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)可對其應(yīng)答。
例如，可以用半抗原修飾分離的腫瘤細胞膜以及腫瘤細胞。這些修飾的腫瘤細胞膜(和腫瘤細胞)至少具有下列性質(zhì)之一(ⅰ)引發(fā)浸潤所治療哺乳動物的腫瘤的T淋巴細胞，(ⅱ)引發(fā)對該哺乳動物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答，以及(ⅲ)引發(fā)對該哺乳動物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。修飾的腫瘤細胞膜和細胞也具有在體外刺激T細胞的性質(zhì)。
本說明書中涉及的(修飾的或未修飾的)腫瘤細胞膜包括膜制品可以貯存或施用的任一形式，例如，重懸浮于稀釋劑中的膜、膜沉淀或冷凍的或凍干的膜。
本發(fā)明的膜可以在本發(fā)明的方法中單獨使用，或與其它化合物包括但不限于本發(fā)明的其它組合物一起使用。因此，腫瘤細胞和腫瘤細胞膜可以單獨使用或共同施用。對于本發(fā)明，共同施用包括同時和連續(xù)施用。此外，腫瘤細胞和腫瘤細胞膜可以與其它化合物，包括但不限于細胞因子如白細胞介素2、白細胞介素4、γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素12、白細胞介素15和GM-CSF共同施用。本發(fā)明的腫瘤細胞和腫瘤細胞膜也可以與其它癌癥療法包括但不限于化學(xué)療法、放射療法、抗體療法和反義寡核苷酸療法結(jié)合使用。然而，本發(fā)明的優(yōu)點在于它能單獨用作癌癥治療，使得不必需要其它治療。
本發(fā)明的組合物可含有本發(fā)明的分離的腫瘤細胞膜(修飾的或未修飾的)和一種藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑，如但不限于Hanks溶液、鹽水、磷酸緩沖鹽液、蔗糖溶液和水。通常，根據(jù)預(yù)期的施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)制藥實踐選擇藥學(xué)可接受的載體。有效成分與載體的比例自然取決于組合物的化學(xué)性質(zhì)、溶解度和穩(wěn)定性以及預(yù)計的劑量，并且能用本領(lǐng)域的常識優(yōu)化。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物是一種含有有效量的分離的修飾腫瘤細胞膜的疫苗組合物。對于本公開內(nèi)容，“有效量”是達到希望的結(jié)果所需的量。例如，在一種治療癌癥的方法中，“有效量”意思是分離的修飾腫瘤細胞膜的量，該量具有至少導(dǎo)致下列情況之一的性質(zhì)(ⅰ)引發(fā)浸潤腫瘤的T淋巴細胞，(ⅱ)引發(fā)對腫瘤的炎癥反應(yīng)，(ⅲ)引發(fā)對腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，和(ⅳ)腫瘤退化。同樣，在體外刺激T細胞的方法中，“有效量”是導(dǎo)致T細胞刺激的膜的量。
疫苗組合物可含有，例如，每劑量至少104c．e．分離的膜，優(yōu)選地至少105c．e．，最優(yōu)選地至少106c．e．。劑量是在單次施用中所施用的疫苗組合物的量。在一個實施方案中，疫苗組合物含有每劑量約105-約2．5×107c．e．的膜。更優(yōu)選地約5×106c．e．。所用的本發(fā)明的腫瘤細胞和腫瘤細胞膜的量通常取決于如化合物對癌細胞的親和力、存在的癌細胞的量和組合物的溶解度等因素?？筛鶕?jù)患者的體重、臨床狀況設(shè)定劑量。
本發(fā)明的疫苗組合物可以包裝為適于皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)和皮下施用的劑型。此外，該劑型也可含有分離的腫瘤細胞膜，在施用時例如用適當(dāng)?shù)南♂寗┲亟?。半抗原本發(fā)明的腫瘤細胞和腫瘤細胞膜可以作為修飾的、未修飾的腫瘤細胞和腫瘤細胞膜使用，或作為修飾的、未修飾的腫瘤細胞和腫瘤細胞膜的組合使用。對于本發(fā)明，修飾包括但不限于用半抗原修飾。不單獨誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(但增強對結(jié)合或以其它方式附著的另一分子的免疫應(yīng)答)的任一小分子可起半抗原的作用。通常，所使用的分子應(yīng)小于大約1000mw。
本領(lǐng)域中已知多種半抗原，例如TNP(Kempkes等人，免疫學(xué)雜志1991 1472467)；磷酰膽堿(Jang等人，歐洲免疫學(xué)雜志1991 211303)；鎳(Pistoor等人，實驗皮膚病學(xué)雜志(J．Invest．Dermatol．)199510592)；砷酸(酯)(Nalefski和Rao，免疫學(xué)雜志1993 1503806)。
通常，適用于本發(fā)明的半抗原具有可結(jié)合親水性氨基酸(例如賴氨酸)的性質(zhì)。半抗原可通過賴氨酸的ε-氨基或-COOH基與細胞結(jié)合。另外，也可使用能通過二氮(diaza)偶聯(lián)結(jié)合疏水性氨基酸如酪氨酸和組氨酸的半抗原。適用于本發(fā)明的半抗原的實例包括二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙?；?N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸熒光素、砷酸苯異硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磷酰膽堿、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥(Nahas和Leskowitz，細胞免疫學(xué)(Cellular Immunol．)198054241)及其組合。一旦學(xué)習(xí)了本公開內(nèi)容，技術(shù)人員就能選擇用于本發(fā)明的半抗原。例如，能用遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)試驗常規(guī)測試半抗原。佐劑在一個優(yōu)選實施方案中，腫瘤細胞或腫瘤細胞膜與一種免疫佐劑一起施用。該佐劑具有增強對半抗原修飾的腫瘤細胞和膜的免疫應(yīng)答的性質(zhì)。佐劑的代表性實例是卡介苗，BCG，或合成佐劑，包含從皂樹(quillajasaponaria)皮純化的均質(zhì)皂苷、小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)的QS-21，McCune等人，癌癥(Cancer)1979 431619，一般是皂苷、脫毒的內(nèi)毒素和細胞因子如白細胞介素2、白細胞介素4、γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素12、白細胞介素15、GM-CSF及其組合。
應(yīng)當(dāng)理解，可對佐劑進行優(yōu)化。換句話說，技術(shù)人員可以利用常規(guī)實驗確定使用的最佳佐劑。制備本發(fā)明的腫瘤細胞膜的方法本發(fā)明使用的腫瘤細胞可如下制備。如Berd等人(1986)同上文、Sato等人(1997)、美國專利號5，290，551和美國申請系列號08／203，004、08／479，016、08／899，905、08／942，794或相應(yīng)的PCT申請PCT／US96／09511所述加工腫瘤，其每一項都在此完整引入作為參考。簡言之，經(jīng)分裂提取細胞，如用膠原酶和DNA酶酶促分裂，用攪拌器機械分裂，用鑷子起毛，使用研缽和研杵，用手術(shù)刀片切成小塊，等等。對于液體腫瘤，可收集血液或骨髓樣品，并經(jīng)密度梯度離心分離腫瘤細胞。
通過破裂細胞由腫瘤細胞制備腫瘤細胞膜，例如，利用低滲休克、機械分裂和酶促分裂，及經(jīng)離心分離不同的細胞成分。簡言之，可使用下列步驟裂解腫瘤細胞，從裂解的腫瘤細胞中除去細胞核獲得無細胞核的腫瘤細胞，獲得不含細胞和細胞核的基本上較純的膜，使該腫瘤細胞膜與半抗原作用以獲得半抗原修飾的腫瘤細胞膜。可按照Heike等人的方法進行膜分離。
在本發(fā)明的一個實施方案中，完整細胞和細胞核可通過連續(xù)離心去除，直到經(jīng)顯微鏡檢查基本上不含細胞核和細胞。例如，裂解的細胞可以以低速度，如約500-2000g離心約5分鐘。該分離方法使得在大約2×108細胞當(dāng)量(c．e．)的膜物質(zhì)中保留少于約100個細胞和／或細胞核。例如，可通過約100000g約90分鐘的超速離心沉淀含有膜的核后(postnuclear)上清液。沉淀中含有全部膜。例如，可將膜重懸浮于約8％蔗糖、5mM Tris，pH7．6的溶液中，并冷凍于約-80℃直至使用?？梢允褂萌我幌♂寗?，優(yōu)選的是作為穩(wěn)定劑的稀釋劑。為了測定膜制品的質(zhì)量，可以定期培養(yǎng)(約6×107c．e．膜)。不應(yīng)生成細胞集落，用光學(xué)顯微鏡也應(yīng)當(dāng)檢測不到細胞或細胞核。
用DNP或另一種半抗原對所制備的細胞或膜的修飾可以按已知的方法進行，例如，Miller和Claman的方法，免疫學(xué)雜志，1976，117，1519，在此完整引用作為參考，該方法包括腫瘤細胞或膜與一種半抗原在無菌條件下溫育30分鐘，隨后用無菌鹽水洗滌。用單克隆抗半抗原抗體經(jīng)流式細胞術(shù)可證實半抗原修飾。
分裂的細胞或分離的膜可以新鮮使用或者例如在可控速度的冷凍機或在液氮中冷凍貯存?zhèn)溆?。細胞和膜一旦融解后立即使用。?yōu)選地，融解細胞或膜后馬上向患者施用。例如，可在對患者進行皮膚試驗或治療當(dāng)天，融解細胞或膜。任選地，可洗滌細胞或膜，并任選地照射2500R?？梢栽俅蜗礈?，然后懸浮于不含酚紅的Hanks平衡鹽溶液中。
同種異體腫瘤細胞膜可如上所述制備。然而，在向受試者施用之前，應(yīng)與同源(例如自體的)抗原呈遞細胞共溫育。同源抗原呈遞細胞加工同種異體膜，使得患者的細胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)可對其應(yīng)答。該方法使得可以用來源于非患者自身腫瘤的腫瘤細胞膜來免疫患者。同種異體腫瘤細胞膜與抗原呈遞細胞溫育約數(shù)小時到約數(shù)天的一段時間。然后洗滌膜脈沖(cmembrane-pulsed)的抗原呈遞細胞，并對患者注射。
可以用多種方法制備抗原呈遞細胞，包括例如Grabbe等人，1995和Siena等人，1995的方法。簡言之，例如通過靜脈穿刺從欲免疫的患者中獲得血液。此外，也可獲得骨髓。此外，也可通過白細胞除去法獲得血液白細胞。經(jīng)梯度離心可從這些來源的任一個中分離單核白細胞。白細胞進一步可用抗原CD34的單克隆抗體經(jīng)正選擇純化。
在組織培養(yǎng)基(例如，補充有血清如胎牛血清、合并的人血清或自體血清的RPMI-1640)中培養(yǎng)并擴大純化的白細胞。此外，也可使用無血清培養(yǎng)基。為了刺激抗原呈遞細胞的生長，可以向培養(yǎng)基中加入細胞因子。細胞因子包括但不限于粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素4(IL4)、TNF(腫瘤壞死因子)、白細胞介素3(IL3)、FLT3配體和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。
在培養(yǎng)中分離并擴大培養(yǎng)的抗原呈遞細胞可以表征為例如樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞和朗格漢斯細胞。使用腫瘤細胞膜和組合物的方法治療癌癥的方法本發(fā)明涉及一種治療診斷或懷疑患有癌癥的哺乳動物優(yōu)選地人的方法，包括施用一種藥學(xué)可接受量的半抗原修飾的腫瘤細胞膜、半抗原修飾的腫瘤細胞或其組合。膜和／或細胞可與免疫佐劑和／或藥學(xué)可接受的載體混合。在施用該組合物之前可施用藥學(xué)可接受量的低劑量環(huán)磷酰胺或另一種低劑量的化療劑。半抗原化的組合物之后任選地可施用藥學(xué)可接受量的非半抗原化的腫瘤細胞或腫瘤細胞膜。也可按照本發(fā)明的方法施用非半抗原化的組合物。
可根據(jù)本發(fā)明治療任一惡性腫瘤，包括轉(zhuǎn)移和原發(fā)性癌癥，實體瘤和非實體瘤。實體瘤包括癌，非實體瘤包括血液惡性腫瘤。癌包括但不限于腺癌和上皮癌。血液惡性腫瘤包括白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。下面是按本發(fā)明的方法可用分離的修飾腫瘤細胞膜治療的癌癥的非限制性實例卵巢癌包括晚期卵巢癌、白血病包括但不限于急性骨髓性白血病、結(jié)腸癌，包括轉(zhuǎn)移至肝的結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、腎癌和前列腺癌。卵巢癌可能是腺癌或上皮癌。結(jié)腸和前列腺癌是腺癌。白血病可能來源于髓樣骨髓或淋巴結(jié)。白血病可能是急性的，表現(xiàn)為最初發(fā)育階段的成熟停止，也可能是慢性的，表現(xiàn)為成熟淋巴樣細胞或髓細胞的過度生長?？筛鶕?jù)本發(fā)明治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期癌癥，優(yōu)選地Ⅲ和Ⅳ期，再更優(yōu)選地Ⅲ期癌癥。
患有前述類型的轉(zhuǎn)移癌的哺乳動物，特別是人類，可以用本發(fā)明的膜、組合物和方法來治療。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以治療家畜。
在施用本發(fā)明的疫苗組合物之前，可通過將其施于皮膚而使患者對用來修飾腫瘤細胞和膜的半抗原免疫。例如，可使用二硝基氟苯(DNFB)。隨后(例如，大約2周后)，可給患者注射一種腫瘤細胞膜組合物。該組合物可施用(如再注射)總共至少三次治療，優(yōu)選地至少六次治療。在一個實施方案中，施用的總數(shù)(包括最初施用)可以是8次，在另一個實施方案中可能是10次。接種方案可由主治醫(yī)師設(shè)計，以適應(yīng)特定患者的病情。例如，可以每2周，優(yōu)選地每周施行疫苗注射。可施用一次加強疫苗。優(yōu)選地，加強免疫一次或兩次。例如，可在最初施用大約6個月之后或大約1年之后加強免疫。
可用藥物增強患者的免疫應(yīng)答。例如，每次施用之前可施用環(huán)磷酰胺(CY)。
可在常規(guī)癌癥治療如手術(shù)后應(yīng)用本發(fā)明。對于實體瘤，如卵巢癌，可最佳或次最佳地摘除(debulking)腫瘤。最佳地摘除是指切除腫瘤使得被治療的患者中只留有小腫瘤塊。次最佳地摘除是指切除腫瘤而在患者中留有大塊。對于非實體瘤，可收集合適的血液或骨髓樣品，并用任何參考文獻中已知的技術(shù)分離癌細胞。切除的腫瘤或收集的腫瘤細胞可用來制備如上所述的腫瘤細胞膜。
可通過任一合適的途徑施用腫瘤細胞膜，包括接種和注射，例如皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)和皮下注射。每次疫苗治療可以有多個施用部位。例如，每次施用可以皮內(nèi)注射兩個優(yōu)選地三個相鄰部位來施用疫苗組合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，在上臂或腿上施用疫苗組合物。
施用多種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物可提高疫苗的效能。這些藥劑通過直接或間接地刺激免疫應(yīng)答而起作用。本發(fā)明的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物包括但不限于白細胞介素12、白細胞介素15和γ干擾素。在一個實施方案中，在每次疫苗注射后施用IL12。對具有炎癥反應(yīng)的患者施用IL12可使腫瘤塊內(nèi)的T淋巴細胞增殖并且更具活性。增加的T細胞數(shù)和功能性引起腫瘤的免疫破壞和消退。
大量工作者已經(jīng)發(fā)展并測試了人癌癥疫苗。盡管它們有時能誘導(dǎo)對患者癌癥的弱免疫力，但很少能導(dǎo)致腫瘤消退或延長存活時間。應(yīng)用本發(fā)明的疫苗驚人地發(fā)現(xiàn)了炎癥反應(yīng)的證據(jù)。用顯微鏡觀察到T淋巴細胞的浸潤。因此，能增強炎癥反應(yīng)和淋巴細胞數(shù)量的該方法在本領(lǐng)域中具有明顯的進步。因此，本發(fā)明也提供了引發(fā)至少具有下列性質(zhì)之一的T細胞的方法施用時(ⅰ)引發(fā)浸潤所治療哺乳動物的腫瘤的T淋巴細胞，(ⅱ)引發(fā)對哺乳動物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答，(ⅲ)引發(fā)對哺乳動物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。
刺激T細胞的方法可以用分離的腫瘤細胞膜在體外刺激T細胞。該試驗?zāi)苡脕碓u價例如應(yīng)用特定腫瘤膜的治療是否可能成功。該試驗中使用的T細胞可以按照下列方法獲得，該方法是描述用于人的，但是可應(yīng)用于任何哺乳動物受試者。
通過對診斷患有某種類型癌癥的患者施用一種藥學(xué)可接受量的組合物，其中含有半抗原修飾的腫瘤細胞、腫瘤細胞膜或其組合，由此產(chǎn)生T細胞。該組合物任選地可含有一種免疫佐劑和／或一種藥學(xué)可接受的載體。在施用第一次腫瘤細胞組合物之前，任選地可施用一種藥學(xué)可接受量的低劑量環(huán)磷酰胺或另一種低劑量的化療劑，如但不限于大約5-10mg／M2的苯丙氨酸氮芥。半抗原化的組合物之后任選地可施用一種藥學(xué)可接受量的非半抗原化的疫苗組合物，其含有非半抗原化的膜、腫瘤細胞或其組合?？梢园凑毡景l(fā)明的方法施用非半抗原化的組合物。
可以從在施用半抗原修飾的自體細胞或膜后對其發(fā)生強烈遲發(fā)型過敏(DTH)反應(yīng)的患者中獲得外周血淋巴細胞(PBL)。DTH反應(yīng)優(yōu)選地有大約10mm的直徑，再更優(yōu)選地大約大于10mm。通過用半抗原修飾的癌細胞重復(fù)刺激可由PBL建立T細胞系。T細胞能用公知的方法分離，如單細胞懸液的制備，過濾，單核細胞的排除和表達特定T細胞受體(TCR)類型的亞群的分離，方法是使該亞群在TCR亞型特異抗體的存在下和／或在IL-2存在下和／或在超抗原存在下擴增。目的T細胞可在體內(nèi)擴增，因為它們是從已經(jīng)富集了目的T細胞的腫瘤的浸潤液中收集的。
修飾的腫瘤細胞和腫瘤細胞膜都具有刺激T細胞的性質(zhì)。對于本發(fā)明，“刺激”是指誘導(dǎo)T細胞的增殖以及T細胞在體外的細胞因子產(chǎn)生。膜和腫瘤細胞都獨立地具有刺激T細胞的能力?？赏ㄟ^T細胞對修飾核苷酸的攝取來檢測并測定T細胞的增殖，這些修飾核苷酸如但不限于3H胸苷、125I UDR(碘代脫氧尿嘧啶核苷)；和染料，如能使活細胞染色的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)。另外，細胞因子如但不限于IFNγ、腫瘤壞死因子(TNF)和IL-2的產(chǎn)生可用于顯示T細胞增殖。細胞因子的產(chǎn)生應(yīng)當(dāng)高于背景水平，通常高25皮克／ml，優(yōu)選地高100皮克／ml。
T細胞是介導(dǎo)兩種免疫功能-效應(yīng)物功能和調(diào)節(jié)功能、分泌蛋白質(zhì)(淋巴因子)和殺傷其它細胞(細胞毒性)-的淋巴細胞。效應(yīng)物功能包括反應(yīng)性)，遲發(fā)型過敏反應(yīng)、同種異體移植排斥、腫瘤免疫和移植物抗宿主反應(yīng)性。淋巴因子產(chǎn)生和細胞毒性由T細胞效應(yīng)物功能證明。T細胞的調(diào)節(jié)功能表現(xiàn)為擴增其它T細胞介導(dǎo)的細胞毒性的能力和B細胞的免疫球蛋白產(chǎn)生。調(diào)節(jié)功能也需要淋巴因子的產(chǎn)生。T細胞應(yīng)答誘導(dǎo)刺激物(如但不限于促分裂原、抗原或凝集素)產(chǎn)生γ干擾素(IFNγ)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可如下建立T細胞系。PBL(1×106)與自體DNP結(jié)合的B淋巴母細胞(1×105)在24孔平底培養(yǎng)板中在淋巴細胞培養(yǎng)基中混合，培養(yǎng)7天后，加入100U／ml IL2(Cetus Oncology，Emeryville，CA)。將擴充的T細胞培養(yǎng)物保存于含有IL2的培養(yǎng)基中，需要時將其分開，以保持22mm直徑孔中大約2×106個細胞的濃度。每14天通過加入自體DNP結(jié)合的B淋巴母細胞再刺激培養(yǎng)物。用單克隆抗體表(panel)(Becton-Dickinson，San Jose，CA)通過流式細胞術(shù)可確定表型。CD8+和CD4+T細胞的分離通過間接淘選完成，其中，按照Wysoki，L．J．和V．L．Sato，美國國家科學(xué)院院報，1978，75，2844的方法，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使抗CD8或抗CD4單克隆抗體包被的T細胞附著于抗免疫球蛋白包被的平皿上，該文在此完整引用作為參考；分離附著的細胞，并用DNP修飾的刺激物包括但不限于以下所述、黑素瘤細胞和β淋巴母細胞和IL2擴充。
例如，通過在圓底微量滴定板的淋巴細胞培養(yǎng)基中以有限稀釋度培養(yǎng)，獲得表型均一的T細胞亞群，該培養(yǎng)基中含有2×105個照射的同種異體飼養(yǎng)細胞、200 U／ml IL-2和植物凝集素。針對應(yīng)答DNP修飾的B淋巴母細胞的增殖能力，篩選含有生長的淋巴細胞集落的孔。陽性孔用IL2擴充，并用自體DNP結(jié)合的B淋巴母細胞每14天重復(fù)刺激。
可作為效應(yīng)細胞測試外周血淋巴細胞(PBL)。將其懸浮于淋巴細胞培養(yǎng)基(RPMI-1640、10％合并的人AB+血清、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鹽培養(yǎng)基添加物(Sigma Chemical Co．)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、25mM HEPES緩沖液、青霉素+鏈霉素)中，并以1×105細胞／孔的濃度加入96孔圓底微量滴定板中。也加入刺激細胞，包括1)自體或同種異體PBL，2)通過用EB病毒轉(zhuǎn)染制備的自體或同種異體B淋巴母細胞系，3)自體培養(yǎng)的黑素瘤細胞；通過照射(5000R)滅活。在大多數(shù)實驗中，效應(yīng)物∶刺激物比優(yōu)選地為1∶1。培養(yǎng)板在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育5天；然后用125I標(biāo)記的IUDR(ICN Radiochemical，Costa Mesa，CA)使這些孔接受脈沖6小時，用自動收集裝置收集，并用γ計數(shù)儀計數(shù)。計算三個重復(fù)孔的平均值。也按照上述方法檢測培養(yǎng)的T細胞的淋巴細胞增殖反應(yīng)。
融解在對DNP修飾的自體細胞的最大DTH反應(yīng)性時從患者獲得并冷藏的PBL，并檢測體外增殖反應(yīng)。單獨的DNFB應(yīng)用不能產(chǎn)生可檢測數(shù)量的循環(huán)效應(yīng)細胞。預(yù)期反應(yīng)性PBL在兩次DNP-疫苗注射后(第63天)可檢測到，并將在疫苗治療期間持續(xù)檢測到，這基于以前應(yīng)用DNP修飾的黑素瘤細胞的經(jīng)驗。
為了檢測細胞因子的產(chǎn)生，可向圓底微量滴定板中以1×105細胞／孔加入T細胞。加入等量刺激物(DNP修飾的自體B淋巴母細胞)，溫育18小時后收集上清液。用可商品獲得的ELISA試劑盒測定γ干擾素(Endogen，Boston，MA；靈敏度=5pg／ml)。
為了測定該反應(yīng)的MHC依賴性，在加入效應(yīng)細胞之前，刺激細胞可與濃度為10μg／ml的MHCⅠ類(W6／32)或MHCⅡ類(L243)單克隆抗體預(yù)溫育1小時。可檢測相同濃度的非特異性小鼠免疫球蛋白，作為陰性對照。
通過淘選大量群體獲得的DNP反應(yīng)性CD8+T細胞能夠通過用DNP修飾的自體B淋巴母細胞重復(fù)刺激，長期(＞3個月)培養(yǎng)于含IL-2的培養(yǎng)基中；它們保留穩(wěn)定的表型，CD3+、CD8+。兩條證據(jù)表明其反應(yīng)是MHCⅠ類限制性的1)刺激細胞與抗Ⅰ類構(gòu)架抗體預(yù)溫育，可阻斷γ干擾素產(chǎn)生，而與抗Ⅱ類抗體溫育不能阻斷，2)T細胞能應(yīng)答一個或兩個HLA-A基因座匹配的同種異體DNP修飾的刺激物，但不能應(yīng)答HLA-A不匹配的刺激物。
為了測定T細胞的γ干擾素產(chǎn)生，可從患者的血液中獲得淋巴細胞。大約1，000，000個淋巴細胞與DNP修飾的自體黑素瘤細胞膜混合，用來刺激T細胞。每7天加入100U／ml白細胞介素2。通過傳代擴充T細胞。然后用DNP修飾的自體黑素瘤細胞膜重新刺激T細胞。得到富集的T細胞群，其可對DNP修飾的自體黑素瘤細胞起反應(yīng)。根據(jù)T細胞的γ干擾素產(chǎn)量測定刺激。通常認(rèn)為高于15皮克／ml的γ干擾素產(chǎn)生即是明顯的。
通過下列實施例進一步說明了本發(fā)明，其意圖只在于說明，而不是欲將本發(fā)明限定于這些具體的實施方案。實施例1分離的黑素瘤膜對T細胞的體外刺激T細胞系的建立按照本方法進行DNP-疫苗施用后，從對DNP-修飾的自體黑素瘤細胞具有強烈遲發(fā)型過敏(DTH)反應(yīng)的患者中獲得外周血淋巴細胞(PBL)。通過密度梯度離心從血液中分離PBL，將其懸浮于冷凍培養(yǎng)基，如含有2．5％人白蛋白和DMSO的RPMI-1640中，在可控速度的冷凍機中冷凍，并貯存于液氮中直至使用(Sato等人，1995)。
通過用DNP-修飾的自體黑素瘤細胞(DNP-Mel)重復(fù)刺激由這些PBL建立T細胞系，并用重組白細胞介素2(IL-2)維持(Sato等人，1995)。
黑素瘤細胞如上所述，從由同一患者中手術(shù)取出的轉(zhuǎn)移塊中酶法提取黑素瘤細胞，并用前述方法冷藏(Sato等人，1997)。由該黑素瘤細胞懸液建立自體黑素瘤細胞系。簡言之，從轉(zhuǎn)移塊中酶法分離出黑素瘤細胞，將其懸浮于組織培養(yǎng)基(含有胎牛血清或人血清的RPMI-1640)中，并加于組織培養(yǎng)板上。數(shù)天后，除去未附著的腫瘤細胞，并加入新鮮的培養(yǎng)基。數(shù)周后，附著的黑素瘤細胞開始快速增殖。當(dāng)細胞生長到鋪滿培養(yǎng)板時，通過用EDTA取下細胞，并加至新鮮的組織培養(yǎng)板中來使細胞分離。
用Miller和Claman的方法用DNP修飾該黑素瘤細胞系細胞。這包括腫瘤細胞與二硝基氟苯(DNFB，Sigma Chemical Co．)在無菌條件下溫育30分鐘，隨后用Hanks溶液洗掉過量的DNFB。用小鼠單克隆抗DNP抗體(SPE-7；Sigma Immunochemicals，St．Louis，MO)經(jīng)流式細胞術(shù)證實DNP修飾(100％的細胞顯示被DNP修飾)。
作為一種備擇方法，可如上所述用DNP修飾冷藏的黑素瘤細胞，而不需建立細胞系的中間步驟。
細胞膜提取用Heike等人的方法從DNP修飾的黑素瘤細胞(DNP-Mel)中提取細胞膜。簡言之，通過在5倍體積的30mM碳酸氫鈉緩沖液、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)中低滲休克，并由Dounce勻漿化(10-20次)，裂解DNP修飾的細胞。通過以1000g連續(xù)離心5分鐘除去剩余的完整細胞和細胞核，直到上清液不含細胞核和細胞。然后，經(jīng)100，000g離心90分鐘沉淀膜。將沉淀中的全部膜以每毫升107細胞當(dāng)量單位(即，從107個細胞中提取的膜)重懸浮于8％蔗糖、5mM Tris，pH7．6中，-80℃下冷凍直至使用。
作為一種備擇方法，用上述相同方法從未修飾的黑素瘤細胞中分離細胞膜。將膜以不同的細胞當(dāng)量濃度(105-109細胞當(dāng)量／ml)懸浮于不含白蛋白的Hanks溶液中。然后如上所述加入DNFB。然后，經(jīng)100，000g離心90分鐘沉淀膜，并用鹽水洗兩次。
膜制品引起的細胞因子產(chǎn)生根據(jù)IFN-γ產(chǎn)生，測定DNP修飾的黑素瘤膜誘導(dǎo)的T細胞反應(yīng)。將從患者PBL中獲得的T細胞以105細胞／孔平板接種于96孔圓底培養(yǎng)板中，每孔100μl培養(yǎng)基(補加有10％人AB血清、2mM L-谷氨酸、100mg／ml／100U／ml鏈霉素／青霉素、10mM HEPES、1％非必需氨基酸的RPMI 1640)。向每孔中加入不同量(約105-約108細胞當(dāng)量)的細胞膜，并加入其它培養(yǎng)基使每孔的總體積為250μl。
溫育18小時后收集上清液進行IFN-γ測定。用可商品獲得的ELISA試劑盒(Endogen，Boston，MA；敏感度=5pg／ml)測定上清液中IFN-γ的濃度。
與自體DNP-Mel膜溫育后檢測到明顯的T細胞的IFN-γ產(chǎn)生(750pg／ml)。T細胞的IFN-γ產(chǎn)生與共溫育的DNP-Mel膜的量有關(guān)。未引發(fā)對未修飾的Mel膜的明顯反應(yīng)。通過用正淘選技術(shù)富集CD4+和CD8+T細胞建立兩種T細胞亞系。由于IFN-γ產(chǎn)生，每種亞系可對DNP-Mel膜起反應(yīng)。CD4+T亞系與DNP-Mel膜的反應(yīng)可被MHCⅡ類的抗體所阻斷，CD8+亞系的反應(yīng)可被MHCⅠ類的抗體所阻斷(分別為73％和80％阻斷)。
這些結(jié)果表明，半抗原修飾的腫瘤細胞膜可成功地用于接種需要腫瘤治療的患者。實施例2用修飾的腫瘤細胞膜治療Ⅲ期卵巢癌最初可按標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療實踐(摘除(debulking)手術(shù)，隨后是化學(xué)治療)治療患者。待化學(xué)治療完成后，可以應(yīng)用含有半抗原二硝基苯(DNP)修飾的卵巢癌細胞膜的疫苗施行6周療程的治療。第一次注射前可施用低劑量的環(huán)磷酰胺。待療程結(jié)束后，可檢測患者對DNP修飾的和未修飾的癌細胞膜的遲發(fā)型過敏反應(yīng)性。用冷藏的從轉(zhuǎn)移性腫瘤提取的和／或從外周血分離的淋巴細胞可進行體外研究。
例如，可選擇接受手術(shù)摘除的患者或化學(xué)治療后顯示腫瘤減小的患者進行治療。從每名患者上切下的腫瘤塊足夠獲得至少100×106個活腫瘤細胞。這名患者可接受化學(xué)治療，如卡鉑和紫杉醇，在化學(xué)治療完成后優(yōu)選地是臨床上無腫瘤的(即，體檢和CT研究正常，血清CA-125＜35IU／L)。
患者可不接受本發(fā)明的治療，這是依據(jù)對于制備疫苗和皮膚試驗不足量的腫瘤細胞(＜100×106個細胞)，低于80的Karnovsky表現(xiàn)狀態(tài)，以前6個月內(nèi)的主要區(qū)域放射治療，系統(tǒng)性皮質(zhì)類固醇的當(dāng)前施用，血細胞比容＜30％或WBC＜3000，年齡＜18，活動性自身免疫病，活動性重癥感染，另一種活動性惡性腫瘤，感染乙型肝炎病毒(循環(huán)抗原)或HIV(循環(huán)抗體)的證據(jù)，或不能提供承諾。
對患者進行腫瘤的手術(shù)切除及轉(zhuǎn)移灶的去除。進行最佳或次最佳地去除的患者是符合條件的。可將腫瘤組織送至實驗室并加工以獲得膜。該膜可以冷藏并貯存于液氮中。
同源的和同種異體的腫瘤細胞膜都可如本說明書所述制備并使用。
從手術(shù)后六(6)周內(nèi)開始，患者可開始化學(xué)治療，如應(yīng)用卡鉑或順鉑+紫杉醇，按照下列劑量方案每3周卡鉑AUC 7．5mg／M2或順鉑75mg／M2，每3周紫杉醇175mg／M2靜脈內(nèi)超過3小時?？墒┬辛鶄€循環(huán)的化學(xué)治療。也可施行另外任一種化學(xué)治療。
完成化學(xué)治療大約四周后，可對患者進行轉(zhuǎn)移評價，包括胸-腹-骨盆計算機X射線斷層造影(CT)。只有證明無復(fù)發(fā)癌的患者才適合選擇進行疫苗治療。假如CT研究為復(fù)發(fā)陰性，則血清CA125水平升高的患者是符合條件的。腫瘤細胞膜治療可以在施行最后一次化學(xué)治療至少4周、最遲12周之后開始。
于第-7天，可用下列物質(zhì)對患者進行皮膚試驗1)DNP修飾的自體卵巢癌細胞或膜，2)稀釋劑(含有0．1％人白蛋白的Hanks平衡鹽溶液)，和3)PPD中間物?？稍诘?5天測定DTH反應(yīng)。在第0天，患者可進行300mg／M2環(huán)磷酰胺的快速靜脈內(nèi)輸液。三天后，他們可皮內(nèi)注射一種腫瘤細胞膜組合物，這可每周重復(fù)持續(xù)六(6)周。疫苗可能包含與BCG混合的DNP修飾的卵巢癌細胞膜?？上蛏媳蹆?nèi)注射疫苗。如果由于某種原因已切除了左腋窩淋巴結(jié)，可使用右臂。
第6次接種兩周半之后，可對患者進行臨床評價，包括CBC、SMA-12、CA125和胸部X射線?？蓽y試他們對下列物質(zhì)的DTHDNP修飾的和未修飾的自體癌細胞、DNP修飾的和未修飾的自體外周血淋巴細胞、稀釋劑和PPD中間物。也可測試對二硝基氟苯(DNFB)的接觸敏感性。
可在第6個月時(從疫苗計劃開始時算起)給予保持無復(fù)發(fā)的患者第7次(加強)疫苗。對于每名患者，可貯存至少一個冷藏瓶的腫瘤細胞膜進行第6個月的加強注射。如果預(yù)計可用的細胞數(shù)不足以進行6次每周疫苗加第6月的加強，則每周注射的開始過程可減為5次?？稍谝荒旰笫┯昧硪淮渭訌娨呙?，但這只是在有足量的細胞可用時。恰在一年加強免疫之前，可用自體腫瘤細胞或膜對患者進行皮膚試驗，確定是否保持其以前的免疫水平。實施例3用修飾的腫瘤細胞膜治療黑素瘤可如前所述處理腫瘤塊。簡言之，可通過用膠原酶和DNA酶酶促分裂和通過機械分裂提取細胞。如本說明書中所述分離細胞膜，在可控速度的冷凍機中冷凍，并貯存于液氮中直至需要使用。在治療患者當(dāng)天，融解、洗滌膜，重懸浮于不含酚紅的Hanks平衡鹽溶液中?？砂凑誐iller和Claman(1976)的方法進行DNP修飾。這包括腫瘤細胞與二硝基氟苯(DNFB)在無菌條件下溫育30分鐘，隨后用無菌鹽水洗滌。
該疫苗組合物可含有最少2．5×106c．e．臺盼藍排除的黑素瘤細胞膜和最多少7．5×106c．e．黑素瘤細胞膜，其懸浮于0．2ml Hanks溶液中。每次疫苗注射可包括三次向相鄰部位的注射。
冷凍干燥的物質(zhì)可用1ml無菌水或磷酸緩沖鹽溶液，pH7．2(PBS)重建?？稍跓o菌緩沖鹽溶液中進行適當(dāng)?shù)南♂?。然后在注射前吸?．1ml與疫苗混合。第一次和第二次疫苗可與0．1ml 1∶10稀釋的Tice BCG(“Tice-1”)混合。BCG是從Organon Teknika Corporation(Durham，NC)獲得的Tice菌株(巴斯德研究所菌株的次代株)。第三次和第四次疫苗可與0．1ml 1∶100稀釋物(“Tice-3”)混合。第五次和第六次和加強疫苗可與0．1ml 1∶1000稀釋物(“Tice-5”)混合。理想的疫苗反應(yīng)是只是有小(＜5mm)中心潰瘍的炎性丘疹。
可通過在前臂上皮內(nèi)注射0．1ml試驗物質(zhì)進行皮膚試驗，并通過測定硬結(jié)的平均直徑估計48小時的DTH?？稍囼炏铝形镔|(zhì)1)1×106個未修飾的和用DNP修飾的自體黑素瘤細胞膜細胞；可使用酶促分裂的(TCE)和機械分裂的(TCM)腫瘤細胞；2)3×106個未修飾的和用DNP修飾的自體外周血淋巴細胞；3)Hanks溶液；和4)PPD中間物強度。通過對上臂腹面皮膚施用200μg DNFB并檢查該區(qū)域在48小時的硬結(jié)圈，也可檢測對DNFB的接觸敏感性?？稍诹芤呙缡┯眠^程后進行全套DTH試驗。預(yù)處理DTH試驗僅限于DNP修飾的黑素瘤細胞膜、PPD和稀釋劑。該策略用來避免1)使患者對DNP修飾的淋巴細胞致敏，和2)通過注射未修飾的腫瘤細胞使患者耐受。
每次進行皮膚試驗時，可收集所有患者的血液用于淋巴細胞和血清的分離和冷藏?？芍芷谛缘貦z測如通過增殖測定的對自體癌細胞的應(yīng)答、細胞因子釋放和細胞毒性。
可在疫苗治療開始之前評估患者的轉(zhuǎn)移性疾病。待第一次8周的疫苗治療結(jié)束之后，每三個月進行一次評價?？衫^續(xù)評價直到第二年，第三年每4個月一次，其后每6個月一次。每次評價可進行體檢和常規(guī)血液檢查(CBC、SMA-12和CA125)。可在施用疫苗前，在(加強免疫前)6個月和12個月進行胸-腹-骨盆的CT，作為臨床指征?？梢源_定未復(fù)發(fā)的和總存活率。所有患者都可進行至少5年或直到死亡時為止。
預(yù)計患者可形成對BCG的局部反應(yīng)，包括排出、2-3月后愈合的壓痛膿皰，留下類似天花接種的瘢痕。患者形成對BCG的敏感性時，這些反應(yīng)的強度可能提高。在接種半抗原處理的疫苗的患者中以未觀察到過敏反應(yīng)、其它變應(yīng)性現(xiàn)象和自身免疫。
接種部位的反應(yīng)可如下分級0-無癥狀；1-癢或不適，但不干擾臂運動或正?；顒?；2-導(dǎo)致干擾臂運動但不需改變正?；顒拥牟贿m；3-導(dǎo)致主要干擾臂運動且需要改變正?；顒拥牟贿m；4-導(dǎo)致不能用四肢進行正?；顒拥牟贿m。
環(huán)磷酰胺可用無菌水重建，并可通過快速靜脈內(nèi)輸液施用適當(dāng)?shù)膭┝俊Ｒ话愕?，大約三分之一的患者在施用低劑量環(huán)磷酰胺后可能感到惡心，大約10％可能會嘔吐。該劑量時不會發(fā)生白細胞減少、脫發(fā)和膀胱炎。預(yù)期該方案伴有較低的惡心和嘔吐發(fā)生率，因為可能只與最后一次疫苗接種結(jié)合施用一次環(huán)磷酰胺。
可在注射疫苗后觀察患者。讓具有意外癥狀或征象的患者聯(lián)系醫(yī)生立即評價。導(dǎo)致不適的發(fā)熱可用乙酰氨基酚治療。低劑量環(huán)磷酰胺引起的惡心可用口服丙氯拉嗪(prochlorperazine)(丙氯拉嗪(Compazine))治療。如果在接種部位發(fā)生嚴(yán)重的局部反應(yīng)(＞5mm潰瘍)，則可降低隨后的BCG劑量(見上)。
一年評估時無復(fù)發(fā)的患者可接受最后的加強疫苗注射。然后可觀察其病情而不進行進一步的治療。發(fā)展為轉(zhuǎn)移的患者可不再研究，并按臨床指征進行治療(通常手術(shù)或化學(xué)治療)。
也可進行用來確定DNP疫苗是否延長這些患者的無復(fù)發(fā)和／或總存活時間的效能研究?？梢詼y定存活參數(shù)(卡-邁(Kaplan-Meier)法)。
Thomas Jefferson 大學(xué)、NIH和FDA關(guān)于承諾的所有規(guī)定均得到遵守。
我們以前用半抗原修飾的黑素瘤細胞對DNP修飾的自體黑素瘤疫苗的研究得出以下結(jié)果治療后100％的患者(N=60)形成對DNP修飾的自體腫瘤細胞的陽性DTH反應(yīng)(≥5mm硬結(jié)直徑)，85％形成強陽性反應(yīng)(≥10mm硬結(jié)直徑)。應(yīng)用DNP修飾的自體癌膜疫苗預(yù)期有類似的成功，即，預(yù)期患者形成對DNP修飾的和未修飾的自體癌細胞膜的DTH。
從前面的敘述可知，除此處所示及所述之外，本發(fā)明的多種修改對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯然的。這些修改也處于附加權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
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美國專利號5，290，551美國專利申請系列號08／203，004美國專利申請系列號08／479，016美國專利申請系列號08／899，905美國專利申請系列號08／942，794PCT US 96／0951權(quán)利要求
1．一種含有半抗原修飾的人腫瘤細胞膜的組合物。
2．權(quán)利要求1的組合物，其中所述腫瘤細胞膜分離自選自癌細胞和非實體瘤細胞的腫瘤細胞。
3．權(quán)利要求1的組合物，其中所述腫瘤細胞膜來源于選自白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、腎癌和前列腺癌的腫瘤。
4．權(quán)利要求3的組合物，其中所述白血病是急性骨髓性白血病。
5．權(quán)利要求1的組合物，其中所述腫瘤細胞膜是選自同源腫瘤細胞膜和同種異體腫瘤細胞膜的腫瘤細胞膜。
6．權(quán)利要求5的組合物，其中所述同源腫瘤細胞膜是自體的。
7．權(quán)利要求1的組合物，其中所述半抗原選自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙?；?N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸熒光素、砷酸苯異硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥及其組合。
8．權(quán)利要求1的組合物，其還含有佐劑。
9．權(quán)利要求8的組合物，其中所述佐劑選自卡介苗、QS-21、脫毒的內(nèi)毒素和細胞因子。
10．權(quán)利要求1的組合物，其具有當(dāng)對患有與所述腫瘤細胞膜相同類型的惡性腫瘤的人施用時，能引發(fā)浸潤該病人腫瘤的T淋巴細胞的性質(zhì)。
11．權(quán)利要求1的組合物，其具有當(dāng)對患有與所述腫瘤細胞膜相同類型的惡性腫瘤的人施用時，能引發(fā)對該病人腫瘤的炎性免疫應(yīng)答的性質(zhì)。
12．權(quán)利要求1的組合物，其具有當(dāng)對患有與所述腫瘤細胞膜相同類型的惡性腫瘤的人施用時，能引發(fā)對該病人腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)的性質(zhì)。
13．權(quán)利要求1的組合物，其中所述腫瘤細胞膜是同種異體的，該組合物進一步包含一種抗原呈遞細胞。
14．權(quán)利要求1的組合物，其中所述腫瘤細胞膜是同種異體的，所述抗原呈遞細胞是同源的。
15．權(quán)利要求1的組合物，其中所述腫瘤細胞膜是同種異體的，所述抗原呈遞細胞是自體的。
16．一種治療癌癥的方法，包括對人施用一種含有治療有效量的半抗原修飾的人腫瘤細胞膜的組合物，其中該病人患有與該腫瘤細胞膜相同類型的惡性腫瘤。
17．權(quán)利要求16的方法，包括引發(fā)浸潤該病人腫瘤的T淋巴細胞和測定浸潤該病人腫瘤的T淋巴細胞。
18．權(quán)利要求16的方法，包括引發(fā)對該病人腫瘤的炎性免疫應(yīng)答和測定該炎性免疫應(yīng)答。
19．權(quán)利要求16的方法，包括引發(fā)對該病人腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)和測定該遲發(fā)型過敏反應(yīng)。
20．權(quán)利要求16的方法，其中所述惡性腫瘤選自癌和非實體瘤。
21．權(quán)利要求16的方法，其中所述惡性腫瘤選自白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、腎癌和前列腺癌。
22．權(quán)利要求21的方法，其中所述白血病是急性骨髓性白血病。
23．權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤細胞膜是選自同源腫瘤細胞膜和同種異體腫瘤細胞膜的腫瘤細胞膜。
24．權(quán)利要求23的方法，其中所述同源腫瘤細胞膜是自體的。
25．權(quán)利要求16的方法，其中所述半抗原選自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙?；?N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸熒光素、砷酸苯異硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥及其組合。
26．權(quán)利要求16的方法，其中所述組合物還含有一種佐劑。
27．權(quán)利要求26的方法，其中所述佐劑選自卡介苗、QS-21、脫毒的內(nèi)毒素和細胞因子。
28．權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤細胞膜是同種異體的，所述組合物進一步含有一種抗原呈遞細胞。
29．權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤細胞膜是同種異體的，所述抗原呈遞細胞是同源的。
30．權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤細胞膜是同種異體的，所述抗原呈遞細胞是自體的。
31．一種引發(fā)浸潤哺乳動物腫瘤的T淋巴細胞的方法，包括對該哺乳動物施用一種治療有效量的半抗原修飾的哺乳動物腫瘤細胞膜，其中該哺乳動物患有一種與該腫瘤細胞膜相同類型的惡性腫瘤。
32．權(quán)利要求31的方法，其中所述哺乳動物是人或選自犬、貓、牛和馬科的動物。
33.一種引發(fā)對哺乳動物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答的方法，包括對該哺乳動物施用一種治療有效量的半抗原修飾的哺乳動物腫瘤細胞膜，其中該哺乳動物患有一種與該腫瘤細胞相同類型的惡性腫瘤。
34．權(quán)利要求33的方法，其中所述哺乳動物是人或選自犬、貓、牛和馬科的動物。
35．一種引發(fā)對哺乳動物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)的方法，包括對該哺乳動物施用一種治療有效量的半抗原修飾的哺乳動物腫瘤細胞膜，其中該哺乳動物患有一種與該腫瘤細胞膜相同類型的惡性腫瘤。
36．權(quán)利要求35的方法，其中所述哺乳動物是人或選自犬、貓、牛和馬科的動物。
37．一種制備半抗原修飾的腫瘤細胞膜的方法，包括裂解腫瘤細胞獲得裂解的腫瘤細胞，從該裂解的腫瘤細胞中除去細胞核獲得無細胞核的腫瘤細胞，由該無細胞核的腫瘤細胞獲得基本上無細胞的腫瘤細胞膜，并使該腫瘤細胞膜經(jīng)一種半抗原處理，獲得半抗原修飾的腫瘤細胞膜。
38．權(quán)利要求37的方法，其中所述裂解選自低滲休克、機械分裂和酶促分裂。
39．權(quán)利要求37的方法，其中所述半抗原選自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙?；?N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸熒光素、砷酸苯異硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥及其組合。
40．一種分離的半抗原修飾的哺乳動物腫瘤細胞膜。
41．權(quán)利要求40的膜，其中所述哺乳動物是人或選自犬、貓、牛和馬科的動物。
42．權(quán)利要求41的膜，其中所述哺乳動物是人。
43．權(quán)利要求42的膜，其中該膜分離自選自癌細胞和非實體瘤細胞的腫瘤細胞。
44．權(quán)利要求42的膜，其中該膜來源于選自白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、腎癌和前列腺癌的腫瘤。
45．權(quán)利要求44的膜，其中所述白血病是急性骨髓性白血病。
46．權(quán)利要求40的膜，其選自同源腫瘤細胞膜和同種異體腫瘤細胞膜。
47．權(quán)利要求46的膜，其中所述同源腫瘤細胞膜是自體的。
48．權(quán)利要求40的膜，其中所述半抗原選自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙?；?N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸熒光素、砷酸苯異硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥及其組合。
49．權(quán)利要求40的膜，其至少具有下列性質(zhì)之一(ⅰ)引發(fā)浸潤哺乳動物腫瘤的T淋巴細胞，(ⅱ)引發(fā)對哺乳動物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答，(ⅲ)引發(fā)對哺乳動物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)和(ⅳ)在體外刺激T細胞。
50．權(quán)利要求40的膜，其中該膜是一種細胞外膜。
51．權(quán)利要求40的膜，其中該膜包括含有MHC分子、熱激蛋白或其組合的膜部分。
52．一種包含權(quán)利要求40的膜的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的腫瘤細胞膜、其組合物、制備該膜和組合物的方法、和治療癌癥的方法。本發(fā)明的組合物包括由半抗原修飾的腫瘤細胞制備的組合物。本發(fā)明的腫瘤細胞膜和組合物具有下列性質(zhì):當(dāng)向患有與所述腫瘤細胞相同類型的惡性腫瘤的哺乳動物施用時,能引發(fā)浸潤哺乳動物腫瘤的T淋巴細胞,引發(fā)對哺乳動物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答,引發(fā)對哺乳動物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。本發(fā)明的膜和組合物也能在體外刺激T細胞。本發(fā)明的方法涉及治療癌癥,包括施用一種治療有效量的腫瘤細胞膜。本發(fā)明也涉及一種制備半抗原修飾的腫瘤細胞膜的方法和含有該膜的劑型。
文檔編號A61K39/385GK1291105SQ99803065
公開日2001年4月11日 申請日期1999年2月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月17日
發(fā)明者D·伯德, 佐藤隆美 申請人:托馬斯杰斐遜大學(xué)