專利名稱：一種用于輻射損傷治療的多肽類藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以血小板第4因子(簡稱PF4)或其活性片段或它們的活性突變蛋白為有效成分的用于放射損傷治療的多肽類藥物及其在腫瘤放療中作為造血保護(hù)劑的應(yīng)用。
骨髓是哺乳動(dòng)物體內(nèi)對輻射最敏感的組織，骨髓損傷導(dǎo)致的造血功能衰竭是輻射致死的主要原因。因此，骨髓的輻射損傷防護(hù)及造血重建對于放射損傷的救治意義重大。造血干細(xì)胞是造血重建的關(guān)鍵細(xì)胞群，它們有很高的輻射敏感性，射線作用后其數(shù)量迅速減少，且增殖分裂自我更新和多向分化的功能明顯受抑，但是一旦有條件再生，就可以很高的增殖速率增長。因此，干細(xì)胞增殖刺激因子可用于輻射損傷的治療。目前治療由放射導(dǎo)致血細(xì)胞減少的主要方法包括骨髓移植，使用能促細(xì)胞增殖的因子如粒細(xì)胞生長刺激因子(G-CSF)，粒單細(xì)胞生長刺激因子(GM-CSF)，紅細(xì)胞生成素(EPO)，這些已獲準(zhǔn)正式投放市場并用于臨床。還有一些因子如血小板生成素TPO等已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上已證實(shí)其促進(jìn)造血重建的作用。
已知造血多能干細(xì)胞在一定的條件下能向粒單細(xì)胞、紅細(xì)胞或巨核細(xì)胞的祖細(xì)胞分化，進(jìn)一步增殖產(chǎn)生成熟的白細(xì)胞、紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞，每個(gè)巨核細(xì)胞又能產(chǎn)生數(shù)千個(gè)血小板。造血細(xì)胞的增殖和分化受許多因子的調(diào)節(jié)，這些因子包括白細(xì)胞介素1、3、6、11、12、13和SCF,GM-CSF,TPO以及EPO。它們單獨(dú)使用或合用能刺激一個(gè)系列或多個(gè)系列造血細(xì)胞的生長和分化。在正常情況下，造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞主要存在于骨髓中，新生兒臍帶血和末梢血中可采集的造血干細(xì)胞絕對數(shù)較低，不能滿足移植需要。
目前已發(fā)現(xiàn)的具有放射保護(hù)功能的試劑較多，包括細(xì)胞刺激因子，如干細(xì)胞因子SCF，白細(xì)胞介素IL-1,IL-6,IL-12等；細(xì)胞抑制因子，如腫瘤壞死因子TNF；免疫調(diào)節(jié)劑類，如細(xì)菌性脂多糖LPS。遺憾的是這些試劑至少要在放射前4小時(shí)使用才能發(fā)揮其對造血干細(xì)胞的放射保護(hù)作用，放射后使用無效，因此對放射損傷的病人無治療作用。多年來臨床上一直迫切需要一種具有雙重功能的藥物來加速放射損傷病人的造血恢復(fù)，也就是說這種藥物不僅具有增加細(xì)胞損傷恢復(fù)的功能，而且還能促進(jìn)干細(xì)胞的自我更新、增殖和分化。
已知PF4是趨化因子家族的一員，具有抑制巨核系造血的作用。研究已發(fā)現(xiàn)PF4的造血抑制作用是可逆的，在抑制干細(xì)胞增殖分化的同時(shí)，能保存其活力，故可保護(hù)造血干祖細(xì)胞免受化療藥物損傷。
本發(fā)明的目的在于提供一種用于輻射損傷治療和防護(hù)的藥物組合物及使用該藥物組合物在腫瘤放療中的造血保護(hù)。
本發(fā)明所述的用于輻射損傷治療和防護(hù)的藥物組合物是以血小板第4因子PF4和/或活性片段和/或它們的活性突變蛋白為有效成份。
上述血小板第4因子及其活性片段或它們的活性突變蛋白可以是天然的、基因重組的或它們的混合物。
所說的“活性突變蛋白”是指血小板第4因子的類似物，天然PF4或其活性片段的氨基酸殘基所替換或缺失，或者一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基替換或缺失，或者一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被加入到天然PF4的順序中，而且與天然PF4的活性片段相比，沒有顯著改變所得到的產(chǎn)物的活性。這些活性突變蛋白可以用已知的人工合成和/或定點(diǎn)誘變技術(shù)或任何其它已知的適合用于該目的技術(shù)來制備。
根據(jù)本發(fā)明，較佳的活性突變蛋白的改變是那些已知的“保守的”置換。PF4或多肽或它們的活性片段的保守的氨基酸置換會(huì)保留該分子的生物學(xué)功能。
本發(fā)明構(gòu)思基于以下實(shí)踐結(jié)果動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究顯示，接受PF4注射2次的小鼠(一次在放射前0小時(shí)，另一次在放射后4小時(shí))，經(jīng)7Gy射線照射后，存活時(shí)間較對照組延長，30天存活率從對照組的33％增至55％。這些結(jié)果表明，PF4能減低小鼠對放射的敏感性。
為闡明PF4對造血干細(xì)胞放射敏感性的影響，體外實(shí)驗(yàn)是將PF4(500ng/ml)與小鼠骨髓細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，照射7Gy后接種至預(yù)先照射15Gy的骨髓基質(zhì)細(xì)胞單層上，然后再加入等量的PF4 1-2次，置于33℃,5％CO2孵育箱中培養(yǎng)4-5周，每周半量換液，測定其中的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞集落生長數(shù)。培養(yǎng)第5周用胰酶消化粘附基質(zhì)細(xì)胞單層，測定其造血細(xì)胞集落生長數(shù)，用以估計(jì)培養(yǎng)中長期培養(yǎng)啟始細(xì)胞，長期培養(yǎng)啟始細(xì)胞(LTC-IC)目前被普遍認(rèn)為是造血干細(xì)胞數(shù)。結(jié)果培養(yǎng)后1-5周，接種PF4處理3次的細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，其非粘附的細(xì)胞數(shù)和集落數(shù)較對照組和PF4處理2次組增多，這種差異隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而趨明顯。第3周開始，對照組粘附層已不再有造血細(xì)胞，而實(shí)驗(yàn)組造血細(xì)胞卻不斷增多，特別是PF4三次組，非粘附細(xì)胞增多更明顯。第5周，對照組粘附基質(zhì)層中未檢測到集落形成細(xì)胞，CFCs為0，而集落形成細(xì)胞(CFCs)在PF4二次組和PF4三次組分別為77±6,590±46，由此可見PF4加入三次較加入二次更有利于造血干細(xì)胞輻射損傷的恢復(fù)。推測放射后2次加入PF4對造血的恢復(fù)與維持是至關(guān)重要的。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，同樣用檢測放射的骨髓細(xì)胞重建放射基質(zhì)培養(yǎng)能力的方法，比較了放射前后加PF4與單純放射后加PF4對放射的造血細(xì)胞重建造血的影響。結(jié)果第5周，非粘附細(xì)胞及粘附CFCs在放射前后加PF4組較單純放射后加PF4組略有增多，但兩組無顯著差異。說明單純放射后加入2次PF4就能使輻射損傷的干細(xì)胞恢復(fù)重建造血的能力，這一研究結(jié)果提示了PF4可能具有修復(fù)造血干細(xì)胞的輻射損傷和刺激造血干細(xì)胞自我更新的雙重能力。
實(shí)施例1取8-10周齡C57BL/6小鼠12只，分成二組，每組6只。在一組小鼠腹腔注射PF4，劑量為每只1微克，將另一組小鼠作為對照，腹腔注射等體積磷酸緩沖液(PBS),20小時(shí)后，將小鼠照射7Gy,4小時(shí)后再次注射相同劑量或等體積的PF4或PBS，然后觀查小鼠照射后30天內(nèi)的生存情況。從圖1中可以看出，接受PF4注射的小鼠，經(jīng)7Gy射線照射后，存活時(shí)間較對照組延長，30天存活率從對照組的33％增至55％，這一結(jié)果表明，PF4能減低小鼠對放射的敏感性。實(shí)施例2將5-氟脲嘧啶(150毫克/公斤體重)腹腔接種給小鼠，2天后取骨髓細(xì)胞，此細(xì)胞主要為造血干祖細(xì)胞。將此種細(xì)胞分為4組，分別與PBS(group A,as control),PF45μg/ml(group B),PF434-581μg/ml(group C)and PF433-601μg/ml(group D)(后兩者為PF4的相關(guān)活性多肽)，在37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)，然后照射7.5Gy，再繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，用染色酶標(biāo)檢測儀(MTT)檢測各組細(xì)胞的存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PF4及其相關(guān)活性多肽均能明顯增加細(xì)胞在照射后24小時(shí)的存活率，提示PF4及其相關(guān)活性多肽能減低造血干祖細(xì)胞對放射的敏感性(如圖2示)。
實(shí)施例3取5-氟脲嘧啶(150毫克/公斤體重)腹腔接種2大后的小鼠骨髓細(xì)胞，照射7.5Gy，將此細(xì)胞分為若干組，分別加入PBS及不同劑量的PF4(0.1-5μg/ml)，在37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，用MTT方法檢測各組細(xì)胞的存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)放射后加入PF4能明顯增加細(xì)胞在照射后24小時(shí)的存活率，其中0.5微克/毫升PF4效果最好，提示PF4能減低放射對造血干祖細(xì)胞的損傷(如圖3示)。實(shí)施例4將PF4(500ng/ml)與小鼠骨髓細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，照射7Gy后接種至預(yù)先照射15Gy的骨髓基質(zhì)細(xì)胞單層上，然后再加入等量的PF4 1-2次，置于33℃,5％CO2孵育箱中培養(yǎng)4-5周，每周半量換液，測定其中的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞集落生長數(shù)。培養(yǎng)第5周用胰酶消化粘附基質(zhì)細(xì)胞單層，測定其造血細(xì)胞集落生長數(shù)，用以估計(jì)培養(yǎng)中長期培養(yǎng)啟始細(xì)胞，即造血干細(xì)胞數(shù)。具體結(jié)果見表1、表2和圖4。
表1非粘附細(xì)胞中的集落形成細(xì)胞數(shù)(CFCs)每瓶中的CFCs
骨髓細(xì)胞與PF4(500ng/ml)孵育4小時(shí)，照射7Gy，然后接種至預(yù)建的照射15Gy的骨髓基質(zhì)細(xì)胞單層上，相同劑量的PF4再加2次，間隔24小時(shí)表2培養(yǎng)35天后每瓶粘附細(xì)胞中的集落形成細(xì)胞數(shù)(CFCs
PF4二次分別在放射前4小時(shí)和放射后立即加入兩次PF4 500ng/ml；PF4三次分別在放射前4小時(shí)和放射后立即及24小時(shí)加入三次PF4 500ng/ml；實(shí)施例5將小鼠骨髓細(xì)胞分為三組，一組細(xì)胞加PF4(500ng/ml)，另外兩組細(xì)胞加磷酸緩沖液PBS，將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，照射7Gy后接種至預(yù)先照射15Gy的骨髓基質(zhì)細(xì)胞單層上，每組3-6瓶。接種PF4處理的細(xì)胞的培養(yǎng)瓶再加入等量的PF4 2次，間隔24小時(shí)；接種PBS處理的細(xì)胞的培養(yǎng)瓶再分成兩組，一組再加入PF4 2次(500ng/ml)，間隔24小時(shí)；另一組繼續(xù)加PBS2次，間隔24小時(shí)；將細(xì)胞置于33℃，5％CO2孵育箱中培養(yǎng)4-5周，每周半量換液，測定其中的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞集落生長數(shù)。培養(yǎng)第5周用胰酶消化粘附基質(zhì)細(xì)胞單層，測定其造血細(xì)胞集落生長數(shù)，用以估計(jì)培養(yǎng)中長期培養(yǎng)啟始細(xì)胞，即造血干細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如下表3和圖5所示；表3培養(yǎng)35天后每瓶粘附細(xì)胞中的集落形成細(xì)胞數(shù)(CFCs)<
PF42次分別放射后立即及24小時(shí)加入兩次PF4 500ng/ml；PF43次分別在放射前4小時(shí)和放射后立即及24小時(shí)加入三次PF4 500ng/ml；實(shí)施例6將小鼠骨髓長期培養(yǎng)3-4周的非粘附細(xì)胞2×106分別接種至預(yù)先照射8Gy的骨髓基質(zhì)TC-1細(xì)胞單層上(這種非粘附細(xì)胞主要包括髓系各階段造血細(xì)胞，TC-1細(xì)胞是從小鼠骨髓長期培養(yǎng)中建立的基質(zhì)細(xì)胞系，其可通過分泌因子刺激性造血細(xì)胞在體外生長)，其中一組細(xì)胞加PF433-60(50-100ng/ml)，另外一組細(xì)胞加磷酸緩沖液PBS，每組3瓶，接種PF433-60處理的細(xì)胞的培養(yǎng)瓶共加PF433-603次，間隔24小時(shí)，將細(xì)胞置于33℃,5％CO2孵育箱中培養(yǎng)3天，倒置顯微鏡下分別計(jì)數(shù)粘附基質(zhì)細(xì)胞生長的；由6-100個(gè)以上的造血細(xì)胞組成的細(xì)胞集團(tuán)數(shù)，結(jié)果見表4及圖6、圖7。由此可見，PF4多肽可增加造血細(xì)胞對基質(zhì)細(xì)胞的粘附和增殖應(yīng)答。
表4PF433-60對造血細(xì)胞在基質(zhì)細(xì)胞上形成造血細(xì)胞島(CAFC)的作用


圖1PF4對放射小鼠生存能力的影響其中-20為照射7Gy前20小時(shí)，給小鼠腹腔注射PF4 1μg/只+4為照射后4小時(shí)再注射一次。圖2PF4及其相關(guān)活性多肽對細(xì)胞照射7.5Gy后24小時(shí)的存活率影響其中A-對照組(PBS)B-PF4 5μg/ml組C-PF434-581μg/ml組(PF4的相關(guān)活性多肽)D-PF433-601μg/ml組(PF4的相關(guān)活性多肽)圖3PF4對細(xì)胞在照射7.5Gy后24小時(shí)的存活率影響圖4PF4對放射后長期培養(yǎng)啟始細(xì)胞的保存作用其中--◆--PBS--■--PF4 500ng/ml加入三次---▲--PF4 500ng/ml加入二次圖5PF4對放射后長期培養(yǎng)啟始細(xì)胞的保存作用其中■-PBS
-PF4-4,0為放射前4小時(shí)和放射后立即加入
-PF4-4,0,24為放射前4小時(shí)，放射后立即和24小時(shí)加入□-PF4 0,24為放射后立即和24小時(shí)加入圖6PBS組接種造血細(xì)胞后第48小時(shí)粘附層細(xì)胞圖象其中，粘附層有少量造血細(xì)胞，造血細(xì)胞集團(tuán)小圖7PF433-60組接種造血細(xì)胞后第48小時(shí)粘附層細(xì)胞的圖象其中，粘附層有大量造血細(xì)胞，并出現(xiàn)造血細(xì)胞島。
權(quán)利要求
1.用于輻射損傷治療及放射保護(hù)的藥物組合物，其特征在于，含有作為有效成分的血小板第4因子和/或其活性片段和/或它們的突變蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述活性片斷可以是血小板第4因子的中部活性區(qū)33-60個(gè)氨基酸殘基也可以是血小板第4因子的任一區(qū)域。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述突變旦白為與天然血小板第4因子具有80％的同源性的多肽。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述突變旦白為與天然PF4和/或其活性片段具有80％的同源性的多肽。
5.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物在輻射損傷中的應(yīng)用，其特征在于其可加速造血干細(xì)胞的損傷修復(fù)，放射前后合用效果最佳，但單純放射后給藥仍然有效。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以血小板第4因子(PF4)或其活性片段或它們的活性突變蛋白為有效成分用于放射損傷治療的多肽類藥物組合物，所說的藥物組合物可以是天然的，基因重組的或它們的組合物，將PF4按規(guī)定程序與致死劑量照射的小鼠骨髓細(xì)胞共孵育，然后接種至放射的骨髓基質(zhì)單層上培養(yǎng)至第5周，用胰酶消化粘附基質(zhì)細(xì)胞單層，測定其造血細(xì)胞集落生長素，用以估算培養(yǎng)中長期培養(yǎng)啟始細(xì)胞，即造血干細(xì)胞數(shù)，結(jié)果表明，放射前后使用該藥物組合物效果最佳，單純放射后給藥仍有效果。
文檔編號(hào)A61K38/19GK1238217SQ99109339
公開日1999年12月15日 申請日期1999年6月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月24日
發(fā)明者韓忠朝, 馬月霞, 雅克·康, 莫妮卡·阿拉瑪妮 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所, 法國巴黎血管和血液研究所