專利名稱：改善上胃腸道功能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胰高血糖素相關(guān)多肽及其用途，單獨(dú)或與其他肽類激素聯(lián)合用于預(yù)防和治療上胃腸道功能紊亂。
背景技術(shù)：
胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)是一種由多效性胰高血糖素基因以組織特異性的方式表達(dá)的33個(gè)氨基酸的多肽。在氨基酸序列方面，GLP-2與胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)之間具有顯著同源性。而且，不同哺乳動(dòng)物的GLP-2之間也是高度保守的。例如，人GLP-2和degu(一種南美洲的嚙齒動(dòng)物)GLP-2與鼠GLP-2之間的差異分別為1個(gè)和3個(gè)氨基酸。當(dāng)GLP-2是外源基因時(shí)，它能夠隨實(shí)驗(yàn)小鼠小腸上皮細(xì)胞的增殖而出現(xiàn)顯著的增加，而且明顯地?zé)o任何不合需要的副作用(Drucker et al.，1996，PNASUSA 937911-7916)。隨后研究表明，對(duì)天然GLP-2的肽鏈序列進(jìn)行某種修飾后得到的多肽類似物在小腸內(nèi)具有增強(qiáng)了的營(yíng)養(yǎng)活性(見(jiàn)1996年6月28日提交的序列號(hào)為08/669,791的美國(guó)的同時(shí)待審查申請(qǐng)，在此引入作為參考)。進(jìn)一步表明GLP-2能使大腸組織增殖(1996年12月10日提交的序列號(hào)為08/763,177的美國(guó)的同時(shí)待審申請(qǐng)，1997年5月2日提交的序列號(hào)為08/850,664的美國(guó)申請(qǐng)，以及Litvak et al.，1997，腸胃病學(xué)(Gastroenterology)，vol.112(4增刊)，第A1455頁(yè)，所有文獻(xiàn)在此引入作為參考)。而且，還表明GLP-2能加快D-葡萄糖通過(guò)腸基側(cè)膜(intestinal basolateral member)的最大轉(zhuǎn)運(yùn)速度(Cheeseman和Tseng，1996，美國(guó)生理學(xué)雜志(American Journalof Physiology)271G477-G482)。
研究已經(jīng)表明，大量結(jié)構(gòu)上與GLP-2無(wú)關(guān)的肽類激素也具有不同程度的營(yíng)養(yǎng)活性。例如，胰島素樣生長(zhǎng)因子-2(IGF-2)能夠促進(jìn)體內(nèi)小腸隱窩細(xì)胞(crypt cell)的有絲分裂(美國(guó)專利US5482926)。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)與IGF-2有64％的序列同源性，IGF-1及其肽類似物能夠加速體內(nèi)消化道組織的生長(zhǎng)(WO91/12018)。生長(zhǎng)激素(GH)具有多種生理學(xué)效應(yīng)，包括促進(jìn)腸粘膜增殖(見(jiàn)，例如，Willmore，美國(guó)專利US5288703)，從而增大消化道的吸收容量。然而，上述肽類激素都不具有GLP-2促進(jìn)下胃腸道組織增殖的效力或特性。
發(fā)明概述部分地，本發(fā)明是建立在下列發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)之上GLP-2受體激動(dòng)劑能夠增強(qiáng)上胃腸道的功能。特別地，研究表明GLP-2能促進(jìn)食管和胃組織的增殖。因此，本發(fā)明的主要目的為開(kāi)發(fā)GLP-2受體激動(dòng)劑在治療及相關(guān)方面的用途。
特別是，已經(jīng)證明GLP-2和GLP-2的肽類類似物能導(dǎo)致上胃腸道組織的增殖。因此，本發(fā)明一方面提供了一種促進(jìn)需要治療的受療者上胃腸道組織增殖的方法，其中包括將促進(jìn)上胃腸道增殖的量的GLP-2或GLP-2類似物釋放到受療者的上胃腸道。
此外，已經(jīng)表明GLP-2能改善非甾醇類抗炎藥(NSAID)引起的胃腸道毒性。因此，本發(fā)明提供了一種從治療或預(yù)防角度對(duì)包括上胃腸道的胃腸有出現(xiàn)炎癥危險(xiǎn)的受療者進(jìn)行治療的方法，其中包括將有效量的GLP-2或GLP-2類似物釋放到上胃腸道。
更具體地，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種對(duì)上胃腸道出現(xiàn)病變的受療者進(jìn)行治療的方法，其中將GLP-2或GLP-2類似物按能夠改善病情的量釋放到上胃腸道。
本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面，提供了一種對(duì)食管受到損傷、部分被切除、侵蝕或出現(xiàn)炎癥的受療者進(jìn)行治療的方法，其中包括將用制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受載體攜帶的改善劑量的GLP-2或GLP-2類似物釋放到受療者上胃腸道。另一方面，以制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的形式以能導(dǎo)致上胃腸道增殖的有效量提供GLP-2或GLP-2類似物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種對(duì)胃部出現(xiàn)損傷、萎縮或炎癥的受療者進(jìn)行治療的方法，其中包括將以制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受載體攜帶的改善劑量的GLP-2或GLP-2類似物釋放到受療者胃的損傷或炎癥部位。另一個(gè)方面，以制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的形式以能導(dǎo)致胃組織增殖的有效劑量提供GLP-2。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種從治療或預(yù)防角度對(duì)包括上胃腸道的胃腸道上有出現(xiàn)炎癥危險(xiǎn)的受療者進(jìn)行預(yù)防性治療的方法，其中包括下列步驟
a)鑒定出在上胃腸道上有出現(xiàn)炎癥危險(xiǎn)的受療者；以及b)向受療者施用有效抑制炎癥發(fā)生的量的GLP-2或GLP-2類似物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種鑒定用于治療涉及上胃腸道炎癥的多肽的方法，其中包括a)得到一種脊椎動(dòng)物GLP-2多肽類似物，該類似物至少有一個(gè)氨基酸替代、缺失、添加或含有一個(gè)帶有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸；b)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的上胃腸道誘發(fā)炎癥；c)在使用人[Gly2]GLP-2時(shí)，按照能改善上胃腸道炎癥狀況的給藥方案，用類似物治療上述帶有誘發(fā)上胃腸道炎癥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；以及d)與未接受這種多肽的對(duì)照動(dòng)物相比，測(cè)定上述類似物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況或死亡率的影響，或者與未接受這種多肽的對(duì)照動(dòng)物相比，測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的上胃腸道的質(zhì)量。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種鑒定用于防止或改善涉及上胃腸道的炎癥的多肽的方法，包括下列步驟a)得到脊椎動(dòng)物GLP-2多肽的一種類似物，該類似物至少有一個(gè)氨基酸替代、缺失、添加或含有一個(gè)帶有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸；b)在使用人[Gly2]GLP-2時(shí)，按照能改善上胃腸道炎癥狀況的給藥方案，用類似物治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；以及c)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的上胃腸道誘發(fā)炎癥；e)與未接受這種多肽的對(duì)照動(dòng)物相比，測(cè)定上述類似物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況或死亡率的影響，或者與未接受這種多肽的對(duì)照動(dòng)物相比，測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的上胃腸道的質(zhì)量。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種從預(yù)防角度對(duì)在包括上胃腸道的胃腸道上有出現(xiàn)炎癥危險(xiǎn)的受療者進(jìn)行醫(yī)治的方法，其中包括下列步驟a)鑒定出在上胃腸道上有出現(xiàn)炎癥危險(xiǎn)的受療者；以及b)向受療者施用有效抑制炎癥發(fā)生和/或改善炎癥狀況量的GLP-2或GLP-2類似物。
本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面，提供了一種用于鑒定能夠促進(jìn)上胃腸道組織增殖的多肽的方法，其中包括步驟a)得到一種脊椎動(dòng)物GLP-2多肽類似物，該類似物至少有一個(gè)氨基酸替代、缺失、添加或含有一個(gè)帶有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸；b)當(dāng)使用人[Gly2]GLP-2時(shí)，采用能使上胃腸道增殖的給藥方案，將上述類似物釋放到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的上胃腸道；以及c)在給藥方案結(jié)束后，評(píng)定上胃腸道或其代表性部分在質(zhì)量、長(zhǎng)度或總蛋白含量上的增加。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種使上胃腸道組織或從其得到的細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括以下步驟用添加有促進(jìn)生長(zhǎng)量的GLP-2或GLP-2類似物的培養(yǎng)基培養(yǎng)上述組織或細(xì)胞。
部分地，本發(fā)明也是建立在以下預(yù)見(jiàn)的基礎(chǔ)上GLP-2或GLP-2類似物與肽類激素IGF-1和/或GH協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞的增殖。而且，GLP-2與IGF-1或GH聯(lián)合施用導(dǎo)致細(xì)胞增殖。這種聯(lián)合治療對(duì)小腸和大腸的營(yíng)養(yǎng)效果比單獨(dú)施用GLP-2、IGF-1或GH的效果更強(qiáng)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是GLP-2與IGF-1或GH聯(lián)合施用促進(jìn)生長(zhǎng)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是促進(jìn)哺乳動(dòng)物上胃腸道組織生長(zhǎng)的組合物，其中包括將GLP-2或GLP-2的營(yíng)養(yǎng)類似物與至少一種選自IGF-1、IGF-2或GH的其它肽類激素以及制藥學(xué)上可接受的載體混合在一起。替代地，本發(fā)明的這些組合物可以包括具有營(yíng)養(yǎng)活性的GLP-2、IGF-1、IGF-2和/或GH的類似物。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物上胃腸道組織生長(zhǎng)的方法，該方法包括治療哺乳動(dòng)物，提高下列多肽的血清水平GLP-2或GLP-2類似物與其他至少一種選自IGF-1、IGF-1類似物、IGF-2、IGF-2類似物、GH和GH類似物的多肽。本發(fā)明的這種方法包括向哺乳動(dòng)物聯(lián)合施用有效量的GLP-2和有效量的其他至少一種選自IGF-1、IGF-1類似物、IGF-2、IGF-2類似物、GH和GH類似物的多肽，用激素或能夠提高GLP-2、IGF-1、IGF-2和/或GH血清水平的小的有機(jī)分子治療哺乳動(dòng)物，以及應(yīng)用基因療法引發(fā)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性生成GLP-2、IGF-1、IGF-2和/或GH，或者構(gòu)建能夠單獨(dú)或聯(lián)合表達(dá)GLP-2、IGF-1、IGF-2和/或GH的細(xì)胞，然后將該細(xì)胞移植到哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生預(yù)期的生物效應(yīng)。
本發(fā)明還提供了一種治療受療者增強(qiáng)上胃腸道功能的方法，其中包括治療哺乳動(dòng)物，提高下列多肽的血清水平GLP-2或GLP-2類似物與其他至少一種選自IGF-1、IGF-1類似物、IGF-2、IGF-2類似物、GH和GH類似物的多肽。
本發(fā)明的組合物和方法用于恢復(fù)或保持胃腸道功能，用于促進(jìn)損傷、潰瘍/發(fā)炎的腸粘膜康復(fù)和再生，用于減小腸道疾病的危險(xiǎn)，用于改善哺乳動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀況，以及用于治療或防止哺乳動(dòng)物，特別是人的營(yíng)養(yǎng)失調(diào)或上胃腸道紊亂。
替代地，本發(fā)明的組合物和方法能夠用于促進(jìn)健康哺乳動(dòng)物上胃腸道增殖，例如，能夠增加牛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的吸收，使其更早斷乳或增加乳和肉的產(chǎn)量。
本發(fā)明的另一個(gè)方面還提供了GLP-2或GLP-2類似物用于生產(chǎn)能夠加速上胃腸道組織生長(zhǎng)的藥用或獸藥用制劑的用途。本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的方面，這種制劑還包括另外一種選自IGF-1、IGF-1類似物、IGF-2、IGF-2類似物、GH和GH類似物的肽類激素。
本發(fā)明進(jìn)一步還提供了試劑盒，其中包括GLP-2或GLP-2類似物與其他至少一種選自IGF-1、IGF-1類似物、IGF-2、IGF-2類似物、GH和GH類似物的多肽。這類組合物以有效治療的單位劑量或多劑量的藥量來(lái)提供。
本發(fā)明還提供了一種用于促進(jìn)上胃腸道組織或細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其中包括以下步驟用含有促進(jìn)生長(zhǎng)的GLP-2或GLP-2類似物與其他至少一種選自IGF-1、IGF-1類似物、IGF-2、IGF-2類似物、GH和GH類似物的多肽激素二者結(jié)合的培養(yǎng)基培養(yǎng)上述組織或細(xì)胞。這些方法可以培養(yǎng)細(xì)胞或體內(nèi)的形式應(yīng)用于細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面還提供了一種治療患者恢復(fù)上胃腸道組織的方法，該方法按下列步驟進(jìn)行(a)用促進(jìn)組織生長(zhǎng)的量的GLP-2或GLP-2類似物與其他至少一種選自IGF-1、IGF-1類似物、IGF-2、IGF-2類似物、GH和GH類似物的多肽激素二者的結(jié)合，培養(yǎng)來(lái)自患者的組織或細(xì)胞，然后(b)把這些組織或細(xì)胞移植到接受治療的患者體內(nèi)。
最后，本發(fā)明還提供了一種用于當(dāng)一種激素與GLP-2聯(lián)用時(shí)測(cè)定該激素活性的方法，其中包括步驟(1)將該激素與一定量的GLP-2或GLP-2類似物聯(lián)合施用給實(shí)驗(yàn)哺乳動(dòng)物；(2)評(píng)定實(shí)驗(yàn)哺乳動(dòng)物上胃腸道組織的繼發(fā)生長(zhǎng)；以及(3)測(cè)定試驗(yàn)哺乳動(dòng)物上胃腸道組織的生長(zhǎng)相對(duì)于單獨(dú)用GLP-2處理的對(duì)照哺乳動(dòng)物是否被加快。
附圖簡(jiǎn)述

圖1給出的是用GLP-2處理后，食管粘膜上皮和肌肉層中5-溴脫氧尿苷染色細(xì)胞數(shù)目的變化。
圖2給出的是用GLP-2治療后食管中總蛋白含量的變化。
圖3給出的是用GLP-2治療后胃的重量的變化。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及GLP-2和GLP-2類似物的治療、預(yù)防以及相關(guān)的用途，具體地用于改善上胃腸道功能因疾病或損傷減弱的醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)的狀況。例如，該方法有效地用于治療患有上胃腸道炎癥的受療者，上胃腸道經(jīng)過(guò)切除的受療者，或者上胃腸道受到毒物等傷害的受療者。
此處使用的“上胃腸道”是指胃腸道(GI)中包括食管和胃的部分。所述的食管是指胃腸道中從接近咽食管結(jié)合處開(kāi)始向遠(yuǎn)延伸經(jīng)由后縱隔至胃食管結(jié)合處為止的部分。所述的胃是指從胃食管結(jié)合處延伸至十二指腸為止的可膨脹的結(jié)構(gòu)。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“受療者”包括人或其他哺乳動(dòng)物以及包括家畜和寵物。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“GLP-2受體激動(dòng)劑”是指任意一種能結(jié)合到GLP-2受體上導(dǎo)致GLP-2受體活化的分子，包括例如GLP-2或GLP-2的肽類類似物。近來(lái)發(fā)現(xiàn)GLP-2受體是一種G-蛋白偶聯(lián)受體。已經(jīng)分離到了GLP-2受體的編碼核酸(見(jiàn)1996年12月13日提交的序列號(hào)為US08/767,224以及1997年4月24日提交的序列號(hào)為US08/845,546的待審查的美國(guó)申請(qǐng)，這兩篇專利在此引作參考)。因此，本領(lǐng)域中鑒定G-蛋白偶聯(lián)受體通用方法也可以用于GLP-2受體。上面提及的待審查申請(qǐng)中公開(kāi)了一種用于評(píng)定化合物的GLP-2受體激動(dòng)劑活性的特別有效的方法。簡(jiǎn)而言之，將GLP-2受體編碼核酸轉(zhuǎn)化到COS細(xì)胞等合適的細(xì)胞中，從而在細(xì)胞表面提供功能性受體。然后通過(guò)讓轉(zhuǎn)化細(xì)胞與受試化合物接觸，測(cè)定受試化合物的激動(dòng)劑活性；受試化合物與轉(zhuǎn)化細(xì)胞結(jié)合引起環(huán)腺苷酸單磷酸酯胞內(nèi)水平的升高，這種現(xiàn)象顯示激動(dòng)劑活性。
用這種方法可以從GLP-2肽類類似物和被選擇的化學(xué)文庫(kù)篩選GLP-2受體激動(dòng)劑活性。這里給出了有關(guān)于可以有效地應(yīng)用到這種方法中的肽類類似物的指導(dǎo)，這種指導(dǎo)還可見(jiàn)于1996年4月12日提交的序列號(hào)為US08/632,533和08/631,273的待審查美國(guó)申請(qǐng)，這些文獻(xiàn)在此引入作為參考。而且，通過(guò)高流通量或紫外高流通量篩選技術(shù)，購(gòu)買獲得的任何一種化學(xué)文庫(kù)都可以有效地用于篩選小分子的GLP-2受體激動(dòng)劑。使用此處以及科學(xué)文獻(xiàn)中描述的方式，可以從GLP-2肽類類似物以及鑒定為GLP-2受體激動(dòng)劑的小分子激動(dòng)劑中篩選用于治療以及與上胃腸道疾病醫(yī)治相關(guān)的用途。
任何一個(gè)需要增強(qiáng)上胃腸道活力的受療者都可能是一個(gè)接受本發(fā)明的GLP-2激動(dòng)劑治療的候選人。特別是，根據(jù)本發(fā)明可以有效治療的一組疾病包括食管疾病。出現(xiàn)下列一種或多種癥狀后的患者就可以被典型地診斷為患有這種疾病吞咽時(shí)疼痛或不適，吞咽液體或固體時(shí)疼痛或不適，燒心，口中有點(diǎn)異味，咽喉中吞咽時(shí)有食物刺痛感(往往咽喉中出現(xiàn)腫塊)以及氣短?？梢杂檬彻芪哥R探察食管來(lái)證實(shí)食管中損傷或病變的存在。替代地，可以利用放射學(xué)方法使用鋇劑消化道X-射線造影術(shù)或CT探測(cè)口服造影物質(zhì)的方法進(jìn)行食管探測(cè)。也可以通過(guò)測(cè)壓法來(lái)評(píng)定食管功能。可以使用Bernstein實(shí)驗(yàn)從功能上評(píng)定食管疾病，特別是食管炎的存在。為了更確切地診斷食管疾病，可以對(duì)食管采取活組織檢查來(lái)分析炎癥的組織學(xué)證據(jù)，還可以進(jìn)一步對(duì)這些材料進(jìn)行培養(yǎng)以測(cè)定是否存在著細(xì)菌、病毒或真菌感染以及炎癥。
食管的炎癥包括炎性血管炎(inflammation-vasculitis)、感染后炎癥、浸潤(rùn)性疾病，例如，硬皮病和淀粉樣蛋白，以及由于乙醇、酸和堿等有毒物質(zhì)突發(fā)性過(guò)量的作用引起炎癥的疾病。
根據(jù)本發(fā)明，另外一組可以有效治療的疾病是涉及胃部的疾病，例如肽潰瘍(peptidic ulcer)。出現(xiàn)下列癥狀后的患者就可以典型地診斷為具有胃部疾病休息或吃飯時(shí)，或者兩種情況下都出現(xiàn)腹痛。然而，胃部疾病的癥狀可以是非典型性的，難以區(qū)分出食管疼痛和胃部疼痛之間的區(qū)別。
此外，GLP-2也可以有效地應(yīng)用于被診斷為有出現(xiàn)上胃腸道機(jī)能紊亂危險(xiǎn)的患者，以防止疾病的發(fā)生或減輕發(fā)病的嚴(yán)重程度。這類患者包括吸煙者和血型為與十二指腸潰瘍及幽門前潰瘍有關(guān)的O型血的患者，服用或?qū)⒁靡环N或多種NSAIDS的患者，接受或?qū)⒁邮芑煹幕颊撸约皯?yīng)激性潰瘍(stress-induced ulceraton)患者。
證明用GLP-2激動(dòng)劑治療能夠加快上胃腸道的組織生長(zhǎng)。從潛在的治療學(xué)角度來(lái)看，用于測(cè)定何種GLP-2類似物具有上胃腸道增殖活性的合適模式可以用于醫(yī)治實(shí)施例1和實(shí)施例3中描述的上胃腸道醫(yī)學(xué)疾病或獸醫(yī)學(xué)疾病。
這些文獻(xiàn)(見(jiàn)，例如，Ann.Surg.Oncol.1(3)252-261(1994)；Ann.Emerg.Med.22(2)178-182(1993))中描述了用于研究食管疾病的動(dòng)物模型，這些動(dòng)物模型包括食管的機(jī)械性損傷或酸誘發(fā)性損傷。因此，本領(lǐng)域中描述的動(dòng)物模型能夠用于評(píng)定被鑒定為能夠改善上胃腸道炎性狀況的GLP-2激動(dòng)劑的化合物的效力。
文獻(xiàn)(見(jiàn)，例如，Experimental and Molecular Pathology 59136-154(1993))中描述了研究胃部疾病使用的動(dòng)物模型。這些模型包括服用非特異性抗炎性藥物誘發(fā)胃十二指腸炎，以及單獨(dú)使用乙醇或與其他藥劑聯(lián)用誘發(fā)胃部損傷。因此，本領(lǐng)域中描述的動(dòng)物模型可以用于評(píng)定被鑒定為能夠改善胃部病情的GLP-2激動(dòng)劑的化合物的效力。
GLP-2的各種脊椎動(dòng)物形式包括，例如，大鼠GLP-2及其同源性物質(zhì)，包括公牛(OX)GLP-2、豬GLP-2、degu GLP-2、牛GLP-2、豚鼠GLP-2、倉(cāng)鼠GLP-2、人GLP-2、虹鱒魚(yú)GLP-2以及雞GLP-2。已經(jīng)有許多文獻(xiàn)報(bào)道了上述這些形式的GLP-2的序列，這些文獻(xiàn)包括Buhl et al.in J.Biol.Chem.，1988，263(18)8621，Nishi andSteiner，Mol.Endocrinol.，1990，41192-8以及Irwin and Wong，Mol.Endocrinol.，1995，9(3)267-77。這些作者報(bào)道的序列在此引入作為參考。
完全根據(jù)本發(fā)明提供的指導(dǎo)，利用一般肽化學(xué)技術(shù)就能夠生產(chǎn)出脊椎動(dòng)物GLP-2類似物，并能評(píng)定它們對(duì)于上胃腸道的營(yíng)養(yǎng)活性。本發(fā)明特別優(yōu)選的類似物是以人GLP-2序列為基礎(chǔ)的類似物，該序列為His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp其中的1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被另外1個(gè)氨基酸殘基保守性地取代，只要該類似物保留了對(duì)上胃腸道的營(yíng)養(yǎng)活性，即測(cè)量時(shí)下列指數(shù)中至少有1個(gè)增加上胃腸道長(zhǎng)度、蛋白含量、質(zhì)量或上胃腸道細(xì)胞的有絲分裂/細(xì)胞分裂的速度，例如通過(guò)使用5-溴脫氧尿苷(BrDU)等有絲分裂間接指示劑測(cè)量得到的。
任一種天然存在的GLP-2，優(yōu)選人GLP-2序列的保守性取代可以定義為下列5組任一組中的互換I.Ala、Ser、Thr、Pro、GlyII.Asn、Asp、Glu、GlnIII.His、Arg、LysIV.Met、Leu、Ile、Val、CysV.Phe、Tyr、Trp本發(fā)明還包括對(duì)任一種脊椎動(dòng)物GLP-2序列中氨基酸的非保守性取代，只要這種非保守性取代發(fā)生在從不同種分離的GLP-2中已知的變化的氨基酸位置上。通過(guò)對(duì)比所有已知脊椎動(dòng)物GLP-2序列可以容易地測(cè)定出非保守性殘基的位置。例如，Buhl等人在J.Biol.Chem.1988，263(18)8621一文中比較了來(lái)自人、豬、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠以及牛的GLP-2序列，發(fā)現(xiàn)第13、16、19、27和28位是非保守性的(位置序號(hào)是參照人GLP-2序列的相應(yīng)位置編排的)。Nishi AndSteiner，Mol.Endocrinol.，1990，41192-8中發(fā)現(xiàn)GLP-2編碼序列中的另外一個(gè)殘基，即上述人序列中的第20位殘基在degu中也發(fā)生了變化，degu是南美洲的一種土著鼠種。因此，在這種情況下，哺乳動(dòng)物中變化的以及優(yōu)選可以被非保守性氨基酸取代的氨基酸位置為第13、16、19、20、27和28位。脊椎動(dòng)物中變化的以及也可以被非保守性殘基取代的另外的氨基酸殘基發(fā)生在第2、5、7、8、9、10、12、17、21、22、23、24、26、29、30、31、32和33位。
替代地，可以在任一位置上進(jìn)行非保守性取代，其中丙氨酸掃描誘變(alanine-scanning mutagenesis)顯示，對(duì)丙氨酸取代一種氨基酸的突變的耐受不會(huì)破壞對(duì)于上胃腸道的全部活性。丙氨酸掃描誘變技術(shù)的描述見(jiàn)Cunningham and Wells，Science，1989，2441081，在此引入作為參考。由于多數(shù)的GLP-2序列僅由約33個(gè)氨基酸組成(并且在人GLP-2中總含有4個(gè)丙氨酸)，因此如下面實(shí)施例中教導(dǎo)的那樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地測(cè)試在其余任一位置上用丙氨酸模擬的效果。
在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施例中，所述的GLP-2肽選自1)具有下列序列的大鼠GLP-2His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp；2)人GLP-2，Ala19取代了大鼠GLP-2中的Thr19，表示如下His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp；3)人[Gly2]GLP-2(人GLP-2中第2位上的丙氨酸被甘氨酸所置換)；4)GLP-2’s和GLP-2類似物，這些類似物中摻入了例如Arg或Arg-Arg等N-端保護(hù)基團(tuán)和/或N-端延伸；和/或摻入了例如Arg或Arg-Arg等C-端保護(hù)基團(tuán)和/或C-端延伸。
另外，1997年4月11日提交的PCT申請(qǐng)PCT/CA97/00252中描述了大量的GLP-2激動(dòng)劑肽，在此引入作為參考，這些肽也可以用于本發(fā)明的方法。
R1和R2表示的“保護(hù)基團(tuán)”是肽化學(xué)領(lǐng)域中常用的能賦予生化穩(wěn)定性和外肽酶抗性的化學(xué)基團(tuán)。合適的N-端保護(hù)基團(tuán)包括，例如，C1-5烷酰基例如乙?；?。合適的N-端保護(hù)基團(tuán)還有不含氨基官能團(tuán)的氨基酸類似物。合適的C-端保護(hù)基團(tuán)包括能在C-端羧基的碳原子上生成酮或酰胺的基團(tuán)，或者在羧基的氧原子處生成酯的基團(tuán)。生成酮和酯的基團(tuán)包括烷基，具體為支鏈或無(wú)支鏈的C1-5烷基，例如，甲基、乙基和丙基，生成酰胺的基團(tuán)包括伯胺、烷基胺等氨基官能團(tuán)，例如，單-C1-5烷氨基和雙-C1-5烷氨基官能團(tuán)例如甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、甲乙氨基等。氨基酸類似物也適合用于保護(hù)本發(fā)明化合物的C-末端，例如，鯡精胺等脫羧氨基酸類似物。
可以用于本發(fā)明的GLP-2肽包括剛剛描述過(guò)的各種GLP-2的衍生物，其中各種官能團(tuán)被偶聯(lián)到肽鏈上，例如，為了延長(zhǎng)半衰期、增強(qiáng)穩(wěn)定性、指導(dǎo)(direct)GLP-2作用等。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了引入親脂性部分以延長(zhǎng)半衰期，在賴氨酸和精氨酸等現(xiàn)有或取代后的氨基酸上對(duì)GLP-2進(jìn)行修飾。1998年3月5日公開(kāi)的WO98/08872中對(duì)這類親脂性部分做了描述，其中包括十四烷酰和羧基十九烷酰(carboxynonadecanoyl)基，這些基團(tuán)被連接到，例如，附加的C-末端賴氨酸或取代了GLP-2(1～33)第20位殘基的賴氨酸的ε位氨基上。
通過(guò)多種公知的生產(chǎn)多肽的技術(shù)能夠制備出為促進(jìn)上胃腸道生長(zhǎng)而選用的特定形式的GLP-2。脊椎動(dòng)物形式的GLP-2當(dāng)然可以通過(guò)適當(dāng)組合使用蛋白質(zhì)分離技術(shù)從自然來(lái)源提取得到。如上述Buhl et al.，一文中描述，對(duì)回腸粘膜進(jìn)行酸-乙醇抽提，結(jié)合大小選擇和以HPLC為基礎(chǔ)的分級(jí)分離，以及借助抗合成胰高血糖素原126-159抗體來(lái)檢測(cè)印跡，通過(guò)上述這些手段可以成功地分離和純化出豬GLP-2。作為GLP-2提取物的替代物，那些只引入了L-氨基酸形式的GLP-2，不管是脊椎動(dòng)物GLP-2還是其類似物，可以通過(guò)應(yīng)用重組DNA技術(shù)進(jìn)行商品化數(shù)量的生產(chǎn)。因此，把預(yù)期的GLP-2或GLP-2類似物的編碼DNA插入到表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化到酵母等微生物或其他宿主細(xì)胞中，然后將轉(zhuǎn)化微生物或宿主細(xì)胞在適合GLP-2表達(dá)的條件下培養(yǎng)。多種基因表達(dá)系統(tǒng)都可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目的，典型地，預(yù)期基因的驅(qū)動(dòng)表達(dá)(drive expression)來(lái)自所選宿主天然使用的表達(dá)調(diào)控。因?yàn)镚LP-2翻譯后不需要糖基化就具有活性，所以它的生產(chǎn)使用大腸桿菌等細(xì)菌宿主就能最方便地實(shí)現(xiàn)。為了實(shí)現(xiàn)這類生產(chǎn)，可以將選擇的GLP-2肽的編碼DNA有效地置于大腸桿菌的lac、trp或PL基因的表達(dá)調(diào)控下。作為GLP-2基因自身DNA編碼表達(dá)的替代形式，可以讓宿主以融合蛋白的形式來(lái)表達(dá)GLP-2肽，在融合蛋白中GLP-2以可釋放的形式連接到一種載體蛋白上，該載體蛋白有利于表達(dá)產(chǎn)物的分離和穩(wěn)定。
生產(chǎn)選擇的GLP-2或GLP-2類似物通用的技術(shù)，以及生產(chǎn)引入了非基因編碼氨基酸和N-及C-末端衍生形式的GLP-2肽需要使用的技術(shù)，已經(jīng)建立完善的自動(dòng)肽鏈合成技術(shù)都被使用，總體描述見(jiàn)，例如，J.M.Stewart and J.D.Young，固相肽鏈合成，第2版，1984 PiereeChemical Company，Rockford，Illinois；M.Bodanszky and A.Bodanszky，合成肽的操作，1984，Springer-Verlag，紐約；應(yīng)用生物系統(tǒng)430A使用者手冊(cè)，1987，ABI Inc.Foster City，California。這些技術(shù)中，使用Fmoc和tBoc操作通過(guò)連續(xù)加上合適的保護(hù)了的氨基酸使GLP-2肽從C-端樹(shù)脂-偶聯(lián)殘基而延長(zhǎng)，具體描述見(jiàn)例如Orskov et al.，F(xiàn)ebs Letters，1989，247(2)193-196。
為了引入N-和/C-端保護(hù)基團(tuán)，也可以采用固相肽鏈合成方法中的常用操作。例如，為了引入C-端保護(hù)基團(tuán)，目的肽鏈合成典型地采用一種支持樹(shù)脂作為固相，該樹(shù)脂經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾因而從樹(shù)脂上裂解下來(lái)后導(dǎo)致GLP-2肽鏈帶有所述的目的C-端保護(hù)基團(tuán)。例如，為了提供一種C-端帶有伯氨基保護(hù)基團(tuán)的肽鏈，合成時(shí)采用p-甲基二苯甲基胺(MBHA)樹(shù)脂，因而使得當(dāng)肽鏈合成完成時(shí)，用氫氟酸處理就可以釋放出期望的末端氨化后的肽鏈。類似地，使用N-甲氨基乙基-衍生的DVB樹(shù)脂可以完成在C-端引入N-甲胺保護(hù)基團(tuán)，用HF處理時(shí)釋放出C-端甲酰胺化的肽鏈。也可以使用常用方法通過(guò)酯化保護(hù)C-端。這種技術(shù)要求所使用的樹(shù)脂/保護(hù)基團(tuán)的結(jié)合能夠允許側(cè)鏈被保護(hù)的肽鏈從樹(shù)脂上釋放下來(lái)，從而使得隨后與預(yù)期的醇發(fā)生反應(yīng)，形成酯官能團(tuán)。FMOC保護(hù)基團(tuán)，與經(jīng)甲氧基烷氧基苯基乙醇(methoxyalkoxybenxyl alcohol)或等效連接物(equivalentlinker)衍生后的DVB樹(shù)脂結(jié)合，能夠用于實(shí)現(xiàn)這種目的，在二氯甲烷中在三氟乙酸(TFA)的作用下從載體上釋放下來(lái)。適當(dāng)活化后的羧基官能團(tuán)的酯化，例如用DCC，能夠隨后加入需要的醇，然后對(duì)酯化后的GLP-2肽鏈去保護(hù)并分離。
當(dāng)合成的GLP-2肽鏈還連接在樹(shù)脂上的時(shí)候，能夠?qū)崿F(xiàn)N-端保護(hù)基團(tuán)的引入，例如用合適的酸酐和腈處理。例如，為了在N-端引入乙?；Ｗo(hù)基團(tuán)，可以用20％乙酐的乙腈溶液對(duì)樹(shù)脂偶聯(lián)的肽鏈進(jìn)行處理。然后把N-端保護(hù)的GLP-2肽鏈從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，去保護(hù)，隨后進(jìn)行分離。
一旦期望的GLP-2已經(jīng)合成完畢，就可以從樹(shù)脂上裂解下來(lái)并完全去保護(hù)，然后純化肽鏈以確保具有選定的氨基酸序列的單鏈寡肽得到回收。使用任何一種一般方法都能實(shí)現(xiàn)純化，這些方法包括在烷基化硅柱上進(jìn)行反向高壓液相色譜(RP-HPLC)，例如，C4-、C8-或C18-硅。這種柱的分級(jí)分離通常用線性梯度洗脫來(lái)完成，例如，從10％增加到90％有機(jī)溶劑，例如乙腈，在含水的緩沖液中，通常含有少量(例如，0.1％)TFA或TEA等配對(duì)試劑。替代地，可以根據(jù)帶電特性用離子交換HPLC實(shí)現(xiàn)肽鏈種類的分離。收集柱級(jí)分，任選地將含預(yù)期/需要純度的肽鏈的級(jí)分合并。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為了生產(chǎn)這種肽鏈的一種藥學(xué)上可接受的酸加成鹽，然后用乙酸、鹽酸、磷酸、馬來(lái)酸、酒石酸、琥珀酸等藥學(xué)上可接受的酸替換裂解酸(例如，TFA)，用已經(jīng)建立的方式處理GLP-2肽鏈。
為了應(yīng)用于患者，本發(fā)明的一個(gè)方面以藥學(xué)上可接受的方式提供了GLP-2肽或其鹽，例如，作為通過(guò)除菌過(guò)濾的一種制劑，例如，用0.22μ濾器過(guò)濾，達(dá)到基本無(wú)熱源。理想地，設(shè)計(jì)制備成的GLP-2肽鏈以單一峰或孤峰在HPLC上遷移，表現(xiàn)出均一并且真正的氨基酸組成，而且對(duì)其進(jìn)行分析得到的序列也應(yīng)該滿足規(guī)范藥品質(zhì)量的各種國(guó)家部門制定的標(biāo)準(zhǔn)。
為了應(yīng)用于治療的用途，選擇的GLP-2或GLP-2類似物應(yīng)配有一種載體，該載體藥學(xué)上可接受，并且適合通過(guò)選擇的給藥途徑把肽施用給患者從而把肽釋放到上胃腸道。合適的藥學(xué)上可接受載體是常規(guī)與以肽鏈為基的藥一起使用的那些，例如稀釋劑、賦形劑等。藥物制劑的普遍性指導(dǎo)，可以參考“Remington’s藥物科學(xué)”，第17版，Mack出版公司，Easton，Penn.，1985。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，化合物配制成適于灌輸給藥的形式，例如，當(dāng)該化合物作為接受完全胃腸外營(yíng)養(yǎng)治療的患者的液體營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，或者通過(guò)注射給藥時(shí)，例如，皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，因此要以滅菌、無(wú)熱源的含水溶液形式使用，并且任選地調(diào)整為生理可耐受的pH值，例如，微酸性或生理pH值。因此，可以將化合物溶于蒸餾水等賦形劑中給藥，或更理想地，溶于鹽水、磷酸鹽緩沖液或5％葡萄糖溶液。如果需要，可以通過(guò)加入乙酸或氫氧化鈉等溶解度增強(qiáng)劑，增強(qiáng)GLP-2或GLP-2類似物的水溶性。
含水載體或賦形劑可以注射劑的形式提供，帶有大量能夠?qū)崿F(xiàn)儲(chǔ)存功效的白明膠，其期望范圍為10～20％。替代地，也可以用膠凝劑，例如透明質(zhì)酸作為儲(chǔ)存劑(也可以用于獸醫(yī)用途)。
作為注射劑的替代形式，可以將GLP-2或GLP-2類似物配制成通過(guò)其他途徑向患者給藥，釋放到上胃腸道。可以根據(jù)一般的藥學(xué)實(shí)踐配制成口服形式，例如片劑、膠囊等。
也可以將該化合物配制成液體形式以便能與食管及胃直接接觸，配制成錠劑或其他類似制劑允許食管或胃的內(nèi)壁與化合物之間直接接觸。另外，可以以一般制劑的形式釋放，實(shí)現(xiàn)化合物快速、高水平地出現(xiàn)在循環(huán)系統(tǒng)中。
為了實(shí)現(xiàn)GLP-2的長(zhǎng)期持續(xù)給藥，也可以將本發(fā)明的GLP-2’s及GLP-2類似物配制成緩慢釋放的植入裝置。這類持續(xù)釋放制劑的實(shí)例包括生物相容聚合物的復(fù)合材料，例如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(lactic-co-glycolic acid)、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、膠原質(zhì)等。關(guān)于藥物釋放載體中的可降解聚合物的結(jié)構(gòu)、選擇及使用在一些出版物中已被綜述，其中包括A.Domb et al.，Polymers forAdvanced Technologies 3279-292(1992)。藥物制劑中選擇和使用聚合物的另外的指導(dǎo)參見(jiàn)由M.Chasin和R.Langer編著的“用作藥物釋放系統(tǒng)的生物降解聚合物”，第45卷“藥物及制藥科學(xué)”，M.Dekker，紐約，1990。也可以使用脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)GLP-2或GLP-2類似物的持續(xù)釋放。關(guān)于如何使用和制備有意義的脂質(zhì)體藥劑的詳細(xì)描述的其他出版物可以參見(jiàn)，美國(guó)專利US4921706，US5008050，US4921706，US4927637，US4452747，US4016100，US4311712，US4370349，US4372949，US4529561，US5009956，US4725442，US4737323，US4920016。當(dāng)需要提供局部高濃度的GLP-2或GLP-2類似物時(shí)，例如為了促進(jìn)發(fā)炎的上胃腸道中上胃腸道的生長(zhǎng)在上胃腸道中或其附近提供高濃度的GLP-2或GLP-2類似物，采用持續(xù)釋放制劑特別有效。
為了用于刺激包括人的哺乳動(dòng)物的上胃腸道生長(zhǎng)和/或增強(qiáng)其上胃腸道功能，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種包裝，以無(wú)菌填入的管瓶或安瓿形式，這種包裝中含有促進(jìn)組織生長(zhǎng)量的GLP-2或GLP-2類似物，以單位劑量或多單位量，其中該包裝中放入一個(gè)指導(dǎo)其用于促進(jìn)生長(zhǎng)的內(nèi)容物的使用的標(biāo)簽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，作為現(xiàn)成給藥制劑，包裝中含有GLP-2或GLP-2類似物以及需要的載體。替代地，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述包裝以適于再組成到磷酸鹽緩沖液等合適載體中的形式提供GLP-2或GLP-2類似物，例如凍干形式。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述包裝是無(wú)菌填入的管瓶或安瓿，其中裝有注射液，該注射液包括溶解在含水賦形劑中的有效的、促進(jìn)上胃腸道增殖量的GLP-2或GLP-2類似物。
根據(jù)本發(fā)明，可以施用GLP-2或GLP-2類似物治療打算從上胃腸道組織增長(zhǎng)獲益的患者。此外，打算從增強(qiáng)上胃腸道功能獲益的患者，無(wú)論是否是由組織生長(zhǎng)增加引起的，都是接受本發(fā)明治療的候選人。通常，打算從增加上胃腸道質(zhì)量和/或增強(qiáng)上胃腸道粘膜功能獲益的患者是接受GLP-2或GLP-2類似物治療的候選人?？梢杂肎LP-2治療的具體疾病包括胃部或食管各種形式的炎性疾病，以及部分或幾乎全部切除上胃腸道的患者。下列表中非窮舉列出了可以用目的GLP-2或聯(lián)用治療的包括胃和食管在內(nèi)的上胃腸道的疾病。
表1胃部疾病I.急性胃炎A.急性出血性和糜爛性胃炎1.急性糜爛性胃炎2.急性出血性胃炎3.急性胃炎4.應(yīng)激性(stress)胃炎5.非甾醇類抗炎藥6.胃病(急性)7.出血性胃病B.急性幽門螺桿菌胃炎1.B型胃炎2.分泌過(guò)多的(hypersecretory)胃炎3.幽門螺桿菌繼發(fā)的非特異性胃炎4.幽門螺桿菌相關(guān)胃炎C.化學(xué)性胃炎1.C型胃炎(即化學(xué)性)2.反應(yīng)性(reactive)胃炎3.返流(reflux)胃炎4.膽汁返流性(bile)胃炎5.非甾醇類抗炎藥胃病(慢性)D.其他急性感染性胃炎(見(jiàn)胃炎的非常見(jiàn)形式)II. 胃炎的常見(jiàn)形式A.幽門螺桿菌胃炎B.化學(xué)性胃炎1. 膽汁返流
2. C型胃炎(即化學(xué)性)3. 反應(yīng)性胃炎4. 返流性胃炎5. 阿司匹林和非甾醇類抗炎藥胃病(慢性)C.化生萎縮性胃炎(metaplastic atrophic)1. 自身免疫性化生萎縮性胃炎a.萎縮性胃炎b.A型胃炎c.difusse corporal gastritisd.自身免疫性慢性胃炎e.自身免疫相關(guān)胃炎2. 環(huán)境化生萎縮性胃炎a.環(huán)境慢性胃炎b.多病灶環(huán)境性胃炎c.多病灶萎縮性胃炎d.萎縮性胃炎e.慢性萎縮性胃炎f.B型胃炎g.自發(fā)性全胃炎III. 胃炎的非常見(jiàn)形式A.竇切除術(shù)后引起的(postantrectomy)萎縮性胃炎B.嗜酸細(xì)胞性胃炎C.感染性胃炎1. 細(xì)菌性(除幽門螺桿菌)a.gastrospirillum hominisb.蜂窩織炎性的c.分枝桿菌性的d.梅毒性的2. 病毒性3. 寄生蟲(chóng)性4. 真菌性D.Crohn’s disease
E.肉狀瘤病F.單一性(isolated)肉芽腫胃炎G.淋巴細(xì)胞性胃炎H.巨大肥厚性胃炎見(jiàn)tadataka yamada M.D.編著的腸胃病學(xué)教科書(shū)第1卷(第2版，1985)中的john h.Yardley和thomas r.Hendrix撰寫的胃炎、十二指腸炎及相關(guān)的潰瘍性病變。
表2食道疾病I.感染性食道A.與微生物有關(guān)的感染1. 真菌a.假絲酵母種(特別是白色假絲酵母)b.aspargillus種c.莢膜組織胞漿菌d.皮炎芽生菌2. 病毒a.單純皰疹病毒(1型)b.巨細(xì)胞病毒c.水痘帶狀皰疹病毒3. 細(xì)菌a.結(jié)核分枝桿菌b.以色列放線菌c.綠色鏈球菌d.嗜酸乳芽孢桿菌e.蒼白密螺旋體II. 非感染性食道炎III. 返酸(acid reflux)IV. 膽汁返流性V.化學(xué)損傷A.藥物B.毒物
C.酸D.堿VI.肉狀瘤病VII. Crohn’s diseaseVIII. 貝赫切特綜合征IX.移植物抗宿主反應(yīng)X.愛(ài)滋病相關(guān)感染A.隱孢子菌小孢子菌isospora beillglardia lamblia沙門氏菌志賀氏菌彎曲桿菌結(jié)核分枝桿菌鳥(niǎo)分枝桿菌復(fù)合物(MAC)難辨梭狀芽孢桿菌巨細(xì)胞病毒單純皰疹病毒見(jiàn)Tadataka Yamada M.D.編著的腸胃病學(xué)教科書(shū)第1卷(第2版，1985)中的各種各樣的食管疾病。
可以利用例如內(nèi)窺鏡檢查法、鋇餐檢查或CT檢測(cè)GLP-2對(duì)于食管的治療效果。例如，以足以達(dá)到下述效果的量將GLP-2或GLP-2類似物施用給上胃腸道炎癥的患者緩解食管不適、減輕疼痛、促進(jìn)吞咽、減輕胸痛、減輕燒心、減少吞咽或吞食后固體或液體的返流、減輕嘔吐或者改善體重或增強(qiáng)活力?？梢酝ㄟ^(guò)減輕疼痛或不適檢測(cè)GLP-2對(duì)胃的治療效果。此外，也可以將GLP-2或GLP-2類似物施用給被確定為發(fā)展成上胃腸道炎癥危險(xiǎn)的患者，例如用非甾醇類抗炎藥(“NSAIDS”)治療過(guò)的患者。NSAIDS的一些實(shí)例有阿司匹林、布洛芬、舒林酸以及吲哚美辛。
當(dāng)然，最適合患者治療的治療劑量和治療方案要隨所醫(yī)治的疾病或病情的不同而變化，并且參考患者體重以及其他參數(shù)。下面實(shí)施例1～3中給出的結(jié)果顯示每天2次共2天用GLP-2或GLP-2類似物治療導(dǎo)致上胃腸道細(xì)胞增殖以及蛋白合成的增加。治療12天導(dǎo)致胃的質(zhì)量增加。實(shí)施例4表明GLP-2治療能改善非甾醇類抗炎藥的胃腸道毒性。小得多的劑量以及更短或更長(zhǎng)的治療周期或治療頻率也將能夠產(chǎn)生有效的治療效果，即特別是上胃腸道質(zhì)量統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加，和/或增強(qiáng)上胃腸道功能。最適合人的劑量大小及服用方法(dosingregimen)可以用本發(fā)明給出的結(jié)果指導(dǎo)，而且能夠用精確設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)來(lái)證實(shí)。
有效劑量和治療方法可以用常規(guī)方法來(lái)測(cè)定，從對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小劑量給藥開(kāi)始，然后在觀察效果(例如，組織學(xué)、疾病活性評(píng)分(diseaseactivity scores)、粘膜酶活性、小腸或大腸上皮特異性基因表達(dá)、炎性反應(yīng)標(biāo)記物例如細(xì)胞因子和髓過(guò)氧化物酶、GLP-2含量的表達(dá))的同時(shí)增加劑量，而且系統(tǒng)地調(diào)整給藥方案。在確定給定受療者的最佳劑量時(shí)臨床醫(yī)師要考慮大量因素。其中主要考慮的是血漿中GLP-2的正常循環(huán)量，對(duì)于健康成年人來(lái)說(shuō)，休息狀態(tài)大約為151pM/mL，攝入營(yíng)養(yǎng)后增加到225pM/mL(Orskov，C.and Holst，J.J.，1987，Scand.J.Clin.Lab.Invest.47165)。另外的因素還包括患者的身材、患者年齡、患者的一般狀況、治療的特定疾病、疾病的嚴(yán)重程度、患者服用其他藥物、GLP-2肽的體內(nèi)活性等。實(shí)驗(yàn)劑量應(yīng)該在考慮了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床文獻(xiàn)后選定。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該能預(yù)見(jiàn)到GLP-2的體外結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)合常數(shù)和Ki等信息也可以用于計(jì)算劑量。
GLP-2肽的典型的人服用劑量為約10μg/kg體重/天～約10mg/kg/天，優(yōu)選約50μg/kg體重/天～約5mg/kg/天，最優(yōu)選約100μg/kg體重/天～約1mg/kg/天。
另一方面，本發(fā)明提供了用植入細(xì)胞對(duì)剛剛確定的患者候選人進(jìn)行治療，所述的植入細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)過(guò)了下述處理在體外或體內(nèi)用GLP-2或GLP-2類似物預(yù)先溫育或處理而使細(xì)胞處于合適的狀態(tài)，或者用遺傳學(xué)手段構(gòu)建使細(xì)胞能夠生產(chǎn)GLP-2或GLP-2類似物。離體(exvivo)細(xì)胞的狀態(tài)只需要將要移植的細(xì)胞或組織置于已經(jīng)加入促進(jìn)生長(zhǎng)的量的GLP-2或GLP-2類似物而且其他方面都適于培養(yǎng)這類細(xì)胞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。合適的調(diào)理期過(guò)后，接著就可以將細(xì)胞直接植入患者或者用現(xiàn)有的細(xì)胞膠囊化技術(shù)將細(xì)胞裝入膠囊移植到體內(nèi)。
本發(fā)明另一方面還包括為了促進(jìn)食管組織的生長(zhǎng)，在體內(nèi)用GLP-2肽處理動(dòng)物。在上胃腸道繼發(fā)增大后，就可以將這些組織用于異源移植療法。由于要移植器官或組織的大小經(jīng)常會(huì)限制異源移植療法的成功，所以在將組織從一種非人的動(dòng)物異源移植給人之前先進(jìn)行上述這種GLP-2肽處理是有益的。例如，為了在將豬上胃腸道組織異種移植給需要這種器官的人之前增大上胃腸道的大小，可以先用GLP-2肽對(duì)豬供體動(dòng)物進(jìn)行處理。
替代地，要移植的細(xì)胞可以體外從已經(jīng)經(jīng)過(guò)遺傳學(xué)手段構(gòu)建，能夠表達(dá)或過(guò)量表達(dá)胰高血糖素基因或者直接單獨(dú)表達(dá)GLP-2的編碼DNA的細(xì)胞產(chǎn)生。由于用這種方式只能生產(chǎn)出含有遺傳編碼氨基酸的GLP-2形式這一局限性，所以這種DNA序列能夠容易地從選定的GLP-2的氨基酸序列中測(cè)定出來(lái)。適于將遺傳信息導(dǎo)入人細(xì)胞的各種病毒載體都能被采用，可以在能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的表達(dá)調(diào)控單元(expression controls)下將GLP-2編碼DNA引入其中。一旦發(fā)生了遺傳學(xué)改變，然后就可以利用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)將構(gòu)建后的細(xì)胞植入。(見(jiàn)，例如，Drucker et al.，1996，PNASUSA 937911-7916.)GLP-2與其他肽類激素聯(lián)用本發(fā)明涉及GLP-2與其他至少一種選自IGF-1、IGF-2和GH的肽類激素治療上有效的聯(lián)合。令人驚奇的是，給哺乳動(dòng)物單獨(dú)施用GLP-2(及其類似物)可以引發(fā)上胃腸道的生長(zhǎng)。意料之中的是，當(dāng)將GLP-2與其他至少一種選自IGF-1、IGF-2和GH的肽類激素聯(lián)用時(shí)，可以觀察到對(duì)上胃腸道組織生長(zhǎng)的明顯效果。
本發(fā)明的GLP-2’s和GLP-2類似物也可以與至少一種已知的食管或胃生長(zhǎng)因子的其他肽類激素混合使用。已知的食管和胃生長(zhǎng)因子包括上皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)以及角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)。
用于治療胃部疾病例如肽潰瘍的GLP-2的特定附屬治療物包括(1)能夠阻斷胃的酸分泌的藥物，例如，H2受體拮抗物、質(zhì)子泵抑制劑以及前列腺素；(2)能夠在胃中形成保護(hù)性屏障的藥物，例如硫糖鋁；(3)含鉍化合物，以及(4)控制幽門螺桿菌因子。
更具體地，本發(fā)明涉及當(dāng)與其他至少一種選自IGF-1和GH的肽類激素聯(lián)用時(shí)，GLP-2的治療及相關(guān)用途。甚至更具體地，本發(fā)明涉及上述能夠增強(qiáng)上胃腸道功能的聯(lián)合的用途。更具體地，本發(fā)明涉及上述能夠促進(jìn)上胃腸道的粘膜上皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞增殖的聯(lián)合的治療及相關(guān)用途。
除了另有特別說(shuō)明外，術(shù)語(yǔ)“GLP-2”在本發(fā)明中共同指GLP-2的各種天然生成形式，特別是哺乳動(dòng)物形式。本發(fā)明還包括那些表現(xiàn)出活性的GLP-2的類似物。測(cè)試GLP-2類似物的活性可以采用本發(fā)明和序列號(hào)為US08/631273的待審查申請(qǐng)中描述的小鼠模型。簡(jiǎn)而言之，這種測(cè)試包括按每公斤體重2.5mg的量，皮下注射GLP-2類似物(溶于PBS中)，每天給藥兩次(b.i.d)，共10～14天，用只注射了PBS的相應(yīng)的未處理動(dòng)物作為對(duì)照。替代地，上述類似物也可以采取一天一次或隔天給藥。給藥完成后，殺死這些動(dòng)物，取出上胃腸道，稱重。這種情況下，可以評(píng)定GLP-2類似物對(duì)上胃腸道的效果。
關(guān)于有效地應(yīng)用于本發(fā)明的GLP-2的特定類似物及變體的指導(dǎo)，以及如何生產(chǎn)其他的GLP-2類似物及變體的指導(dǎo)，參見(jiàn)1996年4月12日提交的序列號(hào)為US08/632,533和08/631,273的待審查申請(qǐng)，這些申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考。簡(jiǎn)單地說(shuō)，GLP-2的任意一種不破壞GLP-2活性的取代、添加或缺失都可以有效地應(yīng)用于本發(fā)明。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的GLP-2類似物至少具有與人GLP-2相同的活性。最優(yōu)選的實(shí)施方案中，與人GLP-2相比所述的GLP-2類似物具有增強(qiáng)了的活性。例如，這類類似物可以表現(xiàn)出增強(qiáng)了的血清穩(wěn)定性、增強(qiáng)了的受體結(jié)合活性及增強(qiáng)了的信號(hào)傳導(dǎo)活性。可以有效地應(yīng)用于本發(fā)明的GLP-2和GLP-2類似物的其他修飾是賦予該分子抗氧化性能。
GLP-2類似物合適地是人GLP-2(人[Gly2]GLP-2)或大鼠GLP-2(rGLP-2)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用Gly取代Ala使大鼠或人GLP-2的第2位發(fā)生變化從而賦予其DPP-IV抗性。本發(fā)明中將第2位上用Gly取代了Ala的人GLP-2稱為[Gly2]人[Gly2]GLP-2。
類似地，本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“IGF-1”、“IGF-2”和“GH”不但包括天然多肽而且包括天然生成的多肽的有效類似物和突變體。關(guān)于可以有效地應(yīng)用于本發(fā)明的IGF-1、IGF-2和GH的特定類似物及突變體的指導(dǎo)參見(jiàn)下列在此引入作為參考的出版物Vanderhoof et al.(1992)胃腸病學(xué)1021949-1956；Steeb et al.(1994)Am.J.Physiol.266G1090-G1098；以及Jones et al.(1995)EndocrineReviews 163-34；Conlon et al.(1995)Journal ofEndocrinology 146247-253；Francis et al.(1993)BiochemicalJournal 293713-719；Lewis et al.，WO93/20836；以及Bozyczkocoyne et al.，WO93/08826。
目標(biāo)肽類激素的促分泌素，即能增加這些激素內(nèi)源性產(chǎn)量的因子也可以作為治療方案的一部分包括于其中，可以代替目標(biāo)肽類激素或者作為目標(biāo)肽類激素的補(bǔ)充刺激目標(biāo)肽類激素的釋放。因此，將這類因子包括進(jìn)來(lái)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的，屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，用生長(zhǎng)激素釋放因子(GHRF)和精氨酸能夠增加內(nèi)源性GH的產(chǎn)量。類似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到能夠作用于適當(dāng)受體從而引發(fā)任一種目標(biāo)肽類激素血清水平升高的化合物，例如小分子，也可以有效地應(yīng)用于本發(fā)明。
如本發(fā)明中使用的那樣，當(dāng)兩種化合物的生理效應(yīng)或者它們的升高后的血清濃度能夠同時(shí)測(cè)量時(shí)，一種化合物，例如肽，就可以被說(shuō)成是與另一種化合物“聯(lián)用”或“聯(lián)合”。由于化合物能夠增高內(nèi)源性產(chǎn)量水平，所以在“聯(lián)用”或“聯(lián)合”時(shí)也可以同時(shí)測(cè)量?jī)?nèi)源性生成激素和另一種被施用藥物的血清濃度。因此，化合物可以同時(shí)施用，分開(kāi)施用或混合成組合物施用，或者順序施用以使它們?cè)谘逯械乃侥軌蚝愣ㄉ摺?br> 除另有說(shuō)明之外，本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“聯(lián)合治療”和“聯(lián)合醫(yī)治”都是指涉及目標(biāo)肽類激素的聯(lián)用導(dǎo)致患者營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的改善或腸質(zhì)量的增加。
本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“改善后的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)”和“增強(qiáng)后的胃功能”是指與治療前相比機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入量的增加。這類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括，但不限于，碳水化合物、蛋白質(zhì)及氨基酸、脂肪、膽固醇及脂溶性維生素，水溶性維生素以及礦物質(zhì)。通過(guò)本發(fā)明方法能夠增加其攝入量的礦物質(zhì)包括Na、Ca、Mg、K、Zn和Fe。本發(fā)明能夠增加吸收的維生素包括，但不限于，維生素A、D、E和K等脂溶性維生素以及B12和葉酸等水溶性維生素。
本發(fā)明使用的“患者”打算包括，但不限于，家畜和寵物。
當(dāng)哺乳動(dòng)物的胃腸吸收功能減退，和/或胃腸道出現(xiàn)炎癥或損傷導(dǎo)致不適和病態(tài)時(shí)，該哺乳動(dòng)物可以被說(shuō)成是胃腸患有胃腸紊亂、疾病和不適(medical conditions)可以使用多種試驗(yàn)來(lái)測(cè)定哺乳動(dòng)物是否患有吸收障礙綜合癥。這些包括糞中脂含量，木糖吸收，胃腸X-射線研究，小腸活組織檢查試驗(yàn)，用于維生素B12吸收的Schilling試驗(yàn)和促胰液素試驗(yàn)。
本發(fā)明的一個(gè)方面，GLP-2與其他至少一種選自IGF-1、IGF-2和GH的肽類激素以藥學(xué)上可接受的形式(例如，用0.22μm濾器過(guò)濾除菌并且基本無(wú)熱源的制劑)混合施用給患者。理想地，混合狀態(tài)的肽鏈在HPLC上以單一峰遷移。
本發(fā)明選用的具體形式的GLP-2、IGF-1、IGF-2和GH可以通過(guò)多種眾所周知的生產(chǎn)肽鏈的技術(shù)來(lái)制備。使用適當(dāng)結(jié)合的蛋白分離技術(shù)，當(dāng)然能夠通過(guò)從天然來(lái)源提取獲得這些天然存在形式的GLP-2、IGF-1、IGF-2或GH。例如，如Buhl et al.In J.Biol.Chem.，1988，263(18)8621-8624一文中的描述，對(duì)回腸粘膜進(jìn)行酸-乙醇抽提，結(jié)合大小選擇和以HPLC為基礎(chǔ)的分級(jí)分離，以及借助抗合成胰高血糖素原126-159抗體來(lái)檢測(cè)印跡，通過(guò)這些手段可以成功地分離和純化出了豬GLP-2。類似地，如美國(guó)專利US2974088中描述的那樣，GH能夠從尸體中提取獲得。
作為提取方法的替換方式，應(yīng)用重組DNA技術(shù)，能夠可再生性地生產(chǎn)出商品化數(shù)量的GLP-2、IGF-1、IGF-2和GH的只引入L-氨基酸的形式。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，把目的形式的GLP-2、IGF-1(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利US5288931)、IGF-2以及GH(見(jiàn)，例如，Goeddel et al.(1979)Nature 281544-548)的編碼核酸以可表達(dá)的方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞，然后在適合特定多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。多種基因表達(dá)系統(tǒng)都可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目的，典型地，預(yù)期基因的驅(qū)動(dòng)表達(dá)來(lái)自所選宿主天然使用的表達(dá)調(diào)控。因?yàn)镚LP-2、IGF-1、IGF-2以及GH翻譯后不需要修飾就具有活性，所以它的生產(chǎn)使用大腸桿菌等細(xì)菌宿主就能最方便地實(shí)現(xiàn)。為了實(shí)現(xiàn)這類生產(chǎn)，可以將選擇的GLP-2、IGF-1、IGF-2或GH的編碼DNA有效地置于大腸桿菌的lac、trp或PL基因的表達(dá)調(diào)控下。作為GLP-2、IGF-1、IGF-2或GH自身編碼DNA表達(dá)的替代形式，可以讓宿主以融合蛋白的形式來(lái)表達(dá)GLP-2、IGF-1、IGF-2或GH，在融合蛋白中GLP-2、IGF-1、IGF-2或GH以可釋放的形式連接到一種載體蛋白上，該載體蛋白有利于表達(dá)產(chǎn)物的分離和穩(wěn)定。
為了應(yīng)用于治療的用途，選擇用于聯(lián)合治療的肽類激素應(yīng)配制有至少一種制藥學(xué)上可接受的載體，而且該載體適合通過(guò)選定的給藥途徑釋放目的多肽。合適的藥學(xué)上可接受載體是那些常規(guī)只與以肽鏈為基的藥一起使用的載體，例如稀釋劑、賦形劑等。藥物制劑，可以參考“Remington’s藥物科學(xué)”，第17版，Mack出版公司，Easton，Penn.，1985。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，化合物配制成適于灌輸或通過(guò)注射給藥的形式，皮下或靜脈內(nèi)給藥，因此要以滅菌、無(wú)熱源的含水溶液形式使用，并且任選地調(diào)整為微酸性或生理pH值。因此，可以將化合物溶于蒸餾水中給藥，或者更理想地，溶于鹽水、磷酸鹽緩沖液或5％葡萄糖溶液。如果需要，可以通過(guò)在GLP-2制劑中加入乙酸來(lái)增強(qiáng)這些化合物的水溶性。
本發(fā)明還提供了各種肽類激素綴合物。本發(fā)明的肽類激素組合物包括共價(jià)連接到一種或多種水溶性聚合物上的肽類激素。已經(jīng)將水溶性聚合物，特別是將聚乙二醇綴合連接到蛋白質(zhì)上以此來(lái)提供附加的期望特性，同時(shí)能保留，或至少部分地保留該肽類激素引發(fā)生長(zhǎng)的特性。這些期望的特性包括增加在水溶液中的溶解度，增強(qiáng)存儲(chǔ)穩(wěn)定性，減小免疫原性，增強(qiáng)對(duì)蛋白酶解的抗性以及延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期。適合用于本發(fā)明組合物的水溶性聚合物包括聚乙二醇均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇與丙二醇的共聚物，其中所述的均聚物和共聚物可以是未取代的或者可以是一個(gè)末端用下列基團(tuán)取代烷基、聚環(huán)氧乙烷化聚醇(polyoxethylated polyols)、聚乙烯醇、多聚糖、聚乙烯乙醚以及α，β-聚[(2-羥乙基)-DL-天冬酰胺]。聚乙二醇是特別優(yōu)選的。描述蛋白質(zhì)的水溶性聚合物綴合物制備方法的其他文獻(xiàn)可以參見(jiàn)，US4179337、US4609546、US4261973、US4055635、US3960830、US4415665、US4412989、US4002531、US4414147、US3788948、US4732863、US4745180、EP152847、EP98110(1984年1月11日公開(kāi))、JP5792435。
本發(fā)明另一方面提供了能夠持續(xù)釋放肽類激素的制劑。這類持續(xù)釋放制劑的實(shí)例包括生物相容聚合物的復(fù)合材料，例如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、膠原質(zhì)等。關(guān)于藥物送遞賦形劑中的可降解聚合物的結(jié)構(gòu)、選擇及使用在一些出版物中已被綜述，其中包括A.Domb et al.，Polymers for AdvancedTechnologies 3279-292(1992)。藥物制劑中選擇和使用聚合物的另外的指導(dǎo)參見(jiàn)由M.Chasin和R.Langer編著的“用作藥物釋放系統(tǒng)的生物降解聚合物”，第45卷“藥物及制藥科學(xué)”，M.Dekker，紐約，1990。也可以使用脂質(zhì)體提供肽激素的持續(xù)釋放。關(guān)于如何使用和制備有意義的脂質(zhì)體藥劑詳細(xì)描述的其他文獻(xiàn)可以參見(jiàn)，美國(guó)專利US4944948，US5008050，US4921706，US4927637，US4452747，US4016100，US4311712，US4370349，US4372949，US4529561，US5009956，US4725442，US4737323，US4920016。當(dāng)需要提供本發(fā)明組合物的局部高濃度時(shí)，例如上胃腸道中或其附近提供高濃度的本發(fā)明的組合物時(shí)，采用持續(xù)釋放制劑特別有效。
為了用于刺激包括人的哺乳動(dòng)物的上胃腸道生長(zhǎng)和/或增強(qiáng)其上胃腸道功能，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種包裝，為無(wú)菌填入的管瓶或安瓿，這種包裝中含有促進(jìn)組織生長(zhǎng)量的GLP-2與其他至少一種選自IGF-1、IGF-2和GH的肽類激素混合，以單位劑量或多單位量提供，其中該包裝中放入一個(gè)指導(dǎo)其中例如用于促進(jìn)上胃腸道生長(zhǎng)的促進(jìn)胃腸道功能的內(nèi)容物的使用的標(biāo)簽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，作為現(xiàn)成給藥制劑，包裝中含有GLP-2與其他至少一種選自IGF-1、IGF-2和GH的肽類激素以及需要的載體。
替代地，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述包裝以提供了所述包裝以適于再組成到磷酸鹽緩沖液等合適載體中的形式提供GLP-2和其他至少一種選自IGF-1、IGF-2和GH的肽類激素，例如凍干形式。還有另一種技術(shù)方案，所述包裝是無(wú)菌填入的管瓶或安瓿，其中裝有注射液，該注射液包括溶解在含水賦形劑中的有效量的GLP-2與其他至少一種選自IGF-1、IGF-2和GH的肽類激素。
根據(jù)本發(fā)明，可以將GLP-2與其他至少一種選自IGF-1、IGF-2和GH的肽類激素聯(lián)合施用，治療打算從上胃腸道功能增強(qiáng)中獲益的患者。一個(gè)方面，患者候選人是那些打算從上胃腸道組織增殖中獲益的患者。此外，患者候選人是那些打算從增強(qiáng)上胃腸道組織功能獲益的患者，無(wú)論上胃腸道功能的增強(qiáng)是否是由組織生長(zhǎng)增加的結(jié)果。聯(lián)合治療在這些組織上的作用顯然會(huì)使那些受疾病或異常狀態(tài)折磨的患者受益。通常，打算從增加上胃腸道質(zhì)量或者先存的正常粘膜上皮細(xì)胞的再生與康復(fù)中獲益的患者是接受本發(fā)明治療的候選人。此外，打算從增強(qiáng)上胃腸道組織功能獲益的患者，無(wú)論上胃腸道功能的增強(qiáng)是否是組織生長(zhǎng)增加的結(jié)果，都是接受本發(fā)明的治療的候選人。例如可以在接受化療或放療之前或之后，胃腸道炎癥發(fā)病前、中或后，接受胃腸外營(yíng)養(yǎng)治療一段時(shí)間以后，活躍的胃腸道疾病發(fā)病后或發(fā)病的過(guò)程中，或者如果患者是一名胃腸道未完全發(fā)育成熟的未成年的幼兒，和/或壞死性小腸結(jié)腸炎為例的胃腸道(GI)炎癥，對(duì)患者進(jìn)行醫(yī)治。
接受GLP-2治療的另外的候選人包括那些住院患者，往往是住進(jìn)加護(hù)病房的患者，已知他們患上胃腸道炎癥及潰瘍的危險(xiǎn)不斷的增加，或者他們服用了能夠增加患上胃腸道炎癥及潰瘍危險(xiǎn)的藥物，例如NSAIDs和/或糖皮質(zhì)類固醇。
在確定給定受療者的最佳劑量時(shí)臨床醫(yī)師要考慮大量因素。其中主要考慮的是機(jī)體正常生成的肽類激素的量。另外的因素還包括患者的身材、患者年齡、患者的一般狀況、治療的特定疾病、疾病的嚴(yán)重程度、患者服用其他藥物、肽或肽類似物的體內(nèi)活性等。實(shí)驗(yàn)劑量應(yīng)該在考慮了關(guān)于肽類激素及肽類激素促分泌素給藥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床文獻(xiàn)后選定。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該能預(yù)見(jiàn)到體外結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)合常數(shù)和Ki的信息也可以用于計(jì)算劑量。預(yù)期聯(lián)合治療劑量相當(dāng)于GLP-2和GLP-2類似物為0.1mg/kg、每天兩次，配合給藥的IGF-1為約2mg/kg、每天兩次，以及GH約1mg/kg、每天一次，聯(lián)合用藥10天后能產(chǎn)生上胃腸道極其顯著的改善。期望小得多的劑量，μg/kg以及或許ng/kg范圍，以及更短或更長(zhǎng)的治療周期或治療頻率也希望能夠產(chǎn)生有效的治療效果，例如，特別是小腸質(zhì)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著增加。
GLP-2肽的典型的人施用劑量為約10μg/kg體重/天～約10mg/kg/天，優(yōu)選約50μg/kg體重/天～約5mg/kg/天，最優(yōu)選約100μg/kg體重/天～約1mg/kg/天。由于本發(fā)明的GLP-2類似物能夠比GLP-2更有效達(dá)10～甚至100倍，所以這樣的GLP-2類似物的典型劑量可以更低，例如，約100ng/kg體重/天～約1mg/kg/天，優(yōu)選約1μg/kg體重/天～約500μg/kg/天，甚至更優(yōu)選約1μg/kg體重/天～約100μg/kg/天。
關(guān)于GH對(duì)哺乳動(dòng)物的給藥，具體為對(duì)人給藥，可以使用的劑量范圍為0.02～2.5mg/kg/天，優(yōu)選的GH劑量范圍為約0.1～2mg/kg/天。關(guān)于IGF’s的給藥，劑量范圍為1μg～1g/kg/天。優(yōu)選地，IGF-1對(duì)人給藥的范圍為約0.03～10mg/kg/天，更優(yōu)選約0.1～4mg/kg/天，最優(yōu)選約0.5～1mg/kg/天。IGF-2的典型劑量為約0.5～5mg/kg/天。對(duì)于IGF類似物來(lái)說(shuō)，所需劑量可以比天然生成的IGF少20～50％。而且，在精確設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)中，能夠測(cè)定出最適合于人的劑量大小以及給藥方案。
另一方面，本發(fā)明提供了用植入的腸細(xì)胞對(duì)剛剛確定的患者候選人進(jìn)行治療，所述的植入腸細(xì)胞在移植或轉(zhuǎn)化到受體中以前已經(jīng)經(jīng)過(guò)再生或刺激能夠在體內(nèi)或體外增殖。來(lái)自體內(nèi)細(xì)胞的狀態(tài)只需要將要移植的細(xì)胞或組織置于已經(jīng)加入促進(jìn)生長(zhǎng)的量的聯(lián)合肽而且其他方面都適于培養(yǎng)這類細(xì)胞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。合適的調(diào)理期過(guò)后，接著就可以將細(xì)胞直接植入患者或者用現(xiàn)有的細(xì)胞膠囊化技術(shù)將細(xì)胞裝入膠囊移植到體內(nèi)。用其他器官進(jìn)行類似操作，例如用皮膚，在人試驗(yàn)中已經(jīng)取得了臨床上的顯著進(jìn)展。例如，皮膚可以在體外再生，通過(guò)把來(lái)自供體的皮膚細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)，然后這種經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的皮膚移植回患者從而達(dá)到治療的目的(例如，燒傷、潰瘍等的治療)。
進(jìn)一步，可以用基因治療實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。作為受體的哺乳動(dòng)物或患者細(xì)胞(可以是任意一種細(xì)胞但優(yōu)選成纖維細(xì)胞或角質(zhì)形成細(xì)胞)能夠被構(gòu)建用來(lái)表達(dá)一種或多種目的生長(zhǎng)因子，或者是GLP-2與IGF-1和/或IGF-2和/或GH的體外聯(lián)合，然后進(jìn)行移植，優(yōu)選置于膠囊中，體內(nèi)釋放治療劑量的這些肽。目前現(xiàn)有的多種轉(zhuǎn)染技術(shù)可以用來(lái)體外把DNA轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中；包括磷酸鈣-DNA沉淀、二乙氨乙基(DEAE)-葡萄糖轉(zhuǎn)染，電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化或重組病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種離體治療方法已經(jīng)被用于把DNA轉(zhuǎn)化到多種不同的細(xì)胞類型包括上皮細(xì)胞(US4868116；Morgan and MulliganWO87/00201；Morgan et al.，1987，Science 2371476-1479；Morgan and Mulligan US4980286)、內(nèi)皮細(xì)胞(WO89/05345)、肝細(xì)胞(WO89/07136；Wolff et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA843344-3348；Ledley et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.845335-5339；Wilson and Mulligan，WO89/07136；Wilson et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.878437-8441)、成纖維細(xì)胞(Palmeret al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 841055-1059；Ansonet al.，1987，Mol.Biol.Med.411-20；Rosenberg et al.，1988，Science 2421575-1578；Naughton&Naughton，US4963489)、淋巴細(xì)胞(Anderson et al.，US5399346；Blaese，R.M.，et al.，1995，Science 270475-480)以及造血干細(xì)胞(Lim，B.，et al.1989，，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868892-8896；Anderson et al.，US5399346)。
可以預(yù)料到基因治療是提供用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的生長(zhǎng)激素的可行方法。特別地，能夠?qū)嵤┻@樣一種實(shí)驗(yàn)，即把來(lái)自能夠分泌全部胰高血糖素的細(xì)胞系的細(xì)胞植入到小鼠體內(nèi)。植入細(xì)胞生長(zhǎng)成為分泌GLP-2和引發(fā)小腸生長(zhǎng)的腫瘤。由于GLP-2是從胰高血糖素衍生的唯一的已知能顯著刺激小腸生長(zhǎng)的多肽，所以這種實(shí)驗(yàn)中觀察到的對(duì)小腸生長(zhǎng)效應(yīng)最可能是由GLP-2的分泌引起的。類似地，也可以構(gòu)建單獨(dú)生產(chǎn)GLP-2，和/或其他至少一種選自IGF-1、IGF-2和GH的肽類激素的細(xì)胞，并植入哺乳動(dòng)物。
替代地，可以使用基因治療體內(nèi)轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。用于這類體內(nèi)方法的核酸制劑可以包括裸DNA、包裹到脂質(zhì)體或與病毒囊膜受體蛋白結(jié)合的脂質(zhì)體中的核酸(Nicolau et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 801068)、偶連到聚賴氨酸-糖蛋白載體復(fù)合物上的DNA以及核酸沉淀。核酸制劑的體內(nèi)導(dǎo)入可以采用本領(lǐng)域已知的任一種技術(shù)，例如，直接注射、電穿孔以及粒子轟擊。此外，“基因槍”也已經(jīng)用于基因釋放進(jìn)入細(xì)胞(澳大利亞專利9068389)。
一種相關(guān)方法可能涉及使用改良的基因治療和編碼下列基因產(chǎn)物的病毒載體GLP-2與其他至少一種選自IGF-1、IGF-2和GH的肽類激素。這類病毒載體可以用來(lái)感染腸損傷患者的殘存腸上皮細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)把這些物質(zhì)有目的地局部釋放到腸中。然而，實(shí)施本發(fā)明并不需要轉(zhuǎn)化全部腸細(xì)胞，即使那些細(xì)胞能夠被轉(zhuǎn)化。其實(shí)，任意一種組織中的能夠分泌選定激素進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞，例如肌細(xì)胞，都可以用于內(nèi)源性地生產(chǎn)激素。
這種方式能夠生產(chǎn)出只含基因編碼氨基酸的形式，由于這一限制，所以能夠容易地從選定的GLP-2、IGF-1、IGF-2和GH的氨基酸序列測(cè)定出用于實(shí)施基因治療方法的這類DNAs的序列。各種適合把遺傳信息導(dǎo)入到人體細(xì)胞的表達(dá)載體，包括病毒載體，都能使用，并且能把GLP-2、IGF-1、IGF-2和GH的編碼DNA’s引入到宿主細(xì)胞的表達(dá)控制功能之下。一旦實(shí)現(xiàn)了遺傳學(xué)變化，然后就能夠利用本領(lǐng)域中已經(jīng)建立的方法把構(gòu)建的細(xì)胞植入。
本發(fā)明已經(jīng)做了描述，下面提供的實(shí)施例應(yīng)該視為是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，而并非限制。
實(shí)施例1本實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了GLP-2在促進(jìn)食管粘膜上皮細(xì)胞和肌肉層增殖方面的作用。
將雌性CDI小鼠(6周齡，約25g，Charles River)圈養(yǎng)在塑料底、金屬線頂蓋的籠子中，保持12小時(shí)的光/暗循環(huán)，允許其隨意獲得飼料和水。用Mettler PJ300秤稱小鼠的重量，并將它們隨機(jī)地分配到對(duì)照組(注射磷酸鹽緩沖液(PBS))或?qū)嶒?yàn)組(注射人[Gly2]GLP-2)中。每個(gè)對(duì)照組或?qū)嶒?yàn)組均由圈養(yǎng)在同一個(gè)籠子中2只小鼠組成。
在注射(50μg/g體重，共0.5ml)5-溴脫氧尿苷(“BrdU”)之前，只用人[Gly2]GLP-22.5μg或PBS處理(皮下)上述雌性CD1小鼠，每天兩次8a.m.和6p.m.，共兩天。在起初的50個(gè)小時(shí)內(nèi)，這些小鼠接受共5次人[Gly2]GLP-2或鹽水的注射。在宰殺前21小時(shí)停止飼喂。注射BrdU2小時(shí)后宰殺這些小鼠。宰殺時(shí)，取食管末端部分(連接胃十二指腸接點(diǎn)的最近2cm食道)進(jìn)行組織學(xué)分析。
將上述食管組織在10％緩沖的福爾馬林中固定24小時(shí)，然后在處理之前置于70％乙醇中。用常規(guī)技術(shù)對(duì)組織進(jìn)行處理并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用石蠟包埋。切下4～6個(gè)顯微切片，用蘇木精和伊紅染色，對(duì)第二套載片進(jìn)行染色用于觀察BrdU-免疫陽(yáng)性細(xì)胞。腸測(cè)微法使用LeicaQ500MC成像分析系統(tǒng)進(jìn)行。結(jié)果顯示于圖1。
當(dāng)通過(guò)BrDU-陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果清楚地顯示施用50小時(shí)人[Gly2]GLP-2會(huì)使食管的粘膜上皮細(xì)胞和肌肉層產(chǎn)生明顯的細(xì)胞增殖。
實(shí)施例2在本實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了人[Gly2]GLP-2對(duì)小鼠食管中的蛋白合成的作用。按照實(shí)施例1中描述的方法，圈養(yǎng)和飼喂雌性CD1小鼠(6周齡)。兩組小鼠(n＝5每組)每天給藥(皮下)2次，共10天，其中一組只用0.5ml PBS(對(duì)照組)，另一組施用溶于0.5mlPBS中的2.5μg人[Gly2]GLP-2。給藥后，用CO2麻醉小鼠，宰殺進(jìn)行分析。在靠近胃與十二指腸結(jié)合處近端的2～4cm區(qū)間內(nèi)，收取長(zhǎng)為1cm的食管組織節(jié)段，用于分析總細(xì)胞蛋白。將這個(gè)1cm的食管組織節(jié)段置于1ml PBS中，用Polytron勻漿。取該勻漿液的等份試樣，用改良Bradford分析法(BIORAD)測(cè)定蛋白含量。結(jié)果見(jiàn)圖2。
蛋白含量測(cè)試結(jié)果顯示用人[Gly2]GLP-2處理后食管組織中的蛋白合成增加。這些結(jié)果與人[Gly2]GLP-2對(duì)這種組織中的相應(yīng)目標(biāo)受體的細(xì)胞作用一致。
實(shí)施例3在本實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了GLP-2對(duì)胃質(zhì)量的作用。把人[Gly2]GLP-2溶于飲用水對(duì)雌性CD1小鼠(6周齡)口服給藥。該飲用水中含4.3μg/ml人[Gly2]GLP-2，每天新鮮配制。每個(gè)小鼠每天接受約100μg人[Gly2]GLP-2。對(duì)小鼠處理12天后，停止飼喂24小時(shí)，用CO2麻醉，宰殺。收取每個(gè)小鼠的胃，稱重。結(jié)果見(jiàn)圖3。
與只接受普通飲用水的對(duì)照小鼠相比，用人[Gly2]GLP-2(p＜0.05)處理后的胃的重量顯著增加。
實(shí)施例4在本實(shí)驗(yàn)中，研究了GLP-2對(duì)吲哚美辛引發(fā)的粘膜上皮損傷的預(yù)防和治療效果。
非甾醇類抗炎藥(NSAIDs)屬于北美洲最普遍消費(fèi)的藥物。從治療角度看，它們具有止痛、抗炎、解熱以及抗血小板的功效。盡管使用具有抑制胃酸功效的藥物或通過(guò)施用外源性的前列腺素目的是在于預(yù)防，但是胃腸毒性仍是發(fā)病的主要原因。在長(zhǎng)期服用NSAID的患者中，NSAID-引發(fā)的胃病，范圍自無(wú)癥狀胃糜爛至威脅生命的腸出血的發(fā)病率估計(jì)在15％～20％之間變動(dòng)。小腸損傷(NSAID-引發(fā)的腸部病變)的確切發(fā)病率還不清楚。
NSAIDs能阻斷花生四烯酸到達(dá)環(huán)-加氧酶(前列腺素合成酶)結(jié)合位點(diǎn)的途徑，從而阻止前列腺素和血栓烷的形成。然而，前列腺素合成的抑制似乎并非是導(dǎo)致NSAID-引發(fā)的小腸粘膜損傷的主要原因。相反地，上皮細(xì)胞通透性的變化、增加了的魯米那細(xì)菌接種量以及膽汁導(dǎo)致了上皮細(xì)胞的損傷。在施用了NSAIDs的鼠類中，除胃病外，還注意到了小腸和結(jié)腸通透性(transmural)炎癥及潰瘍，因此，可以通過(guò)施用NSAID產(chǎn)生用于研究炎性腸道疾病的動(dòng)物模型。
向小鼠和大鼠施用GLP-2能夠通過(guò)活化腺細(xì)胞的增殖以及抑制腸細(xì)胞凋亡來(lái)刺激小腸和大腸中的粘膜的生長(zhǎng)。為了提出GLP-2可以用于治療和/或預(yù)防性處理腸粘膜上皮損傷的可能性，我們已經(jīng)進(jìn)行這樣的研究把一種新的人GLP-2類似物，h[Gly2]-GLP-2，應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性吲哚美辛引發(fā)胃腸炎的小鼠。材料和方法動(dòng)物在整個(gè)研究過(guò)程中，將6～8周齡雌性CD1小鼠(約22～28g，Charles River)圈養(yǎng)在塑料底、金屬線頂蓋的籠子中，保持12小時(shí)的光/暗循環(huán)，允許其隨意獲得飼料和水。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前的前一天用Mettler PJ300秤稱小鼠的重量，并將它們隨機(jī)地分配到實(shí)驗(yàn)組中。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中共有5只小鼠。右后肢皮下注射PBS或人[Gly2]GLP-2，每天兩次，上午9點(diǎn)和下午7點(diǎn)。注射4天后，開(kāi)始施用吲哚美辛。在接受第一劑量吲哚美辛的前一晚讓小鼠禁食。
在上午9點(diǎn)到下午5點(diǎn)之間宰殺小鼠，測(cè)量胃、小腸和大腸的重量。還測(cè)量了小腸和大腸的長(zhǎng)度。心臟穿刺取血，10,000g離心10分鐘分離血漿。將血漿在-70℃凍存以備將來(lái)研究GLP-2水平之用。取組織用于組織學(xué)分析，蛋白，濕重或干重，RNA以及髓過(guò)氧化物酶的研究。施用GLP-21997年8月1日從Allelix獲得的50.4mg h[Gly2]GLP-2(ALX-0600)溶于滅菌水中，用5N NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至最終pH7。這批肽用于所有實(shí)驗(yàn)。將0.2、0.5、1.0、2.0mg/ml的等份試樣凍存于-80℃。將1m(溶液中)600μg的h[Gly2]-GLP-2均勻地溶解于399ml的磷酸鹽緩沖液(PBS-137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4·7H2O，1.4mM KH2PO4，pH7.3)中得到終濃度為1.5μg/ml。將體積為14ml的等份試樣保存于-80℃，注射前37℃水浴解凍。使用1/2cc U-100胰島素注射器(Insulin Syringes)(Becton Dickinson and Company，NJ)，每次注射的注射體積為0.5ml。用PBS注射的動(dòng)物從相同的給藥途徑接受與用于稀釋h[Gly2]-GLP-2的同樣的PBS溶液。施用吲哚美辛吲哚美辛(1-[p-氯苯甲酰基]-5-甲氧-2-甲基吲哚-3-乙酸)(Sigma Chemical Co.，St Louis MO，lot 74H1212)，制備原液，第一次注射前1小時(shí)分裝。將小鼠稱重，然后禁食過(guò)夜，第一次注射吲哚美辛前1小時(shí)飼喂。接受第二次吲哚美辛注射小鼠不禁食。用Mettler AE166秤稱出吲哚美辛的重量(14.5mg)，溶于1mL無(wú)水乙醇中。將該溶液37℃溫育5分鐘，徹底攪拌至完全溶解。將998.1μL的吲哚美辛原液稀釋到41ml pH7.3的5％NaHCO3中。兩天內(nèi)每天的上午10點(diǎn)向動(dòng)物注射0.5ml O.D.。將第二次注射使用的吲哚美辛-20℃保存過(guò)夜，使得能夠在注射前室溫解凍。這兩天中每天的同一時(shí)間(上午10點(diǎn))注射小鼠，約在接受h[Gly2]-GLP-2后1小時(shí)。不接受吲哚美辛的動(dòng)物只注射賦形劑(250μl無(wú)水乙醇溶于10.5mLpH7.3的5％NaHCO3-2天內(nèi)每天注射的終體積為0.5ml)。在注射PBS或h[Gly2]-GLP-2 14天后在CO2小室中宰殺動(dòng)物。結(jié)果進(jìn)行小型實(shí)驗(yàn)測(cè)定可重復(fù)地在小鼠中產(chǎn)生50％死亡率的吲哚美辛的劑量。對(duì)于該研究中所有接受吲哚美辛處理的各組，按以下方式將吲哚美辛施用給7～8周齡的雌性CD1小鼠過(guò)夜禁食后兩天內(nèi)，按7mg/kg的劑量皮下注射，每天兩次。這種劑量能穩(wěn)定地導(dǎo)致鹽水-處理的對(duì)照動(dòng)物50％的死亡率。在每個(gè)處理組中，以皮下注射的方式，每天兩次向接受吲哚美辛的動(dòng)物以及向陰性對(duì)照施用0.75μg的PBS或h[Gly2]-GLP-2。
處理組I用于檢定吲哚美辛(劑量為7mg/kg)引發(fā)的腸損傷的類型和范圍。用鹽水或h[Gly2]-GLP-2預(yù)處理動(dòng)物4天，接下來(lái)的另外兩天用鹽水或者h(yuǎn)[Gly2]-GLP-2加吲哚美辛，然后在接受初始劑量吲哚美辛的兩天后宰殺。
處理組II用于測(cè)定用h[Gly2]-GLP-2或鹽水預(yù)處理4天并且接著用鹽水或h[Gly2]-GLP-2繼續(xù)處理10天后的效果。
處理組III用于測(cè)定先用鹽水或h[Gly2]-GLP-2處理4天并且同時(shí)施用了2天吲哚美辛的小鼠的效果。
本研究的處理組IV和V涉及接受鹽水或h[Gly2]-GLP-2同時(shí)開(kāi)始(IV)或下一天開(kāi)始(V)施用吲哚美辛并一直持續(xù)直到10天實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束動(dòng)物被宰殺時(shí)為止的小鼠。
與用鹽水處理過(guò)的對(duì)照組45～50％的存活率相比，組II～I(xiàn)V中所有經(jīng)過(guò)h[Gly2]-GLP-2處理的小鼠都表現(xiàn)出了明顯增高的存活率，范圍是75～95％。這種差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是十分顯著的(P＜.05～.01)。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(experimental endpoint)包括小腸及大腸的重量、組織學(xué)、疾病活性評(píng)分(disease activity scores)、粘膜酶活性(mucosalenzyme activity)、小腸及大腸上皮特異性基因表達(dá)、細(xì)胞因子和髓過(guò)氧化物酶的表達(dá)等炎性反應(yīng)標(biāo)記物以及GLP-2含量。在經(jīng)過(guò)h[Gly2]-GLP-2處理的小鼠中，所評(píng)定的指數(shù)中的大部分，特別是上皮損傷/炎癥的標(biāo)志物，都得到了顯著的改善。
等同方案上面所撰寫的說(shuō)明書(shū)足以能使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。實(shí)際上，上述用于實(shí)施本發(fā)明的方法的各種變化對(duì)于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的，都屬于本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)受療者進(jìn)行處理增強(qiáng)包括食管和胃在內(nèi)的上胃腸道功能的方法，該方法包括將增強(qiáng)上胃腸道功能的有效量的GLP-2受體激動(dòng)劑釋放到受療者上胃腸道中的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種對(duì)受療者進(jìn)行處理增強(qiáng)上胃腸道功能的方法，其中GLP-2或GLP-2的肽類類似物被釋放到食管。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的一種對(duì)受療者進(jìn)行處理增強(qiáng)上胃腸道功能的方法，其中GLP-2或GLP-2的肽類類似物被釋放到胃。
4.一種對(duì)受療者進(jìn)行處理使上胃腸道組織增殖的方法，該方法包括將使上胃腸道組織增殖的有效量的目的GLP-2或GLP-2的肽類類似物釋放到受療者上胃腸道中的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的受療者患有上胃腸道炎癥。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的上胃腸道炎癥是食管炎癥。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的食管炎癥選自炎性血管炎、感染后炎癥、浸潤(rùn)性疾病、感染性食管炎、非感染性食管炎、肉狀瘤病、Crohn’s disease、貝赫切特綜合征、移植物抗宿主反應(yīng)、返酸、膽汁返流、藥物引發(fā)的損傷、化學(xué)損傷、輻射、肌炎或膠原性血管疾病(collagen vascular disease)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的上胃腸道炎癥是胃部炎癥。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述的胃部炎癥選自出血性和糜爛性胃炎、幽門螺桿菌胃炎、化學(xué)性胃炎、化生萎縮性胃炎、竇切除術(shù)引發(fā)的胃炎、嗜酸細(xì)胞性胃炎、感染性胃炎、Crohn’s disease、肉狀瘤病、單一性肉芽腫胃炎、淋巴細(xì)胞性胃炎以及巨大肥厚性胃炎。
10.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述受療者的上胃腸道受到部分或近乎全部切除。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述上胃腸道受到部分或近乎全部切除包括食管或胃。
12.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的受療者是人。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的GLP-2類似物與天然大鼠GLP-2相比具有增強(qiáng)了的上胃腸道增殖活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述的GLP-2類似物是人[Gly2]GLP-2。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的GLP-2類似物是通過(guò)口服、皮下或靜脈內(nèi)給藥釋放到上胃腸道。
16.一種鑒定用于治療上胃腸道炎癥的多肽的方法，其中包括下列步驟a)得到一種脊椎動(dòng)物GLP-2多肽類似物，該類似物至少有一個(gè)氨基酸替代、缺失、添加或含有一個(gè)帶有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸；b)誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上胃腸道炎癥；c)按照在使用天然GLP-2時(shí)，能改善上胃腸道炎癥狀況的給藥方案，用類似物治療上述帶有誘發(fā)上胃腸道炎癥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；以及d)與未接受這種多肽的對(duì)照動(dòng)物相比，測(cè)定上述類似物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況或死亡率的影響，或者與未接受這種多肽的對(duì)照動(dòng)物相比，測(cè)定上述類似物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上胃腸道重量的影響。
17.一種鑒定用于防止或改善上胃腸道炎癥的多肽的方法，包括下列步驟a)得到脊椎動(dòng)物GLP-2多肽的一種類似物，該類似物至少有一個(gè)氨基酸替代、缺失、添加或含有一個(gè)帶有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸；b)按照在使用天然GLP-2時(shí)，能改善上胃腸道炎癥狀況的給藥方案，用類似物治療具有誘發(fā)的上胃腸道的炎癥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；以及c)誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上胃腸道炎癥；d)與未接受這種多肽的對(duì)照動(dòng)物相比，測(cè)定上述類似物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況或死亡率的影響，或者與未接受這種多肽的對(duì)照動(dòng)物相比，測(cè)定上述類似物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上胃腸道重量的影響。
18.一種鑒定能夠使上胃腸道組織增殖的多肽的方法，其中包括下列步驟a)得到一種脊椎動(dòng)物GLP-2多肽類似物，該類似物至少有一個(gè)氨基酸替代、缺失、添加或含有一個(gè)帶有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸；b)按照在使用天然GLP-2時(shí)，能誘發(fā)上胃腸道增殖的給藥方案，將類似物送遞給上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的上胃腸道；c)在給藥方案結(jié)束后，評(píng)定上胃腸道或其代表性部分在質(zhì)量、長(zhǎng)度或總蛋白含量上的增加。
19.一種從預(yù)防角度對(duì)有出現(xiàn)上胃腸道炎癥等炎癥危險(xiǎn)的受療者進(jìn)行治療的方法，其中包括下列步驟a)鑒定出有出現(xiàn)上胃腸道炎癥等炎癥危險(xiǎn)的受療者；以及b)向受療者施用證實(shí)抑制炎癥發(fā)生和/或改善炎癥狀況的量的GLP-2或GLP-2類似物。
20.一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物上胃腸道組織生長(zhǎng)的方法，該方法包括治療哺乳動(dòng)物，提高下列多肽的血清水平GLP-2或GLP-2類似物與其他至少一種選自IGF-1、IGF-1類似物、IGF-2、IGF-2類似物、GH和GH類似物的多肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，包括向哺乳動(dòng)物聯(lián)合施用有效量的GLP-2或GLP-2類似物和有效量的其他至少一種選自IGF-1、IGF-1類似物、IGF-2、IGF-2類似物、GH和GH類似物的多肽激素。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，包括把細(xì)胞移植給哺乳動(dòng)物，其中所述的細(xì)胞是來(lái)自體內(nèi)地用遺傳學(xué)手段構(gòu)建而成的以生產(chǎn)GLP-2和/或另一種肽類激素。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，包括來(lái)自體內(nèi)地用遺傳學(xué)手段構(gòu)建生產(chǎn)GLP-2和/或另一種肽類激素的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述的肽類激素是IGF-1或LRIGF-1。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述的肽類激素是IGF-2。
26.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述的肽類激素是GH。
27.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，用于促進(jìn)食管的生長(zhǎng)。
28.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，用于促進(jìn)胃的生長(zhǎng)。
29.一種對(duì)受療者進(jìn)行處理增強(qiáng)上胃腸道功能的方法，包括治療哺乳動(dòng)物提高下列多肽的血清水平GLP-2或GLP-2類似物與其他至少一種選自IGF-1、IGF-1類似物、IGF-2、IGF-2類似物、GH、GH類似物、EGF、EGF類似物、HGF、HGF類似物、KGF以及KGF類似物的肽激素。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，用于保養(yǎng)、恢復(fù)或保持上胃腸道功能在接受化療或放療方案后；在接受一段時(shí)間的胃腸外營(yíng)養(yǎng)后；在發(fā)生胃腸道疾病后；或者其中所述的患者是未成年的幼兒。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的受療者患有上胃腸道炎癥。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述的上胃腸道炎癥是食管炎癥。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述的食管炎癥選自炎性血管炎、感染后炎癥、浸潤(rùn)性疾病、感染性食管炎、非感染性食管炎、肉狀瘤病、Crohn’s disease、貝赫切特綜合征、移植物抗宿主反應(yīng)、返酸、膽汁返流、藥物引發(fā)的損傷、化學(xué)損傷、輻射、肌炎或膠原性血管疾病。
34.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述的上胃腸道炎癥是胃部炎癥。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述的胃部炎癥選自出血性和糜爛性胃炎、幽門螺桿菌胃炎、化學(xué)性胃炎、化生萎縮性胃炎、竇切除術(shù)引發(fā)的胃炎、嗜酸細(xì)胞性胃炎、感染性胃炎、Crohn’s disease、肉狀瘤病、單一性肉芽腫胃炎、淋巴細(xì)胞性胃炎、胃潰瘍以及巨大肥厚性胃炎。
36.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述受療者的上胃腸道受到部分或近乎全部切除。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述受到部分或近乎全部切除上胃腸道涉及食管和胃。
38.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的受療者是人。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述的GLP-2類似物與天然大鼠GLP-2相比具有增強(qiáng)了的上胃腸道細(xì)胞增殖活性。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述的GLP-2類似物是人[Gly2]GLP-2。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述的GLP-2類似物是通過(guò)口服、皮下或靜脈內(nèi)給藥釋放到上胃腸道。
42.一種試劑盒，包括GLP-2與其他至少一種選自IGF-1、IGF-2、GH、EGF、HGF和KGF的肽類激素，這些激素按照有效治療的單位劑量或多劑量來(lái)提供。
43.一種促進(jìn)上胃腸道組織或細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括以下步驟用含有促進(jìn)生長(zhǎng)的GLP-2或GLP-2類似物與其他至少一種選自IGF-1、IGF-1類似物、IGF-2、IGF-2類似物、GH、GH類似物、EGF、EGF類似物、HGF、HGF類似物、KGF以及KGF類似物的多肽激素二者結(jié)合的培養(yǎng)基培養(yǎng)上述組織或細(xì)胞。
44.一種對(duì)患者進(jìn)行治療恢復(fù)上胃腸道功能的方法，該方法按照下列步驟實(shí)施(a)用含有促進(jìn)生長(zhǎng)的GLP-2或GLP-2類似物與其他至少一種選自IGF-1、IGF-1類似物、IGF-2、IGF-2類似物、GH、GH類似物、EGF、EGF類似物、HGF、HGF類似物、KGF以及KGF類似物的多肽激素二者結(jié)合的培養(yǎng)基培養(yǎng)來(lái)自患者的組織或細(xì)胞，以及(b)把上述組織或細(xì)胞移植到接受治療的患者體內(nèi)。
45.一種用于當(dāng)一種激素與GLP-2聯(lián)用時(shí)測(cè)定該激素活性的方法，其中包括(a)將該激素與一定量的GLP-2或GLP-2類似物聯(lián)合施用給實(shí)驗(yàn)哺乳動(dòng)物；(b)評(píng)定實(shí)驗(yàn)哺乳動(dòng)物上胃腸道組織的繼發(fā)生長(zhǎng)；以及(c)測(cè)定實(shí)驗(yàn)哺乳動(dòng)物上胃腸道組織的生長(zhǎng)相對(duì)于單獨(dú)用GLP-2處理的對(duì)照哺乳動(dòng)物是否被加快。
46.一種對(duì)患有肽類潰瘍的患者進(jìn)行治療的方法，該方法包括以下步驟將GLP-2或GLP-2胃類似物與其他至少一種有效治療肽類潰瘍藥物釋放到受療者的上胃腸道，所述藥物選自能夠阻斷胃分泌酸的藥物、能夠在胃中形成保護(hù)性屏障的藥物或含鉍化合物，該藥物以有效治療的藥量提供。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述的能夠阻斷胃分泌酸的藥物包括H2受體拮抗物、質(zhì)子泵抑制劑以及前列腺素。
48.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述的能夠在胃中形成保護(hù)性屏障的藥物包括硫糖鋁。
全文摘要
本發(fā)明涉及胰高血糖素相關(guān)肽及其用于預(yù)防和治療包括食管和胃在內(nèi)的上胃腸道功能紊亂的用途。特別是,現(xiàn)已表明GLP－2和GLP－2類似物能導(dǎo)致上胃腸道組織的增殖。因此,本發(fā)明提供了一種使需要的受療者上胃腸道增殖的方法。而且,本發(fā)明的方法用于治療或預(yù)防上胃腸道炎癥,包括炎性疾病。當(dāng)與其他肽類激素聯(lián)合施用時(shí),GLP－2刺激上胃腸道組織的生長(zhǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了GLP－2與其他至少一種肽類激素組合而成的藥物組合物,本發(fā)明還提供了通過(guò)增高GLP－2與其他至少一種肽類激素的血清水平,從而促進(jìn)上胃腸道組織生長(zhǎng)、改善上胃腸道功能紊亂的方法。本發(fā)明還提供了一種實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。
文檔編號(hào)A61K38/27GK1264307SQ98807330
公開(kāi)日2000年8月23日 申請(qǐng)日期1998年5月15日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月16日
發(fā)明者D·J·德魯克爾 申請(qǐng)人:1149336安大略公司