專利名稱：治療腹瀉疾病和從結(jié)腸中除去特定細(xì)菌種群的方法
與相關(guān)申請的參照根據(jù)《美國聯(lián)邦法典》第35冊第119(e)條，本申請要求1997年6月9日提交的美國臨時(shí)專利申請No.60/049,236的利益。
背景技術(shù)：
乳鏈菌肽(nisin)是一種由食品級微生物產(chǎn)生的細(xì)菌素，為抗微生物物質(zhì)，屬于被稱為羊毛硫抗生素(lantibiotics或lanthocin)的一組類似物質(zhì)，后者還包括枯草菌素、表皮素、gallidermin、pep5。
乳鏈菌肽由屬于藍(lán)斯菲爾德N血清群的乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcuslactis subsp.lactis)產(chǎn)生〔A.T.R.Mattick和A.Hirsch，1947Lancet.2，5〕。乳鏈菌肽是一種由34個(gè)氨基酸殘基組成的肽，含有由構(gòu)成羊毛硫氨酸或β-甲基羊毛硫氨酸殘基的硫醚橋交聯(lián)的5個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)。這些硫醚由半胱氨酸的巰基與絲氨酸或蘇氨酸殘基形成的脫氫側(cè)鏈縮合而成，是乳鏈菌肽前體肽翻譯后經(jīng)修飾的結(jié)果。
據(jù)報(bào)道，乳鏈菌肽起著陽離子表面活性劑的作用，其活性可以被陰離子去垢劑中和〔H.R.Ramseier，1960Arch.Mikrobiol，37，57〕，在分子水平上，乳鏈菌肽作用于細(xì)胞質(zhì)膜而且抑制肽聚糖的生物合成(Reising等.1980Arch.Microbiol，127，187)。乳鏈菌肽抗?fàn)I養(yǎng)期細(xì)菌的作用很可能是因?yàn)樵撾牟迦胫|(zhì)雙層后對細(xì)胞質(zhì)膜的電壓依賴性去極化作用，這可能是通過相鄰乳鏈菌肽分子的相互作用形成一個(gè)臨時(shí)性的孔或通道。乳鏈菌肽的分子特性及其生物合成的機(jī)制已成為目前一篇評論的主題(G.Jung和H.G.Sahl，1991《乳鏈菌肽和新的羊毛硫抗生素》(Nisin and Novel Lantibiotics)ESCOM Science Publishers，Leiden)。
乳鏈菌肽被認(rèn)為只有窄譜活性而且通常只有抗某些革蘭氏陽性菌的活性，但在與螯合劑組合時(shí)能出乎意料地抗革蘭氏陰性菌并且表現(xiàn)出抗革蘭氏陽性菌的活性增強(qiáng)(Blackburn等的美國專利No.5,217,950和5,260,271)。乳鏈菌肽已被用作抗微生物食品防腐劑并被JEFCA及包括美國、英國和歐洲經(jīng)濟(jì)共同體在內(nèi)的各國食品添加劑管理當(dāng)局認(rèn)為是安全的。
雖然乳鏈菌肽在動物模型的初步研究中被證明是有效的〔A.T.R.Mattick和A.Hirsh，1947 Lancet.2，5；E.M.Bavin等，1952 Lancent 1127；J.L.Gowans等，1952Brit.J.Pharmacol.7438；A.Hirsh和A.T.R.Mattick，1949 Lancet.ii190〕，但是乳鏈菌肽被發(fā)現(xiàn)其有效性不足以開發(fā)成用于人或獸醫(yī)的治療。
艱難梭菌(Clostridium difficile)是一種厭氧性革蘭氏陽性桿菌，能產(chǎn)生孢子并產(chǎn)毒，在人結(jié)腸中很少以明顯數(shù)量被發(fā)現(xiàn)。然而，由于許多抗菌劑對其不起作用且其易流行于醫(yī)院和療養(yǎng)院，因此，當(dāng)結(jié)腸的正常細(xì)菌菌叢被壓制時(shí)(最經(jīng)常的是在用廣譜抗菌劑進(jìn)行治療后)，會有艱難梭菌出現(xiàn)。在某些情況下，艱難梭菌可引起被稱為與抗生素相關(guān)的腹瀉和假膜性結(jié)腸炎的嚴(yán)重的疾病。對這些疾病的治療包括使用甲硝唑和口服萬古霉素。但目前萬古霉素的使用面臨嚴(yán)重的問題，因?yàn)槿f古霉素(尤其是口服形式)選擇出一類新的高度耐藥的腸內(nèi)微生物〔即對萬古霉素耐藥的腸球菌(VRE)〕，而VRE可在其它體內(nèi)部位引起致命的無法治療的感染。甲硝唑不能殺滅腸球菌(enterococci)，因此，其使用也有助于選擇出VRE在結(jié)腸中繁殖。艱難梭菌疾病的復(fù)發(fā)率非常高，約為20％；據(jù)認(rèn)為，這可能與孢子的形成有關(guān)，因?yàn)殒咦与y以根除。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是，提供一種治療結(jié)腸的由細(xì)菌引發(fā)的疾病并根除定居于結(jié)腸的有潛在危險(xiǎn)的細(xì)菌的方法。為此，已證明向結(jié)腸施用大劑量的乳鏈菌肽等含羊毛硫氨酸的細(xì)菌素(羊毛硫抗生素)時(shí)它在結(jié)腸中意外的穩(wěn)定性且沒有毒性。由于該發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的又一個(gè)目的是，提供一種將足量的選定的羊毛硫抗生素釋放至結(jié)腸以有效治療結(jié)腸感染的方法。
附圖的簡單說明

圖1表示乳鏈菌肽對胃腸道中的酶的敏感性。
圖2表示片劑包衣厚度對片劑在磷酸鹽緩沖液中的崩解開始時(shí)間的影響。
圖3表示片劑包衣厚度對片劑在磷酸鹽緩沖液中的崩解開始時(shí)間和崩解結(jié)束時(shí)間兩者的影響。
圖4表示包衣厚度對乳鏈菌肽向pH6.8磷酸鹽緩沖液中釋放的延遲的影響。
圖5表示具有40％EudragitTM包衣的6粒片劑的藥物溶出特性。
圖6A和6B表示40％包衣厚度的片劑制劑在被攝取后7小時(shí)里通過人胃腸道的過程。
圖7A和7B表示120％包衣厚度的片劑制劑在被攝取后12小時(shí)里通過人胃腸道的過程。
圖8A和8B表示180％包衣厚度的片劑制劑在被攝取后16小時(shí)里通過人胃腸道的過程。
發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供治療結(jié)腸與艱難梭菌相關(guān)的疾病并除去大腸中定居的微生物(如VRE)的方法。
為達(dá)到此目的，我們發(fā)現(xiàn)，乳鏈菌肽對包括VRE在內(nèi)的各種革蘭氏陽性細(xì)菌的病原性菌株具有很強(qiáng)的活性(美國專利申請No.08/667,650，此專利的全部內(nèi)容在本文中引作參考)。已知乳鏈菌肽對梭菌屬的食物腐敗性微生物具有活性，在我們最先發(fā)現(xiàn)其對艱難梭菌具有活性之后，最近，這些活性被公開了〔Kerr等，1997Lancet 3491026〕。這里，我們證明，乳鏈菌肽對包括對氯林可霉素和甲硝唑耐藥的菌株在內(nèi)的很多艱難梭菌的臨床分離菌具有特別有效的活性。此外，乳鏈菌肽已被證明對人的主要的正常腸道菌叢〔即脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)〕幾乎無活性。事實(shí)上，對50％的艱難梭菌有效的乳鏈菌肽濃度與對50％的脆弱擬桿菌有效的濃度之間的差值非常大。這意味著與Kerr等給出的教導(dǎo)相反，乳鏈菌肽的有效劑量不太可能對腸中的保護(hù)性共生細(xì)菌產(chǎn)生不良影響。雖然如前面已陳述的，乳鏈菌肽要對大多數(shù)革蘭氏陰性菌產(chǎn)生活性需要有增效劑，但也有一些例外。例如，需要復(fù)雜營養(yǎng)的革蘭氏陰性菌〔如淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)〕對單獨(dú)的乳鏈菌肽是敏感的。脆弱擬桿菌是需要復(fù)雜營養(yǎng)的厭氧微生物，其對乳鏈菌肽的敏感性如何先前并不知道。
由于乳鏈菌肽是一種肽，可被小腸中大量存在的蛋白水解酶消化(參見圖1)，其對胃腸道下部靶感染的經(jīng)口使用先前未曾考慮過。而且，不知道將完整的乳鏈菌肽釋放于胃腸道下部時(shí)對其是否耐受，也無法預(yù)料在該部位是否有足夠的穩(wěn)定性以產(chǎn)生抗菌活性。
我們現(xiàn)已用動物模型證明，在亞急性結(jié)腸內(nèi)毒性研究中將乳鏈菌肽反復(fù)釋放時(shí)不會對結(jié)腸產(chǎn)生刺激。而且，我們已證明，在進(jìn)行了上述處理的動物的血液中檢測不出完整的乳鏈菌肽，這提示，通過這種途徑不大會出現(xiàn)全身吸收(和可能的全身毒性)。此外，在將一部分結(jié)腸結(jié)扎的動物研究中，業(yè)已證明，相當(dāng)部分的乳鏈菌肽在被滴注至結(jié)腸后數(shù)小時(shí)在原處仍是完整的。
因此，開發(fā)乳鏈菌肽或其它羊毛硫抗生素類抗菌肽(包括由基因工程法或通過半合成化學(xué)法生產(chǎn)的這些分子的結(jié)構(gòu)變異體)的給藥系統(tǒng)以治療由對這些肽敏感的微生物(包括但不限于艱難梭菌)引起的結(jié)腸感染或除去大腸中對個(gè)體或?qū)ζ渌颊呔哂袧撛谖：Φ拿舾械亩ň游⑸?包括但不限于VRE)具有潛在的實(shí)際效用。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面是，開發(fā)可使有效量的治療結(jié)腸細(xì)菌感染的乳鏈菌肽通過口服給藥的制劑。
這些肽的藥物制劑包括口服用的適當(dāng)包衣的片劑或顆粒劑或膠囊，這些制劑在通過胃和小腸時(shí)能保持劑型的完整性，然后在胃腸道的合適區(qū)域(小腸下部至大腸上部)釋放活性成分。然而，可以料想到的是，例如栓劑和灌腸劑也可用作有效的劑型。下面所述的具體劑型僅是舉例而并非是對本發(fā)明范圍的任何限定。
實(shí)施例實(shí)施例1-5涉及乳鏈菌肽在結(jié)腸環(huán)境中的特性和乳鏈菌肽對通常存在于結(jié)腸中的細(xì)菌的有效性的測試。
實(shí)施例1a乳鏈菌肽對艱難梭菌的活性將得自弗吉尼亞州Richmond市McGuire美國退伍軍人管理局醫(yī)院的20株對氯林可霉素耐藥的臨床分離菌在含羊血的Brucella瓊脂中于無氧條件下進(jìn)行試驗(yàn)。將MIC(最小抑制濃度)定義為完全抑制細(xì)菌可見的生長的最低試驗(yàn)濃度。
如表1所示，所有菌株被0.25μg/ml或更低濃度的乳鏈菌肽抑制。
用與前述相同的方法測試得自佛羅倫薩大學(xué)(意大利)醫(yī)院的60株臨床分離菌對乳鏈菌肽和對目前用于治療艱難梭菌腹瀉和結(jié)腸炎的抗菌劑的敏感性。如表2所示，乳鏈菌肽對這些菌株的MIC中值即MIC50(抑制50％或者更多的受試菌株生長的濃度)為0.05μg/ml，顯著低于抑制相同菌株所需的萬古霉素或甲硝唑的量。MIC90值是抑制90％或更多的受試菌株生長的抗菌劑濃度。
該實(shí)施例表明，艱難梭菌是適合用乳鏈菌肽或相關(guān)肽治療的靶菌。
實(shí)施例1b乳鏈菌肽缺乏對脆弱擬桿菌的活性用與前述相同的方法對得自弗吉尼亞州Richmond市McGuire美國退伍軍人管理局醫(yī)院的脆弱擬桿菌的9株分離菌進(jìn)行測試。即使是所用的最高乳鏈菌肽濃度(32μg/ml)，也無一菌株被抑制。因此，乳鏈菌肽對這些菌株的MIC在64μg/ml以上。同樣地，如表3所示，23株得自佛羅倫薩大學(xué)(意大利)醫(yī)院的分離菌對乳鏈菌肽的敏感性也較低；MIC中值大于128μg/ml。
本實(shí)施例表明，乳鏈菌肽不大可能破壞人腸的正常菌叢。它還表明，單獨(dú)的乳鏈菌肽對需要復(fù)雜營養(yǎng)的革蘭氏陰性菌的活性無法由現(xiàn)有的對其它菌種的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測。
表1乳鏈菌肽對20株艱難梭菌的臨床分離菌的體外活性
表2乳鏈菌肽對60株艱難梭菌的臨床分離菌的比較活性
所有MIC值均以μg/ml表示。MIC50和MIC90用幾何方法算出。
表3乳鏈菌肽對23株脆弱擬桿菌的臨床分離菌的比較活性
所有MIC值均以μg/ml表示。MIC50和MIC90用幾何方法算出。
實(shí)施例2乳鏈菌肽在家兔結(jié)扎的腸中的可耐受性將5只家兔麻醉，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中使其保持睡眠狀態(tài)。開腹，將包含回腸-盲腸結(jié)合部和近段結(jié)腸在內(nèi)的一段腸結(jié)扎。將2只家兔用作對照，往另3只家兔的腸結(jié)扎段中直接注入20mg原料藥(即從廠商處得到的)乳鏈菌肽。將家兔保持6小時(shí)，然后宰殺。
在尸檢時(shí)和對腸的暴露區(qū)域進(jìn)行組織病理學(xué)檢查時(shí)未發(fā)現(xiàn)由乳鏈菌肽治療導(dǎo)致的刺激或毒性的體征。本實(shí)施例表明，一次給藥于家兔結(jié)腸以近似于可能給與人的劑量的乳鏈菌肽不會引起任何局部毒性，即使在將腸結(jié)扎以人工地使結(jié)腸中的劑量維持6小時(shí)也是如此。
實(shí)施例3向家犬的結(jié)腸重復(fù)給藥時(shí)的乳鏈菌肽的可耐受性在近段結(jié)腸區(qū)域手術(shù)植入插管。痊愈后，以6只家犬為一組，每日通過插管往結(jié)腸注入0、50、125或300mg/kg的乳鏈菌肽原料藥，持續(xù)28日；將劑量對半分，在每日上午10點(diǎn)和下午4點(diǎn)左右投藥。
在尸檢時(shí)及進(jìn)行組織病理學(xué)和臨床檢查時(shí)未發(fā)現(xiàn)由乳鏈菌肽治療導(dǎo)致的局部刺激或全身毒性的體征。本實(shí)施例表明，在向哺乳動物的結(jié)腸反復(fù)給藥后，非常大劑量的乳鏈菌肽是可以耐受的。
實(shí)施例4乳鏈菌肽未經(jīng)結(jié)腸全身吸收在上面的實(shí)施例2和3所述的毒理實(shí)驗(yàn)中，采取血樣以測定血清中的乳鏈菌肽。
在家兔結(jié)扎的腸模型(實(shí)施例2)中在滴注乳鏈菌肽后0.5、2和6小時(shí)后抽取血。分析方法是一種特殊的ELISA分析法，其在家兔血清中的定量限度為1μg/ml。
在這些試樣中均未檢測出乳鏈菌肽，表明在該動物模型中由結(jié)腸的吸收可以忽略。
在家犬實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例3)中，在第28日早晨給與乳鏈菌肽后0.5、1、2、3、4、5、6和7小時(shí)后收集血樣。在該實(shí)驗(yàn)中，以藤黃微球菌(Micrococcus luteus)為受試菌，用微生物分析法分析血清；該分析法在家犬血清中的定量限度為0.5μg/ml。在用乳鏈菌肽處理的18只家犬中，17只完成了研究，16只經(jīng)尸檢確認(rèn)導(dǎo)管放置正確。(2只家犬顯示有藥物滲漏至腹膜中；一只不得不在處理過程的初期宰殺了，另一只則完成了研究)。在導(dǎo)管放置正確(在腸內(nèi))的家犬中，在任何時(shí)間均未在血清中檢測出乳鏈菌肽。
本實(shí)施例表明，當(dāng)正確釋藥至哺乳動物的結(jié)腸時(shí)，即使是非常大的劑量，乳鏈菌肽也不會被吸收進(jìn)入全身循環(huán)統(tǒng)，因此，引起全身毒性的可能性很小。
實(shí)施例5乳鏈菌肽可以在哺乳動物結(jié)腸中保持足以抑制靶菌的濃度在上述家兔實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例2)中，尸檢時(shí)收集腸袢的內(nèi)容物。提取內(nèi)容物并用HPLC進(jìn)行分析。用對照組(未用乳鏈菌肽處理過的)家兔的腸內(nèi)容物評價(jià)提取方法的效果如何。該評價(jià)通過往這些試樣中加入已知量的乳鏈菌肽、勻化和提取來進(jìn)行。然后將最有效的提取方法(可將約50％的添加的乳鏈菌肽回收)施用于已用乳鏈菌肽處理過的家兔腸內(nèi)容物。從處理過的家兔的腸內(nèi)容物中回收到高達(dá)給藥量的24％的乳鏈菌肽，這意味著很可能高達(dá)一半的殘留乳鏈菌肽能在原處保持穩(wěn)定6小時(shí)。
假定在成人的每次治療中乳鏈菌肽的劑量擴(kuò)大至600mg，平均(全部)結(jié)腸容量約為4升，則在結(jié)腸中的局部濃度應(yīng)可長時(shí)間地達(dá)到高至40-80μg/ml(或40-80μg/g結(jié)腸內(nèi)容物)。這是靶菌〔艱難梭菌和腸球菌(Enterococcus spp.)〕MIC的許多倍，但處于或低于保護(hù)性革蘭氏陰性腸菌叢(如脆弱擬桿菌)的敏感性限度。實(shí)際劑量可較高或較低，因?yàn)樗?dāng)然地取決于許多因素，如劑型在人體內(nèi)打開和溶出的效率、活性成分的局部生物利用度(可自由地與細(xì)菌作用的量與被束縛于固體物質(zhì)的量之比)、疾病的嚴(yán)重程度、藥品在腹瀉患者中的通過時(shí)間，等等。因此，可以料想到的是，可在任何24小時(shí)的時(shí)間里進(jìn)行多次治療(高達(dá)6次)。預(yù)期日劑量范圍在最小約100mg至最大的約6g之間，最好在約300g至2g之間。
由于已知乳鏈菌肽可非常迅速地殺死敏感細(xì)菌，本實(shí)施例提示，乳鏈菌肽或類似的肽在以足夠劑量釋放于結(jié)腸時(shí)可用來治療由敏感細(xì)菌引起的細(xì)菌性疾病或用來除去定居于腸中有潛在危險(xiǎn)性的敏感細(xì)菌。
上面的實(shí)施例表明，與預(yù)料的相反，乳鏈菌肽和具有相似抗菌特性的其它肽會對結(jié)腸環(huán)境產(chǎn)生所需的效果而沒有任何預(yù)想的、可能的不良效果。
首先，將制劑設(shè)計(jì)成使治療量的乳鏈菌肽通過口服給藥在結(jié)腸中釋放。實(shí)施例6-8涉及這樣的制劑。在下面的研究中所要研究的是可在胃的pH中保持其完整性至少4小時(shí)和在pH6.8(小腸下部的pH)中保持0.5-3小時(shí)然后開始在結(jié)腸中或在結(jié)腸附近崩解的劑型。
最初的制劑研究的目標(biāo)是開發(fā)一種可在pH7.0的磷酸鹽緩沖液中迅速崩解的無包衣芯片。由于乳鏈菌肽的特殊理化特性及活性藥物占芯片的較大比率，片芯較難配制。與包括藥用肽在內(nèi)的大多數(shù)藥物不同，乳鏈菌肽是兩親分子(既親水又親油)(并且是疏水性的)。因此，雖然乳鏈菌肽的水溶性很好(即使在中性pH中)，但在片芯浸入緩沖液中時(shí)它不會迅速從被壓縮的片芯中擴(kuò)散開來，而是在片劑周圍形成一層凝膠化的乳鏈菌肽，它阻止水進(jìn)入片劑內(nèi)部。在評價(jià)各種賦形劑和崩解劑的范圍廣泛的配制程序之后，該獨(dú)特的問題僅通過將最佳量的氯化鈉摻入片劑中而得到解決。摻入氯化鈉可充分降低凝膠程度，從而使片劑能夠崩解。
遇到的第二個(gè)制劑問題涉及芯片的強(qiáng)度。片劑必須能經(jīng)受后面的WusterTM流化床包衣工藝時(shí)遇到的劇烈攪動。含各種比率的高效粘合劑(Povidone，Methocel及CarbopolTM)的片劑所具有的強(qiáng)度不適合此工藝。通過深入的評價(jià)而得到的結(jié)論是，由于乳鏈菌肽的性質(zhì)和理化特性，殘存空氣阻礙了粘合，從而導(dǎo)致片劑的物理強(qiáng)度差。該問題通過在制片工藝中導(dǎo)入碾壓技術(shù)而得到解決。
制劑的釋放特性是通過在芯片上以甲基丙烯酸/甲基丙烯酸酯共聚物(EudragitTM)包衣而賦予的。片劑開始崩解的時(shí)間和崩解完畢的時(shí)間通過在芯片上包以不同重量的包衣而能重現(xiàn)性地發(fā)生變化。
實(shí)施例6-11涉及各種制劑以及它們是否適于使有效量的本發(fā)明羊毛硫抗生素在結(jié)腸中釋放的試驗(yàn)。
實(shí)施例6a崩解劑對片劑崩解的作用制備含以下成分的芯片
1相對于乳鏈菌肽原料藥的重量百分比所用的崩解劑是Ac-Di-Sol、Explotab和Polyplasdone XL。含各種崩解劑的片劑的崩解時(shí)間(在pH7的磷酸鹽緩沖液中測得)如下
用Ac-Di-Sol作為崩解劑配制的片劑比用其它受試崩解劑配制的片劑更快地崩解。因此，后面的制劑用Ac-Di-Sol制備。
實(shí)施例6b氯化鈉對片劑崩解的作用制備含以下成分的芯片
1相對于乳鏈菌肽原料藥的重量百分比含不同量的氯化鈉的片劑的崩解時(shí)間(在pH7的磷酸鹽緩沖液中測得)如下
上述結(jié)果表明，足夠濃度的氯化鈉的存在克服了乳鏈菌肽的膠凝問題并大大促進(jìn)了乳鏈菌肽片劑在生理pH條件下的崩解。含1％以上氯化鈉的受試芯片在4-6分鐘內(nèi)崩解，而氯化鈉濃度為1％或更低的片劑即使在1.5小時(shí)后也未崩解。而且，在氯化鈉濃度15.3％以內(nèi)，崩解時(shí)間的變化很小。根據(jù)本發(fā)明，含濃度約為2-20％的氯化鈉的制劑預(yù)期可有效地將乳鏈菌肽或另一種羊毛硫抗生素釋放于結(jié)腸。
實(shí)施例7乳鏈菌肽芯片制備和測試含下述比率的各成分的芯片制劑
1相對于乳鏈菌肽原料藥的重量百分比NIP(1)配方(相對于乳鏈菌肽原料藥的百分比)顆粒內(nèi)
顆粒外
片劑特性抗碎強(qiáng)度＝5.65±1.8kp(n＝10)崩解時(shí)間在反滲透純水中＝24.4±2.5min(n＝3)在pH7.0磷酸鹽緩沖液中＝33.1±4.5min(n＝3)NIP(2)配方(相對于乳鏈菌肽原料藥的百分比)顆粒內(nèi)
顆粒外
片劑特性抗碎強(qiáng)度＝5.56±1.89kp(n＝10)崩解時(shí)間在反滲透純水中＝23.9±2.1min(＝3)在pH7.0磷酸鹽緩沖液中＝29.9±2.7min(n＝3)不僅發(fā)現(xiàn)這些劑型在模擬通過胃腸道的條件下具有合乎要求的崩解特性和所需的抗碎強(qiáng)度，而且發(fā)現(xiàn)這些劑型還保持了乳鏈菌肽的完整性和含量均勻性。
實(shí)施例8(A)芯片的制備
1AcDiSol＝交聯(lián)羧甲基纖維素鈉2ProSolv＝硅化微晶纖維素3Povidone＝聚乙烯吡咯烷酮根據(jù)以下步驟順序制備芯片1.將所有成分分別用#20(0.0331英寸)的篩過篩。
2.稱取顆粒內(nèi)部分的乳鏈菌肽、氯化鈉、AcDiSol和ProSolv(成分#1-4)。
合并在合適的玻璃容器中。
3.在Turbula混合器中以50rpm混合15分鐘。
4.稱取滑石粉(成分#5)。加入到得自步驟3的混合物中。
5.在Turbula混合器中以50rpm混合3分鐘。
6.將得自步驟5的混合物在輥式壓實(shí)器(TF-mini型)中壓實(shí)，輥壓＝100kg/cm2，輥速＝6rpm，螺桿速度＝11rpm。
7.用振動式制粒機(jī)使得自步驟6的壓實(shí)物通過1.0mm篩目(Erweka AR400濕-干式制粒機(jī))。
8.將得自步驟7的顆粒在輥式壓實(shí)器中壓實(shí)，輥壓＝30kg/cm2，輥速＝8rpm，螺桿速度＝11rpm9.用振動式制粒機(jī)使得自步驟8的壓實(shí)物通過1.0mm篩目。
10.將得自步驟9的顆粒在輥式壓實(shí)器中壓實(shí)，輥壓＝30kg/cm2，輥速＝8
rpm，螺桿速度＝11rpm11.用振動式制粒機(jī)使得自步驟10的壓實(shí)物通過1.0mm篩目。
12.稱取顆粒外部分的氯化鈉、AcDiSol、ProSolv和Povidone(成分#6-9)。
加入到步驟11的顆粒中。
13.在Turbula混合器中以50rpm混合10分鐘。
14.稱取硬脂酸鎂(成分#10)。加入到得自步驟13的混合物中。
15.在Turbula混合器中以50rpm混合2分鐘。
16.將得自步驟15的混合物在Manesty D3B旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)(壓片壓力＝1500磅；速度＝16rpm)中用7.0mm生物凹面站(bioconcave stations)壓片。
發(fā)現(xiàn)用此方法制得的芯片具有在后面的包衣過程中保持其完整性所需的強(qiáng)度。
(B)包衣片的制備
1分散體是30％固體聚合物(即，30g固體聚合物/100g分散體)。2加水，使分散體為20％(即，50％的Eudragit L30D-55分散體重量)。根據(jù)下述步驟制備用于對上面的(A)中制得的芯片進(jìn)行包衣的分散體1.將Eudragit L30D-55用清潔的篩過篩。2.稱取Eudragit L30D-55分散體。3.稱取水。邊攪拌邊往Eudragit分散體中加入約2/3的水。4.稱取檸檬酸三乙酯(TEC)。邊攪拌邊往Eudragit分散體中滴加TEC。用剩余的水(分成2份)清洗TEC容器并加入到混合物中。5.攪拌1小時(shí)。6.稱取滑石粉。邊攪拌邊加入到混合物中。7.攪拌1.5小時(shí)。根據(jù)下述步驟用包衣分散體對芯片進(jìn)行包衣
1.將芯片放置在流化床Wurster裝置中。
2.將包衣分散體放在天平上，從而用磁力攪拌器連續(xù)攪拌。
3.用下述包衣條件將芯片包衣噴霧速率 7.0g/min霧化壓力 1.5bar進(jìn)口溫度 50℃實(shí)施例9包衣厚度對片劑崩解的影響測試Eudragit L30D包衣厚度對經(jīng)如此包衣的片劑在pH6.8時(shí)的崩解和溶出。包衣厚度百分比是包衣重量與芯片重量之比。圖2和3所示結(jié)果表明，崩解開始時(shí)間和完畢時(shí)間均基本上與EudragitL30D包衣厚度成正比。圖4所示結(jié)果表明，片劑與緩沖液的初始接觸跟乳鏈菌肽的初始釋放之間的時(shí)間滯后與包衣厚度直接關(guān)聯(lián)。因此，可使用足夠厚度的Eudragit L30D包衣而賦予足以通過口服將藥物釋放于結(jié)腸的延遲釋放特性。而且，可利用包衣厚度改變延遲釋放特性。
根據(jù)本發(fā)明，預(yù)期約20-180％(軸向0.15-1.316mm)之間的包衣厚度會使制劑產(chǎn)生所需的延遲釋放特性。約40％的厚度(軸向0.371±0.07mm)是目前已知的本發(fā)明的最佳實(shí)施方式。
實(shí)施例10在模擬通過胃腸道的條件下的藥物釋放用USP II型裝置在pH6.8的緩沖液中于37℃以100rpm的攪拌速度制備具有40％Eudragit L30D包衣(包衣厚度軸向?yàn)?.371mm)的片劑(6)。用以下方法得出片劑的溶出特性先將片劑置于0.1N鹽酸(胃)環(huán)境中，然后置于pH6.8的50mM磷酸鹽緩沖液(大腸)環(huán)境中。圖5所示結(jié)果表明，可制備具有于人結(jié)腸釋藥所需的滯后時(shí)間的能重現(xiàn)地釋放乳鏈菌肽的乳鏈菌肽片劑。
實(shí)施例11證實(shí)緩釋片劑將乳鏈菌肽釋放于患者結(jié)腸用前面的實(shí)施例8中所示活性成分與賦形劑的比率(所不同的是，另外，加入了使每片含10mg而所需量的氧化釤)配制含100mg乳鏈菌肽原料藥的芯片。用實(shí)施例8中的Eudragit L30D-55將芯片包衣，使包衣重量達(dá)到芯片重量的40％(包衣厚度軸向?yàn)?.371mm)。在另外的芯片上包以占芯片重量的120％(包衣厚度軸向?yàn)?.896mm)和180％(包衣厚度軸向?yàn)?.316mm)的包衣。然后對片劑進(jìn)行中子轟擊。這使將一部分非放射性釤(152Sm)轉(zhuǎn)換成放射性153Sm，從而可用閃爍掃描法讓片劑在胃腸道中成象〔G.A.Digenis和E.Sandefer，在口服劑型體內(nèi)評定中的伽馬閃爍掃描法和中子活化技術(shù)，Crit.Rev.Ther.Drug CarrierSystems，7，309-345(1991)〕。
用12名健康男性受檢者進(jìn)行閃爍掃描法研究。在第一段時(shí)間里，6名受檢者各服用一片用40％、120％或180％Eudragit包衣(2名受檢者服用一種制劑)的經(jīng)中子活化的片劑。在第二段時(shí)間里，4名受檢者各服用一片包衣40％的片劑，2名受檢者各服用一片包衣120％的片劑。片劑用250ml冰水吞咽。每隔30分鐘進(jìn)行一次成象。
圖6-8顯示了不同片劑在通過胃腸道時(shí)的情況。圖6A和6B顯示了包衣40％的片劑在一個(gè)受檢者中的進(jìn)程，圖7A和7B顯示了包衣120％的片劑的進(jìn)程，圖8A和8B顯示了包衣180％的片劑的進(jìn)程。在圖6A中，可以看到，包衣40％的片劑在胃和空腸中始終是完整的。片劑在5.5小時(shí)于近段結(jié)腸完全崩解(圖6B)。包衣120％的片劑在12小時(shí)剛開始分散，此時(shí)，它位于橫結(jié)腸中(圖7B)。包衣180％的片劑到達(dá)直腸時(shí)基本上仍是完整的(圖8B)。這些結(jié)果表明，片劑在體內(nèi)和體外分散的時(shí)機(jī)與包衣厚度關(guān)聯(lián)。
服用包衣40％的片劑的6名受檢者的數(shù)據(jù)歸納在表4中。在6名受檢者中的5名中，片劑崩解的開始出現(xiàn)在回腸末端與橫結(jié)腸之間，在整個(gè)結(jié)腸中漸進(jìn)性地分散。
表4 包衣40％的乳鏈菌肽片劑在受檢者中的崩解
在服用該制劑的6名受檢者中均未觀察到不良反應(yīng)。
本實(shí)施例表明，乳鏈菌肽可配制成具有局部治療人結(jié)腸疾病所需的合適釋放特性的片劑，片劑成分的分散可在人結(jié)腸中實(shí)現(xiàn)，當(dāng)用緩釋制劑給藥于人結(jié)腸時(shí)，100mg乳鏈菌肽原料藥的劑量完全能被耐受。根據(jù)本發(fā)明，片劑可含約50-600mg乳鏈菌肽。在任何給定的治療中可給與多片片劑(可達(dá)4片)，可給予在任何一段24小時(shí)的時(shí)間里多次治療(可達(dá)4次)。乳鏈菌肽的日劑量范圍可從最小約100mg至最大約6g，最好約為300mg至2g。對于其它羊毛硫抗生素，也可考慮使用類似的片劑劑量和日劑量。
權(quán)利要求
1.由結(jié)腸細(xì)菌感染引起的疾病的治療方法，它包括給與有效量的羊毛硫抗生素。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述羊毛硫抗生素是乳鏈菌肽。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述細(xì)菌感染由艱難梭菌引起。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述疾病是與抗生素相關(guān)的腹瀉或假膜性結(jié)腸炎。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，給與的羊毛硫抗生素的日劑量范圍從最小的100mg至最大的6g。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述日劑量范圍為300mg至2g。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，給與的羊毛硫抗生素的日劑量范圍從最小的100mg至最大的6g。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，給與的羊毛硫抗生素的日劑量范圍從最小的100mg至最大的6g。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述日劑量范圍為300mg至2g。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述日劑量范圍為300mg至2g。
11.定居于大腸的細(xì)菌的根除方法，它包括給與有效量的羊毛硫抗生素。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述羊毛硫抗生素是乳鏈菌肽。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中，所述細(xì)菌是對萬古霉素耐藥的腸球菌。
14.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中，給與的羊毛硫抗生素的日劑量范圍從最小的100mg至最大的6g。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，給與的羊毛硫抗生素的日劑量范圍從最小的100mg至最大的6g。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述日劑量范圍為300mg至2g。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述日劑量范圍為300mg至2g。
18.如權(quán)利要求1或11所述的方法，其中，羊毛硫抗生素經(jīng)口給與。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，羊毛硫抗生素以片劑或膠囊的形式給藥。
20.如權(quán)利要求1或11所述的方法，其中，羊毛硫抗生素是直腸給藥。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，羊毛硫抗生素以栓劑或灌腸劑的形式給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及由艱難梭菌和對萬古霉素耐藥的腸球菌引起的結(jié)腸感染導(dǎo)致的疾病的治療方法。該方法使用乳鏈菌肽和其它含羊毛硫氨酸的細(xì)菌素(羊毛硫抗生素)作為活性成分。
文檔編號A61K38/00GK1264306SQ98805829
公開日2000年8月23日 申請日期1998年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月9日
發(fā)明者B·P·戈登斯坦 申請人:Ambi股份有限公司