專(zhuān)利名稱(chēng)：新型的核酸陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類(lèi)新型陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染劑、涉及含有該轉(zhuǎn)染劑的藥物組合物、涉及其在體內(nèi)、離體和/或體外的核酸轉(zhuǎn)染方面的應(yīng)用及其制備方法。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，今后可能將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。這些轉(zhuǎn)移的效力對(duì)于矯正在許多遺傳病中涉及的核酸表達(dá)的缺乏和/或異常的表達(dá)看來(lái)是必要的。但是，核酸轉(zhuǎn)移的意義并不限于基因治療。另外，核酸轉(zhuǎn)移可以用于研究基因表達(dá)的調(diào)控、基因的克隆，或者用于所有其它的牽涉核酸的體外實(shí)驗(yàn)操作，以及用于制造重組蛋白質(zhì)。這還涉及在體內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)移，比如用來(lái)得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、實(shí)現(xiàn)疫苗接種、研究分子標(biāo)記。另外，在骨髓移植、免疫治療或其他有關(guān)在從器官抽取的細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因的其他方法中，也可能涉及離體細(xì)胞中的核酸轉(zhuǎn)移。
如今，提出了許多方法來(lái)進(jìn)行此類(lèi)遺傳信息的細(xì)胞內(nèi)釋放。其中一種方法特別提出使用化學(xué)的或生化的載體。這些合成的載體具有兩個(gè)主要功能與要轉(zhuǎn)染的DNA復(fù)合和促進(jìn)其細(xì)胞固定作用以及促進(jìn)它穿過(guò)原生質(zhì)膜，而且必要時(shí)穿過(guò)雙層核膜。在開(kāi)發(fā)的合成載體中，聚賴(lài)氨酸類(lèi)的陽(yáng)離子聚合物和DEAE葡聚糖或脂轉(zhuǎn)染劑都是最有利的。
隨著使用脂轉(zhuǎn)染劑類(lèi)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染劑，更準(zhǔn)確說(shuō)是陽(yáng)離子脂類(lèi)的技術(shù)的發(fā)展，此轉(zhuǎn)染模式取得了重大的進(jìn)展。已證實(shí)，帶正電荷的陽(yáng)離子脂類(lèi)，如呈脂質(zhì)體或小泡囊狀的N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)自發(fā)地干擾帶負(fù)電荷的DNA，形成能夠與細(xì)胞膜融合的脂-DNA復(fù)合物，因此能夠進(jìn)行DNA的細(xì)胞內(nèi)釋放。
從DOTMA以后，在此同樣的結(jié)構(gòu)模型上，也就是說(shuō)在親脂基團(tuán)通過(guò)也稱(chēng)作“間隔基團(tuán)”的一個(gè)臂與氨基接合的模型上，開(kāi)發(fā)了其它的陽(yáng)離子脂類(lèi)。其中特別可以舉出含有脂肪酸或膽固醇衍生物作為親脂基團(tuán)，以及如有必要還含有季銨基團(tuán)作為氨基的化合物。可以特別舉出DOTAP、DOBT或ChOTP作為這類(lèi)陽(yáng)離子脂質(zhì)的代表。其它的化合物如DOSC和ChOSC的特征是具有膽堿基團(tuán)而不是季銨基團(tuán)。
還報(bào)道了另一類(lèi)脂類(lèi)轉(zhuǎn)染劑，即脂多胺。一般說(shuō)來(lái)，這涉及含有至少一個(gè)由通過(guò)“間隔基團(tuán)”與親脂區(qū)相連的親水區(qū)的兩親分子。帶正電荷的多胺區(qū)能夠以可逆的方式與帶負(fù)電荷的核酸相連。這種相互作用強(qiáng)烈地使核酸密集化。至于親脂區(qū)，通過(guò)覆蓋由脂質(zhì)層形成的復(fù)合物，它使這種離子相互作用對(duì)外界環(huán)境不敏感。在這類(lèi)化合物中，陽(yáng)離子基團(tuán)可以用含有4個(gè)銨基的L-5-羧基精胺作為代表，其中兩個(gè)是伯胺，兩個(gè)是仲胺。DOGS和DPPES特別由它們構(gòu)成一部分。這些脂多胺對(duì)于初級(jí)內(nèi)分泌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染都是有效的。作為這類(lèi)化合物的代表，可以特別舉出在比如專(zhuān)利申請(qǐng)WO 96/17823和WO97/18185中敘述的脂多胺。
盡管如此，這類(lèi)合成載體的有效性仍須改進(jìn)，特別是在電荷密度和轉(zhuǎn)染劑分子的剛性方面。
實(shí)際上，一般認(rèn)為這些化合物的活性取決于它們達(dá)到的電荷密度。但是，電荷在脂肪鏈上的增多是顯現(xiàn)毒性的根源。因此，將脂肪鏈上電荷密度的穩(wěn)定化將有可能防止出現(xiàn)毒性因素。再者，在脂肪鏈以外的區(qū)域增大電荷密度，將會(huì)增加轉(zhuǎn)染的效果。
此外，用于核酸轉(zhuǎn)移的分子的柔軟性可能是在所述核酸和轉(zhuǎn)染劑之間足夠密切的相互作用的障礙，這阻礙著實(shí)現(xiàn)核酸分子的最佳緊密化，而這種緊密化是所有轉(zhuǎn)染所必須的先決條件。轉(zhuǎn)染劑分子的剛性增加將保證與核酸的更有效的相互作用，這樣就改善了轉(zhuǎn)染。
因此，特別有意義的是提供一種轉(zhuǎn)染能力提高，同時(shí)又具有較低、或者零毒性的轉(zhuǎn)染劑。這就是本發(fā)明提出要達(dá)到的目的。
實(shí)際上，本發(fā)明的確切的目的是提供一種新型的轉(zhuǎn)染劑，該轉(zhuǎn)染劑具有新穎的陽(yáng)離子親水區(qū)賦予所述的轉(zhuǎn)移劑上述的特定性能。
更確切地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)染劑，它含有至少一個(gè)與親脂區(qū)相連的陽(yáng)離子親水區(qū)，所述陽(yáng)離子親水區(qū)包括至少一個(gè)被氨基取代的5原子或6原子雜環(huán)。
帶正電荷的親脂區(qū)能夠以可逆的方式與帶負(fù)電荷的核酸相結(jié)合，這樣核酸就強(qiáng)烈地被緊密化。另外，陽(yáng)離子部分的新穎結(jié)構(gòu)使分子的剛性增加。
陽(yáng)離子親水區(qū)是合成本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移劑的中間體，更具體它用通式(I)來(lái)代表
其中—y是0或1的整數(shù)，不同的y彼此是獨(dú)立的，—X表示氧、氮、硫或硒原子，—Z基團(tuán)彼此獨(dú)立地表示·氫原子·基團(tuán)OR，其中R表示氫原子、甲基或基團(tuán)(CH2)n-NR1R2，這其中n是選自1-6(含)的整數(shù)，R1和R2彼此獨(dú)立地表示氫原子或基團(tuán)(CH2)q-NH2，q可以在1-6(含)中變化，不同的q是彼此獨(dú)立的，·基團(tuán)(CH2)m-NR1R2，其中m是選自0-6(含)的整數(shù)，R1和R2如前面所定義，或·連接陽(yáng)離子親水區(qū)和親脂區(qū)的“間隔基團(tuán)”，條件是，至少一個(gè)取代基Z帶有氨基。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)移劑含有至少一個(gè)通式(I)的陽(yáng)離子親水區(qū)。按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，該轉(zhuǎn)移劑含有兩個(gè)或更多的陽(yáng)離子親水區(qū)，它們?cè)诨鶊F(tuán)Z上彼此相連。
按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，當(dāng)取代基Z中有一個(gè)表示OR，而R表示基團(tuán)(CH2)n-NR1R2時(shí)，n優(yōu)選選自2、3或4。
按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該轉(zhuǎn)染劑含有一個(gè)通式(I)的陽(yáng)離子親水區(qū)，其中X表示氧原子。這時(shí)的陽(yáng)離子親水部分為一個(gè)吡喃糖或呋喃糖形式的糖苷。吡喃糖的形式是特別有意義的，在實(shí)施例中進(jìn)行了非限定性的敘述。
按照本發(fā)明的第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，該轉(zhuǎn)染劑含有一個(gè)通式(I)的陽(yáng)離子親水區(qū)，它為含有6個(gè)鏈節(jié)的含氨基糖苷(在環(huán)上的y等于1)，X是氧原子，至少一個(gè)取代基Z帶有氨基。更優(yōu)選的是，至少兩個(gè)取代基Z中帶有氨基。
按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，該親水區(qū)為一個(gè)通式(I)的含氨基糖苷，其中兩個(gè)y都等于1，X是氧原子，兩個(gè)基團(tuán)Z表示氫原子，另外兩個(gè)Z是含氮的基團(tuán)，優(yōu)選是氨基，最后的基團(tuán)Z表示一個(gè)基團(tuán)OR，R如前面所定義。按照優(yōu)選的方式，基團(tuán)OR位于構(gòu)成本發(fā)明轉(zhuǎn)染劑陽(yáng)離子親水區(qū)的雜環(huán)的2-位上。
按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該陽(yáng)離子親水區(qū)為一個(gè)通式(I)的含氨基糖苷，其中環(huán)上的y等于1，X是氧原子，至少兩個(gè)基團(tuán)Z相當(dāng)于基團(tuán)O-(CH2)q-NH2，q如前面所定義，至少一個(gè)基團(tuán)Z表示OR，R如前面所定義。
作為通式(I)的陽(yáng)離子親水區(qū)的代表，也是用于合成本發(fā)明轉(zhuǎn)移劑的中間體，更具體可以舉出下面的化合物
一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明的轉(zhuǎn)染劑含有與親脂區(qū)相連的至少一個(gè)如上所定義的陽(yáng)離子親水區(qū)。
構(gòu)成本發(fā)明的親脂區(qū)的分子選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的親脂分子。該親脂區(qū)優(yōu)選包括一個(gè)或幾個(gè)直鏈的或分鏈的、飽和的或不飽和的、任選鹵代的脂族鏈。該親脂區(qū)還可以?xún)?yōu)選自類(lèi)固醇衍生物。
按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，親脂部分由一個(gè)或幾個(gè)含有10-22個(gè)碳原子，更優(yōu)選含有12-22個(gè)碳原子的脂族鏈組成。作為例子，可以舉出含有14、16、17、18或19個(gè)碳原子的脂族鏈，特別是-(CH2)13-CH3、-(CH2)15-CH3、-(CH2)16-CH3、-(CH2)17-CH3和-(CH2)18-CH3。
本發(fā)明轉(zhuǎn)移劑的親脂部分也可以?xún)?yōu)選自類(lèi)固醇衍生物，比如膽固醇、膽甾烷醇、3-α-5-環(huán)-5-α-膽甾烷-6-β-醇、膽酸、膽固醇甲酸酯、膽甾烷醇甲酸酯、3α，5-環(huán)-5α-膽甾烷-6β-醇甲酸酯、膽甾烯基胺、6-(1，5-二甲基己基)-3a，5a-二甲基十六氫環(huán)戊二烯并[a]環(huán)丙[2，3]環(huán)戊二烯并[1，2-f]萘-10-基胺，或者膽甾烷基胺。
按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，陽(yáng)離子親水區(qū)通過(guò)一個(gè)所謂的“間隔基團(tuán)”中間分子與親脂區(qū)相連。按照本發(fā)明的意思，“間隔基團(tuán)”指的是所有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的含有可獲得陽(yáng)離子親水部分和親脂區(qū)之間的酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、酯鍵、醚鍵或芳香環(huán)連接的功能團(tuán)的酸或胺取代基。親水部分和親脂部分之間的連接優(yōu)選在存在于通式(I)的陽(yáng)離子親水中間體上的基團(tuán)Z之一上進(jìn)行，該中間體可用來(lái)合成本發(fā)明的轉(zhuǎn)移劑。兩個(gè)親水區(qū)和親脂區(qū)之間的連接優(yōu)選在通式(I)的陽(yáng)離子親水部分的環(huán)上，在-2位，或在-5位或-6位(如果環(huán)上有y，它等于0或1)，通過(guò)“間隔基團(tuán)”來(lái)實(shí)現(xiàn)。
按照優(yōu)選的方式，“間隔基團(tuán)”具有脂族鏈或芳香鏈。另外，“間隔基團(tuán)”優(yōu)選含有一個(gè)或幾個(gè)選自酰胺、氨基甲酸酯、酯、醚或芳香環(huán)的基團(tuán)?！伴g隔基團(tuán)”特別優(yōu)選是如下通式的基團(tuán)-O-CO-(CH2)x-COOH、-O-(CH2)x-COOH、-O-CO-(CH2)x-NH2、-O-(CH2)x-NH2、-NH-(CH2)x-NH2，這里x表示選自1-6(含)的整數(shù)。
作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)染劑的代表，更具體可以舉出如下通式的化合物(16)、(17)、(8a)和(8b)
本發(fā)明還涉及制備如上所定義的新一類(lèi)核酸轉(zhuǎn)染劑的方法。更確切說(shuō)，本發(fā)明涉及由通過(guò)一個(gè)“間隔基團(tuán)”與脂區(qū)連接的單取代的或多取代的雜環(huán)制備所述轉(zhuǎn)染劑的方法。
根據(jù)氨基官能團(tuán)相對(duì)于環(huán)的位置及其數(shù)量的不同，通式(I)的陽(yáng)離子親水區(qū)可以用不同的方法制備。
當(dāng)希望得到式中至少一個(gè)取代基Z是能夠與親脂部分連接的“間隔基團(tuán)”，而至少一個(gè)基團(tuán)Z是OR基，這里R表示基團(tuán)-(CH2)n-NR1R2的通式(I)陽(yáng)離子親水區(qū)時(shí)，由式中所有的取代基-O-(CH2)n-NR1R2都是羥基的相應(yīng)衍生物進(jìn)行操作。
第一步，所述帶有羥基的衍生物按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法進(jìn)行-O-烷基化。特別是在傳統(tǒng)的烷基化溶劑中，在冠醚存在下，在10-60℃的溫度下，借助于堿性介質(zhì)中的烷基化試劑進(jìn)行。
作為烷基化試劑特別使用烷基胺、酯的鹵代衍生物，比如鹵代乙酸烷基酯、或者醇的鹵代衍生物。優(yōu)選使用溴代乙酸烷基酯。烷基官能團(tuán)根據(jù)所希望給出的n值進(jìn)行選擇。比如對(duì)于n等于2，優(yōu)選使用溴代乙酸乙酯。
使用的溶劑是O-烷基化的傳統(tǒng)溶劑，比如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亞砜、乙腈、四氫呋喃(THF)等，優(yōu)選使用THF。
反應(yīng)在堿存在下進(jìn)行，比如在氫氧化鉀或氫化鈉存在下。
第二步，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法，在醇中將得到的衍生物的羧基官能團(tuán)還原。特別是在相容的傳統(tǒng)溶劑中，通過(guò)還原劑的作用進(jìn)行。
作為還原劑，可舉出比如硼烷甲硫醚(BMS)、氫化鋰鋁或硼氫化鈉。
相容的溶劑是比如醚類(lèi)或醇類(lèi)。優(yōu)選使用四氫呋喃(THF)。
第三步，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法將得到的羥基官能團(tuán)疊氮化。
特別是在與反應(yīng)相容的溶劑中，在三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯存在下借助于疊氮酸進(jìn)行反應(yīng)。
可以使用的溶劑是疊氮化的傳統(tǒng)溶劑，比如四氫呋喃、苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷等，優(yōu)選四氫呋喃(THF)。
最后，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法，將疊氮官能團(tuán)轉(zhuǎn)化為氨基官能團(tuán)。
特別是在碳載鈀存在下，在酸性介質(zhì)中還原，比如通過(guò)在酸性介質(zhì)中加氫來(lái)進(jìn)行反應(yīng)，或者使用Staudinger反應(yīng)，或通過(guò)還原劑的作用，如氫化鋰鋁、硼氫化鈉、氯化亞錫等。
如此得到了通式(I)的陽(yáng)離子親水化合物，其中至少一個(gè)Z是能夠連接在親脂部分上的“間隔基團(tuán)”，至少一個(gè)基團(tuán)Z是基團(tuán)OR，這里的R表示基團(tuán)-(CH2)n-NR1R2。
然后通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法進(jìn)行與親脂部分的連接，特別是通過(guò)肽偶聯(lián)的方法，見(jiàn)Bodanski M.的《肽合成的原理和實(shí)踐》(Principles and Practices of Peptides Synthesis)，Springe-Verlag出版社。偶聯(lián)發(fā)生在表示“間隔基團(tuán)”的Z上。
當(dāng)Z中有一個(gè)是“間隔基團(tuán)”時(shí)，如有必要要預(yù)先將其保護(hù)起來(lái)。陽(yáng)離子親水部分所具有的氨基官能團(tuán)也一樣，它優(yōu)選在進(jìn)行肽偶聯(lián)時(shí)預(yù)先保護(hù)起來(lái)。按照常規(guī)方法進(jìn)行保護(hù)基團(tuán)的保護(hù)和消去。
可以通過(guò)各種相容的基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，其使用和消去都不會(huì)改變分子的其余部分。特別是按照T.W.Greene在《有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)》(Protective Groups in Organic Syntheses)A，Wiley-Interscience出版社(1981)，或Mc OMIE在《有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基團(tuán)》(Protective Groups in Organic Chemistry)，Plenum出版社(1973)中敘述的方法進(jìn)行。
作為例子，保護(hù)基團(tuán)可以選自三甲基甲硅基、二苯甲基、四氫吡喃基、甲?；⒁阴；⒙纫阴；?、三氯乙?；⑷阴；?、乙氧基羰基、叔丁氧羰基、三氯乙氧基羰基等。
另一種合成途徑能夠?qū)е碌诙盗嘘?yáng)離子親水化合物。此第二種實(shí)施方案與第一種之不同在于糖的骨架發(fā)生改形。
實(shí)際上，使用的原料是通式(II)的烯糖
其中，取代基Z’是乙酰氧基。使用的烯糖是商品，或者由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法從商品糖得到，特別是通過(guò)相應(yīng)的乙酰溴代糖與鋅/銅偶的反應(yīng)得到。
第一步，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法將乙?；┨峭榛?br> 特別是使用Ferrier反應(yīng)，在Lewis酸存在下與氨基醇、烷氧基羰基醇、羧基醇或者其它各種帶有可以與脂區(qū)偶聯(lián)的基團(tuán)的醇進(jìn)行反應(yīng)。
反應(yīng)優(yōu)選在三氟化硼存在下，在相容的溶劑如乙醚之類(lèi)的醚類(lèi)中進(jìn)行。
第二步，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法，還原得到的不飽和糖苷。
特別是在碳載鈀存在下，在酸性介質(zhì)中進(jìn)行還原，比如在酸性介質(zhì)中加氫。
然后，第三步，通過(guò)各種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，將環(huán)上的乙酰氧基轉(zhuǎn)化為羥基。
特別是借助于醇鹽如甲醇鈉進(jìn)行酯交換。
第四步，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，將環(huán)上的羥基官能團(tuán)轉(zhuǎn)化為疊氮官能團(tuán)。
特別是在與反應(yīng)相容的溶劑中，在三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯存在下，通過(guò)疊氮酸的作用進(jìn)行此反應(yīng)。
可以使用的溶劑是疊氮化的傳統(tǒng)溶劑，優(yōu)選四氫呋喃(THF)。
如此得到通式(III)的陽(yáng)離子親水區(qū)
其中，Z是氫原子或者是疊氮基，Z”中至少一個(gè)不是氫。
可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將親脂部分偶聯(lián)到氨基官能團(tuán)-NR1R2上，特別是使用肽偶聯(lián)(見(jiàn)Bodanski的《肽合成的原理和實(shí)踐》)，或者通過(guò)縮合。
在第一步過(guò)程中使用的醇含有氨基、酯或各種其它的能夠與親脂區(qū)偶聯(lián)的官能團(tuán)，這些官能團(tuán)優(yōu)選預(yù)先保護(hù)起來(lái)。在與親脂區(qū)偶聯(lián)以前保護(hù)基團(tuán)的保護(hù)和消去都按照常規(guī)方法進(jìn)行。
可以用各種相容的基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，其使用和消去都不會(huì)改變分子的其余部分。特別是按照T.W.Greene在《有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)》(Protective Groups in Organic Syntheses)A，Wiley-Interscience出版社(1981)或Mc OMIE在《有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基團(tuán)》(Protective Groups in Organic Chemistry)，Plenum出版社(1973)中敘述的方法進(jìn)行。
作為例子保護(hù)基團(tuán)可以選自三甲基甲硅基、二苯甲基、四氫吡喃基、甲?；⒁阴；?、氯乙?；?、三氯乙?；⑷阴；?、乙氧基羰基、叔丁氧羰基、三氯乙氧基羰基、苯二甲酰亞胺基等。
最后，最后一步，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法，將在5鏈節(jié)或6鏈節(jié)的環(huán)上的疊氮基轉(zhuǎn)化為氨基，分子的其余部分不發(fā)生改變。優(yōu)選通過(guò)在水存在下用三苯基膦的作用進(jìn)行此反應(yīng)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它制備本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)移劑的方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
作為非限定性的例子，如同在本說(shuō)明書(shū)“實(shí)施例”部分中詳細(xì)說(shuō)明的，本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案導(dǎo)致通式(8a)和(8b)的轉(zhuǎn)移劑，而第二種實(shí)施方案導(dǎo)致通式(16)和(17)的轉(zhuǎn)移劑。
合成陽(yáng)離子親水區(qū)的此第二條途徑的意義在于此合成只有很少的必需步驟，還在于得到的胺合成物的多樣性。一個(gè)陽(yáng)離子頭可以與不同的疏水取代基縮合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及含有如前面所定義的核酸轉(zhuǎn)移劑和核酸的組合物。該組合物優(yōu)選每μg核酸含有0.1-50nmol的載體。此比值優(yōu)選為每μg核酸2-20nmol載體，更優(yōu)選為每μg核酸4-12nmol的載體。更特別的核酸轉(zhuǎn)移劑與核酸的比為每μg核酸8-12nmol的載體。
在本發(fā)明中，“核酸”應(yīng)當(dāng)理解是脫氧核糖核酸和核糖核酸?？赡苌婕疤烊换蛉斯ば蛄?，具體地如基因組DNA(gDNA)、互補(bǔ)DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)的序列，雜合序列或合成或半合成的序列，修飾或未修飾的寡核苷酸。這些核酸可以來(lái)自人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒等。它們可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)得到，具體地采用篩選文庫(kù)、化學(xué)合成得到，或采用包括化學(xué)或酶修飾由篩選文庫(kù)所得到序列的混合方法得到。它們可以采用化學(xué)方法修飾。
特別地，脫氧核糖核酸可以是短的寡核苷酸或較長(zhǎng)的序列，可以是單鏈或雙鏈。具體地，這些核酸有利地由質(zhì)粒、載體、附加體、表達(dá)盒等構(gòu)成。這些脫氧核糖核酸可以帶有在其靶細(xì)胞中有功能或否的復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因、轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的調(diào)節(jié)序列、有治療意義的目的基因、修飾或未修飾的反義序列、其他細(xì)胞組分連接區(qū)等。
優(yōu)選地，該核酸包括一個(gè)表達(dá)盒，它由靶細(xì)胞中有活性的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子控制下的一個(gè)或多個(gè)具有治療意義的目的基因構(gòu)成。
在本發(fā)明的意義上，具有治療意義的目的基因應(yīng)當(dāng)特別地理解是編碼具有治療作用的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的任何基因。如此編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)品具體地可以是蛋白質(zhì)或肽。這種蛋白質(zhì)產(chǎn)品對(duì)靶細(xì)胞可以是同源性外源的或內(nèi)源的，即當(dāng)靶細(xì)胞沒(méi)有任何疾病時(shí)在該細(xì)胞中正常被表達(dá)的產(chǎn)物。在這種情況下，蛋白質(zhì)表達(dá)例如可緩解該細(xì)胞中表達(dá)不充分，或由于修飾而失活的或低活性蛋白的表達(dá)，或能夠過(guò)表達(dá)所述的蛋白質(zhì)。具有治療意義的目的基因還可編碼穩(wěn)定性提高的、活性改變的細(xì)胞蛋白突變體。蛋白產(chǎn)品對(duì)靶細(xì)胞還可以是異源的。在這種情況下，表達(dá)的蛋白例如可以補(bǔ)充或提供細(xì)胞中的缺失活性，使它能夠抵御疾病，或刺激免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明意義上的治療產(chǎn)品中，更具體地可以列舉酶、血液衍生物、激素、淋巴因子白介素、干擾素、TNF等(FR 92/03120)、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)或它們的前體或合成酶、營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、HARP/多效營(yíng)養(yǎng)因子等)、原脂蛋白(ApoAI、ApoAIV、ApoE等，F(xiàn)R93/05125)、肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白或小肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(FR 91/11947)、與先天性粘液稠厚癥相關(guān)的CFTR蛋白質(zhì)、腫瘤抑制基因(p53，Rb，RaplA，DCC，k-rev等，F(xiàn)R93/04745)、編碼凝血相關(guān)因子的基因(因子VII、VIII、IX)、參與DNA修復(fù)的基因、自殺基因(胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶)、血紅蛋白或其他蛋白載體的基因、代謝酶、分解代謝酶等。
具有治療意義的核酸還可能是一種反義基因或序列，其在靶細(xì)胞中的表達(dá)能夠控制基因表達(dá)或細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄。根據(jù)在專(zhuān)利EP 140 308中描述的技術(shù)，這樣一些序列例如能夠在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成細(xì)胞mRNA的互補(bǔ)RNA，并因此阻斷其轉(zhuǎn)譯成蛋白。治療基因還包括核酶的編碼序列，它能夠選擇性地破壞靶RNA(EP 321 201)。
如上所述，核酸還可以包括一個(gè)或多個(gè)編碼能夠在人體或動(dòng)物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原性肽的基因。在這種特定的實(shí)施方式下，本發(fā)明可用于制備疫苗，或者用于人或動(dòng)物的免疫治療，特別是抗微生物、病毒或癌的免疫治療。特別涉及EB病毒、HIV病毒、B型肝炎病毒(EP185 573)、假狂犬病病毒、“合胞體形成病毒”、其他病毒的特定抗原性肽，或特定的腫瘤抗原性肽(EP 259 212)。
優(yōu)選地，核酸還含有支持具有治療意義的目的基因和/或編碼抗原性肽的基因在所希望的細(xì)胞或器官中表達(dá)的序列。當(dāng)它們?cè)诒晦D(zhuǎn)染細(xì)胞中能夠發(fā)生作用時(shí)，可能涉及天然地負(fù)責(zé)表達(dá)所考慮基因的序列。還可能涉及不同來(lái)源的序列(負(fù)責(zé)表達(dá)其他蛋白，或甚至合成的序列)。具體地，可能涉及真核生物或病毒基因的啟動(dòng)子序列。例如，可能涉及來(lái)自希望轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組的啟動(dòng)子序列。同樣地，可能涉及來(lái)自病毒基因組的啟動(dòng)子序列。在這方面例如可以列舉E1A、MLP、CMV、RSV等基因的啟動(dòng)子。另外，這些表達(dá)序列可以通過(guò)加入激活、調(diào)節(jié)等序列修飾。還可能涉及可誘導(dǎo)或可阻抑性啟動(dòng)子。
另外，核酸特別在具有治療意義的目的基因上游還可能包括一種引導(dǎo)合成的治療產(chǎn)品到靶細(xì)胞分泌道中的信號(hào)序列。這種信號(hào)序列可能是治療產(chǎn)品的自然信號(hào)序列，但也可能涉及任何其他的功能信號(hào)序列，或人工的信號(hào)序列。該核酸還可能包括將合成的治療產(chǎn)品引向特定胞腔的信號(hào)序列。
本發(fā)明的組合物另外還能夠與轉(zhuǎn)染劑/核酸復(fù)合物結(jié)合并能夠改善轉(zhuǎn)染能力的添加劑。在另外一種實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及含有核酸、如前面定義的轉(zhuǎn)移劑和一種或多種添加劑的組合物，該添加劑能夠與轉(zhuǎn)染劑/核酸復(fù)合物結(jié)合，并能夠改善轉(zhuǎn)染能力。
從這點(diǎn)來(lái)看，本發(fā)明組合物可以含有一種或多種中性脂類(lèi)作為添加劑。這樣一些組合物是特別有利的，轉(zhuǎn)移劑/核酸電荷比低時(shí)尤其如此。申請(qǐng)人事實(shí)上已表明加入中性脂類(lèi)能夠改善核酸脂類(lèi)顆粒的生成，還有利于顆粒滲透到細(xì)胞中，其使細(xì)胞膜不穩(wěn)定。
更優(yōu)選地，在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的中性脂類(lèi)是具有2個(gè)脂肪鏈的脂類(lèi)。特別有利地，使用在生理?xiàng)l件下兩性離子的或沒(méi)有離子電荷的天然或合成的脂類(lèi)。更具體地，它可以選自二油?；字；掖及?DOPE)、油酰基棕櫚?；字；掖及?POPE)、二-硬脂?；⒍?棕櫚?；?、二-肉豆蔻?；字；掖及芬约八鼈兊?-3次N-甲基化衍生物、磷脂?；视汀⒍；视汀⑻腔；视汀⒛X苷脂類(lèi)(具體如半乳糖腦苷脂類(lèi))、鞘脂類(lèi)(例如鞘磷脂)，或脫唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂類(lèi)(具體例如是脫唾液酸GM1與GM2)。
這些不同的脂類(lèi)可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，或者通過(guò)合成，或者通過(guò)從器官(例如腦)或卵提取得到。具體地，可以采用有機(jī)溶劑提取天然脂類(lèi)(還可參見(jiàn)Lehninger，生物化學(xué))。
最近，申請(qǐng)人證實(shí)使用一種直接或非直接地參與所述核酸凝集的化合物作為添加劑也是特別有利的(WO 96/25508)。在本發(fā)明組合物中，這種化合物的存在能夠降低轉(zhuǎn)染化合物的量，由此得到在毒理學(xué)方面有益的結(jié)果，而不會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染活性帶來(lái)任何損害。關(guān)于參與核酸凝集的化合物，應(yīng)當(dāng)定義為一種直接地或非直接地使核酸緊密化的化合物。更確切地，這種化合物或者可以在待轉(zhuǎn)染核酸中直接地起作用，或者在一種直接參與核酸凝集的附加化合物中起作用。優(yōu)選地，直接地在核酸中起作用。例如，預(yù)緊密化試劑可以是任何多陽(yáng)離子物，例如聚賴(lài)氨酸。根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，這種參與核酸凝集的緊密化劑全部或部分地由魚(yú)精蛋白、組蛋白或核仁素和/或一種它們的衍生物衍生得到。這種緊密化劑還可以全部或部分由肽結(jié)構(gòu)單元(KTPKKAKKP)和/或(ATPAKKAA)構(gòu)成，結(jié)構(gòu)單元數(shù)可以是2-10。在本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)中，這些結(jié)構(gòu)單元可以連續(xù)地或非連續(xù)地重復(fù)。也就是說(shuō)它們可以通過(guò)生物化學(xué)性質(zhì)的連接物，例如通過(guò)一種或多種氨基酸，或通過(guò)化學(xué)性質(zhì)的連接物被分隔。
在特別有利的實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物還含有能夠使核酸轉(zhuǎn)移定向的靶向元件。這種靶向元件可以是能夠使DNA轉(zhuǎn)移定向到某些細(xì)胞類(lèi)型或某些所希望的組織(腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、生血細(xì)胞)的細(xì)胞外靶向元件。還可能涉及能夠使核酸轉(zhuǎn)移定向到某些特定的細(xì)胞區(qū)(線粒體、核等)的細(xì)胞內(nèi)靶向元件。靶向元件可以與本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移劑連接，或還可以與如前面所提到的核酸連接。
在本發(fā)明范圍內(nèi)可使用的靶向元件中，可以列舉糖、肽、蛋白、寡核苷酸、脂類(lèi)、神經(jīng)介質(zhì)、激素、維生素或它們的衍生物。優(yōu)選地，涉及糖、肽或蛋白質(zhì)，如抗體或抗體片段、細(xì)胞受體配體或它們的片段、受體或受體片段等。具體地，可能涉及生長(zhǎng)因子受體的配體、細(xì)胞因子受體的配件、細(xì)胞凝集素類(lèi)受體的配體，或具有RGD序列且對(duì)如整聯(lián)蛋白之類(lèi)的粘合蛋白受體有親合性的配體。還可以列舉轉(zhuǎn)鐵蛋白、HDL和LDL的受體，或葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體。靶向元件還可以是能夠靶向于凝集素如脫唾液酸糖蛋白受體或syalydes受體的糖，像sialyde Lewis X，或?yàn)榭贵w的片段Fab、或單鏈抗體(ScFv)。最近報(bào)道了特別關(guān)系到對(duì)特定細(xì)胞的選擇性并能夠有效促進(jìn)這些細(xì)胞中的內(nèi)在化的天然或合成肽配體(Bary等，自然醫(yī)學(xué)(NatureMedicine)，2，1996，299-305)。
可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)，例如采用與憎水部分偶合，或與本發(fā)明轉(zhuǎn)移劑與核酸相互作用的部分偶合，或者與本發(fā)明轉(zhuǎn)移劑或與核酸相互作用的基團(tuán)偶合，使靶向元件與核酸脂類(lèi)復(fù)合物結(jié)合。根據(jù)優(yōu)選方式，上述相互作用可以是離子性的或共價(jià)性的。
按照另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的組合物還可以任選地含有至少一種非離子型表面活性劑，其加入量足以使核酸脂復(fù)合物顆粒的大小穩(wěn)定化。加入非離子型表面活性劑可防止形成聚集體，這使該組合物更適合于在體內(nèi)使用。加入這些表面活性劑的本發(fā)明組合物具有無(wú)毒的優(yōu)點(diǎn)。它們還具有另外的優(yōu)點(diǎn)，考慮到核酸脂復(fù)合物組合物總電荷的降低，減小了干擾其它蛋白質(zhì)的危險(xiǎn)。
表面活性劑優(yōu)選由至少一個(gè)疏水鏈段和至少一個(gè)親水鏈段組成。疏水鏈段優(yōu)選選自脂族鏈、疏水的聚氧亞烷基、亞烷基的聚酯、帶有芐基聚醚頭的聚乙二醇和膽固醇，而親水的鏈段優(yōu)選選自親水的聚氧亞烷基、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮或糖類(lèi)。這些非離子型表面活性劑在專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/FR 98/00222中曾描述過(guò)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是上述的轉(zhuǎn)移劑在轉(zhuǎn)移核酸(更一般是聚陰離子)到細(xì)胞中的用途。這樣的應(yīng)用是特別有利的，因?yàn)檫@些轉(zhuǎn)染劑在保持零或很小的細(xì)胞毒性的同時(shí)，提高了轉(zhuǎn)染效果。
對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用，例如研究基因調(diào)節(jié)、建立動(dòng)物疾病模型或在治療中，本發(fā)明的組合物可以根據(jù)局部、皮膚、口服、直腸、陰道、胃腸外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、經(jīng)皮的、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)等用藥途徑而配制。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物含有在注射劑中、具體地直接注射到所要求器官中時(shí)、或采用局部方法(在皮膚和/或粘膜上)用藥時(shí)在藥學(xué)上可接受的賦形劑。具體地可能涉及滅菌的等滲溶液，或干組合物，特別是凍干組合物，根據(jù)情況通過(guò)添加無(wú)菌水或生理血清，上述組合物能夠制成可注射溶液。注射時(shí)所使用核酸的劑量以及用藥次數(shù)可以根據(jù)不同的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，特別是根據(jù)所使用的用藥方式、涉及的疾病、待表達(dá)基因、或?qū)で蟮闹委煏r(shí)間。更具體地關(guān)于用藥方式，可能是直接注入組織中，例如注入腫瘤中或血液循環(huán)途徑中，或者處理培養(yǎng)細(xì)胞接著采用注射或移植術(shù)再植入體內(nèi)。在本發(fā)明范圍內(nèi)有關(guān)組織與血液循環(huán)途徑例如是肌肉、皮膚、腦、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心、淋巴、血液、骨、軟骨、胰、腎、膀胱、胃、腸、睪丸、卵巢、直腸、神經(jīng)系統(tǒng)、眼、腺、結(jié)締組織等。
本發(fā)明還涉及向細(xì)胞中轉(zhuǎn)移核酸的方法，該方法包括下述步驟(1)讓核酸與如前面定義的轉(zhuǎn)移劑接觸形成核酸脂復(fù)合物，和(2)讓細(xì)胞與(1)中生成的復(fù)合物接觸。
可以通過(guò)與所述的核酸脂復(fù)合物一起培養(yǎng)細(xì)胞(對(duì)于體外或離體的應(yīng)用)或通過(guò)在器官中注射復(fù)合物(對(duì)于體內(nèi)的應(yīng)用)使細(xì)胞與復(fù)合物進(jìn)行接觸。優(yōu)選地，在例如每106細(xì)胞為0.01-1000微克的核酸存在下進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于體內(nèi)用藥，例如可以使用的核酸劑量是0.01-10毫克。
在本發(fā)明的組合物還含有一種或多種如前面定義的添加劑的情況下，這一種或多種添加劑預(yù)先與本發(fā)明的脂混合或與核酸混合。
本發(fā)明因此提供一種核酸轉(zhuǎn)移、特別是治療疾病的特別有利的方法，該方法包括在體外、體內(nèi)或離體下在上述定義的條件下施用與通式(I)化合物結(jié)合的能減輕所述疾病的核酸。更具體地，這種方法可用于因缺少蛋白質(zhì)或核酸產(chǎn)品而造成的疾病，使用的核酸編碼所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，或轉(zhuǎn)錄成核酸產(chǎn)品，或構(gòu)成所述的核酸產(chǎn)品。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)移劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞方面的任何應(yīng)用。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移劑特別地可用于核酸向初級(jí)細(xì)胞中或向穩(wěn)定細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)移?？赡苌婕俺衫w維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元、星形細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)、肝細(xì)胞、造血細(xì)胞系(淋巴細(xì)胞、CD34、樹(shù)狀細(xì)胞等)、上皮細(xì)胞等，它們呈分化或多能(前體)形式。
除了前面說(shuō)明的方案外，本發(fā)明還包括由下面實(shí)施例與附圖得出的其他特征與優(yōu)點(diǎn)，而這些實(shí)施例應(yīng)認(rèn)為是說(shuō)明本發(fā)明而不限制其保護(hù)范圍。
附1/5合成化合物(1)-(5)的示意圖。
圖2/5合成化合物(5)-(8a)以及(8b)的示意圖。
圖3/5合成化合物(9)-(16)的示意圖。
圖4/5在沒(méi)有血清存在下，通過(guò)測(cè)定HeLa細(xì)胞中的熒光素酶活性測(cè)量化合物(8a)和(8b)的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。在不同的載體nmol/DNAμg比值下進(jìn)行測(cè)定，用直方圖表示。對(duì)每種組合物也進(jìn)行了蛋白質(zhì)量的測(cè)試，在同一個(gè)圖上用實(shí)曲線表示。
圖5/5在沒(méi)有血清存在下，通過(guò)測(cè)量NIH 3T3細(xì)胞中的熒光素酶活性來(lái)測(cè)定化合物(8a)和(8b)的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。在不同的載體nmol/DNAμg比值下進(jìn)行測(cè)定，用直方圖表示。
材料和方法—高效液相色譜純化是用Waters LC 4000型設(shè)備在Vydac C4柱子上用乙腈在水中的梯度溶液洗脫進(jìn)行的。
—激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為260nm和590nm，在Perkin ElmerLS50B上進(jìn)行熒光測(cè)定。激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度調(diào)節(jié)到5nm。在加入最終濃度5μg/mL的溴化乙錠后記錄熒光值。
在Bruker MSL 300設(shè)備上，在氘化氯仿中記錄核磁共振波譜，對(duì)質(zhì)子是在330.13MHz，對(duì)碳是在75.47MHz。
實(shí)施例實(shí)施例1由6-芐氧基-吡喃半乳糖甲甙合成轉(zhuǎn)移劑(8a)在

圖1/5和2/5上顯示出反應(yīng)的不同步驟。
a)合成6-芐氧基-2，3，4-三-O-(2’-羧基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙(2)將28.4g(0.1mol)6-芐氧基-β-D-吡喃半乳糖甲甙(1)溶解在400mL四氫呋喃中，并且在攪拌下在0℃放置。加入32g(5.7當(dāng)量)研細(xì)的氫氧化鉀、0.5g(2％)的18-Cr-6冠醚和32.5mL(1.5當(dāng)量)溴代乙酸乙酯。兩小時(shí)以后，蒸發(fā)至干，重新溶解在水中，用2N鹽酸中和得到的溶液。用二氯甲烷萃取，得到32g產(chǎn)物(2)(收率70％)。
13C NMRδ，172.94；136.87；127.93；127.41；98.89；97.22；78.74；76.17；72.97；69.52；67.93；65.39；54.75。
b)合成6-芐氧基-2，3，4-三-O-(2’-羥基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙(3)將30g(0.065mol)前面的三酸(2)溶解于400mL四氫呋喃中，在氮?dú)庀掠?℃放置。在攪拌下滴加40mL硼烷-甲硫醚。在環(huán)境溫度下再攪拌2小時(shí)，然后仔細(xì)加入過(guò)量甲醇。然后蒸發(fā)溶液至干，再多次將得到的固體溶解于甲醇中。在硅膠柱上用乙酸乙酯洗脫進(jìn)行提純，如此得到24.5g最終產(chǎn)物(3)(收率90％)。
c)合成6-芐氧基-2，3，4-三-O-(2’-疊氮基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙(4)將在前面步驟中得到的20g(0.048mol)三醇溶解于500mL四氫呋喃中。加入40g(3.2當(dāng)量)三苯基膦、160mL(3.7當(dāng)量)1.1M的疊氮酸甲苯溶液，然后加入24.2mL(3.2當(dāng)量)偶氮二羧酸二乙酯。1小時(shí)以后，蒸發(fā)溶液，在硅膠柱上用庚烷/乙酸乙酯(6∶4)洗脫進(jìn)行提純，如此得到17.6g產(chǎn)物(4)(收率90％)。
13C NMRδ，128.47；127.80；98.23；79.05；76.27；73.55；71.92；70.15；69.95；68.77；68.14；55.37；51.41；51.11；50.87。
d)合成2，3，4-三-O-(2’-氨基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙三鹽酸鹽(5)將15g(0.03mol)疊氮化合物(4)溶解于200mL乙醇中。加入7.5mL12N的鹽酸，然后在碳載鈀存在下用氫處理3小時(shí)。過(guò)濾后，蒸發(fā)溶劑，將得到的殘?jiān)?12.6g，收率95％)直接用在下一步。
e)合成2，3，4-三-O-(2’-叔丁氧羰基氨基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙(6)將12g(0.028mol)鹽酸鹽(5)溶解于100mL二氧六環(huán)和85mL1N氫氧化鈉的混合物中。加入18.7g(3.3當(dāng)量)二碳酸二叔丁基酯，在環(huán)境溫度下攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)，然后用二氯甲烷萃取(3次50mL)。合并有機(jī)相，然后在硫酸鈉上干燥并蒸發(fā)。如此得到15.56g(收率90％)殘?jiān)?6)，用乙酸乙酯在硅膠柱上提純。
f)合成6-二(十八烷基)氨基琥珀酰-2，3，4-三-O-(2’-叔丁氧羰基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙(7a)將10g(0.016mol)前面的產(chǎn)物(6)溶解于300mL二氯甲烷中。相繼加入14.6g(1.5當(dāng)量)二(十八烷基)氨基琥珀酸、1.95g(1當(dāng)量)二甲氨基吡啶和6.5g(2當(dāng)量)二環(huán)己基碳化二亞胺。通過(guò)二(十八烷基)胺和琥珀酸酐反應(yīng)得到二(十八烷基)氨基琥珀酸。在一夜以后，仔細(xì)加入10mL(1.7g)草酸的甲醇溶液，將其攪拌1小時(shí)(放出一氧化碳)。過(guò)濾溶液，蒸發(fā)至干，在硅膠柱上用庚烷/乙酸乙酯(7∶3)溶液洗脫提純所得產(chǎn)物。如此得到12.8g產(chǎn)物(7a)(收率65％)。
g)合成6-二(十八烷基)氨基琥珀酰-2，3，4-三-O-(2’-氨基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙三(三氟醋酸)鹽(8a)
將10g(0.008mol)產(chǎn)物(7a)溶解于20mL的90％三氟醋酸中。半小時(shí)以后，蒸發(fā)溶液，再每次用20mL甲苯處理3次。用高效液相色譜(RP4；水/乙腈；0→100％；20min)提純所得殘?jiān)?8a)。如此得到9.7g產(chǎn)物(8a)(收率95％)。
MH+＝1304。
實(shí)施例2由6-芐氧基-吡喃半乳糖甲甙合成化合物(8b)反應(yīng)的不同步驟如圖1/5和2/5所示。
合成的第一段與實(shí)施例1中的步驟a)-e)相同。然后按照下面的方式繼續(xù)f)合成6-二(十八烷基)氨基鄰苯二甲酰-2，3，4-三-O-(2’-叔丁氧羰基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙(7b)按與產(chǎn)物(7a)相同的方式得到此產(chǎn)物，但是用二(十八烷基)氨基鄰苯二甲酸代替二(十八烷基)氨基琥珀酸。
g)合成6-二(十八烷基)氨基鄰苯二甲酰-2，3，4-三-O-(氨基-2’-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙三(三氟醋酸)鹽(8b)按照與產(chǎn)物(8a)相同的方式，由上一步得到的產(chǎn)物(7b)得到化合物(8b)。
MH+＝1317實(shí)施例3由三乙?；┨呛铣赊D(zhuǎn)移劑(16)a)合成鄰苯二甲酰亞胺基丙基-4，6-二-O-乙?；?2，3-二脫氧-β-D-赤己-2-烯吡喃糖苷(10)不同的反應(yīng)步驟顯示在圖3/5上。
將13.17g(0.048mol)的三乙酰基-D-己烯糖(9)溶解于250mL二氯甲烷中。加入11g(1.1當(dāng)量)鄰苯二甲酰胺基丙醇和1.56mL(0.26當(dāng)量)三氟化硼醚溶液。在環(huán)境溫度下1小時(shí)以后，用飽和碳酸氫鈉溶液中和該混合物，傾析、干燥和蒸發(fā)溶液。如此得到16g產(chǎn)物(10)(收率80％)，在硅膠柱上用庚烷/乙酸乙酯(5∶5)洗脫提純。
b)合成鄰苯二甲酰亞胺基丙基-4，6-二-O-乙?；?2，3-二脫氧-β-D-赤己-2-烯吡喃葡糖苷(11)將16g糖苷(10)溶解于200mL乙醇中。加入0.16g的10％碳載鈀，用氫處理2小時(shí)。過(guò)濾以后，蒸發(fā)溶液。如此得到15.78g產(chǎn)物(11)(收率99％)。
c)合成鄰苯二甲酰亞胺基丙基-2，3-二脫氧-β-D-吡喃葡糖苷(12)將15g(0.036mol)前面的產(chǎn)物(11)溶解于250mL甲醇中，然后加入3.5mL(0.1當(dāng)量)1N的甲醇鈉。2小時(shí)以后，用amberliteIR120樹(shù)脂中和。過(guò)濾和蒸發(fā)以后，得到11.5g產(chǎn)物(12)(收率96％)。
d)合成鄰苯二甲酰亞胺基丙基-4，6-二疊氮基-2，3，4，6-四脫氧-β-D-吡喃葡糖苷(13)將11g(0.033mol)脫乙?；漠a(chǎn)物(12)溶解于250mL四氫呋喃中。在攪拌下相繼加入21.5g(2.5當(dāng)量)三苯基膦和110.5mL(3.7當(dāng)量)1.1M的疊氮酸的甲苯溶液。以保持混合物的溫度不超過(guò)30℃的速度加入12.88g(2.5當(dāng)量)偶氮二羧酸二乙酯。1小時(shí)以后，蒸發(fā)溶液至于，在硅膠柱上用庚烷/乙酸乙酯(8∶2)洗脫提純所得產(chǎn)物。如此得到7.2g產(chǎn)物(13)(收率57％)。
e)合成氨基丙基-4，6-二疊氮基-2，3，4，6-四脫氧-β-D-吡喃葡糖苷(14)將7g(0.018mol)產(chǎn)物(13)溶解于500mL乙醇中，然后加入2.6mL水合肼，在40℃攪拌2小時(shí)。蒸發(fā)以后，再溶解于二氯甲烷中，讓形成的鄰苯二甲酰肼結(jié)晶。過(guò)濾和蒸發(fā)溶液。如此得到4.17g產(chǎn)物(14)(收率90％)。
f)合成(膽甾烯基-O-甲酰氨基丙基)-4，6-二疊氮基-2，3，4，6-四脫氧-β-D-吡喃葡糖苷(15)將6.34g(0.9當(dāng)量)氯甲酸膽固醇酯和4g(0.016mol)產(chǎn)物(14)溶解于200mL乙醚中。立即形成沉淀，這時(shí)加入50mL1N的氫氧化鈉。幾分鐘后，溶液重新變得清澈透明。再攪拌30min，然后傾析，用50mL水洗滌兩次，將溶液蒸發(fā)至干。如此得到9.4g產(chǎn)物(15)，在硅膠柱上用庚烷/乙酸乙酯(6∶4)洗脫提純(收率90％)。
g)合成(膽甾烯基-O-甲酰氨基丙基)-4，6-二氨基-2，3，4，6-四脫氧-β-D-吡喃葡糖苷(16)將9g(0.013mol)二疊氮化合物(15)溶解于150mL的80％四氫呋喃中，然后加入14.2g(4當(dāng)量)三苯基膦，并在50℃下加熱1小時(shí)。在冷卻以后，放到陰離子樹(shù)脂IRC-50 COOH柱上，用80％的四氫呋喃洗滌。然后用四氫呋喃/水/醋酸(64∶16∶10)的混合物洗脫呈醋酸鹽形式的產(chǎn)物。如此得到8.9g產(chǎn)物(16)(收率90％)。
13C NMRδ，176.55；156.65；139.84；132.02；128.46；125.46；122.44；97.11；74.28；56.66；56.12；50.02；43.70；42.30；39.51；38.57；36.98；36.55；36.16；35.76；31.87；30.30；29.89；28.18；23.82；22.78；22.53；21.03；19.31；18.70；11.84。
實(shí)施例4合成化合物(17)a)合成(5-O-乙?；?6-乙酰氧基甲基-5，6-二氫-2H-吡喃-2-基氧)乙酸芐基酯將2.8g(0.01mol)的三乙?；?D-己烯糖和1.6mL(1.1eq.)乙醇酸芐酯(1.1當(dāng)量)溶解于80mL氯仿中。在冰浴中冷卻并加入0.651mL(0.5當(dāng)量)三氟化硼醚溶液。45分鐘以后，用飽和碳酸氫鈉水溶液中和，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。在硅膠柱上用庚烷/乙酸乙酯(6∶4)混合物洗脫進(jìn)行層析純化。收率96％。
b)合成(5-O-乙?；?6-乙酰氧基甲基-四氫吡喃-2-基氧)乙酸在大氣壓和環(huán)境溫度下，在0.35g的10％碳載鈀存在下，將3.5g(0.0093mol)前面的產(chǎn)物加氫10小時(shí)。在硅藻土上過(guò)濾，濃縮并在硅膠柱上用乙酸乙酯洗脫進(jìn)行層析提純。收率90％。
c)合成N，N-二(十八烷基)-(5-O-乙酰基-6-乙酰氧基甲基-四氫吡喃-2-基氧)乙酰胺將0.675g(0.0017mol)前面的產(chǎn)物溶解于8.6mL氯仿中。加入0.9mL二異丙基乙基胺、0.899g(1當(dāng)量)二(十八烷基)胺和0.426g(1.2當(dāng)量)二環(huán)己基碳化二亞胺。在環(huán)境溫度下過(guò)夜后，濃縮并用庚烷萃取產(chǎn)物。在硅膠柱上用庚烷/乙酸乙酯(8∶2)混合物洗脫進(jìn)行層析純化。收率70％。
d)合成N，N-二(十八烷基)-(5-羥基-6-羥基甲基-四氫吡喃-2-基氧)乙酰胺將1.57g(0.00198mol)前面的產(chǎn)物溶解于10mL甲醇中。加入0.197mL(0.2當(dāng)量，2M甲醇溶液)甲醇鈉。在環(huán)境溫度下2小時(shí)以后，中和并濃縮。在硅膠柱上用庚烷/乙酸乙酯(8∶2)洗脫進(jìn)行層析純化。收率92％。
e)合成N，N-二(十八烷基)-(5-疊氮基-6-疊氮基甲基-四氫吡喃-2-基氧)乙酰胺(17)將0.6g(0.00087mol)前面的產(chǎn)物溶解于15mL四氫呋喃中。加入0.48g(2.1當(dāng)量)三苯基膦，然后再加入0.288mL(2.1當(dāng)量)DEAD。當(dāng)放熱反應(yīng)終止時(shí)，加入1.588mL(2.5當(dāng)量)的1.38M疊氮酸甲苯溶液。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，濃縮并再用庚烷處理，過(guò)濾并濃縮。然后在硅膠柱上用庚烷/乙酸乙酯(8∶2)混合物洗脫進(jìn)行層析純化。收率72％。
13C NMRδ，173.21；172.07；162.22；161.77；118.34；114.49；110.65；108.34；96.88；65.18；64.50；48.27；46.54；40.69；35.86；31.78；30.94；28.63；27.56；26.92；22.54；21.84；13.94。
實(shí)施例5本發(fā)明的轉(zhuǎn)染劑8(a)和8(b)與DNA的結(jié)合此實(shí)施例說(shuō)明在本發(fā)明轉(zhuǎn)染劑和DNA之間結(jié)合的性質(zhì)以及復(fù)合物的形成。
將本發(fā)明的轉(zhuǎn)染劑溶解于水中成為10mM的濃度。如此得到的溶液是透明的，相當(dāng)于陽(yáng)離子脂類(lèi)微團(tuán)的結(jié)構(gòu)。
按照6nmol轉(zhuǎn)染劑/μgDNA的比值制備轉(zhuǎn)染劑/DNA復(fù)合物。
轉(zhuǎn)染劑8(b)與DNA結(jié)合得到的復(fù)合物尺寸等于92nm±27nm，在水中的熒光為7％，在300mM的氯化鈉中的熒光為60％。
與DNA結(jié)合的本發(fā)明轉(zhuǎn)染劑8(a)能夠形成尺寸約98nm±20nm的復(fù)合物，在水中的熒光為6％，在300mM的氯化鈉中的熒光為55％。
這些結(jié)果表明，本發(fā)明的轉(zhuǎn)染劑能夠與DNA相結(jié)合，形成平均直徑大約100nm的顆粒，此尺寸特別適合于通過(guò)細(xì)胞膜。實(shí)際上，在300mM時(shí)，50％以上的DNA仍然與本發(fā)明的轉(zhuǎn)染劑結(jié)合。
實(shí)施例6用本發(fā)明的轉(zhuǎn)染劑8(a)和8(b)進(jìn)行DNA的體外轉(zhuǎn)染在不同的載體量/μgDNA下，在體外評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染的效果。
為此實(shí)驗(yàn)使用的遺傳材料是由質(zhì)粒pGL2-基本載體[Promega]，通過(guò)插入含有從pcDNA3[Invitrogen]質(zhì)粒提取的人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的Mlu I-Hind III片段，從而得到的包含“熒光素酶”報(bào)道基因的pCMV-Luc質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
還使用了在生理血清(0.15M的氯化鈉溶液)中稀釋到40μg/mL的核酸溶液。
將本發(fā)明中描述的產(chǎn)品溶解于水中，濃度為80μM-800μM，與DNA溶液等體積混合。最終的鹽水濃度為75mM，以即時(shí)制備細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑溶液。
為了進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在適當(dāng)?shù)臈l件下，在24孔(2cm2/孔)微板上培養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期，達(dá)到50-70％的匯合。
用500μL的不含有血清蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞在無(wú)血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。將50μL細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑混合物[1μgDNA/孔]加入到細(xì)胞中[3孔/對(duì)照載體DNA]。在轉(zhuǎn)染2小時(shí)后，用適當(dāng)數(shù)量的血清補(bǔ)充生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，通過(guò)按照Promega試劑盒[熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)]所推薦的使用說(shuō)明測(cè)定熒光素酶的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染的效果。通過(guò)測(cè)定在細(xì)胞中溶解物中的蛋白質(zhì)濃度來(lái)估計(jì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑混合物的毒性。
在圖4/5中匯集了對(duì)于HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染所得到的結(jié)果，在圖5/5中顯示了在NIH3T3細(xì)胞中所得到的結(jié)果。
由這兩個(gè)圖以及對(duì)于載體/DNA比值大于20nmol/μgDNA所得到的結(jié)果(未顯示)可以推斷出，當(dāng)載體/DNA比值為2-20nmol載體/μgDNA時(shí)轉(zhuǎn)染特別有效。
現(xiàn)有的結(jié)果表明，對(duì)于使用的兩種細(xì)胞，比值為4-12nmol載體/μgDNA，更優(yōu)選比值8-12nmol/μgDNA下轉(zhuǎn)染的效果最佳。
另外還證實(shí)，無(wú)論對(duì)于哪種細(xì)胞，產(chǎn)物8(a)和8(b)的顯示載體劑量效果的直方圖是可疊合的。
對(duì)于NIH 3T3細(xì)胞，在所研究的載體劑量下，本發(fā)明的兩種產(chǎn)物都是無(wú)毒的。實(shí)際上，只有對(duì)于劑量超過(guò)8nmol載體/轉(zhuǎn)染細(xì)胞樣本時(shí)，才觀察到最大20％的細(xì)胞蛋白質(zhì)損失。
權(quán)利要求
1.含有至少一個(gè)陽(yáng)離子親水區(qū)和一個(gè)親脂區(qū)的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，所述陽(yáng)離子親水區(qū)由至少一個(gè)被氨基取代的5原子或6原子雜環(huán)組成。
2.按照權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，該陽(yáng)離子親水區(qū)，即所述轉(zhuǎn)染劑的合成中間體具有(I)的通式
其中—y是0或1的整數(shù)，不同的y彼此是獨(dú)立的，—X表示氧、氮、硫或硒原子，—Z基團(tuán)彼此獨(dú)立地表示·氫原子·基團(tuán)OR，其中R表示氫原子、甲基或基團(tuán)(CH2)n-NR1R2，這其中n是選自1-6(含)的整數(shù)，R1和R2彼此獨(dú)立地表示氫原子或基團(tuán)(CH2)q-NH2，q可以在1-6(含)間變化，不同的q是彼此獨(dú)立的，·基團(tuán)(CH2)m-NR1R2，其中m是選自0-6(含)的整數(shù)，R1和R2如前面所定義，以及·可以連接陽(yáng)離子親水區(qū)和脂區(qū)的“間隔基團(tuán)”，條件是，至少一個(gè)取代基Z帶有氨基。
3.按照權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，在通式(I)中的基團(tuán)(CH2)n-NR1R2中，n是選自2、3和4的整數(shù)。
4.按照權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，陽(yáng)離子親水區(qū)由吡喃糖或呋喃糖形式的糖苷組成。
5.按照權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，在通式(I)中，在環(huán)上的y等于1，而X是氧原子。
6.按照權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)染劑，其特征還在于，至少一個(gè)基團(tuán)Z帶有氨基。
7.按照權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)染劑，其特征還在于，至少兩個(gè)基團(tuán)Z帶有氨基。
8.按照權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)染劑，其特征還在于，有兩個(gè)基團(tuán)Z是氫原子，另外兩個(gè)基團(tuán)Z是含氮的基團(tuán)，特別是氨基，最后一個(gè)基團(tuán)Z表示基團(tuán)OR，這里R如權(quán)利要求2中所定義。
9.按照權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，基團(tuán)OR在通式(I)雜環(huán)的2-位上。
10.按照權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)染劑，其特征還在于，至少兩個(gè)基團(tuán)Z是O-(CH2)2-NH2，至少一個(gè)基團(tuán)Z表示OR，R如權(quán)利要求2所定義。
11.按照權(quán)利要求1或2的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，該陽(yáng)離子親水區(qū)，即轉(zhuǎn)染劑合成的中間體選自
12.按照權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，該親脂區(qū)由一個(gè)或多個(gè)飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的、任選鹵代的脂族鏈和/或由類(lèi)固醇衍生物組成。
13.按照權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，所述的脂族鏈含有10-22個(gè)碳原子，特別含有14、16、17、18和/或19個(gè)碳原子。
14.按照權(quán)利要求12或13的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，所述脂族鏈選自-(CH2)13-CH3、-(CH2)15-CH3、-(CH2)16-CH3、-(CH2)17-CH3和-(CH2)18-CH3。
15.按照權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，類(lèi)固醇衍生物選自膽固醇、膽甾烷醇、3-α-5-環(huán)-5-α-膽甾烷-6-β-醇、膽酸、甲酸膽固醇酯、甲酸膽甾烷醇酯、甲酸3α，5-環(huán)-5α-膽甾烷-6β-醇酯、膽甾烯基胺、6-(1，5-二甲基己基)-3a，5a-二甲基-十六氫環(huán)戊二烯并[a]環(huán)丙[2，3]環(huán)戊二烯并[1，2-f]萘-10-基胺，或者膽甾烷基胺。
16.按照權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，親脂區(qū)通過(guò)一個(gè)由含有可水解官能團(tuán)的酸基團(tuán)或含氨基基團(tuán)組成的“間隔基團(tuán)”與親水區(qū)相連。
17.按照權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，該“間隔基團(tuán)”含有一個(gè)或多個(gè)脂族鏈或芳香鏈，還包括一個(gè)或多個(gè)選自酰胺、酯、醚、氨基甲酸酯和芳香環(huán)的基團(tuán)。
18.按照權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，該“間隔基團(tuán)”選自-O-CO-(CH2)x-COOH、-O-(CH2)x-COOH、-O-CO-(CH2)x-NH2、-O-(CH2)x-NH2、-NH-(CH2)x-NH2，這里x表示選自1-6(含)的整數(shù)。
19.按照權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)染劑，其特征在于，其代表是如下結(jié)構(gòu)式的化合物(16)、(17)、(8a)或(8b)
20.制備按照權(quán)利要求1-19之一的轉(zhuǎn)染劑的方法，其特征在于，通過(guò)“間隔基團(tuán)”將親脂區(qū)與通式(I)的雜環(huán)偶合。
21.組合物，其特征在于，它含有如權(quán)利要求1-19之一所述的轉(zhuǎn)染劑和至少一種核酸。
22.按照權(quán)利要求21的組合物，其特征在于，轉(zhuǎn)染劑/核酸的比值為0.1-50nmol轉(zhuǎn)染劑/μgDNA。
23.按照權(quán)利要求21的組合物，其特征在于，它還含有一種或多種添加劑。
24.按照權(quán)利要求23的組合物，其特征在于，所述添加劑是中性的脂類(lèi)。
25.按照權(quán)利要求23的組合物，其特征在于，所述添加劑是直接或間接參與核酸聚集的化合物。
26.按照權(quán)利要求21-25之一的組合物，其特征在于，該組合物含有可以用于可注射制劑的可藥用載體。
27.按照權(quán)利要求21-25之一的組合物，其特征在于，該組合物含有可用于皮膚和/或粘膜施用的可藥用載體。
28.按照權(quán)利要求1-19之一的轉(zhuǎn)染劑在將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的應(yīng)用。
29.轉(zhuǎn)移核酸到細(xì)胞中的方法，其特征在于，該方法包括如下的步驟(1)將核酸與如權(quán)利要求1-19之一所定義的轉(zhuǎn)染劑和必要時(shí)的一種或多種添加劑接觸，形成核酸脂復(fù)合物，以及(2)讓細(xì)胞與在(1)中形成的復(fù)合物接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類(lèi)新的陽(yáng)離子核酸轉(zhuǎn)染劑,其特征在于,該轉(zhuǎn)染劑含有至少一個(gè)與陽(yáng)離子親水區(qū)相連的親脂區(qū),所述陽(yáng)離子親水區(qū)由一個(gè)被氨基取代的5原子或6原子雜環(huán)組成。
文檔編號(hào)A61K47/16GK1259134SQ98805799
公開(kāi)日2000年7月5日 申請(qǐng)日期1998年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月6日
發(fā)明者M·比索德斯, D·謝爾曼, J·赫斯克維斯 申請(qǐng)人:羅納-布朗克羅萊爾股份有限公司