專利名稱：乳鐵蛋白在治療過敏原誘發(fā)疾病中的應用的制作方法
背景技術：
本發(fā)明涉及用于治療在對過敏原應答中與不適當或過度免疫反應有關的疾病(包括炎癥性皮膚反應、哮喘和關節(jié)炎)的藥物組合物和方法。
背景技術：
乳鐵蛋白是80千道爾噸(kD)的鐵結合糖蛋白，在牛奶里的濃度高，在其它分泌物和體液里的濃度較低。它是許多鐵結合蛋白中的一種，稱為轉鐵蛋白，涉及哺乳動物的鐵結合和輸送。Montreuil和Mullet，1960，C.R.Acad.Sci.Paris2501736-1737；Montreuil等，1960，Biochem.Biophys.Acta 45413-421；Johansson，1960，Acta Chem.Scand.14510-512，Blanc和Isliker，1961，Bull.Soc.Chim.Biol.43929-943；Masson和Heremans，1967，Protides Biol.Fluids Proc.Colloq.21115-124；QuerinJenn等，1971，Eur.J.Biochem.20420-425；Leger等，1977，Biol.Anim.Biochim.Biophys.17737-747。
乳鐵蛋白最初發(fā)現(xiàn)于奶中，在初乳中它可達到7克/升水平。但是，自此以后，在許多其它體液里，包括眼淚、唾液和粘膜分泌物和在多形核白細胞的次級顆粒中也可檢測到。Biserte等，1963，Exp.Ann.Biochim.Med.2585-120；Masson，1970，inLa Lactoferrine，93-165頁，Arscia，Bruxelles.這樣，該蛋白主要由腺體上皮細胞和與局部和中樞免疫防御相關的中性白細胞表達。
乳鐵蛋白由于其良好的抗微生物活性，已顯示在宿主防御機制上起重要的作用。乳鐵蛋白的抗微生物作用看來至少部分是通過沒收微生物生長所必須的鐵這一乳鐵蛋白的鐵結合性質的緣故。
業(yè)已顯示，乳鐵蛋白的產生是由脂多糖(LPS)誘導的，脂多糖是細菌細胞壁的組分。Gutteberg等，1990，Scan.J.Clin.Lab.Invest.5042l-427。有成堆的證據(jù)顯示，除了抗微生物活性外，乳鐵蛋白可影響先天性和適應性免疫過程，包括自然殺細胞功能，參與炎癥過程，補體激活和影響細胞因子(cytokine)的產生。Lash等，1983，Blood 61885-888；Mansson等，1990，Ann.Rheum.Dis.49594-597；Van Snick等，1974，J.Exp.Med.1401068-1084。對于后者，現(xiàn)已在體外和體內證明，乳鐵蛋白會減少全身腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產生(Machnicki等，1993，Int.J.Exp.Path.74433-439)，TNF-α是一種在炎癥、膿毒血癥和內毒素休克中起重要作用的細胞因子(Beutler等，1985，Science229869-871；Tracey等，1987，Curr.Opinion Immunol.1454-461；Waage等，1989，J.Exp.Med.169333-338；Kunkel等，1989，Crit.Rev.Immunol.993-117)。
但是，以前的研究致力于調節(jié)LPS激發(fā)的TNF-α生成。Machnicki等，1993，Int.J.Exp.Path.74433-439；Gutteberg等，1990，APMIS 981027-1032；和Gutteberg等，1991，APMIS 99602-608。由于已知乳鐵蛋白與LPS直接結合，所觀察到的TNF-α減少是否歸因于該細胞因子本身轉錄或轉錄后的調節(jié)，或歸因于在LPS存在下由于直接與此內毒素結合并使之滅活導致乳鐵蛋白減少，這尚未確定。Ellison和Giehl，1991，J.Clin.Invest.881080-1091；Appelmelk等，1994，Infect.Immunity 622628-2632。以前尚未證明過乳鐵蛋白的過敏原誘發(fā)作用。由于該原因，尚未進行實驗來檢驗同源重組乳鐵蛋白影響誘導TNF-α-依賴性生物學反應的能力，此反應中刺激TNF-α的表達不依賴于LPS。
cDNA編碼的乳鐵蛋白和其重組制備方法如下列專利所述美國專利5,571,896，5,571,697和5,571,691。美國專利申請08/453,703、08/456,106，(1995年5月30日提交)和08/691,123，(1996年8月1日提交)都揭示以融合產物來生產乳鐵蛋白的方法。此外，美國專利08/391986(1995年2月21日提交)揭示了用乳鐵蛋白來調節(jié)或中和肝素活性，還有，美國專利08/866,544(1997年5月30日提交)揭示了乳鐵蛋白的突變體和其變異體。前述專利和申請全文納入本文作參考。
發(fā)明綜述乳鐵蛋白抑制了過敏原依賴性炎癥反應的誘發(fā)。本發(fā)明顯示，乳鐵蛋白可抑制并非由內毒素(即細菌細胞壁的脂多糖(LPS)組分)誘發(fā)的TNF-α依賴的反應。乳鐵蛋白是一種活性化合物，用于治療用過敏原因素引發(fā)的局部免疫反應而導致的各種炎癥疾病。
本發(fā)明一個方面的特征是提供抑制局部炎癥反應的組合物。該組合物包括乳鐵蛋白和藥學上可接受的載體。這些組合物可替換地包括，或另外還可包括對局部誘導的TNF-α-依賴的炎癥有所需抑制活性的、乳鐵蛋白的功能性類似物或功能性片段。
另一個方面本發(fā)明提供了治療哺乳動物以局部免疫反應為特征的疾病的方法，該方法是給予有效量的包含乳鐵蛋白和藥學上可接受載體的組合物。用于本發(fā)明治療方法的組合物可替換地包括，或另外包括對局部誘導的TNF-α依賴的炎癥有抑制活性的、乳鐵蛋白的功能性類似物或功能性片段。
本發(fā)明的組合物和方法可用來治療各種局部免疫反應導致的病癥。這類病癥包括諸如接觸性過敏皮炎、牛皮癬、UV-誘發(fā)的炎癥、嬰兒尿布濕疹、肺炎和痤瘡等皮膚發(fā)炎疾病。
此外，本發(fā)明的組合物和方法可用作抗皺紋美容液中的補充劑，以消除羥基酸的發(fā)炎副作用，羥基酸是這類美容產品里最常用的活性組分。
最后，本發(fā)明組合物和方法可用來治療涉及局部免疫反應導致的發(fā)炎的其它病癥。這類病癥包括，但不限于，哮喘和關節(jié)炎。
附圖簡述

圖1A顯示了導致局部免疫反應和炎癥的皮膚中的細胞遷移的級聯(lián)反應圖。
圖1B顯示了上皮郎格爾漢斯細胞和角質化細胞產生的細胞因子的相互作用，這引發(fā)了皮膚的局部免疫反應。
圖2顯示了新生小鼠皮膚里乳鐵蛋白與產生TNF-α的角質化細胞上它的受體的結合。頂部兩圖顯示只用標記乳鐵蛋白得到的黑白圖像。底部兩圖顯示在過量未標記乳鐵蛋白的存在下進行結合試驗時的黑白圖像。
圖3A顯示皮內給予乳鐵蛋白抑制了由噁唑酮誘發(fā)的，而不是由注射TNF-α而刺激誘導的樹突細胞在引流淋巴結里的積聚。
圖3B顯示了皮內給予乳鐵蛋白抑制了噁唑酮和IL-1-β誘發(fā)的樹突細胞在引流淋巴結里的積聚。
圖4顯示了乳鐵蛋白對TNF-α和IL-1β誘導的郎格爾漢斯細胞遷移的影響。
圖5提供了從兩個獨立實驗(圖A和B)得到的結果，它表示，用噁唑酮治療誘導了經0.02％BSA預處理小鼠的樹突細胞在引流淋巴結里的積聚(參見圖A和B的第2條圖與條圖1的對比)。在兩個實驗中局部給予小鼠乳鐵蛋白導致強烈抑制了對噁唑酮反應而致的淋巴結中樹突細胞的積聚(參見圖A和B的條圖3)。結果表明，局部給予乳鐵蛋白能極有效地抑制因對過敏原反應而致的樹突細胞在淋巴結里的積聚，并因此抑制了過敏原誘導的皮膚炎癥。
發(fā)明詳述通過乳鐵蛋白調節(jié)腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產生本發(fā)明基于以下出乎意料的發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白和其類似物和衍生物，包括截短的分子、生物活性片段和含有取代和缺失的突變蛋白質，能抑制內毒素(LPS)獨立途徑產生TNF-α所引起的各種反應。
炎癥疾病常常是局部免疫反應的結果，例如暴露于化學品(包括外源和內源產生的化學品或過敏原)而致，或由自身免疫反應引起。這類炎癥反應是由于定居在表皮里的免疫性“郎格爾漢斯”細胞捕獲抗原而引起的。一旦捕獲抗原，郎格爾漢斯細胞經歷成熟或分化過程，使它們離開表皮并如成熟的樹突細胞(DC)那樣遷移，經皮膚的真皮向下進入淋巴系統(tǒng)。它們然后可通過淋巴系統(tǒng)進入引流的淋巴結，在那兒它們向T-淋巴細胞提呈位于其細胞表面上的加工過的抗原。Kimber和Cumberbatch，1992，毒理學應用藥學(Toxicol.Appl.Pharmacol.)117137-146。參見圖1A?；罨腡-細胞可能通過觸發(fā)復雜的免疫反應進行應答，這導致炎癥性白細胞侵入皮膚而引起局部炎癥反應。
因此，局部免疫反應，例如皮膚免疫反應，需要(1)識別和捕獲抗原，這通過郎格爾漢斯細胞成熟和樹突細胞向淋巴結遷移來完成；(2)通過抗原提呈，樹突細胞活化了淋巴結里的T-細胞；和(3)接著刺激炎癥性白細胞集結于皮膚。
這些過程的每一個都依賴于一種或多種調節(jié)參與免疫酸的細胞功能的細胞因子。
引發(fā)炎癥反應(如皮膚炎癥級聯(lián)反應)的細胞因子是由表皮的角質化細胞和郎格爾漢斯細胞所產生。如圖1B所示，郎格爾漢斯細胞定居于表皮中靠近角質化細胞。
由化學過敏原誘導的郎格爾漢斯細胞遷移和隨后的樹突細胞在引流淋巴結里的積聚依賴于局部有無TNF-α，TNF-α是一種表皮中由角質化細胞對皮膚致敏或其它形式皮膚創(chuàng)傷起反應時所產生的細胞因子。Cumberbatch和Kimber，1992，免疫學(Immunology)75257-263；Cumberbatch等，1994，免疫學81395-401；Cumberbatch和Kimber，1995，免疫學8431-35。全身給予中和性抗TNF-α抗體幾乎可完全抑制由諸如噁唑酮等化學品誘導的郎格爾漢斯細胞遷移的刺激和樹突細胞積聚。Cumberbatch和Kimber，1995，同上。皮內給予均質的重組TNF-α本身足以誘導郎格爾漢斯細胞從皮膚遷移并導致樹突細胞在引流淋巴結里的數(shù)量增加。Cumberbatch和Kimber 1992，同上；Cumberbatch等，1994，同上。
如圖3A和實施例2和3所示，皮內給予乳鐵蛋白和其功能性類似物和功能性片段抑制了由噁唑酮誘導，但不是由注射TNF-α刺激的樹突細胞在引流淋巴結里的積聚。這些數(shù)據(jù)與乳鐵蛋白的負調節(jié)角質化細胞產生TNF-α相一致，已知角度質細胞在皮膚致敏后受到刺激而產生TNF-α。
前已證明，刺激郎格爾漢斯細胞遷移和樹突細胞積聚也依賴于局部有無另一個表皮細胞因子，白介素1β(IL-1β)。Enk等，1993，免疫學雜志(J.Immunol.)1503698-3704。該細胞因子在鼠表皮里由郎格爾漢斯細胞少量產生，其表達上調是皮膚致敏的進一步結果。Enk和Katz，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.891398；Enk和Katz，1992，皮膚學研究雜志(J.Invest.Dermatol.)99S39-S41。全身給予中和性抗-IL-1β抗體抑制了郎格爾漢斯細胞的遷移和樹突細胞的積聚。Enk等，1993，同上。
因此，很顯然，郎格爾漢斯細胞的有效遷移依賴于得到IL-1β和角質化細胞的從頭合成TNF-α。前述工作提供的進一步證據(jù)顯示皮內單獨給予IL-1β會誘導郎格爾漢斯細胞的遷移。參見圖3B和實施例2和3。
乳鐵蛋白抑制了噁唑酮誘導的和IL-1β誘導的樹突細胞在引流淋巴結里的積聚。這樣，乳鐵蛋白削弱了IL-1β誘導的，但不是TNF-α誘導的樹突細胞的積聚(參見圖3A)。這顯示，在細胞因子級聯(lián)反應引起的局部免疫反應里，乳鐵蛋白的抑制作用是在IL-1β的下游和在TNF-α的上游。
還有，本文顯示了乳鐵蛋白能與角質化細胞上的受體結合，這表明乳鐵蛋白與角質化細胞結合可防止TNF-α的產生。特別是，圖2顯示，乳鐵蛋白能與新生小鼠皮膚里產生TNF-α的角質化細胞上的受體結合。乳鐵蛋白的這種結合主要在表皮層和汗腺里，但不在正常的表皮細胞里。
本文公開的實驗結果顯示，乳鐵蛋白對郎格爾漢斯細胞遷移和樹突細胞積聚的抑制作用是由于對TNF-α產生的負調節(jié)，而不是通過對郎格爾漢斯細胞功能其它方面的影響。這樣，乳鐵蛋白能通過與角質化細胞上的受體結合來抑制TNF-α的從頭合成。
兩葉結構的演變賦予了乳鐵蛋白以獨特的鐵結合性質和分子的其它生物功能。根據(jù)這些結構域的鑒定，美國專利申請08/866,544(1997年5月30日提交)描述了乳鐵蛋白多肽中賦予該蛋白質鐵結合性質的序列和結構，(所揭示的內容納入本文作參考)。該申請?zhí)峁┝嗽O計和生產新穎的有修飾的鐵結合能力的乳鐵蛋白變體或它的部分的指導方法。典型的是，乳鐵蛋白變體具有改進的性質，包括，但不限于，對鐵具有較高親和力以改善抗微生物活性的乳鐵蛋白變體、對鐵具有較低親和力并具有改善的鐵釋放性能的乳鐵蛋白變體，或是具有修飾的pH或溫度要求或結合和/或釋放鐵的范圍的乳鐵蛋白變體。同樣，用于本發(fā)明方法的乳鐵蛋白典型地具有增加的對白介素活性的抑制，如IL-1β證明的那樣。另外，本發(fā)明可設計具有其它改進特性，(如治療耐受性、免疫反應性或生物半衰期)但保留其生物活性的乳鐵蛋白變體。
本發(fā)明的乳鐵蛋白變體可以衍生自各種哺乳動物的野生型乳鐵蛋白，包括，但不限于人、小鼠、大鼠、牛和豬的乳鐵蛋白?？赏ㄟ^本領域公知的方法使野生型乳鐵蛋白突變。參見Sambrook等，1990，分子克隆(Molecular Cloning)；實驗室手冊(A Laboratory Manual).Cold Spring Harbour實驗室出版社出版，美國紐約；Kunkel等，1987，Meth.Enzymol.154367-382；Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-42。
在一個優(yōu)選的實施方案里，本發(fā)明乳鐵蛋白變體包括氨基酸序列里的至少一個突變。在另一個優(yōu)選的實施方案里，本發(fā)明的乳鐵蛋白包括截短的氨基酸序列。
在適合于真核細胞表達的載體中可以插入本發(fā)明的編碼乳鐵蛋白和其變體的核酸序列，所有的方式是允許乳鐵蛋白變體表達?；蛘?，可將本發(fā)明乳鐵蛋白變體部分的編碼核酸插入能讓其在真核細胞里表達的載體中。
在另一個優(yōu)選的實施方案里，乳鐵蛋白在重組表達系統(tǒng)里產生。參見，如Ward等，1992，生物技術(Biotechnology)10784-789；Ward等，1995，生物技術13498-503。為了此目的，將所需形式乳鐵蛋白的編碼核酸(參見，如美國專利5,571,691，全文納入供參考)表達性摻入一個細胞宿主中，然后在適合表達特定肽或蛋白質的條件下培養(yǎng)。各種基因表達系統(tǒng)適合用于該目的，典型的是由所選宿主自然使用表達控制來驅動所需基因的表達。
因為本發(fā)明乳鐵蛋白變體如同自然產生的乳鐵蛋白，需要翻譯后的修飾，如在數(shù)個氨基酸殘基處的糖基化，所以許多乳鐵蛋白變體或其部分需要在真核細胞宿主里生產。在優(yōu)選的實施方案里，如Ward等，1992，基因(Gene)122219-223；和美國專利5,571,896和5,571,697所述，乳鐵蛋白產物可通過曲霉菌(Aspergillus)表達系統(tǒng)產生，本文將其全文納入作為參考。
但是，若要產生的乳鐵蛋白變體或其部分是非糖基化形式，它們的生產可方便地在諸如大腸桿菌等細菌宿主里進行。為了這種生產，可將所選乳鐵蛋白變體或其部分的編碼核酸置于表達控制(元件)下，如大腸桿菌的lac，trp或PL基因下。
作為乳鐵蛋白變體或其部分編碼核酸表達的另外方式，可用宿主來表達作為融合蛋白的乳鐵蛋白產物，在融合蛋白中乳鐵蛋白可釋放性地連接于載體蛋白上，這樣有利于表達產物的分離和穩(wěn)定性。
在另一方法中，乳鐵蛋白變體或其部分可通過有機合成產生。特別是其中無乳鐵蛋白(alactoferrin)變體部分，如長度約20-50個氨基酸的肽。的產生可用已建立的自動肽合成技術，如J.M.Stewart和J.D.Yong，固相肽合成(Solid Phase PeptideSynthesis)，第2版，1984，Pierce Chemical Company，Rockford(美國伊利諾斯)；和M.Bodanszky和A.Bodanszky，肽合成實踐(The Practice of PeptideSynthesis)，1984，Springer-Verlag，美國紐約；實用生物系統(tǒng)430A使用手冊(AppliedBiosystems 430A Users Manual)，1987。ABI Inc.，F(xiàn)oster Cty(美國加利福尼亞)；和固相肽合成，實用方法(Solid Phase Peptide Synthesis.A practical Approach)，E.Atherton & R.C.Sheppard，IRL出版社，牛津(1989)。在這些技術中，乳鐵蛋白變體部分自其C-末端、樹脂偶聯(lián)的殘基開始通過依次加入適當保護的氨基酸用Fmox或tBox方案而生長獲得。
含乳鐵蛋白的藥物組合物乳鐵蛋白和乳鐵蛋白產品。本文的術語“乳鐵蛋白”指乳鐵蛋白的天然或重組形式，除非特定指出，它們是指哺乳動物的形式。本文的術語“乳鐵蛋白產品”指乳鐵蛋白和可用于本發(fā)明的其功能類似物和功能片段。特別是，該術語涵蓋了截短的乳鐵蛋白和具有一個或多個氨基酸被取代或缺失的乳鐵蛋白。乳鐵蛋白的“功能類似物和功能片段”分別指乳鐵蛋白的突變體和衍生物，和乳鐵蛋白衍生的肽，它們能抑制細胞產生TNF-α。一般來說，本發(fā)明涵蓋的乳鐵蛋白、功能性乳鐵蛋白類似物和功能性片段能抑制涉及產生TNF-α的不合適的或過度的局部免疫反應。
乳鐵蛋白類似物或乳鐵蛋白衍生肽可通過實施例2描述的小鼠模型來測試鑒定是否為功能性的類似物或功能性的片段。參見Cumberbatch和Kimber，1992，免疫學(Immunology)75257-263。簡言之，該試驗涉及通過給予過敏原，如在剃毛小鼠皮膚上涂以噁唑酮，來誘導局部免疫反應。一小時后，在噁唑酮處理過的部位皮內注射約0.002％-0.5％以鹽水配的待測乳鐵蛋白類似物或片段。第二組和第三組動物分別注射相同濃度范圍和以相同緩沖液配的乳鐵蛋白和BSA。約12小時后，處死動物，回收引流淋巴結。比較聚集的樹突細胞的數(shù)量，可按Cumberbatch和Kimber(同上)所描述的方法來測定，顯示乳鐵蛋白類似物或片段的效能和它們作為本發(fā)明組合物和方法的應用。
一般來說對乳鐵蛋白的任何取代、加成或刪除不會破壞其受體介導的抑制TNF-α產生的作用，如同不合適或過度的免疫反應可用于本發(fā)明。本領域技術人員可不經過多的實驗進行這類取代、加成和刪除。在優(yōu)選的實施方案中，功能性乳鐵蛋白類似物或功能片段基本上與天然人體乳鐵蛋白一樣有效。在最佳實施方案里，功能性乳鐵蛋白類似物或功能片段與天然人體乳鐵蛋白相比具有增加的TNF-α下調活性。例如，這類功能類似物或功能片段顯示出增加的血清穩(wěn)定性、增加的受體結合和增加的信號傳導活性。對可用于本發(fā)明的乳鐵蛋白以及功能性乳鐵蛋白類似物和功能性片段的修飾是使該分子更易為炎癥部位生物利用的修飾。例如，當局部外用給予乳鐵蛋白產品時，功能性乳鐵蛋白類似物或功能片段也許會顯示增加的經皮吸收。
本發(fā)明特定的乳鐵蛋白產物可通過各種生產蛋白質產品公知的方法來制備。這些天然形式的乳鐵蛋白可通過從天然來源，如哺乳動物奶，最佳的是人奶、用適當聯(lián)合的蛋白質分離技術提取得到。例如，如Cheron等，1977，C.R.Acd.Sci.法國巴黎284585-588，乳鐵蛋白分離可通過順次提取和用Sephadex G-25、G-50、G-75和G-100純化得到。
作為提取以外的另一方法，只摻入L-氨基酸的這些形式的乳鐵蛋白可通過使用重組DNA技術重現(xiàn)地和以市售數(shù)量生產出來。參見，如Ward等，1992，生物技術(Biotechnology)10784-789；Ward等，1995，生物技術13498-503。為了實現(xiàn)此目的，可將所需形式乳鐵蛋白的編碼核酸(參見美國專利5,571,691，全文納入本文作參考)可表達性地摻入一細胞宿主中，然后在適合特定肽或蛋白質表達的條件下培養(yǎng)。各種基因表達系統(tǒng)適合于該目的，并且通常由所選定的宿主自然使用的表達控制元件驅動所需基因的表達。
由于乳鐵蛋白的天然形式需要翻譯后的修飾，例如在數(shù)個氨基酸殘基處的糖基化，本發(fā)明的許多乳鐵蛋白、其功能性類似物或功能性片段需要在真核細胞宿主里生產，在優(yōu)選的實施方案里乳鐵蛋白產物可由曲霉菌表達系統(tǒng)產生，如Ward等，1992，基因(Gene)122219-223；和美國專利5,571,896和5,571,697所描述的那樣，其全文納入本文作為參考。
然而，如果使用乳鐵蛋白的非糖基化形式其功能性類似物或功能性片段，可在細菌宿主，如大腸桿菌里方便地得到這些產品。對于這類產品，可將編碼所選定的乳鐵蛋白、其功能性類似物或功能性片段的核酸置于大腸桿菌的lac，trp或PL基因的表達控制之下。
作為表達核酸編碼的乳鐵蛋白、功能性類似物或其功能性片段本身的另一種方案，可采用能以融合蛋白形式表達乳鐵蛋白的宿主，在融合蛋白中乳鐵蛋白產物與一載體蛋白可釋放地連接在一起，這樣有利于表達產物的分離和穩(wěn)定性。
另一個方案是，乳鐵蛋白可通過有機合成產生，特別是當乳鐵蛋白是功能性片段，如長度20-50個氨基酸的肽，可使用已建立的自動肽合成技術。肽合成的示范性闡述可參見，如J.M.Stewart和J.D.Yong，固相肽合成(Solid Phase PeptideSynthesis)，第2版，1984，Pierce Chemical Company，Rockford(美國伊利諾斯)；和M.Bodanszky和A.Bodanszky，肽合成實踐(The Practice of PeptideSynthesis)，1984，Spriuger-Verlng，美國紐約；實用生物系統(tǒng)430A使用者手冊(Applied Biosystems 430A Users Manual)，1987，ABI Inc.，F(xiàn)oster City.美國加利福尼亞；和E.Atherton & R.C.Sheppard固相肽合成-實用方法(Solid Phase PeptideSynthesis-A Practical Approach)，IRL出版社，牛津(1989)。在這些技術中，乳鐵蛋白片段可從其C-末端、樹脂偶聯(lián)的殘基開始通過依次加入適當保護的氨基酸，用Fmoc或tBoc方案而生長獲得。
另一個方法，用于本發(fā)明方法和組合物的功能性乳鐵蛋白片段可通過肽酶酶消化或純化的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白產物的水解得到。當然，乳鐵蛋白片段也可通過在前述合適的宿主里重組表達來產生。本發(fā)明也涵蓋化學修飾的乳鐵蛋白產物，包括甲基化、羧基化等產物的應用。
藥物制劑和給藥途徑。對于治療應用，本發(fā)明的乳鐵蛋白產物可通過任何可得到的常規(guī)手段，如單一治療劑或治療劑組合來給予。每種可單獨給予，但通常與選定的給藥途徑和標準藥學實踐中選擇的藥物載體一起給藥。本發(fā)明的藥物組合物適合于口服、非胃腸道給藥、局部外用或直腸給藥，或作為吸入劑，可以是單位劑量形式，藥學領域技術人員公知的方式給予。非胃腸道給藥包括，但不限于，皮下注射、靜脈注射、腹腔內注射或肌注。
用此活性組分治療可在所治病癥，如牛皮癬、接觸性皮炎、UN-誘發(fā)的炎癥、嬰兒尿布濕疹、哮喘、關節(jié)炎等被診斷出來后的任何時間開始。較好的是，治療為預防性的或在疾病的早期進行以防止在第一地點發(fā)生廣泛的炎癥。典型的是，治療將持續(xù)到炎癥被治愈。對于慢性疾病，如牛皮癬、哮喘或關節(jié)炎，或對持續(xù)暴露于過敏原的情況，治療可能必須延長到癥狀治愈之后。由于乳鐵蛋白是天然的非毒性蛋白，預計即使長期治療也不會發(fā)生副作用。
給予的劑量當然根據(jù)已知的因素而變化，如(1)特定乳鐵蛋白產品的藥物動力學特征和其給藥模式和途徑，(2)接受者的年齡、健康、高度和體重，(3)癥狀的性質和程度，(4)共同治療的種類，(5)治療的頻度和(6)所需的效果，而定?；钚越M分的每日劑量預計可為約1毫克/千克體重-1.2克/千克體重，較佳的劑量是50-500毫克/千克體重。當該活性成分局部外用于皮膚或作為吸入劑時，通常是用0.005％到約5％活性成分與載體一起，較佳的是約0.05％到約0.5％活性組分與載體混合使用。
每單位劑型(適合給藥的組合物)含大約0.005％到約0.5％活性成分。在這些藥物組合物里，活性成分通常占組合物總重量的大約0.5-95％。
典型的是，此活性成分可局部外用給予，作為吸入劑或在發(fā)炎的關節(jié)或軟骨里注射。然而另外，乳鐵蛋白產物可口服給藥，以固體或半固體劑量形式，如硬膠囊或軟明膠膠囊，片劑或粉末劑，或為液體劑型，如酏劑、糖漿劑或懸浮劑。也可非胃腸道給藥，以無菌液體劑型。其它劑型可為潛在可能的劑型，如貼膏劑或軟膏劑或透皮給藥。
本發(fā)明的乳鐵蛋白也可配制成緩釋植入裝置以延長和緩慢地給予乳鐵蛋白產物。這類緩釋制劑的例子包括生物相容聚合物，如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-羥乙酸)、甲基纖維素、透明質酸、膠原蛋白等的復合物。在一些出版刊物里，包括A.Domb等，Polymers for Advanced Technologies 3279-292(1992)揭示了在藥物輸送運載體中可降解聚合物的結構、選擇和使用。在M.Chasin和R.Langer(編輯)”生物可降解的聚合物作為藥物輸送系統(tǒng)(Biodegradable Polymers as DrugDelivery Systems”)“Drug and the Pharmaceutical Sciences”第45卷，A.Dekker，美國紐約1990，等文獻可找到藥物配制中聚合物的選擇和使用指南。脂質體也可用于乳鐵蛋白產物的緩釋。如何使用和制備藥物的脂質體制劑的詳情可參見美國專利4,944,948；美國專利5,008,050；4,921,706；4,927,637；4,452,747；4,016,100；4,311,712；4,370,349；4,372,949；4,529,561；5,009,956；4,725,442；4,737,323；4,920,016。當需要乳鐵蛋白高濃度局部給予時，緩釋制劑尤為有用。
明膠膠囊或液體填充的軟明膠膠囊可含活性組分和粉末化或液體載體，如乳糖、卵磷脂淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等。相似的賦形劑可用來制備壓制片劑。片劑和膠囊均可制備成緩釋產品以在一段時間里持續(xù)釋放藥物。壓制片劑可為糖包衣或膜包衣以掩蓋令人不愉快的味道并將片劑與大氣隔開，或為腸包衣以選擇性地在胃腸道里崩解?？诜囊后w劑型可含有著色劑和/或調味劑以增加病人的接受程度。
Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，美國賓夕法尼亞(1990)-一本該領域標準的參考書，進一步描述了合適的藥物載體，其全文納人本文作為參考。
在優(yōu)選的實施方案中，包含乳鐵蛋白產物的藥物組合物可局部外用給藥以治療過敏性皮膚疾病，作為吸入劑治療諸如哮喘等肺部炎癥疾病，以鼻噴霧劑治療鼻炎和鼻竇炎，或以注射劑型治療關節(jié)炎。除了乳鐵蛋白產物外，這些組合物可包含其它活性成分，包括，但不限于，氫化可的松、維生素A酸或用于局部治療的常規(guī)輔劑。下面闡述給予本發(fā)明乳鐵蛋白的優(yōu)選的藥劑局部外用制劑若需要治療皮膚炎癥，優(yōu)選的給藥途徑通常是局部外用給藥。由于乳鐵蛋白(例如)通過汗腺分泌(Masson等，1966，Clin.Chem.Axta 14735-739)，當局部外用給予時，乳鐵蛋白產物通常可望進入皮膚的孔。到達其作用部位的活性物質的利用度會因皮膚表面損傷伴發(fā)炎癥而進一步減少?；蛘?，制劑中可加入增加皮膚滲透的物質。
一般來說，對于局部外用給藥，乳鐵蛋白可通過本領域公知的方法以藥物上可接受的形式配制成溶液、凝膠、洗劑、軟膏劑、霜劑、懸浮劑、糊劑、涂敷藥、粉末、酊劑、氣溶膠、透皮藥物輸送系統(tǒng)等。制備局部外用制劑的實際方法是本領域技術人員公知的，在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，MackPublishing Company，美國賓夕法尼亞(1990)；和Pharmaceutaicl Dosage Forms andDrug Delivery Systems，第6版，Williams & Wilkins(1995)中有詳細描述。
為了增加活性組分的透皮吸收，許多藥劑可加入局部外用制劑中，包括，但不限于二甲亞砜、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、表面活性劑、azone、醇丙酮、丙二醇和聚乙二醇。另外，物理方法，如離子電滲療法或聲波傳遞法(sonophoresis)，也可用來增加透皮滲透。
藥物組合物可直接用于皮膚。或者，它們可通過各種透皮藥物輸送系統(tǒng)，如貼膏劑來輸送。
吸入劑的配制特別用來治療肺部炎癥疾病，如哮喘和支氣管炎的含乳鐵蛋白的組合物典型的是作為吸入劑給藥。
一般來說，乳鐵蛋白可用常規(guī)吸入劑給藥。乳鐵蛋白可單獨使用，或與其它吸入氣溶膠共同給藥，包括，但不限于，β-腎上腺素能激動劑，如舒喘寧吸入氣溶膠、salmeterol xinafoate吸入氣溶膠、硫酸叔丁喘寧吸入氣溶膠；腎上腺皮質甾族化合物，如倍他米松二丙酸酯吸入氣溶膠；抗哮喘、抗過敏或肥大細胞穩(wěn)定劑，如色甘酸鈉吸入氣溶膠；抗炎氣溶膠，如去炎松醋酸酯局部氣溶膠；抗膽堿能藥，如，溴化異丙托品吸入氣溶膠；或擬交感物質，如甲磺酸乙基異丙腎上腺素吸入氣溶膠和硫酸異丙喘寧吸入氣溶膠。Ansel等的藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng)(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，Williams & Wilkins，美國賓夕法尼亞(1995)提供了另外的指導供參考。
噴霧劑的配制特別用于治療鼻炎、鼻竇炎和曬傷，含乳鐵蛋白的組合物典型地以噴霧劑形式給藥。
一般來說，可用諸如市售的常規(guī)噴霧裝置給予乳鐵蛋白產物。乳鐵蛋白可單獨給藥，或與其它物質共同給藥，包括，但不限于，抗組胺藥、擬交感藥和抗菌素。此外，乳鐵蛋白可以在含藥的氣霧中，如氯化鈉鼻溶液(Salinex溶液(Muro))或鹽酸丁芐唑啉鼻溶液(Sine-Off(SmithKline Beecham))或功能性類似物氣霧給藥。藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng)(同上)提供了另外的指導供參考。
注射劑的配制對于特地用于治療關節(jié)炎和蜂窩織炎，包含乳鐵蛋白的組合物可通過注射給藥，如局部注入患病的關節(jié)或軟骨，或全身注射。
一般來說，水、油、鹽水、右旋糖酐(葡萄糖)水溶液、聚山梨酸酯和有關的糖溶液和諸如丙二醇或聚乙二醇的多元醇適合作為非胃腸道給藥溶液的載體。非胃腸道給藥的溶液或乳劑宜含大約5-15％聚山梨酸酯80或卵磷脂，合適的穩(wěn)定劑和需要時的緩沖物質?？寡趸瘎?，但不限于，氫硫化鈉、硫化鈉或抗壞血酸單獨或組合使用，是合適的穩(wěn)定劑。也可使用檸檬酸和其鹽和EDTA鈉。另外，非胃腸道給藥溶液可含防腐劑，包括，但不限于，氯化苯甲烴銨、對羥基苯甲酸甲酯或丙酯和氯丁醇。
Remington藥物科學(同上)描述了供非胃腸道給藥的其它合適的藥物載體。
適應癥如上所述，TNF-α在各種急性和慢性炎癥疾病的發(fā)病機理和/或進程里起重要作用。結果，設計可用于治療的TNF-α產生的合成的抑制劑引起了人們相當?shù)呐d趣。本文引用的證據(jù)表明，乳鐵蛋白產物提供了調節(jié)TNF-α產生的手段。從這些資料里衍生得到的乳鐵蛋白的潛在治療用途有很多，包括，但不限于，治療下列所討論的需要治療的哺乳動物，特別是人體的炎癥。
接觸性皮炎接觸性皮炎是由于接觸環(huán)境里的物質導致的濕疹性皮炎。這些物質是刺激劑或過敏原，可能引起急性、亞急性或慢性濕疹性炎癥。刺激性接觸性皮炎，即對皮膚的刺激是接觸性皮炎最常見的形式。當接觸是持續(xù)性時，溫和的刺激劑會引起干燥、裂縫和紅斑。例如，諸如手部、尿布區(qū)域等部分連續(xù)地暴露于濕氣導致的嬰兒尿布濕疹或結腸造口周圍皮膚會最后導致紅斑炎癥。強的化學品會產生即刻的反應。參見T.P.Habif，臨床皮膚學(Clinical Dermatology)，Mosby，Missouri(1996)和醫(yī)學手冊(The Textbook of Medicine)，編輯J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司，美國費城(1985)。
過敏性接觸皮炎與刺激性接觸皮炎相反，它是一種遲發(fā)型過敏反應，影響到數(shù)量有限的個體這些人在一次或數(shù)次接觸對他們具有抗原活性的物質后發(fā)病。
刺激性和過敏性接觸皮炎二者據(jù)信由局部免疫級聯(lián)反應所引起，涉及到角質化細胞里TNF-α的從頭表達的，其解釋同上。
目前的治療方法和它們的缺點。急性接觸性皮炎目前用冷濕敷，同時給予類固醇，如氫可的松、去氫氫化可的松、甲基去氫氫化的可松，嚴重病例是氟代皮質類固醇，它們在極低濃度下是強效抗炎劑。比氟代類固醇、氫可的松、去氫氫化可的松和甲基去氫氫化可的松的效力更小的藥物用于較不嚴重的病例。根據(jù)炎癥的嚴重程度，類固醇局部外用給藥或全身給藥。
但是，已報道類固醇，特別是強效的氟代類固醇，有許多副作用。例如，上皮和真皮萎縮是一個可預見的副作用，減少膠原蛋白折合成和血管基質支持減少會導致毛細管擴張、紫癜和條紋。也已報道口周皮炎與氟代類固醇有關，還有臉部紅斑的加劇，這絕對地限制了這些化合物擴大用于臉部。此外，眼內壓的可能上升堅決禁止任何類固醇在眼睛附近的長時間外用。
已認識到局部外用類固醇的全身吸收有另外的危害。皮質醇的血藥濃度可達閉合情況下身體的20％。在這些皮膚病中類固醇中斷使用后，此類危險反彈的現(xiàn)象是不能忽略的。
總之，顯然對于接觸性皮炎需要有低毒性治療方法。
本發(fā)明提供的改進的治療方法。本發(fā)明提供了包含乳鐵蛋白產物的新穎藥用組合物來治療接觸性皮炎。在一個優(yōu)選的實施方案中，所配制的組合物供局部外用。具體講，乳鐵蛋白產物可以洗劑、霜劑、膏劑等形式應用，濃度為大約0.005％-5％活性物質，在優(yōu)選的實施方案里，濃度為大約0.01％到大約0.5％活性物質。通常，組合物包括用于局部外用給藥的常規(guī)使用的輔劑。參見同上。在另一個實施方案中，組合物可配制成皮內注射劑。本發(fā)明的組合物可直接干擾角質化細胞產生TNF-α，這樣，預防了會導致刺激性和過敏性接觸皮炎的過度的局部免疫反應。由于已知乳鐵蛋白是無毒的蛋白質，因此該組合物將不會有可檢測到的副作用。
牛皮癬牛皮癬是一種慢性皮膚炎癥，它會反復發(fā)作和緩解，并影響到世界人口的1-3％。在美國，一百萬以上的人患有牛皮癬，其中多于11％的人經歷了這類嚴重的殘疾，以致危害到工作和效力。該疾病可在任何年齡發(fā)病，三十多歲達到峰值。其嚴重性、病程和緩解是不可預見的。參見，T.P.Habif，臨床皮膚學(CliniicalDermatology)，Mosby，Missouri(1996)和醫(yī)學手冊，編輯J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司，美國費城(2985)。
患有牛皮癬的病人可分為兩組，有遺傳易感性的病人和對后成因素即環(huán)境因素。反應的那些病人，最常見的形式是慢性斑塊性牛皮癬，其特征是表皮增生，真皮和表皮發(fā)炎。這些改變是由于在對未鑒定的抗原刺激反應中T-淋巴細胞活化介導了區(qū)域性淋巴結中的真皮免疫反應?；罨腡-細胞引起角質化細胞增殖，并呈現(xiàn)牛皮癬表型。在對環(huán)境刺激應答中誘發(fā)的前炎癥細胞因子蛋白引起了炎癥反應，結果炎癥性白細胞滲入真皮和表皮。
目前的治療策略和它們的缺點。牛皮癬尚不能治愈，目前的治療策略是尋求抑制該疾病的嚴重性和疾病程度的方法。身體受累＜10％病人的第一線療法是局部給予抗炎藥。美國最常用的藥物是皮質類固醇(氫化可的松和其類似物)，因為它們短時間里極為有效，費用相對低廉。例如，全身給予皮質類固醇可導致牛皮癬病損的消退，但抑制需要不斷加大劑量。當治療逐漸減少時，就有反彈現(xiàn)象，病損可能擴大到鱗片樣脫皮。如果有其它正當理由，對患牛皮癬的病人全身給予類固醇，在決定開始治療時就應當認識到和權衡牛皮癬惡化的危險。
雖然牛皮癬對治療的反應可能會引起一段時間的緩解，但重復給予會對治療的抗炎作用產生耐藥性，治療效果持續(xù)不超過數(shù)月。此外，當使用的氫化可的松劑量超過標準(1％)時，嬰孩會出現(xiàn)涉及腦垂體-腎上腺抑制的嚴重副作用。James等，1967，柳葉刀(lancet)21059-1061；Turpeinen，1991，Br.J.Dermatol.124358-360。也報告了類固醇另外的副作用，同上。
總之，確實需要有效而嚴重副作用較少的牛皮癬的治療方法。
本發(fā)明提供的改進的治療方法。我們對免疫反應在牛皮癬發(fā)病機理中所起中心作用理解的最新進展導致了我們應用免疫療法緩解該疾病的研究。具體講，業(yè)已顯示，牛皮癬是由不適當?shù)木植棵庖叻磻鸬?，該局部免疫反應涉及角質化細胞從頭生成TNF-α。Gilhar等，1996，臨床實驗免疫學(Clin.Exp.Immunol.)106134-142。因此，本發(fā)明的一個實施方案是提供組合物，它直接干擾角質化細胞生成TNF-α，從而防止不適當?shù)木植棵庖叻磻獙е屡Ｆぐ_。更具體地講，本發(fā)明提供了新穎的藥用組合物，包括用于治療牛皮癬的乳鐵蛋白產物。在一個優(yōu)選的實施方案中，組合物被配制成在約0.5％到約5％載體里局部外用。在另一個實施方案里，組合物被配制成皮內注射的形式。
如上所述，牛皮癬據(jù)信是不可治愈的疾病，因此需要長期的治療。本發(fā)明組合物與目前的治療方法相比的一個重要優(yōu)點在于，乳鐵蛋白產物是低毒的(或無毒的)。
UV-誘發(fā)的炎癥暴露于UV光是局部皮膚反應和疾病，包括皮膚曬傷性光老化和癌癥的另一個重要來源。
目前的預防性治療方法和它們的缺點。目前，通過使用具有光防護劑，如對-氨基苯甲酸，作為活性組分的防曬劑來減少光活性非離子化輻射向角質素下活的上皮細胞的滲透，即預防UV輻射的不良反應。這些光保護劑通常被設計用來防護較短波長范圍290-320納米的紫外光。防曬劑這樣對黑色素的生成產生了不完全的阻斷作用，黑色素是應對于穿透的輻射而產生，并能夠通過曬黑來部分保護皮膚。
然而，許多炎癥性皮膚反應和皮膚老化是由于長期受到320-400納米范圍(UVA)的較長射線引起的，對此通常的光保護劑不能提供保護。若需要對UVA進行保護，則需要諸如二氧化鈦或氧化鋅等物理防曬劑，它們可作為厚厚的霜劑或糊劑。但是，這些不透明的保護劑要象澄清的奶狀洗劑來防護UVA幾乎是不可能被接受的，此外，它們也不允許皮膚發(fā)生自身防護性曬黑反應，參見T.P.Habif，臨床皮膚學(Clinical Dermatology)，Mosby，Missouri(1996)和醫(yī)學手冊(TheTextbook of Medicine)編輯J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司(美國費城)(1985)。
目前的治療方法和它們的缺點。一旦發(fā)生UV-誘發(fā)的皮膚炎癥，即曬傷，通常用冷敷和空閑來治療。更嚴重的病例用強的松龍治療，它會引起嚴重的副作用，如上皮和真皮萎縮，進而是如上所述的毛細管擴張、紫癜和條紋。
簡言之，需要能預防和/或治愈UV5誘發(fā)的皮膚炎癥的物質。
本發(fā)明提供的改進的預防和治療方法。本發(fā)明提供了治療和預防UV-誘發(fā)的皮膚刺激的改進的組合物和方法。更具體說，本發(fā)明的一個實施方案提供了新穎的UV防護組合物，包括常規(guī)的防曬基質和作為添加劑的預防發(fā)炎的乳鐵蛋白。這些新穎的藥物組合物易于預防UV-誘導的皮膚炎癥，包括UVA誘發(fā)的炎癥，同時允許皮膚曬黑。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含用于治療UV-誘發(fā)的皮膚炎癥的乳鐵蛋白產物的藥物組合物。
光老化皮膚如上所述，暴露于UV光的副作用之一是皮膚老化，也稱為光老化。
目前用全反維生素A酸治療光老化皮膚的方法和它的缺點。目前，局部外用全反維生素A酸對光損傷皮膚提供了某些逆轉作用。Weiss等，1988，J.AMA259527-532。但是，大多數(shù)病人經歷了全反維生素A酸誘發(fā)的皮炎的副作用，可能持續(xù)數(shù)周到數(shù)月。參見T.P.Habif，臨床皮膚學(Clinical Dermatology)，Mosby，Missouri(1996)和醫(yī)學手冊(The Textbook of Medicine)，編輯J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司，美國費城(1985)。這樣，需要改進的產物來治療光老化皮膚。
本發(fā)明提供的改進的組合物。本發(fā)明提供了用來治療光老化皮膚的改進的組合物和方法。更具體說，在一個實施方案里，本發(fā)明提供了常規(guī)的全反維生素A酸組合物，它包括乳鐵蛋白產品作為對全反維生素A酸誘發(fā)的炎性副作用的保護劑。
抗皺產品近幾年來許多局部外用的“抗皺”美容產品已進入市場。這些產品通常由想要預防臉部皮膚老化，甚至想逆轉已發(fā)生的老化過程的個體使用，它們含有羥基酸作為活性組分。雖然這些產品似乎確實具有所需的“去皺”活性，但它們通常會引起皮膚發(fā)炎的副作用。因此，需要對目前使用的抗皺產品進行改進以減輕它們的發(fā)炎副作用。
本發(fā)明提供的改進的組合物。根據(jù)本發(fā)明，乳鐵蛋白可加到常規(guī)的抗皺霜劑、洗劑和其它產品里，作為預防羥基酸誘發(fā)的發(fā)炎副作用的添加劑。
痤瘡導致皮膚發(fā)炎或與皮膚發(fā)炎有關的另一個疾病是痤瘡，一種干擾許多人生活質量的皮膚疾病。參見T.P.Habif，臨床皮膚學(Clinical Dermatology)，Mosby，Missouri(1996)和醫(yī)學手冊(The Textbook of Medicine)編輯J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司，美國費城(1985)。
目前用全反維生素A酸治療光老化皮膚的方法和它的缺點。對于較輕的疾病，通常局部外用抗微生物制劑，如芐基過氧化物，或氯林可霉素、四環(huán)素或紅霉素。
另一種方法是，該疾病可用全身廣譜抗微生劑治療。但是，雖然局部外用療法更為有效，但這類治療方法常常不產生所需的效果，此外，它們與嚴重的副作用有關。例如，雖然四環(huán)素是常用的，但具有牙變色、光敏感的危險，甚至通過藥物與口服避孕劑的相互作用產生意料之外的懷孕。由于它們可進入生長中的骨架和牙齒，它們不可處方給予4個月的胎兒到12歲的兒童。也有可能在應激時，如懷孕時從骨頭流走，結果母親有患肝炎或胎兒吸收的危險。紅霉素是有用的，然而常常導致胃腸道問題。
更嚴重的痤瘡可能需要更廣泛的外科手術，較高劑量的抗微生物劑、病損內給予類固醇或甚至全身給予類固醇，雌激素已選用于患有嚴重的頑固痤瘡的婦女，結果良好，但作為環(huán)狀雌激素孕激素療法使用它們都停止排卵不能懷孕的附帶危險。
總之，目前治療痤瘡的方法常常不能讓病人滿意地治愈，同時也有相當嚴重的副作用。因此，需要有效低毒的療法。
本發(fā)明提供的改進的組合物。本發(fā)明提供了包含乳鐵蛋白產物的有效的組合物供治療痤瘡相關的炎病。通常，此組合物按治療接觸性皮炎所用組合物相似折方法來配制。
關節(jié)炎關節(jié)炎，即關節(jié)軟骨的發(fā)炎，與許多原因有關，已知有各種表現(xiàn)。如，關節(jié)炎可為自身免疫性疾病，或由過敏原誘發(fā)。參見醫(yī)學手冊(Textbook of Medicine)，編輯J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司，美國費城(1985)。
目前的治療方法和它們的缺點。目前，關節(jié)炎通常用皮質類固醇或其它類固醇進行全身性給藥治療。有關類固醇治療的問題如上所述。此外，目前治療關節(jié)炎的方法沒有一種能停止疾病的進程，還可能導致骨骼變形。這樣，需要改進的組合物和方法治療關節(jié)炎。
本發(fā)明提供的改進組合物。本發(fā)明提供了包含乳鐵蛋白產品的新穎的組合物，它可抑制過敏原介導的炎癥，用來治療許多形式的關節(jié)炎。此外，由于自身免疫反應的介導看來像過敏原涉及的免疫反應那樣有賴于相似的機理，即二者均是由TNF-α介導的，可以推測提供的本組合物也具有治療與自身免疫病有關關節(jié)炎的價值。在本發(fā)明的一個實施方案中，含乳鐵蛋白產物作為活性組分的組合物被直接注入患病的關節(jié)中。其它抗炎劑，如水楊酸酯可用作輔劑。在本發(fā)明的另一個實施方案里，乳鐵蛋白產物可通過注射全身給藥，或以緩釋產品的形式給藥。本發(fā)明組合物與治療關節(jié)炎已知產品相比的一個優(yōu)點是(1)有效性，直接妨礙疾病的推動力，即關節(jié)發(fā)炎，從而防止疾病加重，(2)無毒，即如上所述，已證明乳鐵蛋白產品對人體和其它哺乳動物沒有毒性。
肺部炎癥性疾病肺部炎癥疾病，如過敏性哮喘和支氣管炎是特征為氣管和支氣管對各種刺激，如過敏原的反應性增加，導致大范圍氣道狹窄的疾病。例如，哮喘是呼吸系統(tǒng)應答外部刺激的炎癥反應。在嚴重的病例中，哮喘會因缺乏氧氣供給而引起死亡，美國多達5％的人可能受此病折磨。在2到17歲年齡之間的過半病例被診斷為哮喘，在該年齡組它導致了疾病和殘疾。參見醫(yī)學手冊，編輯J.B.Wyngaarden和L.H.Smith，W.，W.B.Saundres公司，美國費城(1985)。
目前的治療方法和它們的缺點。目前的治療方法包括給予擬交感藥物，甲基黃嘌呤和皮質類固醇。擬交感藥物包括腎上腺素和異丙腎上腺素，具有β-腎上腺素能作用。它們的使用僅限于對心臟的作用，此外，重復使用后會產生耐藥性。甲基黃嘌呤據(jù)信會通過它們對細胞質酶磷酸二酯酶的作用引起平滑肌松弛，在許多病例中引起厭食、惡心、胃腸道失調和中樞神經系統(tǒng)興奮。皮質類固醇在治療哮喘中極為有效，但它們有上述嚴重的副作用。因此，需要有效同時低毒性的新穎組合物和方法治療哮喘。
本發(fā)明提供的改進的組合物。本發(fā)明提供了包含乳鐵蛋白產物的新穎的組合物和方法來治療哮喘。通常此組合物可作為吸入劑給予。另外，含乳鐵蛋白產物的組合物可通過注射或片劑、膠囊劑或緩釋劑型進行全身給藥。即使在高劑量下，本發(fā)明組合物也沒有明顯的副作用，因為乳鐵蛋白是天然、無毒的蛋白質。
下列實施例更詳盡地解釋了本發(fā)明。下列制劑和實施例使本領域技術人員能更清楚地理解和實施本發(fā)明。但本發(fā)明的范圍不為所例舉的實施方案所限定，它們只是本發(fā)明闡述的一個方面，方法是本發(fā)明范圍里的功能等價物。確實，除了本文所描述外，本領域技術人員顯然還可從前述說明和附圖里作出各種修改。這類修改也落在所附的權利要求書范圍里。
優(yōu)選的實施方案實施例1乳鐵蛋白與產生TNF-α的角質化細胞上的受體的結合下列實施例是一種原位配體-結合試驗，它顯示125I-乳鐵蛋白與新生小鼠皮膚上皮層里角質化細胞的結合。
實驗過程。從新生野生型小鼠得到大約2毫米2背部皮膚樣品，37℃用PBS簡單淋洗兩次，37℃，在0.5mlPBS/0.1％牛血清白蛋白里一式兩份培養(yǎng)，所述的PBS含有(A)1.0×108125I-乳鐵蛋白；和
(B)1.0×108125I-乳鐵蛋白加上50倍過量未標記的鐵飽和重組乳鐵蛋白。
樣品用冷的PBS/0.1％牛血清白蛋白洗滌6次，每次10分鐘，固定在4％多聚甲醛里3小時而不振搖，然后以冷的PBS淋洗兩次10分鐘。馬上冷凍樣品。樣品用于制備10μm切片，然后用濃度增加的乙醇使切片脫水。將該切片放在NTB-2乳劑里，4℃暴光7天和14天。展開后，用蘇木精染色顯影切片并用Permount固定。
乳鐵蛋白與角質化細胞結合。原位雜交實驗顯示，乳鐵蛋白在角質化細胞膜上積聚。參見，如圖2。特別是，圖2顯示了乳鐵蛋白與其在新生小鼠皮膚上產生TNF-α的角質化細胞上的受體原位結合。頂部兩圖顯示只用標記乳鐵蛋白(1.0×108125I-乳鐵蛋白)得到的黑白視野圖像。底部兩圖顯示當有過量(50倍過量)未標記乳鐵蛋白存在時進行結合試驗的黑的視野圖像。乳鐵蛋白的結合集中在上皮和毛囊里，但在正常的真皮層沒有觀察到。這些結果表明，乳鐵蛋白與其在上皮里角質化細胞表面上的受體結合。角質化細胞已知能產生TNF-α。
實施例2乳鐵蛋白對DC積聚在引流淋巴結中的影響下列實施例顯示乳鐵蛋白抑制由噁唑酮和IL-1β誘發(fā)的樹突細胞在引流淋巴結里的積聚，同時乳鐵蛋白不影響通過給予TNF-α誘發(fā)的樹突細胞的積聚。
實驗過程。各組小鼠(n＝10)在兩耳的耳郭里皮內注射30微升各懸浮在磷酸緩沖鹽水里(PBS；pH7.2)的0.02％鼠乳鐵蛋白(LF)或0.02％牛血清白蛋白(BSA)，2小時后，小鼠在同樣的位點分別接受第二次皮內注射50ng(30微升)細胞因子，即TNF-α或IL-1β(懸浮在0.1％BSA/PBS中)，或兩耳背面局部接觸25微升溶于丙酮∶橄欖油(4∶1)中的0.5％噁唑酮(Ox)。對照小鼠不作處理。引流(耳)淋巴結在不同時間取出，然后根據(jù)每次處理所誘導的DC積聚的動力學將淋巴結分別接觸TNF-α4小時，IL-1β17小時，噁唑酮18小時。隨后，如前所述對每個淋巴結的樹突細胞數(shù)進行評估。Cumberbatch和Kimber，1992，免疫學75257-263。
結果。如表1和圖3A所示，用噁唑酮處理誘導了樹突細胞在引流淋巴結里的積聚(條圖4，與條圖1對照組相比)。對噁唑酮-誘導的動物皮內給予乳鐵蛋白結果抑制了樹突細胞在引流淋巴結里的積聚達75％(噁唑酮/乳鐵蛋白13,774樹突細胞/每個淋巴結(基礎水平以上)，噁唑酮/+乳鐵蛋白3,394樹突細胞/每個淋巴結(基底水平上)，參見表I)，這表明這些動物的局部免疫反應被乳鐵蛋白所抑制。
如表I和圖3A進一步顯示，給予TNF-α誘導了引流淋巴結里樹突細胞的積聚(參見圖3A，條圖2)。圖3A，條圖3反映的結果表明，乳鐵蛋白對TNF-α誘發(fā)的局部免疫反應沒有任何影響，即給予TNF-α/-乳鐵蛋白導致4,753樹突細胞/每個淋巴結(基礎水平以上)，而給予TNF-α/+乳鐵蛋白導致4,802樹突細胞/每個淋巴結(基礎水平以上)。這些結果表明，乳鐵蛋白作用于免疫應答級聯(lián)反應中TNF-α的上游。
如表I(B)和圖3B所示，皮內給予IL-1β刺激了郎格爾漢斯細胞的遷移和樹突細胞在引流淋巴結里的積聚(圖3B，條圖1)。給予乳鐵蛋白導致免疫反應的抑制，如圖3B，條圖2所示，皮內注射乳鐵蛋白導致抑制了樹突然細胞的積聚達56％(IL-1β/-乳鐵蛋白7,569樹突細胞/每個淋巴結(基礎水平以上)，噁唑酮/+乳鐵蛋白3,342樹突細胞/每個淋巴結(基礎水平以上)，參見表I)。
這些結果表明(1)樹突細胞的積聚依賴于IL-1β水平的增加，和(2)IL-1β作用于TNF-α的上游，因為TNF-α誘發(fā)的免疫反應不受乳鐵蛋白影響。
這樣，IL-1β刺激了角質化細胞從頭合成TNF-α。此外，這些資料顯示乳鐵蛋白對郎格爾漢斯細胞遷移和樹突細胞積聚的抑制作用是由于負調節(jié)了TNF-α的產生，而不是通過影響郎格爾漢斯細胞的功能。因此，乳鐵蛋白能抑制TNF-α的從頭合成。
表1乳鐵蛋白對DC在引流淋巴結里積聚的影響<
<p>實施例3乳鐵蛋白對TNF-α-和IL-1β-誘導的郎格爾漢斯細胞遷移的影響下列實施例顯示，乳鐵蛋白抑制了IL-1β-誘導的郎格爾漢斯細胞的遷移，但它不影響TNF-α誘導的郎格爾漢斯細胞的遷移。
實驗過程。各組小鼠(n＝3)在兩耳的耳郭里皮內注射30微升各懸浮在磷酸鹽緩沖的鹽水里(PBS；pH7.2)的。0.005％鼠乳鐵蛋白(LF)或0.005％牛血清白蛋白(BSA)，2小時后，小鼠在同樣的位點分別接受第二次皮內注射50ng(30微升)細胞因子，即TNF-α或IL-1β(懸浮在0.1％BSA/PBS中)，或兩耳背面局部接觸25微升溶于丙酮∶橄欖油(4∶1)中的0.5％噁唑酮(Ox)。對照小鼠不作處理。在TNF-α處理后30分鐘或IL-1β處理后17小時取下耳朵，如前所述制備上皮片。Cumberbatch等，1994，Immunology 81395-401。用間接免疫熒光法測量郎格爾漢斯細胞(LC)的頻率。結果以4個樣品，每個樣品檢查10個視野的平均細胞數(shù)/毫米3(±SE)表示。實驗組之間差異的統(tǒng)計學意義用Student’s t-檢驗進行計算，p＜0.005。
結果。如表II和圖4所示，皮內給予IL-1β導致刺激郎格爾漢斯細胞的遷移被乳鐵蛋白所抑制。給予TNF-α也導致郎格爾漢斯細胞的遷移但不被乳鐵蛋白所抑制。
這些結果證實，在局部免疫應答級聯(lián)反應中，IL-1β作用于TNF-α的上游，乳鐵蛋白作用于IL-1β的下游，但作用于TNF-α的上游。
表 II乳鐵蛋白對TNF-α和IL-1β-誘發(fā)的郎格爾漢斯細胞遷移的影響
實施例4乳鐵蛋白對樹突細胞在引流淋巴結里積聚的影響下列實施例顯示，當局部給予乳鐵蛋白時，它能抑制由噁唑酮誘發(fā)的樹突細胞在引流淋巴結里的積聚。
實驗過程。各組小鼠(n＝6)在兩耳背部局部外用溶液溶于lubriderm洗劑的0.02％乳鐵蛋白或0.02％牛血清白蛋白(BSA)溶液。稍后，小鼠的相同位點處局部接觸25微升溶于丙酮∶橄欖油(4∶1)里的0.5％噁唑酮(Ox)溶液。對照小鼠不作經處理。在局部接觸后18小時取出引流淋巴結，如上所述評估每個淋巴結里樹突細胞的數(shù)量。Cumberbatch等，1992，Immunology 75257-263。
結果。如圖5所示，兩個獨立實驗的結果(圖A和B)表明，用噁唑酮處理誘發(fā)了樹突細胞在0.02％BSA預處理小鼠引流淋巴結里的積聚(參見圖A和B的條圖2對條圖1對照)。在兩個實驗中局部給予鼠乳鐵蛋白導致強烈抑制噁唑酮引起的樹突細胞在淋巴結里的積聚(參見圖A和B的條圖3)。
結果表明局部外用給予乳鐵蛋白能極有效地抑制對過敏原反應中樹突細胞在淋巴結里的積聚，并因此抑制了過敏原誘發(fā)的皮膚炎癥。
圖5顯示當乳鐵蛋白局部外用于皮膚表面時，乳鐵蛋白對噁唑酮引起的樹突細胞在引流淋巴結里的積聚的抑制作用。
所有說明書里引用的參考文獻都全文納入作為參考。
本文提供的實施例僅供例舉。本發(fā)明僅受所附的權利要求書的限定。
權利要求
1.一種抑制IL-1β的炎癥活性的方法，它包括給予藥學上有效量的乳鐵蛋白產品的步驟。
2.一種組合物，它包括(a)產生局部炎癥反應的治療或美容化合物，和(b)乳鐵蛋白產物。
3.根據(jù)權利要求2所述的組合物，其中化合物(a)選自全反維生素A酸、光防護劑和羥基酸。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的組合物，它還包括藥學上可接受的載體或美容載體。
5.一種治療哺乳動物的過敏原誘發(fā)的炎癥疾病的方法，它包括對哺乳動物給予治療有效量的乳鐵蛋白產品。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述的哺乳動物是人。
7.根據(jù)權利要求1、5或6任一所述的方法，其中過敏原誘發(fā)的炎癥疾病特征是TNF-α產生增加引起的局部免疫反應。
8.根據(jù)權利要求1和5-7任一所述的方法，其中乳鐵蛋白產品是天然的乳鐵蛋白。
9.根據(jù)權利要求1和5-7任一所述的方法，其中乳鐵蛋白產品是重組產生的乳鐵蛋白或其生物活性類似物。
10.根據(jù)權利要求1和5-7任一所述的方法，其中乳鐵蛋白產品是乳鐵蛋白的生物活性片段。
11.根據(jù)權利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎癥疾病選自關節(jié)炎和肺部炎癥疾病。
12.根據(jù)權利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎癥疾病是皮膚炎癥疾病。
13.根據(jù)權利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎癥疾病選自接觸性皮炎、牛皮癬、UV-誘發(fā)的炎癥、嬰孩尿布濕疹和痤瘡。
14.根據(jù)權利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中乳鐵蛋白產品以組合物形式給予，所述的組合物還包含抗皺劑，炎癥疾病是臉部皮膚衰老。
15.根據(jù)權利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎癥疾病是哮喘。
16.根據(jù)權利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎癥疾病是鼻竇炎。
17.根據(jù)權利要求1、5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎癥疾病是鼻炎。
18.根據(jù)權利要求5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎癥疾病是支氣管炎。
19.根據(jù)權利要求5、6、7、8、9和10任一所述的方法，其中炎癥疾病是支氣管炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療過敏性疾病的藥物組合物和方法,所述的過敏性疾病的特征在于包括炎癥性皮膚反應、哮喘和關節(jié)炎的局部免疫反應。
文檔編號A61K31/203GK1262625SQ98805584
公開日2000年8月9日 申請日期1998年4月10日 優(yōu)先權日1997年4月10日
發(fā)明者I·金伯, M·坎伯巴奇, R·J·迪爾曼, O·M·康萘利, P·沃德 申請人:阿吉尼克斯股份有限公司