專利名稱:改良產(chǎn)抗菌素微生物的新方法
本發(fā)明提供了一種提高產(chǎn)抗菌素微生物之產(chǎn)生抗菌素能力的新方法。該方法包括用于表達基因產(chǎn)物的DNA編碼序列轉(zhuǎn)化微生物宿主細胞-其中基因產(chǎn)物在所需的抗菌素生物合成途徑中起限速作用。本發(fā)明還提供了編碼抗菌素生物合成基因產(chǎn)物的相關(guān)DNA序列、重組DNA表達載體以及轉(zhuǎn)化的微生物宿主細胞。
本發(fā)明代表了重組DNA技術(shù)在產(chǎn)抗菌素微生物如鏈霉屬微生物中的早期的并且是很重要的商業(yè)化利用。在本發(fā)明之前，對重組DNA技術(shù)的開發(fā)和利用大部分是局限在大腸桿菌及哺乳動物細胞內(nèi)表達特定的多肽。這些進展使我們可以比較簡單地表達異源基因產(chǎn)物，如人胰島素A和B鏈、人胰島素原、人生長激素、人反應蛋白C、人組織血纖維蛋白溶酶原激活因子、牛生長激素及其它幾種有潛在應用價值之化合物。在上述各情況中，異源基因的表達或多或少都是獨立的，并且沒有作用于或參與或調(diào)節(jié)每個起作用的生物合成途徑?，F(xiàn)在，重組DNA技術(shù)已能夠用于改善選擇的生物合成途徑，以提高抗生素或抗微生物前體的表達產(chǎn)率。
應用于鏈霉菌屬及其它產(chǎn)抗菌素微生物的大多數(shù)重組DNA技術(shù)僅是限于對克隆載體的研究開發(fā)。早期的嘗試包括有Reusser在美國專利4332898號中以及Manis等人在美國專利4273875號4332900號、4338400號和4340674號所公開的方法。在這些較早的文獻中并沒有公開過有關(guān)對鏈霉屬的轉(zhuǎn)化技術(shù)。但曾公開了產(chǎn)抗生素微生物中有較大應用潛力的改良載體，如Fayerman等人在美國專利4513086號中、Nakatsukasa等人在美國專利4513085號和4416994號中公開的載體。這些改良的載體包含有在鏈霉菌中可選擇的標志、能夠用于轉(zhuǎn)化許多重要的鏈霉屬菌株，并可構(gòu)建進行更為復雜的基因克隆實驗所需要的工具。
最近由Hopwood等人(Nature，314∶642，1985)報導了一項這樣的實驗。雖然Hopwood等人報導了有關(guān)新的雜合抗菌素色素的生產(chǎn)，但除了描述自鏈霉屬菌株向其它菌株轉(zhuǎn)移放線菌紫素色素生物合成基因外，并沒有涉及增加一定的宿主細胞產(chǎn)抗菌素能力或生物合成效率的內(nèi)容。
本發(fā)明之所以特別有用，是因為它可將重組DNA技術(shù)在商業(yè)上應用于鏈霉菌及其它產(chǎn)抗菌素的微生物。又因為臨床上重要的抗菌素有一半以上是由鏈霉菌產(chǎn)生的，故特別期望開發(fā)可應用于這些微生物的方法。本發(fā)明提供了這類方法，使之可以克隆增加抗生素生產(chǎn)能力的基因以及能在產(chǎn)抗菌素微生物中生產(chǎn)新抗菌素及抗菌素前體的基因。
為使本發(fā)明公開清楚起見，茲對有關(guān)術(shù)語定義如下抗菌素-由某種微生物產(chǎn)生的物質(zhì)(可以是天然的產(chǎn)物或經(jīng)過有限化學修飾的)，可抑制或阻止其它微生物或真核細胞生長，或殺死其它微生物或真核細胞。
抗菌素生物合成基因-編碼某種酶活性的基因或編碼某種可調(diào)節(jié)酶活性之表達產(chǎn)物的DNA片段。這種酶活性對于將初級代謝物轉(zhuǎn)化為抗菌素中間體的酶促反應是必需的。這些抗菌素中間體亦可能具有抗菌素活性，且也許繼后轉(zhuǎn)變成抗菌素。
抗菌素生物合成途徑-為初級代謝物轉(zhuǎn)變?yōu)榭咕刂虚g體，并于其后再轉(zhuǎn)變?yōu)榭咕厮匦璧囊惶淄暾目咕厣锖铣苫蚣吧锘瘜W反應。
產(chǎn)抗菌素微生物-可以是任何微生物，但其中不只限于游運放線菌屬Actinoplanes、雙岐放線菌屬Actinomadura、芽孢桿菌屬Bacillus、頭孢菌屬Cephalosporium、小單孢菌屬Micromonospora、青霉屬Penicillium、諾卡氏菌屬No-cardia和鏈霉菌屬Streptomyces，其可產(chǎn)生某種抗菌素或含有編碼某種抗菌素產(chǎn)物的基因，如經(jīng)表達，即可產(chǎn)生某種抗菌素。
抗菌素抗性基因-一個DNA片段，能編碼使微生物對某種抗菌素能有抗性的活性。
ApR-氨芐青霉素抗性表型或使微生物產(chǎn)生這種抗性的基因。
宿主細胞-包含有能用某種重組DNA克隆載體轉(zhuǎn)化的活原生質(zhì)體的微生物。
NmR-新霉素抗性表型或使微生物產(chǎn)生這種抗性的基因。
抗菌素生物合成途徑的運轉(zhuǎn)-抗菌素生物合成基因的表達及能使初級代謝物轉(zhuǎn)變?yōu)榭咕厮枰挠嘘P(guān)生物化學反應。
重組DNA克隆載體-任何可選擇的并獨立復制的因素或在染色體上整合的因素，包括質(zhì)粒和噬菌體，但不限于它們。這種DNA載體分子可加入或已加入了附加的DNA。
rep-附圖中所用的符號，為鏈霉屬質(zhì)粒的復制起點。
限制性酶切片段-任何經(jīng)一種或多種限制性內(nèi)切酶的作用所產(chǎn)生的線性DNA。
敏感宿主細胞-包含活原生質(zhì)體的宿主細胞。如其中沒有對一定抗菌素有抗性的DNA片段，則這些宿主細胞在該種抗菌素存在的條件下便不能生長。
轉(zhuǎn)化體-為受體宿主細胞，其中包含有業(yè)經(jīng)轉(zhuǎn)化的活原生質(zhì)體。
轉(zhuǎn)化-將DNA導入含活原生質(zhì)體的受體宿主細胞，從而能改變受體細胞的基因型。
tsr-硫鏈絲菌肽(thiostrepton)抗性表型或使微生物產(chǎn)生這一抗性的基因。
附圖中的質(zhì)粒和染色體圖是按大致比例畫的。但泰樂菌素(ty-losin)生物合成基因則不同，雖然聯(lián)接，但散布于一大片段DNA間。因此，詳細的限制性內(nèi)切酶作用位點圖譜資料只是針對含泰樂菌素生物合成基因的大DNA片段的若干小區(qū)域的。所給基因圖沒有必要詳盡地列出某種限制性內(nèi)切酶的所有酶切點。個別基因的定位是由圖上的短線標示的，并且是通過缺失突變作圖確定的，因此某個基因的確切位置只是大致上的。
圖1-泰樂菌素生物合成途徑。
圖2-質(zhì)粒pHJL280的限制性位點和功能圖。
圖3-質(zhì)粒pHJL284的限制性位點和功能圖。
圖4-質(zhì)粒pHJL309的限制性位點和功能圖。
圖5-質(zhì)粒pHJL311的限制性位點和功能圖。
圖6-質(zhì)粒pHJL315的限制性位點和功能圖。
圖7-泰樂菌素生物合成基因的染色體組構(gòu)。
本發(fā)明提供了提高產(chǎn)抗菌素微生物之抗菌素或抗菌素前體生產(chǎn)能力的方法。其中包括培養(yǎng)那些通過生物合成途徑生產(chǎn)某種抗菌素或抗菌素前體的微生物。所說的微生物是用一種DNA克隆載體或其部分轉(zhuǎn)化，因而該載體或其部分含有一抗菌素或抗菌素前體生物合成基因，它編碼生物合成途徑之限速酶或基因產(chǎn)物的表達。在適于細胞生長的條件下，即可有抗菌素或抗菌素前體生物合成基因的表達，并產(chǎn)生抗菌素或抗菌素前體，其前提是培養(yǎng)方法可提高微生物的抗菌素生產(chǎn)能力。
本發(fā)明還提供有關(guān)抗菌素生物合成的基因、重組DNA克隆載體、以及用基因和載體轉(zhuǎn)化了的抗菌素或抗菌素前體生產(chǎn)微生物。
此外，本發(fā)明還進一步提供了一種制備抗菌素、抗菌素前體或其醫(yī)藥上可接受的鹽的方法，其中包括于需氧發(fā)酵條件下、在含有可同化的碳、氮源及無機鹽的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)能夠通過抗菌素生物合成途徑產(chǎn)生抗菌素或抗菌素前體的微生物，該微生物是用DNA克隆載體或部分載體轉(zhuǎn)化。其特征在于該DNA克隆載體或其部分載體含有一編碼抗菌素生物合成途徑之限速酶或基因產(chǎn)物表達的抗菌素生物合成基因。所說的抗菌素生物合成基因即可在能增加微生物抗菌素生產(chǎn)能力的發(fā)酵條件下得以表達。
本發(fā)明的方法可廣泛適用于所有的產(chǎn)抗菌素微生物。下列各表列出了本發(fā)明適用的大部分抗菌素生產(chǎn)菌種。
表1產(chǎn)氨基環(huán)醇抗菌素微生物微生物 抗菌素芽胞桿菌屬(Bacillus)各不相同的種 各種不同的氨基環(huán)醇小單孢菌屬(Micromonospora)各不相同的種 慶大霉素糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)各個不同的種 各種不同的氨基環(huán)醇表1(續(xù))微生物 抗菌素鏈霉屬(Streptomyces)albogriseolus 新霉素albus var.metamycinus 間霉素aquacanus N-甲基潮霉素Batrofaciens 潮霉素bikiniensis 鏈霉素bluensis var.bluensis 布獸霉素canus 核糖基巴龍胺catenulae 鎖鏈菌素chrestomyceticus 氨苷菌素crystallinus 潮霉素Berythrochromogenesvar.narutoensis 鏈霉素eurocidicus A16316-Cfradiae 潮霉素和新霉素fradiae var.italicus 氨苷菌素galbus 鏈霉素griseus 鏈霉素griseoflavus MA1267hofuensis 蘇多霉素復合物hygroscopicus 潮霉素、殺亮菌素和潮霉菌素表1(續(xù))微生物 抗菌素hygroscopicusglebosus型 土塊霉素hygroscopicus var.
limoneus 有效霉素hygroscopicus var.
sagamiensis 壯觀霉素kanamyceticus 卡那霉素A和B春雷霉素kasugaensiskasugaspinus 春雷霉素lavendulae 新霉素lividus 青紫霉素mashuensis 鏈霉素microsporeus SF-767netropsis LL-AM31noboritoensis 潮霉素olivaceus 鏈霉素olivoreticuli var.
cellulophilus 越霉素Apoolensis 鏈霉素rameus 鏈霉素ribosidificus SF733rimofaciens 越霉素表1(續(xù))微生物 抗菌素rimosus formaparomomycinus 巴龍霉素和鎖鏈霉素spectabilis 壯觀霉素tenebrarius 托伯拉霉素和阿泊拉霉素輪枝鏈霉菌屬(Streptoverticillium)flavopersicus 壯觀霉素表2產(chǎn)安沙霉素抗菌素 微生物微生物 抗菌素小單孢菌屬(Micromonospora)各不同種 各種不同的安沙霉素(Ansamycins)諾卡氏菌屬(Nocardia)mediterranei 利福霉素鏈霉屬(Streptomyces)collinus Ansatrienes和萘霉素diastochromogenes Ansatrienes和萘霉素galbus subsp.
griseosporeus 萘霉素Bhygroscopicus 草霉素(herbimycin)hygroscopicus var.
geldanus var.nova 蓋伯殺菌素表2(續(xù))微生物 抗菌素nigellus 21-羥基-25-二甲基-25-甲基硫腙曲張鏈菌素rishiriensis 枝三烯菌素(mycotrienes)sp.E/784 阿克他霉素和枝三烯菌素sp.E88 枝三烯菌素spectabilis 曲張鏈菌素tolypophorous 多利霉素表3產(chǎn)Anthracycline和苯醌抗菌素微生物微生物 抗菌素鏈霉屬(Streptomyces)caespitosus 絲裂霉素A、B和Ccoelicolor 放絲菌紫素coeruleorubidicus 道諾霉素cyaneus 氰環(huán)素flavogriseus 氰環(huán)素Agalilaeus aclacinomycinA金霉素和硫霉素lusitanus 萘啶霉素peuceticus 道諾霉素和亞德里亞霉素violochromogenes arugomycinMM4550和MM13902
表3(續(xù))微生物 抗菌素cattleya 噻嗯霉素chartreusis SF1623和頭霉素A與B表4產(chǎn)β-內(nèi)酰胺抗菌素的微生物微生物 抗菌素土壤桿菌屬(Agrobacterium) 各種β-內(nèi)酰胺頭孢屬(Cephalosporium)acremonium 青霉素和頭孢菌素色素桿菌屬(Chromobacterium) 各種β-內(nèi)酰胺葡糖桿菌屬(Gluconobacter) 各種β-內(nèi)酰胺諾卡氏菌屬(Nocardia)lactamadurans 頭霉素Cuniformis 諾卡氏菌素青霉屬(Penicillium)chrysogenum 各種青霉素和其它β-內(nèi)酰胺沙雷氏菌屬(Serratia) 各種β-內(nèi)酰胺antibioticus 小棘酸argenteolus asparenomycinA鏈霉屬(Streptomyces)cinnamonensis 頭霉素A和B
表4(續(xù))微生物 抗菌素clavuligercls PA-32413-I、頭霉素C、A16886A、青霉素、頭孢菌素小棘酸和其它clavamfimbriatus 頭霉素A和Bflavovirens MM4550和MM13902flavus MM4550和MM13902fulvoviridis MM4550和MM13902griseus 頭霉素A和B以及地毯草霉素A和Bhalstedi 頭霉素A和Bheteromorphus C2081X和頭霉素A與Bhygroscopicus 脫乙酰氧基頭孢菌素Clipmanii 頭霉素、青霉素N、7-甲氧基頭孢菌素C、A16884、MM4550、MM13902olivaceus epithienamycinF，MM4550和MM13902panayensis C2081X、頭霉素A和Brochei 頭霉素A和Bsioyaensis MM4550和MM13902sp.OA-6129 OA-6129Asp.KC-6643 地毯草霉素A(carpetimycinA)
表4(續(xù))微生物 抗菌素viridochromogenes 頭霉素A和Bwadayamensis WS-3442-D表5大環(huán)內(nèi)酯、Lincosamide和鏈陽性菌素產(chǎn)抗菌素微生物微生物 抗菌素小單孢菌屬rosaria 薔薇霉素鏈霉屬albireticuli 碳霉素albogriseolus 米科諾霉素albus 白絲菌素albus var. 考來霉素(coleimycin)coilmyceticusambofaciens 螺旋霉素和螺旋霉素Dantibioticus 夾竹桃霉素avermitilis avermectinsbikiniensis 銅霉素bruneogriseus 白環(huán)素(albocycline)M188和天青菌素caelestiscinerochromogenes 青灰霉素Bcirratus 卷須霉素deltae 德爾塔霉素表5(續(xù))微生物 抗菌素djakartensis niddamycinerythreus 紅霉素eurocidicus 甲菌素eurythermus 安哥拉霉素fasciculus 苦味霉素felleus 阿格霉素和苦霉素fimbriatus 苦味霉素flavochromogenes 苦味霉素和光澤霉素(shincomycins)fradiae 泰樂菌素fungicidicus NA-181fungicidicus var.
espinomyceticus 針棘霉素furdicidicus 腐敗霉素(mydecamycin)goshikiensis 包扎霉素griseofaciens PA133A和Bgriseoflavus 針霉素griseofuscus 束菌素griseolus 灰色霉素griseospiralis 雷洛霉素griseus 疏螺體表griseus ssp.sulphurus bafilomycins
表5(續(xù))微生物 抗菌素halstedi 碳霉素和殺亮菌素hygroscopicus 泰樂菌素hygroscopicus subsp.
aureolacrimosus milbemycinskitastoensis 北里霉素A3和交沙霉素lavendulae 阿德加霉素lincolnensis 林肯霉素loidensis 春霉素A和Bmacrosporeus 碳霉素maizeus 英格拉霉素mycarofaciens 乙?；?氯霉素和針棘霉素narbonensis 交沙霉素和冥菌素narbonensis var.
josamyceticus 北里霉素A3和交沙霉素olivochromogenes 夾竹桃霉素platensis 普拉特霉素rimosus 泰樂菌素和中性霉素rochei 蘭卡菌素和抗包氏柔螺旋體rochei var. 表volubilis T2636roseochromogenes 白環(huán)素(albocycline)roseocitreus 白環(huán)素表5(續(xù))微生物 抗菌素spinichromogenes var.
suragaoensis 久慈霉素tendae 碳霉素thermotolerans 碳霉素venezuelae 甲霉素violaceoniger 蘭卡菌素和蘭卡霉素表6其他產(chǎn)抗菌素的鏈霉屬抗菌素類型 鏈霉屬菌種 抗菌素氨基酸類似物 種 環(huán)絲氨酸含環(huán)戊烷環(huán) coelicolor 次甲霉素Aerythrochromogenes 肉瘤霉素kasugaensis 金絲菌素violaceoruber 次甲霉素A含硝基 venezuelae 氯霉素多烯類 griseus 白地霉抗菌素nodosus 兩性霉素Bnoursei 制霉菌素四環(huán)素類 aureofaciens 四環(huán)素、氯四環(huán)素、去甲基四環(huán)素和去甲基氯四環(huán)素rimosus 氧四環(huán)素表7產(chǎn)核苷抗菌素的微生物微生物 抗菌素棒狀桿菌屬michiganese pv.rathayi 衣霉素類似物諾卡氏菌屬candidus 吡唑呋喃菌素鏈霉屬antibioticus ara-Achartreusis 衣霉素griseoflavus var.
thuringiensis 綠鏈菌素griseolus 西萘芬近(sinefugin)lysosuperificus 衣霉素表8產(chǎn)多肽抗菌素的微生物微生物 抗菌素游動放線菌屬missouriensis 阿克他菌素teichomyceticus teicoplanin芽孢桿菌屬各個不同種 桿菌肽、多鏈絲霉素和粘桿菌素諾卡氏菌屬candidus A-35512和avoparcin
表8(續(xù))微生物 抗菌素lurida 瑞斯托菌素orientalis 萬古霉素鏈霉屬antibioticus 放絲菌素aureus 硫鏈絲菌肽canus 雙霉素eburosporeus LL-AM374haranomachiensis 萬古霉素pristinaespiralis 原始霉素roseosporus 脂肽，如A21978Ctoyocaensis A47934virginiae A41030表9產(chǎn)抗菌素 微生物微生物 抗菌素放線路分枝菌屬各個物種 各種聚醚oligosporus A80190指孢囊菌屬各個物種 各種聚醚表9(續(xù))微生物 抗菌素諾卡氏菌屬各個物種 各種聚醚鏈霉屬albus A204、A28695A和B，以及鹽霉素aureofaciens 萘良菌素bobili A80438cacaoi var.asoensis 溶胞菌素chartreusis A23187cinnamonensis 莫能菌素(monensin)conglobatus ionomycineurocidicus var.
asterocidicus laidlomycinflaveolus CP38936gallinarius RP30504griseus 灰爭菌素hygroscopicus A218、emericid、DE3936、A120A、A28695A和B、et-heromycin和豬神霉素lasaliensis 拉沙里菌素表9(續(xù))微生物 抗菌素longwoodensis 溶胞菌素mutabilis S-11743apactum A80438ribosidificus lonomycinviolaceoniger 尼日利亞菌素輪枝鏈霉菌屬各個物種 聚醚本發(fā)明是用催化初級代謝物轉(zhuǎn)變?yōu)榭咕刂傅木幋a基因轉(zhuǎn)化產(chǎn)抗菌素微生物，這是一個最好的例證。其中的一個酶-大菌素(macrocin)鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶催化泰樂菌素生物合成中的最后步驟。用大菌素鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因(定各為tylF)轉(zhuǎn)化產(chǎn)泰樂菌素的微生物，發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)化的細胞中tylF基因產(chǎn)物的水平增加，故認為它可改善泰樂菌素生物合成途徑。
此外，本發(fā)明還提供了提高產(chǎn)泰樂菌素微生物產(chǎn)生泰樂菌素或泰樂菌素前體生產(chǎn)能力的方法。其中包括在適于細胞生長的條件下，培養(yǎng)通過生物合成途徑產(chǎn)生泰樂菌素或泰樂菌素前體的微生物，所說的微生物是用-DNA克隆載體或其部分載體進行轉(zhuǎn)化。該載體或其部分載體包含有編碼該生物合成途徑中限速酶或基因產(chǎn)物表達的泰樂菌素或泰樂菌素前體生物合成基因，進而使泰樂菌素或泰樂菌素前體生物合成基因得以表達，并產(chǎn)生泰樂菌素或泰樂菌素前體，條件是該培養(yǎng)方法可提高微生物產(chǎn)生泰樂菌素或泰樂菌素前體的能力。
本發(fā)明利用抗菌素生物合成基因以提高微生物的抗菌素生產(chǎn)能力。業(yè)已克隆并鑒定了少數(shù)的抗菌素生物合成基因，這些基因已在有關(guān)文獻中述及。已建立了分離抗菌素生物合成基因的若干方法，但一個特別優(yōu)選的方法是Baltz等人于1985年6月7日申報的美國專利申請742349號中所述的方法(相當于歐洲專利申請86304239.6號)，該文獻列為本說明書中的參考文獻。用于本方法之特定舉例的泰樂菌素抗生素生物合成基因最初是從基本上依照Fishman等人(J.Bacteriology，161∶199-206，1985)所述的程序構(gòu)建的λ基因文庫中分離的。
圖1是泰樂菌素生物合成途徑的圖解說明;圖中的每個箭頭代表了由一種或多種泰樂菌素生物合成基因產(chǎn)物催化的一個步驟。每個箭頭的上面都標示了負責各步轉(zhuǎn)變的基因。各基因型的命名可能代表能提供同一基因型的一組基因。本發(fā)明的實施例中使用了許多表達載體，這些載體包含一個或多個泰樂菌素生物合成基因，并可由美國北方地區(qū)研究實驗室(NRRL)(Northern Regional Research Laboratories，Peoria，Illinois，61604)得到。表10中列出并簡單描述了本發(fā)明實施例中所使用之方法的各種質(zhì)粒。
已描述了許多具有突變的泰樂菌素生物合成基因的Strepto-myces fradiae菌株，因此它們比其原始菌株產(chǎn)生少得多的泰樂菌素。表11提供了對這些突變菌株的簡要描述。
表11泰樂菌素生物合成有缺陷的Streptomyces fradiae突變株菌株命名突變基因 ATCC＊或NRRL寄存號GS15 tylF NRRL 18058(1986、3，19寄存)GS16 tylF ATCC 31664(公開)GS28 tylF NRRL 18059(1986、3，19寄存)GS33 tylLGS48 tylD NRRL 12170(公開)GS52 tylC NRRL 18060(1986，3，19寄存)GS62 tylMGS76 tylDtylH NRRL 12171(公開)GS85 tylKGS88 tylJ＊ATCC是美國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址Rockville，MD20852USA);
NRRL是北方地區(qū)研究實驗室(地址Peoria，IL61604USA)。
用質(zhì)粒pHJL280、pHJL284和pHJL315轉(zhuǎn)化Strepto-myces fradiae GS15和Streptomyces fradiae GS28。GS15和GS28菌株是用亞硝基胍對S.fradiae C4誘變得到的。S.fradiae C4則是通過誘變得自于S.fradiae T59235(ATCC 19609)。與C4菌株差不多，GS15菌株幾乎不產(chǎn)生泰樂菌素，而GS28菌株只產(chǎn)生很少的泰樂菌株。據(jù)信，GS15和GS28菌株降低了或不存在泰樂菌素生產(chǎn)能力，是由于編碼大菌素鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶(MOMT)之tylF基因發(fā)生突變的結(jié)果。MOMT酶是泰樂菌素生物合成途徑中大菌素(macroain)轉(zhuǎn)變?yōu)樘肪厮匦璧?，常常以反應限速量存在于產(chǎn)泰樂菌素菌中。質(zhì)粒pHJL280、pHJL284和pHJL315通過提供增加tylF生物合成基因的考貝數(shù)及增加用于泰樂菌素生物合成之大菌素鄰位甲基轉(zhuǎn)移酶濃度的途徑，來排除這一反應的限制作用。因此，使S.fradiae GS15/pHJL280、S.fradiae GS15/pHJL284、S.fradiae GS15/pHJL315、S.fradiae GS28/pHJL284、S.fradiae GS28/pHJL280和S.fradiae GS28/pHJL315發(fā)酵72小時，其大菌素鄰位甲基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生能力可比C4菌株增加大約2至6倍，且比GS28菌株增加120倍。
質(zhì)粒pHJL280也用于轉(zhuǎn)化下列菌株(1)Streptomyces fradiae GS16;(2)S.fradiae GS48;(3)S.fradiae GS48;(3)S.fradiae GS76;以及(4)S.fradiae GS88，這些菌株產(chǎn)生泰樂菌素的量低于測定極限，并由C4菌株經(jīng)誘變產(chǎn)生。未轉(zhuǎn)化的菌株GS16、GS48、GS76和GS88分別產(chǎn)生有缺陷的酶或限速量的下列各種酶(1)tylE酶，即去甲基大菌素鄰位甲基轉(zhuǎn)移酶;(2)tylD酶，其為加或生物合成6-脫氧-D-阿洛糖所需要;(3)tylH酶，為氧化tylactone之C-23甲基位所需要;以及(4)tylJ酶。未轉(zhuǎn)化的菌株GS16、GS48、GS76和GS88分別都有趨向于積累去甲基大菌素、去麥卡糖基泰樂菌素和23-脫氧去麥卡糖基泰樂菌素，而不是積累所要的泰樂菌素抗菌素化合物。
質(zhì)粒pHJL280提供了一個提高泰樂菌素生物合成途徑效率的方法。這不僅是提供非缺陷型基因，而且增加了tylD、tylE、tylH和tylJ生物合成基因的拷貝數(shù)以及由這些基因編碼產(chǎn)物的細胞內(nèi)含量。因此，增加可利用的tylE基因產(chǎn)物的濃度，從而導致酶量的增加，以推動泰樂菌素生物合成途徑中由去甲基大菌素轉(zhuǎn)變成大菌素進而形成泰樂菌素。同樣，可利用的tylD、tylH和tylJ基因產(chǎn)物的濃度也得以增加，從而導致能夠推動泰樂菌素之6-脫氧-D-阿洛糖加成及C-23氧化的酶量增加。將Streptomyces fra-diae GS16/pHJL280、S.fradiae GS48/pHJL280、S.fradiae GS76/pHJL280和S.fradia GS88/pHJL280發(fā)酵144-168小時，其泰樂菌素產(chǎn)率將顯著高于未轉(zhuǎn)化的、低產(chǎn)泰樂菌素突變株的泰樂菌素產(chǎn)率。這些轉(zhuǎn)化了的菌株編碼在質(zhì)粒pHJL280上的特異性酶比親代C4菌株高，從而進一步驗證了本發(fā)明。質(zhì)粒pHJL280可用于改善任何微生物的泰樂菌素生產(chǎn)能力，這些微生物存在有泰樂菌素生物合成之限速量的tylD、tylE、tylF、tylH或tylJ基因產(chǎn)物(或其任何形式的組合)。
質(zhì)粒pHJL284也用來轉(zhuǎn)化Streptomyces fradiae GS52-一個衍生自C4菌株的低產(chǎn)泰樂菌素突變株。該菌株產(chǎn)生反應限制量的酶，這種酶為由mycarose向de-o-methyllac-tenocin生物合成或加成所需要。因此，S.fradiae GS52的泰樂菌素生物合成途徑趨向于產(chǎn)生脫碳霉糖泰樂菌素，而不是產(chǎn)生預期的泰樂菌素抗菌素化合物。質(zhì)粒pHJL284通過提供無缺陷的生物合成基因和增加tylC生物合成基因的拷貝數(shù)來改善這個途徑的合成效率。因此，轉(zhuǎn)化菌株中可利用的tylC基因產(chǎn)物的濃度得以增加，從而提高了能推動預期之加成反應的酶產(chǎn)量。這樣，使S.fradiae GS52/pHJL284發(fā)酵144-168小時，其泰樂菌素產(chǎn)生水平即顯著高于未轉(zhuǎn)化的突變菌株，且較親代C4菌株有更高的tylC酶水平。質(zhì)粒pHJL284也用于本方法，以改善S.fradiae GS88(tylJ突變株)的泰樂菌素生產(chǎn)能力。因此也能用于本方法以改善任何微生物的泰樂菌素生產(chǎn)能力，其中存在有泰樂菌素生物合成限速量之tylC、tylF或tylJ基因產(chǎn)物(或其任意組合)。
質(zhì)粒pHJL309含有tylL和tylM生物合成基因，用于本方法可改善S.fradiae GS33(tylL突變株)和GS62(tylM突變株)的泰樂菌素生產(chǎn)能力。質(zhì)粒pHJL309亦可用于本方法，以改善任何其中存在有泰樂菌素生物合成限速量tylL或tylM基因產(chǎn)物(或其后者)之微生物的泰樂菌素生產(chǎn)能力。
質(zhì)粒pHJL311含有tylC、tylF、tylH、tylJ或tylK生物合成基因，故可用于本發(fā)明的方法，以改善Streptomyces fradiae GS52(tylC突變株)、GS88(tylJ突變株)、GS15和GS28(兩者為tylF突變株)以及GS85(tylK突變株)的泰樂菌素生產(chǎn)能力。質(zhì)粒pHJL311亦可用于本方法以改善其中存在有泰樂菌素生物合成限速量之tylC、tylF、tylH、tylJ或tylK基因產(chǎn)物(或其任何組合)的任何微生物的泰樂菌素生產(chǎn)能力。
質(zhì)粒pHJL315含有tylD、tylE、tylF、tylH和tylJ生物合成基因，故可用于本方法以改善S.fradiae GS48(tylD突變株)、GS88(tylJ突變株)、GS16(tylE突變株)、GS76(tylD、tylH雙重突變株)，以及GS15和GS28(均為tylF突變株)的泰樂菌素生產(chǎn)能力。質(zhì)粒pHJL315亦可用于本方法以改善任何其中存在有泰樂菌素生物合成限速量tylD、tylE、tylF、tylH或tylJ基因產(chǎn)物(或其任意組合)的微生物的泰樂菌素生產(chǎn)能力。
這些結(jié)果表明本發(fā)明的載體能夠通過提供較未轉(zhuǎn)化之微生物含量要高的酶或其它基因產(chǎn)物(這些酶或其它基因產(chǎn)物在抗菌素生物合成途徑中起限速作用)，以提高產(chǎn)抗菌素微生物的抗菌素生產(chǎn)能力。然而，維持在產(chǎn)抗菌素宿主細胞內(nèi)的質(zhì)粒有時需要大量消耗細胞的能量，否則此能量可能用于產(chǎn)生抗菌素。因此，用獨立復制載體轉(zhuǎn)化的某些微生物實際上顯示出抗菌素生產(chǎn)能力降低-雖然同一載體能夠增加其它微生物的抗菌素生產(chǎn)能力。絕不希望本發(fā)明以任何方式被理論所束縛或限制。由于下列事實，這樣顯然會作出反常的解釋。通過特異酶的作用由初級代謝物，如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酰-CoA、甲基丙二酰CoA和葡萄糖可以生產(chǎn)抗菌素。在微生物的迅速生長期通常并不存在這些酶，所以不能奪去生長的細胞所需要的化合物。鑒于生長受到營養(yǎng)條件的限制，故可以相信，當抗菌素生物合成基因被激活后，即可引起酶的合成，進而改變某些初級代謝物變成抗菌素產(chǎn)物的方向。
據(jù)信產(chǎn)抗菌素微生物的抗菌素合成也是一個非必需的功能，因為阻斷抗菌素生物合成的突變株也與產(chǎn)抗生素的親代一樣是可存活和生長的。野生型菌株只產(chǎn)生相當小量的抗菌素，這雖然足以給微生物提供選擇優(yōu)勢。
由天然分離物發(fā)展到工業(yè)上應用的抗菌素生產(chǎn)菌株包括許多次突變和選擇，以便獲得較高的抗菌素生產(chǎn)能力。因為除生長和維持功能外，抗菌素的合成還要消耗初級代謝物和細胞能量，故認為對較高的抗菌素生產(chǎn)能力的選擇，常常是發(fā)生在損害生物體活力的情況下。為此，抗菌素高產(chǎn)菌株的產(chǎn)生涉及維持生長的功能與產(chǎn)生抗菌素之間的細胞營養(yǎng)和能量來源的精巧平衡。這種精細調(diào)節(jié)的結(jié)果使高產(chǎn)產(chǎn)菌株對影響細胞生理因素極為敏感。例如，引入獨立復制載體，特別是多拷貝質(zhì)粒，有時就會使正?？咕馗弋a(chǎn)的微生物其抗菌素生產(chǎn)能力有下降的趨勢。對于這一抑制作用的機制尚不清楚，但因為在這些條件下并不積聚可測出的抗菌素前體，故可能是發(fā)生在抗菌素生物合成的早期。另外，獨立復制載體可能消耗用于DNA或RNA前體合成的代謝庫，或者在質(zhì)粒高拷貝數(shù)的情況下，可以“滴定”DNA結(jié)合蛋白，如RNA聚合酶、DNA聚合酶、聚合酶激活物或基因表達的阻遏物。獨立復制載體的另一個常見的局限性是質(zhì)粒自發(fā)的丟失。當載體經(jīng)常出現(xiàn)生長速度降低時，自發(fā)丟失便成了一個突出的問題。對質(zhì)?？剐詷酥镜倪x擇可以確保同源的、含質(zhì)粒細胞群體的生長，但也有可能破壞抗菌素發(fā)酵過程中的精細的生理平衡(如上面提到的)?？赏ㄟ^殺死或抑制丟失質(zhì)粒的細菌可選掉不穩(wěn)定的質(zhì)粒，并因而也導致生長速度的降低。
有時觀察到，獨立復制載體對微生物產(chǎn)抗菌素能力的不利影響。對高產(chǎn)菌株這種不利影響最大，而這些菌株的生長維持功能和抗菌素的產(chǎn)生之間的平衡尤為精細。本發(fā)明通過提供培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法(該方法利于鑒定含有已整合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細胞，以及另外還提供具有利于確定整合之特征的載體，從而克服了這一先前尚未認識到的質(zhì)粒獨立復制對高產(chǎn)能力菌株的不利影響問題。在改善高度選擇的并經(jīng)常規(guī)改良了的產(chǎn)抗菌素微生物的生產(chǎn)能力中，選擇一種能引起整合的培養(yǎng)程序是十分重要的。通過整合或載體獨立復制進行轉(zhuǎn)化，可改良抗菌素低生產(chǎn)能力的微生物或菌株。正如發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)技術(shù)人員將會理解到的，當本發(fā)明應用于抗菌素低產(chǎn)菌株時，可顯示出對抗菌素生產(chǎn)能力最大程度的改善。
依照標準轉(zhuǎn)化程序轉(zhuǎn)化一定的抗菌素生產(chǎn)菌株或其突變株，選擇或以另外方式鑒定轉(zhuǎn)化株，之后于并不需要有宿主細胞的質(zhì)粒DNA序列存在即可生長和復制的條件下培養(yǎng)細胞，便可比較容易地完成質(zhì)粒DNA的整合。在非選擇的條件下經(jīng)幾次傳代后，某些細胞便不再含有游離的質(zhì)粒DNA。這樣通過選擇或用另外方法鑒定存在于宿主細胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA序列，便可鑒定出質(zhì)粒DNA已整合到染色體(基因組)DNA內(nèi)的那些宿主細胞。一個載體若在轉(zhuǎn)化的宿主細胞內(nèi)在遺傳上不穩(wěn)定，那么與這種載體接合時，這一培養(yǎng)技術(shù)對獲得載體DNA的整合是特別有用的。這樣即可在沒有選擇壓力的情況下培養(yǎng)，使載體產(chǎn)生沒有質(zhì)粒的分離系。Bibb等人(Nature，384∶526-531，1980)曾描述了一個為維持載體的穩(wěn)定遺傳所需要的DNA序列，并構(gòu)建了缺乏這一穩(wěn)定性序列的種種載體。
例如用以構(gòu)建本發(fā)明之質(zhì)粒的克隆載體pHJL210和pHJL401即缺乏這一穩(wěn)定性序列。1984年8月10日遞交的美國專利申請639566號(相當于歐洲專利公告176199號)公開了質(zhì)粒pHJL210。1986年3月20日遞交的美國專利申請841920號中公開了質(zhì)粒pHJL401，它是1985年8月7日遞交的763172號申請的接繼部分(相當于1986年8月5日遞交的歐洲專利申請86306011.7號)。上文所用的“不穩(wěn)定”一詞是指只有當轉(zhuǎn)化的細胞培養(yǎng)于沒有保留質(zhì)粒選擇壓力的條件下時，質(zhì)粒便以高頻率從這些細胞中丟失，因為對轉(zhuǎn)化的細胞施予選擇壓力時，象pHJL210和pHJL401這樣的質(zhì)粒將會相當穩(wěn)定。當在沒有選擇壓力的條件下培養(yǎng)用穩(wěn)定載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞時，發(fā)現(xiàn)載體并沒有象不穩(wěn)定載體那樣以高頻率丟失。并且由于大量的細胞仍含有獨立復制的質(zhì)粒，即使在非選擇條件下生長之后，因此這就為整合體的鑒定造成困難。有關(guān)對整合體的選擇將在下面作更詳盡的描述。一旦載體DNA整合到宿主細胞的染色體DNA中，就會發(fā)現(xiàn)該宿主細胞的抗菌素產(chǎn)生能力得到最大程度的增加，因為此時由獨立復制質(zhì)粒引起的抑制作用已不復存在。
含克隆基因之載體整合到抗菌素生產(chǎn)的微生物基因組內(nèi)可用多種方法達到。一種方法是使用能夠整合到宿主菌株基因組中的溶源性噬菌體或其它噬菌體載體。另一方法是使用攜帶有克隆基因的質(zhì)粒載體，并篩選那些通過克隆序列與同源染色體序列之間的單純重組過程，將重組質(zhì)粒整合到宿主基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)化株。通過將同源于宿主細胞之基因組的DNA加入載體，可顯著地提高載體的整合頻率。上面所說的“整合”既是指單純重組過程(即所謂Campbell型重組)也是指雙交換(double-crossover)過程，后者可引起載體與染色體之間遺傳信息的交換。就雙交換重組而言，僅僅只有一部分載體整合到染色體DNA內(nèi)。
例如，攜帶泰樂菌素生物合成基因(tyl)的克隆質(zhì)?？赏ㄟ^質(zhì)粒上tyl基因與基因組中同源tyl基因間的單純交換整合到Stre-ptomyces fradiae基因組內(nèi)。另一辦法是除了克隆tyl基因外，再在質(zhì)粒上加入一段非tyl S.fradiae DNA序列，并篩選在相應于非tyl序列的位點上的整合。后一種方法避免了在tyl序列內(nèi)進行整合有可能產(chǎn)生的誘變作用。但如果希望進行雙交換重組，則載體所包含的抗菌素生物合成基因的兩側(cè)應有同源DNA的分離序列。
為了避免重組質(zhì)粒(獨立復制或整合的)對泰樂菌素生產(chǎn)的潛在不利的、然而卻是間接的影響，可利用Streptomyces fradiae由培養(yǎng)基中吸收泰樂菌素前體并將其轉(zhuǎn)變?yōu)樘肪氐哪芰?。在一次對已用質(zhì)粒pHJL280轉(zhuǎn)化的并經(jīng)過培養(yǎng)獲得整合體的泰樂菌素生產(chǎn)菌株的發(fā)酵中，只有細胞的一個亞群(～18%)是有硫鏈絲菌素抗性的，此即表明存在有質(zhì)粒pHJL280序列。然而，這個亞群含有兩種限速酶(即去甲基大菌素-鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶〔DMOMT〕和大菌素-鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶〔MOMT〕)基因的多拷貝，因而提高了兩種酶的水平(約9倍)，并能夠?qū)⑺姓７e聚的去甲基大菌素和大菌素轉(zhuǎn)變?yōu)樘肪?見表14)。
據(jù)此，我們即可建立含有限速酶之多拷貝基因及高水平酶的S.fradiae的特異性菌株，以作為將積聚的前體轉(zhuǎn)變?yōu)樘肪氐霓D(zhuǎn)變菌?？梢勒諑追N不同的方式來使用這些具轉(zhuǎn)變作用的菌株(1)具轉(zhuǎn)變作用的菌株可與正常生產(chǎn)菌菌株以較低的轉(zhuǎn)變菌生產(chǎn)菌比例一同接種到發(fā)酵器內(nèi);(2)可于生產(chǎn)周期的后期將轉(zhuǎn)變菌菌株接種到生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)物內(nèi)，以轉(zhuǎn)變中間體;(3)可將轉(zhuǎn)變菌菌株保留在分離“反應器”內(nèi)，之后向其中加入得自生產(chǎn)菌菌株的發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)液;或者(4)將轉(zhuǎn)變菌菌株固定在柱上，并使生產(chǎn)菌菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液通過之。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以理解到使用上述的分隔生產(chǎn)和轉(zhuǎn)變菌群的方法，可消除重組質(zhì)粒有時對高產(chǎn)抗菌素菌株之抗菌素生產(chǎn)能力的不利影響。
分隔菌群亦可排除載體穩(wěn)定性上問題。因為轉(zhuǎn)變菌株能在小容器內(nèi)生長，其中抗菌素的選擇或某些其它保留質(zhì)粒的選擇手段可得以精心調(diào)節(jié)和控制。實質(zhì)上，轉(zhuǎn)變菌株正是酶的來源，并且能夠如大腸桿菌中的重組質(zhì)粒生產(chǎn)蛋白質(zhì)那樣的方式，大量生產(chǎn)這些酶。
當然，只有借助本發(fā)明的方法即當轉(zhuǎn)化DNA包含編碼未轉(zhuǎn)化菌株之限速酶的基因時抗菌素生產(chǎn)才能得以增加。檢測抗菌素生物合成中限速步驟的方法是本領(lǐng)域中已知的(Seno和Baltz，1982，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，21∶758-763)，但是當整套抗菌素生物合成基因均可引入抗菌素生產(chǎn)菌株內(nèi)時，便不必鑒定限速步驟。如果某限速酶是未知的，只要用整套抗菌素生物合成基因轉(zhuǎn)化抗菌素生產(chǎn)菌株，就可不管什么酶是限速的，均能保證轉(zhuǎn)化了的宿主細胞比未轉(zhuǎn)化的宿主細胞有較高水平的限速酶。但某抗菌素生物合成途徑的限速酶常常是可以知道的，且能夠借助本發(fā)明的方法，用編碼抗菌素生物合成限速酶的載體轉(zhuǎn)化微生物，從而提高該微生物體的抗菌素生產(chǎn)能力。
例如，GS15菌株(其產(chǎn)生不易測得量的泰樂菌素，即這些細胞產(chǎn)生的泰樂菌素量低于測定泰樂菌素水平之分析法的檢測極限)和SG28菌株(其產(chǎn)生很低水平的泰樂菌素)包含tylF突變，這樣一來，鑒定這些突變株中泰樂菌素生物合成之限速步驟就是一件比較簡單的事情了。衍生出GS15和GS28菌株的菌株定名為新霉素鏈霉菌C4(S.fradiae C4)，其可產(chǎn)生高水平的泰樂菌素，并積聚大量的大菌素(泰樂菌素的直接前體，經(jīng)tylF基因產(chǎn)物的作用可形成泰樂菌素)。比C4菌株產(chǎn)生更多泰樂菌素的其它菌株同樣比C4菌菌株積聚更多的大菌素。這些研究表明tylF基因產(chǎn)物是以泰樂菌素之生物合成的限速量存在于泰樂菌素高產(chǎn)菌株內(nèi)。用包含tylF基因的載體轉(zhuǎn)化這些大菌素積聚的菌株，之后分離那些只含整合載體拷貝的轉(zhuǎn)化株，即得到能比未轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生更多泰樂菌素轉(zhuǎn)化體。在這些轉(zhuǎn)化體中觀察到的泰樂菌素生產(chǎn)的增加，與積聚于未轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)的大菌素的量有關(guān)。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員會很清楚由上述方法制得的轉(zhuǎn)化體可能仍含有限速量的tylF基因產(chǎn)物，在進一步增加tyl基因拷貝數(shù)的情況下，將會進一步增加泰樂菌素產(chǎn)率?；蛘咭艳D(zhuǎn)化菌株還可含有限速量的另一種抗生素合成酶，但按照本發(fā)明的方法其可達到非限速水平。
本發(fā)明通過控制抗菌素生物合成途徑，提供增加抗菌素產(chǎn)量的方法和重組DNA克隆載體。一個作為舉例說明的抗菌素生物合成途徑包括生物合成泰樂菌素-一種由弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)、龜裂鏈霉菌(S.rimosus)和吸水鏈霉菌(S.hygro-scopicus)的菌株產(chǎn)生的復雜的大環(huán)內(nèi)酯。泰樂菌素包含一個16碳的分支內(nèi)酯(tylonolide)，其上接有3個糖(mycarose、mycaminose和mycinose)。一般認為該內(nèi)酯是按照類似參與脂肪酸生物合成的模式，由兩分子乙酸鹽、5分子丙酸鹽和1分子丁酸鹽通過1分子丙?；?S-輔酶A與2分子丙二酰-S-輔酶A、4分子甲基丙二酰-S-輔酶A及1分子乙基丙二酰-S-輔酶A縮合而成的。內(nèi)酯生成、醣的生物合成與聯(lián)接以及所形成的中間體化合物轉(zhuǎn)變?yōu)樘肪厥怯梢幌盗谢蚓幋a的酶催化的。為這樣一些酶編碼的克隆基因可使泰樂菌素生物合成途徑得到改變、運轉(zhuǎn)效率得以改善。而對此已通過本發(fā)明的實施得以證實。
本發(fā)明之目的是使用泰樂菌素生物合成若干基因可舉例說明的包括以下一些基因，如tylC、tylD、tylE、tylF、tylH、tylJ、tylK、tylL和tylM基因。這一組基因中，首選的是tylF基因，因為由其編碼的大菌素-鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶顯然是大多數(shù)泰樂菌素生產(chǎn)菌株之泰樂菌素生物合成途徑中的限速酶。在S.fradiae的最適發(fā)酵條件下，由于有tylF基因產(chǎn)物催化限速步驟，故可使大菌素積聚達到不可接受的水平。如附圖1中所示出的，tylF酶催化大菌素轉(zhuǎn)變?yōu)樘肪?。過量產(chǎn)生tylF基因產(chǎn)物-大菌素鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶，可導致泰樂菌素生物合成途徑更有效地運轉(zhuǎn)，此表現(xiàn)在提高了抗菌素產(chǎn)率并降低了發(fā)酵的成本。
本技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)的技術(shù)人員將會理解到，本發(fā)明并不只限于使用質(zhì)粒pHJL280、pHJL284、pHJL309、pHJL311或pHJL315。包含于這些質(zhì)粒中的抗菌素生物合成基因可以被整個地或部分地切出并連接到任何數(shù)量的各種重組DNA克隆載體上。例如，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和BglⅡ消化質(zhì)粒pHJL280可得到5個大小分別為～10.3kb、～6.54kb、～2.3kb、～1.7kb和～1.0kb的BamHⅠ-BamHⅠ片段;兩個大小分別為～2.9kb和2.0kb的BamHⅠ-BglⅡ片段以及1個大小為～0.2kb的BglⅡ-BglⅡ片段。質(zhì)粒pHJL280的～2.9kb BamHⅠ-BglⅡ片段即含有tylF基因。用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和EcoRⅠ消化質(zhì)粒pHJL280可產(chǎn)生四個片段1個～11.24kb EcoRⅠ-EcoRⅠ片段;1個～11.5kb BglⅡ-EcoRⅠ片段;1個～4.0kb EcoRⅠ-BglⅡ片段和1個～0.2kb BglⅡ-BglⅡ片段。質(zhì)粒pHJL280的～4.0kb EcoRⅠ-BglⅡ片段含有tylE基因。
用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ消化質(zhì)粒pHJL284產(chǎn)生三個大小分別為～9.7kb、～2.3kb、～1.0kb的BamHⅠ-BamHⅠ片段以及四個大小分別為～6.24kb、～4.3kb、～2.3kb、～1.1kb的EcoRⅠ-BamHⅠ片段。質(zhì)粒pHJL284的～2.3kb BamHⅠ-EcoRⅠ片段含有tylF基因。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ消化質(zhì)粒pHJL284，產(chǎn)生兩個大小為～16.4kb和～10.54kb的片段;其中～16.4kb片段含有tylF、tylC和tylJ基因。質(zhì)粒pHJL311的～1.7kb EcoRⅠ-BamHⅠ限制性酶切片段包含tylK基因。質(zhì)粒pHJL309的～18.5kbEcoRⅠ限制性酶切片段以及～8.3kb BamHⅠ-KpnⅠ限制性酶切片段都含有tylL和tylM基因。
上面提到的任何一個含tyl基因的片段均可連接到其它載體中，以制成用于本發(fā)明之方法的載體。所說的其它載體包括有美國專利4468462、4513086、4416994、4503155及4513185號中公開的那些載體，以及質(zhì)粒pIJ101、pIJ350、pIJ702(ATCC 39155)、SCP2＊(NRRL 15041)、pHJL192、pHJL197、pHJL198、pHJL210、pHJL211、pHJL400、pHJL401、pHJL302、pIJ922、pIJ903、pIJ941、pIJ940和pIJ916等。這些載體可在S.fradiae及其它產(chǎn)泰樂菌素菌株中復制，因而可用于克隆本發(fā)明的抗菌素生物合成基因。如期望將載體整合到染色體上，則優(yōu)先選用前述的“不穩(wěn)定”載體。
可用于本發(fā)明之目的的鏈霉屬菌株包括有S.fradike，S.fradiae GS52、S.fradiae GS48、S.fradiae GS16、S.fradiae GS28、S.fradiaeGS15、S.fradiaeGS76，S.rimosus和S.hygros copicus。其中Streptomyces hygroscopicus和S.rimosus是已知的，現(xiàn)寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，Maryland 20852)。根據(jù)登記號ATCC27438、ATCC21449、ATCC15484、ATCC19040和ATCC15420可索取到S.hyg-roscopicus的多個菌株，且依據(jù)登記號ATCC10970可得到S.rimosus。特別是在用質(zhì)粒pHJL280轉(zhuǎn)化時，優(yōu)選的鏈霉菌菌株是S.fradiae GS16、S.fradiae GS15和S.fra-diae GS28。新霉素鏈霉菌(S.fradiae)也是人們所熟知的微生物，可按照各自的登記號(NRRL2702，NRRL2703和ATCC19609)，在不受限制的基礎(chǔ)上由NRRL(Peoria，Illinois61604)和ATCC得到該菌的若干菌株。
本發(fā)明中所述及的重組質(zhì)粒各包含一個或多個抗菌素生物合成基因。除多順反子的部分外，每個抗菌素生物合成基因正常情況下均包含(1)一個指導基因轉(zhuǎn)錄的啟動子;(2)一個當轉(zhuǎn)錄成mRNA時可指導轉(zhuǎn)錄體翻譯的序列;(3)一個編碼蛋白質(zhì)的序列和(4)一個轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。這些元件中每一個都可單獨使用，并可通過重組DNA技術(shù)用于構(gòu)建各種不同的重組基因。作為一個實施例，將tylF基因的蛋白質(zhì)編碼序列與得自非新霉素鏈霉菌基因的啟動子、翻譯活化序列和轉(zhuǎn)錄終止序列相連接，即形成可在分離了非新霉素鏈霉菌序列的宿主內(nèi)發(fā)揮功能的重組基因。這樣一種新的基因若導入產(chǎn)生抗菌素或抗菌素中間體的微生物中，即可形成雜種抗菌素，盡管上述抗菌素中間體不發(fā)現(xiàn)于泰樂菌素合成代謝途徑上，但可作為新的基因產(chǎn)物的底物。同樣，將tylF基因的啟動子和其它調(diào)節(jié)元件同非泰樂菌素抗菌素生物合成基因的編碼序列連接，可制得在S.fradiae宿主內(nèi)發(fā)揮功能的雜合基因。因此，本文所述的每個質(zhì)粒上的每個抗菌素生物合成基因的各個元件都是本發(fā)明的一個重要組成部分。
例如，已在tylF核苷酸序列上鑒定了tylF啟動子的序列，其構(gòu)成了本發(fā)明的一部分重要內(nèi)容。該啟動子序列表示如下圖中，為方便起見只畫出一條DNA鏈據(jù)信tylF基因的啟動子和翻譯活化序列是位于殘基1和207之間的序列內(nèi)。序列末端為tylF基因之編碼區(qū)的起始部分。
作為另一個實施方案，提供了tylF基因的DNA序列。特別是給出了包括上述啟動子和翻譯活化序列的整個tyl基因，其序列如下

其中A是脫氧腺苷酰殘基;G是脫氧鳥苷酰殘基;C是脫氧胞苷酰殘基;T是胸苷酰殘基。按上面標明的序號，結(jié)構(gòu)基因是從殘基541延續(xù)到殘基1371，其末端是終止密碼子，在殘基1372處。tylF結(jié)構(gòu)基因的氨基酸序列在相應核苷酸序列的下面給出。正如本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員都理解的，因為遺傳密碼的簡并性，可以獲得與上述所提供的密碼子相當?shù)捻樞?，以編碼與tylE相同的基因產(chǎn)物。而得到這些相當序列的方法又是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟悉的。另外，所提供的特定序列并不能以任何方式構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
可以通過許多途徑，使用幾種不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)S.fradiae菌株。培養(yǎng)基中優(yōu)選的碳水化合物來源包括糖密、葡萄糖、葡聚糖和甘油等;氮源包括大豆粉、氨基酸混合物和蛋白胨等。培養(yǎng)基內(nèi)還摻入營養(yǎng)性無機鹽，包括可解離出鈉、鉀、銨、鈣、磷酸根、氯化物、硫酸根等離子的常用鹽。還須加入微生物生長和發(fā)育所必需的重要的微量元素。這些微量元素一般是作為混雜物伴隨著加其它成份時加入培養(yǎng)基內(nèi)的。S.fradiae菌株于需氧條件下，可在比較寬的pH范圍(大約5.5～8)及大約25°～37℃的溫度范圍內(nèi)生長。具體地說，可通過培養(yǎng)含有本發(fā)明所提供之載體的S.fradiae以生產(chǎn)泰樂菌素。因為微生物能夠利用許多能源，故使用許多培養(yǎng)基中的任何一種均可。然而從節(jié)省生產(chǎn)的角度，最好是使用某些能獲得最大抗菌素產(chǎn)率，并且易于分離出抗菌素的培養(yǎng)基。用于生產(chǎn)泰樂菌素的培養(yǎng)基包含有某種可同化的碳源，如葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉、甘油、糖蜜、葡聚糖、黃糖(brown sugar)、玉米浸泡液固化物(corn steep solids)等。其中優(yōu)選的碳源是葡萄糖和淀粉。此外，可利用的培養(yǎng)基還包含一種可同化的氮源，如亞麻子粉、油渣、魚粉、棉子粉、燕麥粉、小麥粉、大豆粉、牛肉浸膏、蛋白胨(肉類或大豆)、酪蛋白、氨基酸混合物等。優(yōu)選的氮源是大豆粉、酪蛋白和玉米浸泡液固化物。
可將提供鈉、鉀、銨、鈣、鎂、鈷、硫酸根、氯化物、磷酸根、碳酸根、醋酸根和硝酸根等離子的無機鹽及干酒糟和酵母提取物等生長因子源也可摻入培養(yǎng)基內(nèi)，以獲得更好的培養(yǎng)結(jié)果。
鑒于必需微量元素是其它微生物生長和發(fā)育所必需的，故亦應加入本發(fā)明所用微生物的培養(yǎng)基內(nèi)。這些微量元素通常是作為其它培養(yǎng)基成分的混雜物一同被加入的。
培養(yǎng)基的初始pH可以很寬。但發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的初始pH范圍比較理想的是在大約pH5.5與pH8.0之間，最好是在大約pH6.5至pH7.0之間。正如培養(yǎng)其它微生物時所觀察到的，在微生物產(chǎn)生泰樂菌素的整個這段生長期間里，培養(yǎng)基的pH是逐漸增加的，可從pH7.2左右增加到pH8.0或8.0以上，最終pH至少是部分地取決于培養(yǎng)基的初始pH、培養(yǎng)基中的緩沖條件及微生物維持生長的時間長短。
深層、需氧培養(yǎng)條件是選作大量生產(chǎn)泰樂菌素的條件。如進行相對小量的制備，可利用震蕩瓶并在瓶內(nèi)作表面培養(yǎng)，但是如大量制備則最好在無菌罐內(nèi)進行深層需氧培養(yǎng)。可用已形成孢子的懸浮物接種無菌罐內(nèi)的培養(yǎng)基。然而，在接種物中使用形成了孢子的懸浮液時經(jīng)受了生長遲滯期，此時培養(yǎng)物更易呈現(xiàn)營養(yǎng)體型，以避免明顯的生長遲滯，從而使之更高效地利用發(fā)酵裝置。因此，最好先通過用微生物的孢子形式接種相對小量的培養(yǎng)基，產(chǎn)生微生物的營養(yǎng)型接種物，并在得到年青的、有活力的營養(yǎng)型接種物時，經(jīng)無菌操作將營養(yǎng)型接種物轉(zhuǎn)移到大罐內(nèi)。用于產(chǎn)生營養(yǎng)型接種物的培養(yǎng)基可與進行大規(guī)模泰樂菌素生產(chǎn)所利用的培養(yǎng)基相同或者不同。
微生物最好生長于25℃至37℃的溫度范圍內(nèi)。泰樂菌素生產(chǎn)的最適溫度似乎出現(xiàn)于大約26-30℃。
按著深層培養(yǎng)工藝中的習慣作法，須向培養(yǎng)介質(zhì)內(nèi)通入無菌空氣。為使微生物生長更好并利于泰樂菌素產(chǎn)生，在泰樂菌素罐式生產(chǎn)中使用的空氣流速最好是每體積培養(yǎng)物每分鐘大于0.1體積空氣。當所用空氣流速為每體積培養(yǎng)物每分鐘至少1體積時，便可使微生物有效生長并獲得最佳泰樂菌素產(chǎn)率。
發(fā)酵期間培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)泰樂菌素活性的濃度很容易通過取樣檢測，因在有泰樂菌素存在下，已知對泰樂菌素敏感的微生物的生長就會受到抑制。
一般說來，在使用深層需氧培養(yǎng)或震蕩瓶培養(yǎng)時，接種后最高泰樂菌素生產(chǎn)能力出現(xiàn)在2-7天左右之內(nèi)，而使用表面培養(yǎng)時則出現(xiàn)在大約5-10天之內(nèi)。
如有必要，可用常規(guī)方法如過濾或離心法將菌絲體和未溶解的固體物由發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)除去。根據(jù)需要，可用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟悉的吸附或抽提技術(shù)由過濾或離心過的培養(yǎng)液中分離出泰樂菌素。
為從過濾的培養(yǎng)液中提取泰樂菌素，可選用不與水混溶的、極性有機溶劑，這樣的溶劑包括脂肪酸的酯，如乙酸乙酯和乙酸戊酯;氯化烴類，如氯仿、二氯乙烯和三氯乙烯;不與水混溶的醇，如丁醇和戊醇;不與水混溶的酮，如甲基·異丁基酮和甲基·戊基酮;以及其它醚如二乙醚和甲基·丙基醚。還可使用有相似性質(zhì)的其它溶劑。目前優(yōu)選的抽提溶劑是氯仿和乙酸戊酯。
對于吸附技術(shù)回收泰樂菌素，可使用各種吸附劑和離子交換樹脂，如碳、硅膠、氧化鋁及有酸性性質(zhì)的離子交換樹脂，如“XE”64和“IRC”50(Rohm & Haas公司出售的弱酸性陽離子交換樹脂)、羧甲基纖維素樹脂及“Dowex”50(Dow化學公司出售的強酸性陽離子交換樹脂)。泰樂菌素能夠在氯仿、丙酮、苯或其它適當溶劑所形成的溶液中吸附到上述或相似的某種吸附劑上。之后可用適當?shù)南疵摷夹g(shù)由吸附劑上洗脫被吸附的泰樂菌素，如用甲醇或乙醇等低級醇，或含約50%低級酮(如丙酮)的低級醇。
用優(yōu)選的抽提方法所獲得的有機溶劑抽提物可直接蒸發(fā)至干，以得到泰樂菌素粗品?；蛘哂昧硪环N方法，可將有機溶劑抽提物進一步制成純化的泰樂菌素。即在真空中濃縮有機溶劑抽提物、用活性碳使?jié)饪s物脫色，并加非極性溶劑(如石油醚)沉淀泰樂菌素。如此得到的沉淀物是一種固態(tài)的、通常呈無晶形的純泰樂菌素?？墒褂蒙鲜鋈魏我环N形成結(jié)晶的溶劑將無晶形沉淀物結(jié)晶出來。還可用吸附層析法由含泰樂菌素的有機抽提物中回收泰樂菌素，即先使泰樂菌素吸附在層析柱上，再由吸附劑上洗脫泰樂菌素從而回收之。
由培養(yǎng)液內(nèi)制備所需產(chǎn)物的其它方法都是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以想到的。
泰樂菌素可與無機酸(如硫酸、鹽酸和硝酸)及有機酸(如酒石酸、葡糖酸、草酸和醋酸)形成酸加成鹽。可將泰樂菌素的游離堿溶解在某種可使之溶解的溶劑(如丙酮或乙醚)中，并向該溶液加入等摩爾量的適當酸，制成酸加成鹽。所形成的鹽通常是從溶液中沉淀出來的。如萬一鹽不沉淀，則可將溶液蒸發(fā)成較小的體積，使之沉淀，或者向其中加一種并不溶解鹽的可混溶劑，進而回收之。
下列實施例旨在進一步闡明本發(fā)明，而不是限定本發(fā)明。只是為方便起見方提供試劑的來源，此也絕不是限定本發(fā)明。
實施例1質(zhì)粒pHJL280的分離A.大腸桿菌K12HB101/pHJL280的培養(yǎng)可按登記號NRRL B-18043由NRRL得到大腸桿菌(E.co-li)K12 HB101/pHJL280的凍干品。將凍干的細胞劃線培養(yǎng)在含有50μg/ml氨芐青霉素的L-瓊脂板上(每升L瓊脂含有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl、2g葡萄糖和15g瓊脂)，以得到E.coli K12 HB101/pHJL280的單一菌落分離物。用這樣一個菌落接種100mlL培養(yǎng)液(即沒有瓊脂的L瓊脂)，之后將其于37℃需氧保溫過夜(約16小時)。次日晨以10000×g離心10分鐘收獲細胞。將如此得到的～1g細胞用于制備質(zhì)粒pHJL280 DNA，制備基本上按下述方法進行。
B.質(zhì)粒分離將按實施例1A制得的細胞沉淀懸浮在10ml含25%蔗糖和50mMTris-HCl(pH＝8.0)的溶液中。向細胞懸液內(nèi)加入1ml濃度為10mg/ml的溶菌酶(溶于50mM Tris-Hcl，pH＝8.0)，并將所得混合物在冰上保溫5分鐘。之后向細胞懸液內(nèi)加入大約4ml 0.25MEDTA(pH＝8.0)，并在冰上繼續(xù)保溫5分鐘。向溶菌酶處理的細胞內(nèi)加入大約16ml溶菌溶液(溶菌溶液含0.4%脫氧膽酸鹽(deoxycholate)、1%Brij58〔Sigma化學公司，P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178〕和0.05M Tris-Hcl，pH＝8.0;以及0.0625M EDTA)，并將所得混合物于37℃保溫15分鐘。
將細胞溶解產(chǎn)物以48000×g離心25分鐘以澄清之。將上清液傾入另外的離心管內(nèi)，向其中加入0.1體積3.0M NaOAc(pH8.0)和0.64體積異丙醇。以20000×g離心10分鐘收集DNA沉淀物，之后重新溶解在0.1體積TE緩沖液(10mM Tris-HCl、pH＝7.8，和1mM EDTA)中。將該DNA溶液于65℃保溫30分鐘，之后在CsCl和Propidium diiodide中，用平衡密度梯度超離心法純化。將如此得到的質(zhì)粒pHJL280 DNA溶解于TE緩沖液中，濃度約為1μg/μl。附圖2中給出了質(zhì)粒pHJL280的限制性酶切圖譜。
實施例2質(zhì)粒pHJL284、pHJL309、pHJL311和pHJL315的分離可依照表10中所列的登記號由NRRL得到包含質(zhì)粒pHJL284，pHJL309、pHJL311和pHJL315的大腸桿菌各菌株的凍干品。所要的各種質(zhì)?；旧隙际前凑諏嵤├?所述的方法由凍干細胞制得并純化的。附圖2-6中分別給出了上述質(zhì)粒的限制性酶切圖譜。
實施例3新霉素鏈霉菌(Streptomyces fradiae)GS28/pHJL280的構(gòu)建將S.fradiae GS28的培養(yǎng)物接種于20ml胰蛋白酶解酪蛋白-大豆培養(yǎng)液(TSB)內(nèi)，并在29℃水浴震蕩(260rpm)保溫過夜(約16小時)。用勻漿器(Thomas Scientific，Swedesboro，NJ)和T-Line實驗室攪拌器將培養(yǎng)物制成勻漿，之后用超聲細胞破碎器(Sonifier Cell Disruptor，Heat Systems Ultrasonics，lnc.)以76瓦破碎處理7秒鐘。將4ml經(jīng)過勻漿并破碎的培養(yǎng)物接種到20ml含0.3%(重量/體積)甘氨酸的TSB(BBL)內(nèi)，并再次于29℃保溫過夜。次日早晨按上述方法將培養(yǎng)物再次勻漿并培養(yǎng)。第三次保溫過夜后，勻漿并收集培養(yǎng)物，之后用P培養(yǎng)基洗兩次。P培養(yǎng)基的制備方法是先將103g蔗糖加到0.25gK2SO4和2.03g MgCl2-6H2O中，之后加去離子水至終體積700ml。將混合物除菌后，每70ml溶液大約加入各10ml下列溶液0.05gKH2PO4/100ml去離子水;2.78g CaCl2/100ml去離子水和0.25MTES(2-(〔tris-(羥甲基)甲基〕-氨基)乙烷磺酸)(pH＝7.2)。
將細胞沉淀重新懸浮于15ml含1mg/ml溶菌酶(Calbio-chem，La Jolla，CA92037)的P培養(yǎng)基中，之后于室溫下保溫1.5小時以形成原生質(zhì)體。離心小心收集原生質(zhì)體，用P培養(yǎng)基洗兩次，再懸浮于2ml P培養(yǎng)基內(nèi)，并于冰上保溫備用。向大約50μl濃度為1mg/ml的硫酸肝素(Sigma)內(nèi)加入約1μg質(zhì)粒pHJL280DNA，并在冰上保溫10分鐘。當由S.fradiae宿主中制備時，用少至大約5-100毫微克(ng)的質(zhì)粒DNA即可轉(zhuǎn)化S.fradiae。按Hopwood等人(Genetic Mani-pulation of StreptomycesA Loboratory Man-ual〔John Lnnes Foundation，Norwich，Eng-land〕，1985)所述的方法分離鏈霉菌質(zhì)粒DNA。首先將DNA/肝素溶液加到大約200μl原生質(zhì)體內(nèi)，之后向DNA/原生質(zhì)體混合物內(nèi)加入大約0.9ml 55%PEG 1000(Sigma)在P培養(yǎng)基內(nèi)構(gòu)成的溶液中，并將所得混合物于室溫下輕輕混合。
用4ml軟R2瓊脂復蓋物將混合物以不同的等份鋪在R2平板上。R2平板含有30ml R2培養(yǎng)基并已于37℃干燥約4天。R2培養(yǎng)基的配制是將103g蔗糖、0.25g K2SO4、2ml微量元素溶液、10.12g MgCl2-6H2O、10.0g葡萄糖、2.0gL-天冬酰胺、0.1g酪蛋白氨基酸和22g瓊脂加水到700ml;將所得溶液除菌;最后加下列溶液各100ml0.05g KH2PO4/100ml去離子水、2.22g CaCl2/100ml去離子水和0.25MTES(pH＝7.2)。再將終溶液的pH調(diào)到7.2。微量元素溶液每升含40mg ZnCl2、200mg FeCl3-6H2O、10mg CuCl2-2H2O、10mg MnCl2-4H2O、10mg Na2B4O7-10H2O和10mg(NH4)6Mo7O24·4H2O。軟R2瓊脂復蓋物的制備是將51.5g蔗糖、5.06g MgCl2-6H2O、1.11g CaCl2、50ml 0.25M TES(pH＝7.2)和2.05g瓊脂加足夠的去離子水，以達到終體積500ml。將混合物蒸汽加熱直到瓊脂融溶，倒入4ml等分的容器內(nèi)，并于使用前高壓滅菌。用轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體鋪板后，于29℃將平板保溫24小時，之后將4ml含25μl硫鏈絲菌肽(50mg/ml)(E.R.Squibb，Princeton，NJ08540)的軟R2瓊脂灑布在原生質(zhì)體上。平板于29℃持續(xù)保溫，直到再生完全(此期間通常約需7-14天)，以選擇所要的S.fradiae GS28/pHJL280轉(zhuǎn)化株。
培養(yǎng)S.fradiae GS28/pHJL280菌株，并以高于未轉(zhuǎn)化之S.fradiae GS28菌株的水平產(chǎn)生大菌素鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶和泰樂菌素?；旧习凑丈蟉eh等人(Journal of Chroma-tography，288157-165，1984)所述的方法分析并檢測大菌素鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶活性。將轉(zhuǎn)化的GS28/pHJL280與親代GS28菌株產(chǎn)生的大菌素鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶活性水平進行比較，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化菌株中酶產(chǎn)量增加60至100倍，泰樂菌素產(chǎn)量增加14至18倍。大體上依照Baltz和Seno(Antimicrobial Agents and Chemotherapy 20214-225，1981)以及Kennedy，J.H.(Journal of Chromatography 281288-292，1983)所述的方法分析并檢測泰樂菌素生產(chǎn)水平。
實施例4Streptomyces fradiae GS15/pHJL280的構(gòu)建基本上按實施例3所述的方法構(gòu)建需要的菌株，不同的是使用S.fardiae GS15，而不是S.fradiae GS28。將需要的菌株培養(yǎng)72小時，即以高于未轉(zhuǎn)化之S.fradiae GS15菌株的生產(chǎn)水平產(chǎn)生大菌素鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶和泰樂菌素(未轉(zhuǎn)化菌株所產(chǎn)生的泰樂菌素很不容易檢測出來)。
實施例5Streptomyces fradiae GS15/pHJL284的構(gòu)建基本上按著實施例4的方法構(gòu)建需要的菌株，不同的是使用質(zhì)粒pHJL284，而不是質(zhì)粒pHJL280。培養(yǎng)需要的菌株并以高于未轉(zhuǎn)化之S.fradiae GS15菌株的生產(chǎn)水平產(chǎn)生大菌素鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶和泰樂菌素。
實施例6Streptomyces fradiae GS16/pHJL280的構(gòu)建基本上按著實施例3的方法構(gòu)建需要的菌株，不同的是使用S.fradiae GS16，而不是S.fradiae GS28。培養(yǎng)需要的菌株并以高于未轉(zhuǎn)化菌株的生產(chǎn)水平產(chǎn)生tylE基因產(chǎn)物-去甲基大菌素鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶和泰樂菌素。大體上按照上述文獻所述的方法分別分析并檢測去甲基鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶活性和泰樂菌素生產(chǎn)水平，不同的是底物以去甲基大菌素式替大菌素。
實施例7Streptomyces fradiae GS76/pHJL280的構(gòu)建基本上按照實施例3的方法構(gòu)建需要的菌株，不同的是使用S.fradiae GS76，而不是S.fradie GS28。培養(yǎng)需要的菌株并以高于未轉(zhuǎn)化之菌株的水平生產(chǎn)tylD和tylH基因產(chǎn)物和泰樂菌素。
實施例8Streptomyces fradiae GS48/pHJL280的構(gòu)建基本上按著實施例3的方法構(gòu)建需要的菌株，不同的是使用S.fradiae GS48，而不是S.fradiae GS28。培養(yǎng)需要的菌株并以高于未轉(zhuǎn)化菌株的生產(chǎn)水平產(chǎn)生tylD基因產(chǎn)物和泰樂菌素。
實施例9Streptomyces fradiae GS52/pHJL284的構(gòu)建基本上按實施例3的方法構(gòu)建需要的菌株，不同的是使用S.fradiae GS52和質(zhì)粒pHJL284，而不是使用S.fradiae GS28和質(zhì)粒pHJL280。培養(yǎng)需要的菌株并以高于未轉(zhuǎn)化菌株的生產(chǎn)水平產(chǎn)生tylC基因產(chǎn)物和泰樂菌素。
實施例10
限速酶的比活性及使用本方法增加泰樂菌素生產(chǎn)下表證明本方法的功效。表中列出的所有轉(zhuǎn)化株都是大致按實施例3的方法獲得的。表12和13標示的結(jié)果得自培養(yǎng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌株(Baltz和SenoAntimicrobial Agents and Chemotherapy 20∶214-225，1981)。如被培養(yǎng)的菌株包含有質(zhì)粒，則培養(yǎng)基也含20μg/ml硫鏈絲菌肽。應注意的是，列于表12和13中的轉(zhuǎn)化菌株為泰樂菌素低產(chǎn)菌株或其產(chǎn)生的泰樂菌素很不容易檢測出來，并在為保留質(zhì)粒作為獨立復制載體而在有選擇壓力(硫鏈絲菌肽)的條件下進行培養(yǎng)。
(表12、表13見下頁)表14中的結(jié)果得自于泰樂菌素高產(chǎn)菌株的轉(zhuǎn)化體，它轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)可得到整合體，這種轉(zhuǎn)化體中所有質(zhì)粒DNA或其部分均已整合到宿主細胞的基因組內(nèi)。有兩種方法用于得到整合體。第一種方法中，將轉(zhuǎn)化體移入選擇性(含硫鏈絲菌肽)和非選擇性平板內(nèi)傳代，并于29℃保溫約16小時以得到單菌落。將非選擇性平板上的單菌落(它有硫鏈絲菌肽抗性)移到選擇性平板上以同樣方法再傳代幾次，直至不經(jīng)選擇也可發(fā)現(xiàn)有穩(wěn)定的單菌落。第二種得到整合體的方法是用棉花簽由平板的表面上轉(zhuǎn)移孢子，使轉(zhuǎn)化體無選擇性地傳代幾次;幾次傳代后，使菌落在非選擇性的液體培養(yǎng)基(TSB)中生長，之后勻漿、用聲波破碎、稀釋并在選擇性和非選擇性培養(yǎng)基上鋪敷，以鑒定比較穩(wěn)定的整合體。得到整合體的其它方法顯然是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員都知道的。且本方法并不僅僅就是一種為了得到整合體的特殊方法。
表13tylE基因產(chǎn)物去甲基大菌素鄰位-甲基轉(zhuǎn)移酶(DMOMT)的比活性DMOMT 比活性菌株 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒2天 3天 4天GS16 pHJL210 0 0 0GS16 pHJL280 1.8 3.7 4.0GS16 pHJL280 3.8 1.7 3.0GS16 pHJL284 1.3 1.6 2.2C4 pHJL210 0.7 1.3 1.5C4 pHJL210 0.2 1.1 1.9C4 無 0.4 1.5 1.0用相對穩(wěn)定的整合體接種未加硫鏈絲菌肽(無選擇性壓力)的營養(yǎng)型培養(yǎng)基(復合的營養(yǎng)型培養(yǎng)基每升含10g玉米浸泡液的濃縮液、5g酵母提物、5g大豆粉、3g碳酸鈣和4.5g粗制大豆油，并用NaOH將pH調(diào)到7.8。TSB也是一種適用的營養(yǎng)型培養(yǎng)基)，并用營養(yǎng)型培養(yǎng)物接種(10%接種物)發(fā)酵培養(yǎng)基(其中也沒有硫鏈絲菌肽)。于29℃，以260rpm速度震蕩發(fā)酵7天。用甲醇∶CHCl3提取發(fā)酵液，讀出290nm處的吸收值再與標準曲線比較，以測得發(fā)酵液的大環(huán)內(nèi)酯總含量。將發(fā)酵液在硅膠薄層層析平板上點樣，
并用95∶5的乙酸乙酯∶二乙胺溶劑體系展層，以鑒定泰樂菌素因子。各個大環(huán)內(nèi)酯成分的濃度為總的A290吸收值乘以用HPLC法測得的每種成分的百分數(shù)。
(表14見上頁)實施例11泰樂菌素的制備S.fradiae含本發(fā)明提供之質(zhì)粒，其形成孢子的培養(yǎng)物可通過有下列成分的營養(yǎng)瓊脂斜面上生長而得到酵母提取物 1.0g牛肉浸膏 1.0g水解酪蛋白(“N-Z-Zmine-A型”，Sheffield化學公司出售) 2g葡聚糖 10g氯化鈷7水合物 20mg瓊脂 20g水 1L加氫氧化鈉將培養(yǎng)基的pH調(diào)到pH7.3。
用所需微生物的孢子接種斜面并于30℃保溫5天。將生長在斜面上的已生長孢子的培養(yǎng)物覆以水，并輕輕刮下孢子，以制得提供孢子水懸液。
于無菌條件下用1ml孢子懸液接種100ml有下列組成的無菌營養(yǎng)型培養(yǎng)基葡萄糖 15g大豆粉 15g
玉米浸泡液固體物 15g氯化鈉 5g碳酸鈣 2g自來水加至總體積1L。
將接種過的營養(yǎng)型培養(yǎng)基于大約30℃保溫48小時，保溫期間將其放在一有2英寸行程的往復式震蕩器上以每分鐘114次的速度震蕩。
用5ml營養(yǎng)型接種物無菌接種裝在500ml Erlenmeyer瓶內(nèi)的、滅菌的100ml生產(chǎn)培養(yǎng)基大豆粉 15g酪蛋白 1g粗制葡萄糖糖漿 20ml碳酸鈣 25g硝酸鈉 3g自來水加至總體積1升。
之后于大約26-28℃將接種的培養(yǎng)物保溫100小時。保溫期間，將被保溫的培養(yǎng)物置于有2英寸行程的往復式震蕩器上以每分鐘114次的速度震蕩。起始培養(yǎng)基的pH為大約pH6.5，在保溫期終末時，培養(yǎng)基的pH逐漸增加到大約pH7.5。
過濾發(fā)酵培養(yǎng)液以除去菌絲體和其它未溶解的固體物。濾出的培養(yǎng)液內(nèi)即含泰樂菌素。
實施例12泰樂菌素的另一種制備法在有下列成份的營養(yǎng)瓊脂斜面上培養(yǎng)所需要的轉(zhuǎn)化微生物，即得形成孢子的培養(yǎng)物。
蕃茄醬-燕麥粉瓊脂蕃茄醬 20g預煮過的燕麥粉 20g瓊脂 15g水加至終體積為1升。
用微生物孢子接種斜面并將接種過的斜面于大約30℃保溫9天。保溫后，用水覆蓋斜面上形成了孢子的培養(yǎng)物，從斜面的表面輕輕刮下孢子，制得孢子水懸液。
利用無菌技術(shù)，將由一個斜面上得到的接種物的一半用于接種500ml已除菌的營養(yǎng)型培養(yǎng)基(裝在2升Erenmeyer瓶內(nèi)。)該培養(yǎng)基有下列成分的玉米浸泡液-酵母Ⅰ葡萄糖 15g玉米浸泡液固化物 5g酵母 5g碳酸鈣 5g水，加至終體積為1升。
將接種過的培養(yǎng)基放在有2英寸行程的往復式震蕩器上，以每分鐘110次的速度震蕩，在28℃保溫48小時。由瓶內(nèi)取出0.25加侖營養(yǎng)型接種物作為接種物加入裝在一鐵制350加侖發(fā)酵罐內(nèi)的250加侖上述無菌玉米浸泡液-酵母Ⅰ培養(yǎng)基中。向培養(yǎng)液內(nèi)加入0.25加侖消泡劑(消泡劑產(chǎn)品為Dow Corning公司出售)以防止過多的泡沫形成，如必要時可于發(fā)酵期間補充加入。經(jīng)接種的培養(yǎng)基于28℃發(fā)酵24小時。發(fā)酵期間，向培養(yǎng)基內(nèi)以每分鐘27立方英尺的速度通入無菌空氣，并用16英寸的風輪以每分鐘160轉(zhuǎn)的速度進行攪拌。
向-1700加侖鐵制發(fā)酵罐內(nèi)加入1200加侖有下列成份的培養(yǎng)基玉米浸泡液大豆Ⅻ葡萄糖 30kg大豆油餅粉 15kg玉米浸泡液固化物 5kg粗制大豆油 10kg碳酸鈣 2kg氯化鈉 5kg水，加至終體積1000升用96加侖生長在發(fā)酵罐內(nèi)的接種物接種培養(yǎng)基。于28℃發(fā)酵4天，必要時可加入“Larex”1號(一種由Swift &公司出售的消泡劑產(chǎn)品)控制泡沫形成。以每分鐘128立方英尺的速率向發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)通入無菌空氣，并用兩個以每分鐘130轉(zhuǎn)的速度運轉(zhuǎn)的24英寸風輪進行攪拌。
向發(fā)酵液內(nèi)加入600磅“Silflo”(一種由Silfo公司出售的硅藻土助濾劑)，并過濾所得混合物。加20%氫氧化鈉將濾液調(diào)到pH8.5，加500加侖氯仿，將混合物攪拌30分鐘并潷去呈乳液形式的氯仿層。每次用500加侖氯仿重復進行兩次氯仿抽提。合并含有泰樂菌素的氯仿乳液并使之通過De Laval分離器以破壞乳液，之后于真空條件下將氯仿溶液濃縮到25升。使溶液通過直徑6英寸含10公斤活性炭的柱(如Pittsburgh Coke and Che-mical公司出售的活性碳)，以除去其中的大部雜質(zhì)。用16升氯仿洗活性碳柱，之后于真空中將合并的含泰樂菌素之氯仿洗脫液濃縮到約2升體積。于攪拌下將氯仿濃縮液緩慢加到20升石油醚內(nèi)，將混合物攪拌15分鐘，過濾出泰樂菌素的白色、非晶形沉淀物。
將非晶形泰樂菌素溶解于355ml丙酮，過濾丙酮混合物除去輕度混濁，并于輕輕攪拌下將過濾的丙酮混合物緩慢加入20升5℃的水中。于室溫條件下放置泰樂菌素的含水丙酮溶液同時輕輕攪拌，以使丙酮緩慢蒸發(fā)，從而使泰樂菌素結(jié)晶出來。過濾收集泰樂菌素結(jié)晶，并于室溫下真空干燥。泰樂菌素的熔點約127-132℃。
實施例13泰樂菌素酒石酸鹽的制備將5g結(jié)晶泰樂菌素溶解于100ml丙酮，并于攪拌下加入溶于20ml丙酮的1.5g D-酒石酸。于室溫下放置該溶液，從而結(jié)晶出泰樂菌素的酒石酸鹽。過濾收集泰樂菌素酒石酸鹽的結(jié)晶體，用丙酮洗并風干。泰樂菌素的結(jié)晶酒石酸鹽熔點為140-146℃。
實施例14泰樂菌素葡糖酸鹽的制備將1.03g葡糖酸-δ內(nèi)酯溶于10ml水中并將該水溶液于85℃加熱2小時，以使該內(nèi)酯水解成葡糖酸。向水溶液內(nèi)加入15ml溫甲醇，并于攪拌下向甲醇混合物內(nèi)加入溶于10ml甲醇的5g泰樂菌素。于室溫下將泰樂菌素甲醇混合物放置過夜。于室溫下真空除去混合物中的甲醇。之后向含水泰樂菌素混合物中加入40ml水。過濾稀釋過的混合物，并將含泰樂菌素的濾液凍干，從而得到一種含泰樂菌素葡糖酸鹽的白色固體物。泰樂菌素葡糖酸鹽熔點約114-117℃。
實施例15泰樂菌素鹽酸鹽的制備將890mg泰樂菌素溶解于200ml乙醚中。加0.082ml 12N鹽酸使乙醚混合物酸化。過濾出所形成的泰樂菌素鹽酸鹽的沉淀物，用乙醚洗并真空干燥之。由乙醚-乙醚混合物中重結(jié)晶出泰樂菌素的鹽酸鹽。泰樂菌素鹽酸鹽的熔點大約141-145℃。
勘誤表
權(quán)利要求
1.一種增加產(chǎn)抗菌素微生物之抗菌素或抗菌素前體生產(chǎn)能力的方法，其中包括在適于細胞生長的條件下培養(yǎng)一種經(jīng)生物合成途徑能產(chǎn)生抗菌素或抗菌素前體的微生物，所說的微生物是用-DNA克隆載體或其部分轉(zhuǎn)化了的，該DNA克隆載體或其部分含有一編碼抗菌素或抗菌素前體生物合成的基因，該基因編碼生物合成途徑中的一種限速酶或基因產(chǎn)物，在培養(yǎng)過程提供了提高微生物之抗菌素生產(chǎn)能力的前提下，來表達抗菌素或抗菌素前體生物合成基因，并生產(chǎn)抗菌素或抗菌素前體。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中微生物是Streptomyces、Cephalosporium或Penicillium。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2的方法，其中微生物、抗菌素、抗菌素前體、抗菌素生物合成途徑和抗菌素生物合成基因分別是Strep-tomyces、泰樂菌素、一種泰樂菌素前體、泰樂菌素生物合成途徑和一個泰樂菌素生物合成基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3的方法，其中微生物是S.fradiae、S.rimosus和S.hygroscopicus。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的方法，其中泰樂菌素生物合成基因是tylC、tylD、tylE、tylF、tylH、tylJ、tylK、tylL或tylM。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1-5中任一項的方法，其中生物合成基因是tylF。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中克隆載體是質(zhì)粒pHJL280、pHJL284、pHJL309、pHJL311或pHJL315。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中用克隆載體轉(zhuǎn)化的微生物是Streptomyces fradiae GS15/pHJL280，S.fradiaeGS15/pHJL284，S.fradiae GS15/pHJL311，S.fradiaeGS15/pHJL315，S.fradiae GS28/pHJL280，S.fradiaeGS28/pHJL284，S.fradiae GS28/pHJL311，S.fradiaeGS28/pHJL315，S.fradiae GS16/pHJL280，S.fradiaeGS16/pHJL315，S.fradiae GS48/pHJL280，S.fradiaeGS48/pHJL315，S.fradiae GS52/pHJL284，S.fradiaeGS52/pHJL311，S.fradiae GS76/pHJL280，或S.fradiaeGS76/pHJL315.
9.如權(quán)利要求
1中限定的重組DNA克隆載體。
10.質(zhì)粒pHJL280、pHJL284、pHJL309、pHJL311或pHJL315。
11.用根據(jù)權(quán)利要求
9的克隆載體轉(zhuǎn)化的微生物。
12.用權(quán)利要求
10的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的微生物。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12的微生物，其為E.coli K12 HB101/pHJL280，E.coli K12 HB101/pHJL284，E.coli K12 HB101/pHJL309，E.coli K12 HB101/pHJL311，或E.coli K12 JM109/pHJL315.
14.根據(jù)權(quán)利要求
12的微生物，其為Streptomyces。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14的微生物，其為Streptomyces fradiae。
16.S.fradiae GS15/pHJL280，S.fradiaeGS15/pHJL284，S.fradiae GS15/pHJL311，S.fradiaeGS15/pHJL315，S.fradiae GS28/pHJL280，S.fradiaeGS28/pHJL284，S.fradiae GS28/pHJL311，S.fradiaeGS28/pHJL315，S.fradiae GS16/pHJL315，S.fradiaeGS48/pHJL280，S.fradiae GS48/pHJL315，S.fradiaeGS52/pHJL284，S.fradiae GS52/pHJL311，S.fradiaeGS76/pHJL280，或S.fradiae GS76/pHJL315.
17.編碼tylC、tylD、tylE、tylF、tylH、tylJ、tylK、tylL或tylM生物合成基因的DNA序列。
18.編碼tylC、tylD、tylE、tylF、tylH、tylJ、tylK、tylL或tylM生物合成基因之啟動子和翻譯活化序列的DNA序列。
19.編碼tylF基因之啟動子和翻譯活化序列的DNA序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求
19的編碼tylF啟動子的DNA序列，其為
TGT CAG GTC GCC CGT GGT GAC GGG CTC CGG GGC GGC GGC GCG GGC GGC CGA CCT TGA CAT ACC CGC GGC CGG GCT CCT CGT TCC GGC GCG GCC CGC GCC GAT AGC GTC CGT CCT CAC CGG CTC CGG CGT CCG CGT CCC CGC CGG GAC GTG CCA CCT CTC CCG ACC CCG CGA GCC GAT CGA CCC GCT ACT GGA GGA CCC-3′其中A是脫氧腺苷酰殘基;G是脫氧鳥苷酰殘基;C是脫氧胞苷酰殘基;T是胸苷酰殘基，且其中R是互補于所說的被描述之DNA序列的脫氧核苷酸的序列，其中A與T配對，T與A配對，G與C配對且C與G配對。
21.制備抗菌素、抗菌素前體或其醫(yī)藥上可接受之鹽的方法，其中包括在含有可同化之碳源、氮源和無機鹽的培養(yǎng)基中，于需氧發(fā)酵條件下培養(yǎng)通過抗菌素生物合成途徑產(chǎn)生抗菌素或抗菌素前體的微生物-所說的微生物是用-DNA克隆載體或其部分轉(zhuǎn)化了的，其特征在于該DNA克隆載體或載體的一部分含有編碼抗菌素生物合成途徑中表達限速酶或基因產(chǎn)物的抗菌素生物合成基因，所說的抗菌素生物合成基因在發(fā)酵條件下能被表達，從而可提高微生物的抗菌素生產(chǎn)能力。
22.根據(jù)權(quán)利要求
21的方法，其中抗菌素或抗菌素前體是泰樂菌素或泰樂菌素前體。
23.編碼tylF基因的DNA序列。
24.tylF基因。
25.根據(jù)權(quán)利要求
24的基因，其序列如下
其中A是脫氧腺苷酰殘基，G是脫氧鳥苷酰殘基，C是脫氧胞苷酰殘基，T是胸苷酰殘基，正如上面所指明的，結(jié)構(gòu)基因為殘基541直到殘基1371，殘基1372處為終止密碼子;tylF結(jié)構(gòu)基因的氨基酸序列在相應的核苷酸序列下面示出。
26.由按權(quán)利要求
25所限定的tylF基因之核苷酸541至1371編碼的氨基酸序列。
專利摘要
公開了一種提高產(chǎn)抗菌素微生物宿主細胞生產(chǎn)抗菌素能力的方法。該方法包括用編碼能表達抗菌素生物合成限速酶或其它基因產(chǎn)物的重組DNA克隆載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)抗菌素的微生物。
文檔編號C12R1/465GK87102137SQ87102137
公開日1987年11月4日 申請日期1987年3月20日
發(fā)明者卡倫·利·考克斯, 斯科特·埃里克·菲什曼, 查爾斯·李·赫什伯格, 尤金·托馬斯·塞諾 申請人:伊萊利利公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan