專利名稱：抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的反義脫氧寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)DNA復(fù)制及乙型肝炎病毒基因的表達(dá)的反義脫氧寡核苷酸，它還可通過(guò)3’單磷酸化修飾以提高穩(wěn)定性，從而提高對(duì)HBV的抑制效果。
乙型肝炎病毒(HBV)引起的乙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(1988年)估計(jì)，全球的HBV攜帶者大約2-3億人，主要分布在東南亞及非洲，全世界的所有肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)患者中，有80％是HBV感染者，受HBV慢性感染的人群患HCC的相對(duì)危險(xiǎn)性至少增加100倍。我國(guó)是乙型肝炎高流行區(qū)，8-10％的人群(約1億人口)為乙型肝炎(病毒)表面抗原(Hepatitis B(virus)Surface Antigen,HBsAg)的陽(yáng)性者。根據(jù)1980年全國(guó)調(diào)查，我國(guó)現(xiàn)患肝炎的病人約2千萬(wàn)，其中60％以上為慢性肝炎患者，由此可見，由HBV感染引起的乙型肝炎與其相關(guān)的HCC是世界性的主要健康問(wèn)題之一。但是，到目前為止，臨床上仍缺乏有效的直接抑制病毒繁殖的治療方法。因此，研究新的治療方法是當(dāng)今一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。
HBV是一種嗜肝性DNA病毒，具有很強(qiáng)的宿主特異性，其感染可引起急性或慢性肝炎。HBV的感染、繁殖依賴其DNA的復(fù)制及基因組的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。HBV基因組是一個(gè)部分雙鏈環(huán)狀DNA分子，約3.2kb，它含有4個(gè)主要的讀碼框架，它們分別編碼核心抗原(preC,C)，聚合酶(P)，表面抗原(preS1,preS2和S)和X蛋白(X)?？刂七@些基因表達(dá)的順式調(diào)控元件有啟動(dòng)子Cp,Sp1,Sp2和Xp，增強(qiáng)子ENⅠ和ENⅡ，靜止子(silencer)和糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件GRE等。在它們的調(diào)控下，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的mRNA:3.5kb,2.4kb,2.1kb和0.8kb mRNA(如

圖1所示)。起始位點(diǎn)不同的3.5kb mRNA具有不同的功能。較長(zhǎng)的前核心mRNA翻譯產(chǎn)生前核心抗原，然后加工成e抗原(HBeAg)；而較短的前基因組mRNA翻譯產(chǎn)生C蛋白和P蛋白，同時(shí)也是HBV DNA復(fù)制的模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生子代DNA(李載平，汪垣HBV分子生物學(xué)前進(jìn)中的生物化學(xué)論文集(二)，上海科學(xué)技術(shù)出版社，1992年，247-256)。
HBV病毒的復(fù)制過(guò)程已經(jīng)研究清楚(參見Robinson WS,Klote L,and AokiN.,J.Med.Virol.,1990,31:18-32)，包括1,3.5kb的前基因RNA被包裝進(jìn)新合成的衣殼內(nèi)，成為反轉(zhuǎn)錄的模板。衣殼包裝的識(shí)別位點(diǎn)為ε。
2，在聚合酶的作用下反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生負(fù)鏈DNA。引物為聚合酶的N端，結(jié)合在3’端的DRⅠ處。形成DNA:RNA雜合雙鏈，然后由聚合酶中的RNase H水解雜合鏈中的RNA，留下DNA單鏈。
3，以負(fù)鏈DNA為模板，在3’端的DRⅡ處向DRⅠ合成一段DNA，再?gòu)?’端的DRⅠ處合成正鏈DNA。合成過(guò)程中同時(shí)被包裝運(yùn)出細(xì)胞，出細(xì)胞后正鏈DNA的合成停止，其結(jié)果是部分雙鏈部分單鏈的DNA分子。
可見，HBV復(fù)制過(guò)程中重要的元件包括直接重復(fù)序列DRⅠ,DRⅡ和衣殼包裝的識(shí)別位點(diǎn)ε。DRⅠ,DRⅡ是正負(fù)DNA鏈合成的起點(diǎn)。前基因RNA中ε序列可以形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，是形成衣殼蛋白的識(shí)別信號(hào)。HBVDNA復(fù)制時(shí)的聚合酶是P蛋白。P蛋白由3.5kb mRNA從不同翻譯起始點(diǎn)翻譯而成，是一個(gè)95 KD的富含組氨酸的堿性蛋白，可被加工成為多種分子量較小的產(chǎn)物?，F(xiàn)已闡明P蛋白的4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域依次為①蛋白引物[也稱為引發(fā)酶(primase)或末端蛋白(terminal protein,TP)](可作為病毒DNA合成的引物，并與新生DNA共價(jià)連接[Wang G.H.,Seeger C.Cell 1992,71(4):663-670])；②間隔區(qū)(刪除大部分以后并不影響逆轉(zhuǎn)錄酶的活性)；③逆轉(zhuǎn)錄酶；④RNA酶H(RNaseH)。
抑制HBV病毒DNA的復(fù)制，減少病毒的數(shù)量，可達(dá)到抑制HBV基因表達(dá)，最終清除病毒的目的。
反義寡核苷酸技術(shù)(antisense oligonucleotide technology)為抑制HBV基因的表達(dá)提供了一種新的方法(Keoagh T,Shaffer JD,Anal.Chem.,1996,68:3405-12)。反義寡核苷酸通過(guò)堿基配對(duì)的方式結(jié)合到互補(bǔ)的mRNA上，能抑制RNA的剪接及翻譯。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上說(shuō)，在人基因中某一特定的17聚體堿基序列只出現(xiàn)一次，如果采用20或20以上個(gè)堿基組成的反義寡核苷酸用于疾病的治療，幾乎不會(huì)在基因組中有重復(fù)的序列，因此，反義寡核苷酸的作用十分特異，可以顯著地減小毒副作用。因此，反義寡核苷酸的特點(diǎn)是能夠通過(guò)堿基配對(duì)的方式，特異地與靶mRNA結(jié)合，阻止mRNA翻譯，從而專一地抑制特定基因的表達(dá)。經(jīng)過(guò)10多年來(lái)的豐富和發(fā)展，反義核酸已經(jīng)發(fā)展成為一項(xiàng)成熟的技術(shù)，它能為研究特定基因的功能、特異抑制癌基因的表達(dá)及抑制病毒的繁殖提供有力的工具(Holt,Mol.Med.Yoday,1996,2:184-5；Plenat,Mol.Med.Today,1996,2:250-7)。它也將能成為抑制乙型肝炎病毒基因的表達(dá)及乙型肝炎病毒的繁殖和治療乙型肝炎的藥物。
1978年，Zamecnik和stephenson(Zamecnik PC,Stephenson M,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1978,75:280-284；Stephenson M,Zamecnik PC,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1978,75:285-289)首先將寡核苷酸用于專一性抑制病毒基因表達(dá)，他們首次證明一段與勞氏肉瘤病毒RNA互補(bǔ)的13核苷酸長(zhǎng)的寡核苷酸可以抑制勞氏肉瘤病毒的繁殖。1984年，由Simons、Lzant和Weintraub首次提出反義RNA的概念，從那時(shí)起，已發(fā)表大量的研究成果證明反義寡核苷酸可以在體外抑制病毒的繁殖，例如對(duì)水皰性口炎病毒、單純性皰疹病毒、流感病毒、人免疫缺陷性病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤病毒(HPV)(Leonetti,Gene,1988,72:323-327；Smith,Proc.Nail.Acad.Sci.USA,1986,83:2728-32；Zerial,Nucleic Acids Res.,1987,15:9909-13)等。反義寡核苷酸對(duì)HBV基因表達(dá)的抑制也已經(jīng)做了較多的工作。國(guó)外，幾家實(shí)驗(yàn)室和公司已申請(qǐng)了幾項(xiàng)專利(WO 95/19433,WO 96/03152,WO 96/39502,WO 97/03211)。他們針對(duì)S，前S,C，前C,P等基因以及ε位點(diǎn)設(shè)計(jì)了許多條反義寡聚核苷酸。這些都針對(duì)ayw亞型，都采用硫代磷酸修飾。他們的反義寡聚核苷酸有的對(duì)一個(gè)基因的表達(dá)有較強(qiáng)的抑制作用，但對(duì)其他基因的抑制作用較弱。其中也有一些反義寡聚核苷酸用來(lái)抑制HBV DNA的復(fù)制，例如針對(duì)ε位點(diǎn)的。國(guó)內(nèi)，趙小俠等(病毒學(xué)報(bào)，1992,8:125-130)，分別把HBV的S及C基因反向克隆到原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄載體上，在原核細(xì)胞中研究了反向克隆的HBVS和C基因?qū)φ蚩寺〉腟基因及C基因表達(dá)的抑制作用。姚志強(qiáng)等在體外及細(xì)胞內(nèi)研究了反義寡核苷酸對(duì)HBV基因表達(dá)的抑制作用(Acta.Virol.1996,40:35-9；1995,39:227-30)。但是，他們選用的乙型肝炎病毒亞型也是ayw亞型，此型在我國(guó)較少，在我國(guó)adr亞型較多。因此，諸多的研究由于抑制效率不夠高或者寡核苷酸穩(wěn)定性差或不適合于中國(guó)亞型的原因，至今仍處于實(shí)驗(yàn)室的研究之中，未進(jìn)入臨床研究階段。
為此，本發(fā)明的目的是提供一種能有效抑制乙型肝炎病毒(包括adr亞型)DNA的復(fù)制及乙型肝炎病毒基因的表達(dá)的反義脫氧寡核苷酸，它包括四條分別能與HBV基因中1798到1821位，1807到1827位，ε區(qū)的1875到1895位及HBV的P基因的mRNA起始密碼子區(qū)域結(jié)合的反義脫氧寡核苷酸。它們能通過(guò)3’單磷酸化修飾以提高其穩(wěn)定性，從而提高該寡核苷酸在細(xì)胞內(nèi)對(duì)乙型肝炎病毒的抑制作用。該反義脫氧寡核苷酸可應(yīng)用于作為治療乙型肝炎的藥物。
本發(fā)明提供一種抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制及乙型肝炎病毒基因表達(dá)的反義脫氧寡核苷酸，該反義脫氧寡核苷酸與HBV的1798到1821位，1807到1827位，ε區(qū)的1875到1895位及HBV的P基因mRNA起始密碼子區(qū)域結(jié)合。該反義脫氧寡核苷酸包括4條反義脫氧寡核苷酸，即AsC,AsD,AsE和AsP，它們分別與HBV的1798到1821位，1807到1827位，ε區(qū)的1875到1895位及HBV的P基因mRNA起始密碼子區(qū)域結(jié)合，它們的序列如下AsC 5’TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCA 3’AsD 5’AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTG 3’AsE 5’GCC ACC CAA GGC ACA GCT TGG 3’AsP 5’GGG CAT TTG GTG GTC TGT AAG CAG 3’。
該反義脫氧寡核苷酸可通過(guò)3’單磷酸化修飾，以提高穩(wěn)定性，使其抑制乙型肝炎病毒更有效，它們的結(jié)構(gòu)如下AsC(3’P)5’TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCAp 3’AsD(3’P)5’AAAAGT TGC ATG GTG CTG GTGp 3’AsE(3’P)5’GCC ACC CAA GGC ACA GCT TGGp 3’AsP(3’P)5’GGG CAT TTG GTG GTC TGT AAG CAGp 3’。
在考慮抑制HBV的DNA復(fù)制時(shí)我們采用如下的幾種策略1)，根據(jù)HBV DNA的復(fù)制過(guò)程，選在DRⅠ和DRⅡ之間的1798到1821位和1807到1827位區(qū)域設(shè)計(jì)AsC和AsD，它們位于前基因RNA的3’和5’端。也是前C基因的起始密碼子和前基因RNA的帽子區(qū)的位置。AsE結(jié)合到前基因RNA的3’端的1798到1821位或AsF結(jié)合到前基因RNA的3’端的1807到1827區(qū)，形成DNA:RNA雜交雙鏈，首先在RNaseH的作用下，水解雜合鏈中的RNA，使前基因RNA 3’端不帶DRI位點(diǎn)，它將不能被反轉(zhuǎn)錄成DNA。而AsC和AsD本身3’端為磷酸基團(tuán)不能作為DNA合成的引物，從而抑制了病毒DNA的復(fù)制(見圖2)。此外，HBV的4種mRNA都在同一個(gè)位點(diǎn)終止轉(zhuǎn)錄并加上polyA尾巴。即4種mRNA的3’端都帶有DRⅡ,DRⅠ,ε元件和TATAAA。在DRⅡ與DRⅠ之間有ASC,AsD的結(jié)合位點(diǎn)。AsC,AsD與4種mRNA在3’端的靶序列結(jié)合，可由RNaseH將mRNA切斷。mRNA被切去polyA尾巴后，壽命大大縮短，導(dǎo)致所有蛋白質(zhì)的表達(dá)的減少。AsC位點(diǎn)也在前C蛋白的起始碼處，AsD還在前基因RNA的帽子區(qū)，因此也能抑制前C蛋白和C蛋白，P蛋白的表達(dá)。
2)，設(shè)計(jì)AsE作用于HBV的ε位點(diǎn)。HBV的ε位點(diǎn)在基因的1849位到1910位，在前基因RNA中這段序列可以形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，是形成衣殼蛋白的識(shí)別信號(hào)。AsE與HBV的前基因RNA的ε位點(diǎn)的1875到1895位作用，其中1880到1885位是環(huán)區(qū)。AsE的結(jié)合使前基因RNA的這個(gè)區(qū)域不能形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，即不能形成衣殼蛋白的識(shí)別信號(hào)，從而可抑制反轉(zhuǎn)錄的起始。它也可以作用于4種mRNA。
3)，設(shè)計(jì)AsP作用于HBV的P基因的起始碼區(qū)域。HBV的P基因從2310位開始，AsP與P基因的2292到2315位核苷酸互補(bǔ)，即它能與P基因的起始密碼子區(qū)域(-18～+6位)結(jié)合。抑制P蛋白的合成。用AsP抑制HBV P基因的表達(dá)將會(huì)抑制HBVDNA的復(fù)制。
根據(jù)以上理論及HBV基因序列(包括adr亞型)，針對(duì)HBV 1798到1821位，1807到1827位，ε位點(diǎn)及P基因，本發(fā)明設(shè)計(jì)相應(yīng)的反義脫氧寡核苷酸AsC 5’TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCA 3’與HBV1798到1821位核苷酸互補(bǔ)，AsD 5’AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTG 3’與HBV1807到1827位核苷酸互補(bǔ)。即它們能與4種mRNA的3’端靶結(jié)合。ASE 5’GCC ACC CAAGGC ACA GCT TGG 3’與HBV的1875到1895位核苷酸互補(bǔ)。AsP 5’GGGCAT TTG GTG GTC TGT AAG CAG 3’與HBV的2292到2315位核苷酸互補(bǔ)。其中ASC和ASP專門針對(duì)adr亞型，ASD,AsE，則對(duì)各亞型通用，與已有的報(bào)道相比，序列上有一些不同，更大的差別在于文獻(xiàn)報(bào)道用化學(xué)修飾，本發(fā)明采用3’單磷酸化修飾。
本發(fā)明提出的4種寡核苷酸的作用機(jī)理主要著眼于抑制病毒DNA的復(fù)制，而不是單純抑制某個(gè)RNA的翻譯，尤其是用AsC和ASD激活RNaseH在DRⅠ和DRⅡ中間將前基因RNA切斷以及ASC,ASD和AsE與4種mRNA結(jié)合，使之被RNaseH水解這一機(jī)制均未見有報(bào)道。通過(guò)抑制病毒DNA的復(fù)制，減少病毒DNA數(shù)量，進(jìn)而導(dǎo)致病毒基因的表達(dá)即病毒抗原蛋白合成的減少。在實(shí)驗(yàn)中可以通過(guò)檢測(cè)HBV病毒DNA的減少和病毒抗原蛋白的減少來(lái)了解這些寡核苷酸的抑制作用。
考慮到血清中及細(xì)胞內(nèi)有較高活性的核酸水解酶，其中主要為3’→5’核酸外切酶，它要求3’端為OH基團(tuán)的核酸為底物。根據(jù)本發(fā)明人以前的研究成果(參見發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?7106495.4，申請(qǐng)日1997年6月28日)，本發(fā)明對(duì)寡聚核苷酸也進(jìn)行3’單磷酸化修飾，當(dāng)寡核苷酸3’的OH基團(tuán)被磷酸化后，就不能作為3’→5’核酸外切酶的底物，延長(zhǎng)了其在血清中及細(xì)胞內(nèi)的滯留時(shí)間，因此能夠更有效地與目的基因的互補(bǔ)序列相結(jié)合，抑制作用也更強(qiáng)。此外，寡核苷酸3’的OH基團(tuán)被磷酸化后也不能作為病毒DNA合成的引物，可抑制病毒DNA的復(fù)制。因此，在DNA合成儀上合成了本發(fā)明的上述4條3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P),AsD(3’P),AsE(3’P)和AsP(3’P)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法進(jìn)行了純化。
為了研究本發(fā)明設(shè)計(jì)的四條反義脫氧寡核苷酸對(duì)于HBV DNA復(fù)制及基因的表達(dá)的抑制作用，本發(fā)明采用HBV質(zhì)粒DNA(p1.2Ⅱ)轉(zhuǎn)染到肝來(lái)源的HepG2細(xì)胞作為模型來(lái)研究反義脫氧寡核苷酸的作用。質(zhì)粒(p1.2Ⅱ)含有1.2倍長(zhǎng)度的HBV(adr亞型)基因克隆，包括全長(zhǎng)的HBV基因組及1403～1983的重疊區(qū)，它能表達(dá)所有的HBVmRNA，轉(zhuǎn)染到肝來(lái)源的HepG2細(xì)胞之后，可以表達(dá)HBsAg和HBeAg及產(chǎn)生完整的有感染活力的病毒顆粒。由于它是adr亞型，因而可以作為研究本發(fā)明設(shè)計(jì)的四條反義脫氧寡核苷酸對(duì)乙型肝炎的抑制作用的模型。測(cè)定細(xì)胞中HBV DNA的考貝數(shù)可以觀察反義脫氧寡核苷酸對(duì)HBVDNA復(fù)制的抑制作用。用已有的測(cè)定試劑盒可以測(cè)定HBsAg和HBeAg的表達(dá)量，可以觀察反義脫氧寡核苷酸抑制HBVDNA復(fù)制后，使病毒DNA減少，進(jìn)而產(chǎn)生的對(duì)HBV基因表達(dá)的抑制作用。研究結(jié)果證明本發(fā)明合成的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P),AsD(3’P),AsE(3’P)和AsP(3’P)能夠抑制HBV病毒DNA的復(fù)制和HBV的S抗源和E抗源的表達(dá)。在下面的實(shí)施例中將表示出本發(fā)明反義脫氧寡核苷酸對(duì)乙型肝炎病毒在HepG2細(xì)胞中DNA復(fù)制和基因表達(dá)都有明顯的抑制作用，證明本發(fā)明反義脫氧寡核苷酸可用于配制抑制乙型肝炎病毒及治療乙型肝炎的藥物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1，提供了一種反義脫氧寡核苷酸，它能通過(guò)RNaseH切斷病毒DNA復(fù)制的模板前基因RNA或抑制病毒DNA復(fù)制的起始或抑制病毒聚合酶的合成，達(dá)到抑制乙型肝炎病毒DNA的復(fù)制，減少病毒DNA數(shù)量，進(jìn)而抑制病毒的繁殖及乙型肝炎病毒基因的表達(dá)。這是一種直接抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制及病毒基因的表達(dá)的物質(zhì)，為乙型肝炎的治療提供了新的方法。
2，用反義脫氧寡核苷酸抑制HBV病毒DNA復(fù)制及基因的表達(dá)具有專一性高的特點(diǎn)，而不會(huì)對(duì)人體細(xì)胞本身產(chǎn)生影響。
3，本發(fā)明提供的反義脫氧寡核苷酸還可以通過(guò)在反義脫氧寡核苷酸的3’末端加上一個(gè)磷酸提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。使它們對(duì)乙型肝炎病毒的抑制作用更加明顯。由于本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的反義脫氧寡核苷酸不含非天然的修飾成分，其降解產(chǎn)物不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用。
本發(fā)明通過(guò)以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的闡述，但并不限止本發(fā)明的范圍。
圖1 HBV基因組的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，反義寡核苷酸作用位點(diǎn)。
圖2 HBV病毒復(fù)制過(guò)程和AsC或AsD抑制作用圖解。
圖3點(diǎn)雜交檢測(cè)HBV DNA圖中1，對(duì)照脫氧寡核苷酸；2，不加脫氧寡核苷酸；3,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P)；4,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P)；5,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsE(3’P)；6,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P)。
圖4不同濃度的反義脫氧寡核苷酸對(duì)HBeAg表達(dá)的抑制作用圖中■,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P)；◆,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P)；●,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsE(3’P)；▲,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P)；×，對(duì)照脫氧寡核苷酸(NC)。
圖5不同濃度的反義脫氧寡核苷酸對(duì)HBsAg表達(dá)的抑制作用圖中■,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P)；◆,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P)；●,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsE(3’P)；▲,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P)；×，對(duì)照脫氧寡核苷酸(NC)。
圖6反義脫氧寡核苷酸對(duì)HBeAg表達(dá)抑制的時(shí)間曲線圖中A492表示492毫微米光吸收值?！?3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P)；◆,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P)；●,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsE(3’P)；▲,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P)；×，對(duì)照脫氧寡核苷酸(NC)；*，不加脫氧寡核苷酸。
圖7反義脫氧寡核苷酸對(duì)HBsAg表達(dá)抑制的時(shí)間曲線反義脫氧寡核苷酸或?qū)φ彰撗豕押塑账釢舛葹?0umol/L。
圖中A492表示492毫微米光吸收值?！?3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P)；◆,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P)；●,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsE(3’P)；▲,3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P)；×，對(duì)照脫氧寡核苷酸(NC)；*，不加脫氧寡核苷酸。
實(shí)施例1寡核苷酸的合成合成了4條反義脫氧寡核苷酸AsC,AsD,AsE和AsP；它們的結(jié)構(gòu)是
AsC 5’ TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCA 3’AsD 5’ AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTG 3’AsE 5’ GCC ACC CAA GGC ACA GCT TGG 3’AsP 5’ GGG CAT TTG GTG GTC TGT AAG CAG 3’。
及4條3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P),AsD(3’P),AsE(3’P)和AsP(3’P)；它們的結(jié)構(gòu)是AsC(3’P) 5’ TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCAp 3’AsD(3’P) 5’ AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTGp 3’AsE(3’P) 5’ GCC ACC CAA GGC ACA GCT TGGp 3’AsP(3’P) 5’ GGG CAT TTG GTG GTC TGT AAG CAGp 3’。
1條非互補(bǔ)的對(duì)照脫氧寡核苷酸NC:5’GAT CAT GGC GCG CTT TGA GGA 3’3′-單磷酸化寡核苷酸的合成使用0.2μmole 3′磷酸固相柱(3′-phosphateCPG Glen Research公司產(chǎn)品，全稱2-[2-(4,4’-二甲基三苯甲氧基)乙磺酰]乙基-丁二酰長(zhǎng)鏈烷基胺-微孔玻璃珠(2-[2-(4,4’-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfomyl]ethyl-succinoyllong chain alkylamino-CPG)，在ABI 391EP DNA合成儀上用0.2μmole合成順序合成。非修飾的反義脫氧寡核苷酸和對(duì)照脫氧寡核苷酸分別用0.2μmole dG固相柱和dA固相柱(Glen Research產(chǎn)品)，用相同的合成順序合成。產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。
實(shí)施例2反義脫氧寡核苷酸對(duì)乙型肝炎病毒在HepG2細(xì)胞中DNA復(fù)制的抑制作用一、實(shí)驗(yàn)步驟(1)質(zhì)粒DNA及反義脫氧寡核苷酸的轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于1×DMEM(含10％胎牛血清)培養(yǎng)液中，37℃,5％CO2培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天，接種細(xì)胞于12孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)染前5小時(shí)換新鮮的培養(yǎng)液。準(zhǔn)備溶液A質(zhì)粒p1.2Ⅱ(中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所汪垣教授提供)10μg，反義脫氧寡核苷酸(3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P),3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P),3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsE(3’P),3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P))或?qū)φ彰撗豕押塑账岣?0μmol/L，加不含血清的DMEM至100μl，混勻；溶液B:6μllipofectin(Gibco BRL產(chǎn)品)，94μl不含血清的DMEM，混勻，室溫放置30分鐘。溶液A和溶液B混勻，室溫放置30分鐘。用不含血清的DMEM洗細(xì)胞兩次，加入上述轉(zhuǎn)染混合液(每個(gè)樣品重復(fù)3次，)，37℃,5％CO2培養(yǎng)5小時(shí)，加入2ml含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃,5％CO2培養(yǎng)120小時(shí)。
(2)細(xì)胞DNA的抽提10μmol/L寡核苷酸作用5天后，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，合并重復(fù)三次的細(xì)胞，在4℃以3000g離心2分鐘，收集細(xì)胞于1.5ml離心管中，加入1ml TRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5分鐘，加入0.2ml氯仿，振蕩15秒，室溫放置2～3分鐘，4℃1200g離心15分鐘，將水相轉(zhuǎn)移至另一個(gè)1.5ml離心管中，用于細(xì)胞總RNA抽提。在中層及下層有機(jī)相加入0.3ml無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置5分鐘，然后10,000g離心5分鐘，棄上清，加入1ml 0.1mol/L檸檬酸鈉，10％乙醇溶液，室溫放置30分鐘，每5分鐘混勻一次，然后于4℃,10,000g離心5分鐘，重復(fù)用1ml 0.1mol/L檸檬酸鈉，10％乙醇溶液洗一次，懸浮于75％乙醇，室溫放置20分鐘，每5分鐘搖動(dòng)一次，于4℃,10,000g離心5分鐘，置于空氣中干燥后，加入100μl 8mmol/L NaOH溶解。
(3)HBV基因探針的制備質(zhì)粒p1.2Ⅱ用BamHⅠ酶切、電泳，純化出含3.2 kb長(zhǎng)度的完整線性HBVDNA，用隨機(jī)六核苷酸引物法制備HBVDNA探針，(參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，J.Sambrook &,E.F.Fritsch及T.Maniatis著，金冬雁等譯，科學(xué)出版社，1986年，502-504)。
(4)用點(diǎn)雜交(Dot Blot)檢測(cè)HBV DNA用抽濾加樣器把變性的DNA樣品點(diǎn)到尼龍膜上，用紫外交聯(lián)于膜上，然后與32P標(biāo)記的HBVDNA探針雜交。具體方法參見現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，盧圣棟主編，高等教育出版社，1993年，209-210；分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，J.Sambrook &,E.F.Fritsch及T.Maniafis著，金冬雁等譯，科學(xué)出版社，1986年，483-490。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析從圖3中可以看出，用3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P),3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P),3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsE(3’P)、3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P)作用的HepG2細(xì)胞中，其HBV DNA的考貝數(shù)要少于不加寡核苷酸及加不與HBV RNA配對(duì)的對(duì)照脫氧寡核苷酸的HepG2，細(xì)胞中HBV DNA的考貝數(shù)，表現(xiàn)為雜交點(diǎn)直徑較小，雜交點(diǎn)較淺。說(shuō)明反義脫氧寡核苷酸可以抑制HBV DNA的復(fù)制。
實(shí)施例3不同濃度反義脫氧寡核苷酸對(duì)乙型肝炎病毒基因表達(dá)的抑制試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)步驟(1)質(zhì)粒DNA(p1.2Ⅱ)及反義脫氧寡核苷酸轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于1×DMEM(含10％胎牛血清)培養(yǎng)液中，37℃,5％CO2培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天，接種細(xì)胞于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)染前5小時(shí)換新鮮的培養(yǎng)液。配制溶液A:0.8μg質(zhì)粒p1.2Ⅱ，及不同濃度的反義脫氧寡核苷酸及對(duì)照用的脫氧寡核苷酸，它們分別是0、40、80、120、160、200pmol。當(dāng)轉(zhuǎn)染體積是20μl時(shí)，脫氧寡核苷酸的終濃度分別是0、2、4、6、8、10μmol/L)，加DMEM至10μl，混勻；溶液B:0.3μl lipofectin,9.7μlDMEM，混勻，室溫放置30分鐘。溶液A和溶液B混勻，室溫放置30分鐘。用DMEM洗細(xì)胞兩次，加入上述轉(zhuǎn)染混合液(每個(gè)樣孔做6次，其中3個(gè)樣品的上清用重復(fù)測(cè)定HBsAg，另三個(gè)樣品的上清用于重復(fù)測(cè)定HBeAg),37℃,5％CO2培養(yǎng)5小時(shí)，加入100μl含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)120小時(shí)，取100μl細(xì)胞培養(yǎng)上清用于HBsAg及HBeAg的測(cè)定。
(2)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg及HBeAg的測(cè)定在包被抗HBs或HBe反應(yīng)板加入100μl待測(cè)標(biāo)本，并設(shè)HBsAg或HBeAg陽(yáng)性對(duì)照2孔，陰性對(duì)照2孔，空白對(duì)照1孔，然后每孔加入酶結(jié)合物100μl(空白不加)，充分混勻，封板。37℃孵育1小時(shí)。棄去反應(yīng)板孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿每孔，靜置20秒鐘，甩干，反復(fù)5次。然后每孔加底物液100μl，封板。37℃孵育15分鐘，加終止液50μl。最后，在酶標(biāo)儀上用空白孔校零，讀取各孔反應(yīng)液的492毫微米光吸收A492值。
(3)反義脫氧寡核苷酸對(duì)HBsAg及HBeAg抑制率的計(jì)算方法如下
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析(1)抗HBV的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P),AsD(3’P),AsE(3’P),AsP(3’P)對(duì)HBV抗原表達(dá)的抑制作用如圖4、圖5所示，抗HBV的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P),AsD(3’P),AsE(3’P),AsP(3’P)，既抑制了HBV DNA的復(fù)制也表現(xiàn)出對(duì)HBV基因表達(dá)的抑制。3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P)從2μmol/L開始即可明顯抑制HBeAg及HBsAg的表達(dá)，隨著3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P)濃度的提高，對(duì)HBeAg及HBsAg表達(dá)的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，至10μmol/L時(shí)，對(duì)HBeAg及HBsAg的抑制率分別是78.3％及84.0％；AsD(3’P)從2μmol/L開始即可明顯抑制HBeAg及HBsAg的表達(dá)，隨著3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P)濃度的提高，對(duì)HBeAg及HbsAg表達(dá)的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，至10μmol/L時(shí)，對(duì)HBeAg及HBsAg的抑制率分別是82.2％及88.0％；AsE(3’P)濃度提高至10μmol/L時(shí)，對(duì)HBeAg及HBsAg的抑制率分別是80.1％及87.0％；3’末端單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P)從2μmol/L開始也可明顯抑制HBeAg及HBsAg表達(dá)，隨著3’末端單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P)濃度的提高，對(duì)HBeAg及HBsAg表達(dá)的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，至10μmol/L時(shí)，對(duì)HBeAg及HBsAg的抑制率分別是47.6％及33.8％。
(2)抗HBV反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P),AsD(3’P),AsE(3’P),ASP(3’P)對(duì)HBV基因表達(dá)影響的比較3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸ASC(3’P),3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P),3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsE(3’P)，及3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸ASP(3’P)均能抑制HBV基因的表達(dá)。但是，3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸ASD(3’P)在0、2、4、6、8、10μmol/L時(shí)對(duì)HBeAg表達(dá)的抑制率分別是0、31.4％、51.8％、67.1％、72.9％和82.2％；對(duì)HBsAg表達(dá)的抑制率分別是0、31.4％、51.9％、76.3％、81.7％和88.0％。3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸ASC(3’P)在0、2、4、6、8、10μmol/L時(shí)對(duì)HBeAg表達(dá)的抑制率分別是0、28.3％、47.8％、62.7％、76.0％和78.3％；對(duì)HBsAg表達(dá)的抑制率分別是0、28.2％、46.8％、73.8％、78.0％和84.0％。3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsE(3’P)在0、2、4、6、8、10μmol/L時(shí)對(duì)HBeAg表達(dá)的抑制率分別是0、29.7％、49.3％、63.8％、73.7％和80.1％；對(duì)HBsAg表達(dá)的抑制率分別是0、30.1％、49.8％、76.3％、80.2％和87.0％。而3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P)在0、2、4、6、8、10μmol/L時(shí)對(duì)HBeAg表達(dá)的抑制率分別是0、17.9％、26.6％、32.9％、45.2％和47.6％；對(duì)HBsAg表達(dá)的抑制率分別是0、10.0％、23.8％、29.4％和33.8％。3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P),ASE(3’P)和AsC(3’P)
對(duì)HBV基因表達(dá)的抑制作用比3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P)對(duì)HBV基因的抑制作用要高出一倍左右。
實(shí)施例4反義脫氧寡核苷酸抑制乙型肝炎病毒基因表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)步驟HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于1×DMEM(含10％胎牛血清)培養(yǎng)液中，37℃,5％CO2培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天，接種細(xì)胞于12孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)染前5小時(shí)換新鮮的培養(yǎng)液。準(zhǔn)備溶液A質(zhì)粒p1.2Ⅱ10μg，反義脫氧寡核苷酸(3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P)、3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P),3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsE(3’P),3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P))或?qū)φ彰撗豕押塑账岣?0μmol/L，加不含血清的DMEM至100μ1，混勻；溶液B:6μl lipofectin,94μl不含血清的DMEM，混勻，室溫放置30分鐘。溶液A和溶液B混勻，室溫放置30分鐘，用不含血清的DMEM洗細(xì)胞兩次，加入上述轉(zhuǎn)染混合液(每個(gè)樣品重復(fù)3次，)，37℃,5％CO2培養(yǎng)5小時(shí)，加入2ml含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)在37℃,5％CO2培養(yǎng)，并每隔12小時(shí)取200μl細(xì)胞培養(yǎng)液用于HBsAg及HBeAg的測(cè)定，具體步驟同實(shí)施例2。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析從圖6及圖7可以看到，HBV基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，當(dāng)不加寡核苷酸時(shí)，HBeAg及HBsAg在第二天開始表達(dá)，隨著時(shí)間的增加，表達(dá)量逐步升高。當(dāng)加入10μmol/L 3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsC(3’P)或3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P),3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsE(3’P)，或3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsP(3’P)時(shí)，HBeAg及HBsAg的表達(dá)比不加反義脫氧寡核苷酸時(shí)要明顯降低，尤其是加入3’單磷酸化修飾的反義脫氧寡核苷酸AsD(3’P),AsE(3’P)和AsC(3’P)時(shí)，對(duì)HBeAg及HBsAg表達(dá)的抑制作用尤其顯著，而且這種抑制作用持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4天。HBeAg及HBsAg的表達(dá)量上升很慢，至第4天之后，HBeAg及HBsAg的表達(dá)量才有稍明顯的升高。說(shuō)明反義寡核苷酸對(duì)HBV基因表達(dá)的抑制作用可持續(xù)至DNA轉(zhuǎn)染后第5天。同時(shí)，當(dāng)加入不能與HBV mRNA互補(bǔ)的對(duì)照脫氧寡核苷酸時(shí)，HBeAg及HBsAg的表達(dá)量也有些降低，這可能是由于DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中的脫氧寡核苷酸影響了HBVDNA的轉(zhuǎn)染效率，因此，HBeAg及HBsAg的表達(dá)量有所下降。但是，HBeAg及HBsAg表達(dá)量下降的幅度要明顯小于反義脫氧寡核苷酸對(duì)HBeAg及HBsAg表達(dá)的抑制作用。
權(quán)利要求
1．一種抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制及乙型肝炎病毒基因表達(dá)的反義脫氧寡核苷酸，其特征在于該反義脫氧寡核苷酸與HBV的1798到1821位，1807到1827位，ε區(qū)的1875到1895位及HBV的P基因mRNA起始密碼子區(qū)域結(jié)合。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的反義脫氧寡核苷酸，其特征在于該反義脫氧寡核苷酸包括4條反義脫氧寡核苷酸，即AsC,AsD,AsE和AsP，它們分別與HBV的1798到1821位，1807到1827位，ε區(qū)的1875到1895位及HBV的P基因mRNA起始密碼子區(qū)域結(jié)合，它們的序列如下AsC 5’ TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCA 3’AsD 5’ AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTG 3’AsE 5’ GCC ACC CAA GGC ACA GCT TGG 3’AsP 5’ GGG CAT TTG GTG GTC TGT AAG CAG 3’。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的反義脫氧寡核苷酸，其特征在于該反義脫氧寡核苷酸是通過(guò)3’單磷酸化修飾，它們的結(jié)構(gòu)如下AsC(3’P) 5’ TGC ATG GTG CTG GTG A AC AGA CCAp 3’AsD(3’P) 5’ AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTGp 3’AsE(3’P) 5’ GCC ACC CAA GGC ACA GCT TGGp 3’AsP(3’P) 5’ GGG CAT TTG GTG GTC TGT AAG CAGp 3’。
4．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的反義脫氧寡核苷酸的應(yīng)用，其特征在于該反義脫氧寡核苷酸含有下列序列之一AsC 5’ TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCA 3’AsD 5’ AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTG 3’AsE 5’ GCC ACC CAA GGC ACA GCT TGG 3’AsP 5’ GGG CAT TTG GTG GTC TGT AAG CAG 3’，可應(yīng)用于配制抑制乙肝病毒及治療乙型肝炎的藥物。
5．根據(jù)權(quán)利要求3所述的反義脫氧寡核苷酸的應(yīng)用，其特征在于該反義脫氧寡核苷酸含有下列寡核苷酸之一AsC(3’P) 5’ TGC ATG GTG CTG GTG AAC AGA CCAp 3’AsD(3’P) 5’ AAA AGT TGC ATG GTG CTG GTGp 3’AsE(3’P) 5’ GCC ACC CAA GGC ACA GCT TGGp 3’AsP(3’P) 5’ GGG CAT TTG GTG GTC TGT AAG CAGp 3’，可應(yīng)用于配制抑制乙肝病毒及治療乙型肝炎的藥物。
全文摘要
一種抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制及乙型肝炎病毒基因表達(dá)的反義脫氧寡核苷酸,包括4條分別能與乙型肝炎病毒的1798到1821位,1807到1827位,ε區(qū)的1875到1895位及P基因的mRNA起始密碼子區(qū)域結(jié)合的反義脫氧寡核苷酸。在其3’端也可用單磷酸化修飾以提高穩(wěn)定性,使其抑制乙型肝炎病毒更有效。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明,該反義脫氧寡核苷酸能抗乙型肝炎病毒,可應(yīng)用于配制抑制乙肝病毒及治療乙型肝炎的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/7125GK1218056SQ98111018
公開日1999年6月2日 申請(qǐng)日期1998年8月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月27日
發(fā)明者陸長(zhǎng)德, 陳錦輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所