專利名稱：2－型趨化因子結(jié)合蛋白及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及總的來說，本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，特別是各種痘病毒編碼的趨化因子結(jié)合蛋白和它們的使用方法。
2．相關(guān)技術(shù)的說明人們逐漸明了，在較高等級的脊椎動物的細(xì)胞中生存的病毒必定已經(jīng)進(jìn)化到能特異地回避寄主的免疫系統(tǒng)(Gooding,L.，細(xì)胞，91:5-7,1992；Marrack,P.和Kappler,J.,細(xì)胞，76:323-332,1994；Smith,G.,微生物學(xué)趨勢，82:80-88,1994)。事實上，病毒的生存依賴于回避，抑制，抵銷，或混淆寄主對外源入侵的無數(shù)應(yīng)答的策略。免疫系統(tǒng)的效應(yīng)裝備授予的選擇壓力顯然是進(jìn)化壓力的強有力的因素，今天現(xiàn)存的所有真核病毒都含有與免疫系統(tǒng)戰(zhàn)斗的印跡或殘跡，如編碼的蛋白或它們特殊的生物學(xué)生存策略所證實的。
更大的DNA病毒(即，腺病毒，皰疹病毒，虹彩病毒和痘病毒)特異地編碼起保護(hù)病毒不受感染寄主的免疫識別和/或清除功能的蛋白質(zhì)。這樣的“subversive”病毒蛋白質(zhì)現(xiàn)在正提供出有關(guān)免疫系統(tǒng)功能操作的信息，并且很可能在將來將鑒定這一正在增長的家族的更多新成員的發(fā)現(xiàn)。
在二十世紀(jì)八十年代，術(shù)語“病毒因子”是用來描述從感染細(xì)胞分泌的病毒編碼的蛋白質(zhì)，病毒因子通過模仿細(xì)胞外信號分子如對寄主免疫的組成成分很重要的細(xì)胞因子或其它分泌的調(diào)節(jié)物而起作用(Kotwal,G.和Moss,B.，自然，335:176-178,1988)。后來，在二十世紀(jì)九十年代，引入了術(shù)語“病毒編碼受體”來解釋觀察到的現(xiàn)象，就是一些病毒編碼蛋白模仿重要的細(xì)胞受體，并通過將寄主細(xì)胞因子從它們正常的受體中轉(zhuǎn)移，從而在最早時期干擾免疫路線而起作用(Upton，等人，病毒學(xué)，184:370,1991；Schreiber和McFadden，病毒學(xué)，204:692-705,1994)。
最近對特殊的痘病毒，粘液瘤病毒的研究表明該病毒通過各種策略破壞免疫系統(tǒng)(McFadden和Graham，病毒學(xué)討論會，5:421-429,1994)。粘液瘤病毒是稱為粘液瘤病的家養(yǎng)兔的有毒性的系統(tǒng)疾病的感染試劑。根據(jù)上一世紀(jì)的最早敘述，粘液瘤病毒是實驗室動物中發(fā)現(xiàn)的第一個病毒致病原，并且是明確地為了根除害蟲的目的故意引入環(huán)境中的第一個病毒試劑。因為它是在40多年以前釋放進(jìn)澳大利亞和歐洲野兔群體中的，兔和病毒的野生品系已經(jīng)經(jīng)過了相互進(jìn)化和選擇壓力，在接種區(qū)已經(jīng)導(dǎo)致了穩(wěn)定狀態(tài)的地方性動物病(Fenner,F.和Ratcliffe,F.N.,“粘液瘤病”，劍橋大學(xué)出版社，倫敦，1965)。
粘液瘤具有許多與其它痘病毒相關(guān)的生物學(xué)特征，也就是復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)定位和大的雙鏈DNA基因組(160kb)。許多證據(jù)表明，粘液瘤，象所有的痘病毒，編碼多重基因產(chǎn)物，這些基因產(chǎn)物的功能是允許該病毒在各種寄主組織中傳播和繁殖。這些病毒蛋白質(zhì)中的一些蛋白質(zhì)特異地抵抗或破壞寄主炎癥應(yīng)答的發(fā)展和獲得性細(xì)胞免疫，通常痘病毒是這樣的免疫調(diào)節(jié)蛋白的豐富來源(Turner,P.C.，和Moyer,R.W.,Cur.Top.Microbiol.Imm.,163:125-152,1990；Buller,R.M.L.和Palumbo,G.J.,Micro.Dev.,55:80-122,1991；Smith,G.L.,J.Gen.Virol.,94:1725-1740,1993；McFadden,G.,(Ed)，“病毒受體，病毒因子和相關(guān)的DNA病毒編碼的免疫調(diào)節(jié)物”R.G.Landes公司Austin Texas,1995)。
這樣的免疫調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的例子包括粘液瘤生長因子(MGF)，該因子以類似旁分泌的方式通過細(xì)胞表皮生長因子受體刺激鄰近細(xì)胞(Upton，等人，病毒學(xué)雜志，61:1271-1275,1987；Opgenorth，等人，病毒學(xué)，186:185-191,1992；Opgenorth，等人，病毒學(xué)，192:701-708,1992；Opgenorth，等人，病毒學(xué)雜志，66:4720-4731,1992)；Serpl，具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的分泌糖蛋白，它防止了早期炎癥應(yīng)答的發(fā)展(Upton，等人，病毒學(xué)，179:628-631,1990；Lomas,等人，JBC,268:516-521,1993；Macen，等人，病毒學(xué)，195:348-363,1993)；T2，分泌的細(xì)胞腫瘤壞死因子(TNF)受體超家庭的病毒同系物，它結(jié)合和抑制兔TNF(Smith，等人，BBRC,176:335-342,1991；Schreiber,M.和McFadden,G.,出處同上，1994；Upton，等人，出處同上，1991)；T7，分泌的細(xì)胞干擾素γ受體的病毒同系物，它結(jié)合和抑制兔干擾素γ(Upton，等人，科學(xué)，258:1369,1992；Upton和McFadden,分子遺傳學(xué)方法，4:383,1994；Mossman，等人，“病毒受體，病毒因子和相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)物”，p.41-54Ed.McFadden,R.G.Landers公司，1995)；和M11L，類似表面受體蛋白，它通過未知的機制干擾炎癥應(yīng)答(Opgenorth，等人，出處同上；Graham，等人，病毒學(xué)，191:112-124,1992)。
免疫調(diào)節(jié)蛋白也包括趨化細(xì)胞因子，稱為“趨化因子”。趨化因子是小分子量的免疫配體，它們是白細(xì)胞，如特別是嗜中性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和T細(xì)胞的化學(xué)引誘物。存在兩類主要的趨化因子，都含有四個保守的半胱氨酸殘基，在蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)中形成二硫鍵。α類命名為C-X-C(其中X是任何氨基酸)，它包括IL-8,CTAP-Ⅲ,gro/MGSA和ENA-78；和β類，命名為C-C，包括MCP-1,MIP-1α和β，和調(diào)節(jié)激活，正常的T表達(dá)和分泌蛋白質(zhì)(RANTES)。類別的命名的根據(jù)是干擾殘基是否隔開了基序中開始兩個半胱氨酸。通常，大多數(shù)C-X-C趨化因子是嗜中性粒細(xì)胞而不是單核細(xì)胞的化學(xué)引誘物，而C-C趨化因子似乎吸引單核細(xì)胞而不是嗜中性粒細(xì)胞。最近，發(fā)現(xiàn)了稱為lymphotactin的新蛋白質(zhì)，命名為第三類趨化因子“C”組(Kelner，等人，科學(xué)，266:1395-1933,1994)。我們確信趨化因子家族在淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞滲入炎癥位點中是非常重要的。
很可能更多的免疫調(diào)節(jié)病毒基因仍然有待發(fā)現(xiàn)。這些基因和相關(guān)基因產(chǎn)物不僅提供仔細(xì)分析不同的寄主抗病毒防御機制裝備的有用工具，而且它們也可以提供鑒定細(xì)胞免疫組成的新元素和抑制炎癥和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)失常的新藥物類別的新探針。
本發(fā)明的概要本發(fā)明敘述了可溶的特異于病毒的細(xì)胞因子類的抑制劑的新家族，這些細(xì)胞因子參與白細(xì)胞的趨化性，總稱為“趨化因子”。這些蛋白質(zhì)命名為2型趨化因子結(jié)合蛋白(2型CBP)并且屬于痘病毒蛋白質(zhì)家族，這一蛋白質(zhì)家族與Shope纖維瘤病毒和粘液瘤病毒編碼的T1蛋白質(zhì)(SFV-T1)相關(guān)。2型CBP和相關(guān)的功能同系物可用于治療各種炎癥紊亂失調(diào)，在這些病癥中，病理過程與白細(xì)胞的過量流入相關(guān)。
附圖的簡要說明

圖1顯示了與趨化性細(xì)胞因子(趨化因子)結(jié)合的痘病毒蛋白質(zhì)2型CBP家族的已知成員的序列排列。RPV35千道爾頓的序列是不完全的。
圖2顯示了粘液瘤的T1基因的核苷酸序列，它表達(dá)了2型CBP。盒狀核苷酸三聯(lián)體是鄰接的T2基因(TNF-受體同系物)的終止密碼，箭頭指出了推測的信號肽切割位點，和下面劃線的氨基酸是T1蛋白質(zhì)(SEQID NO:1和SEQ ID NO:2)的兩個推測的N-糖基化位點。
圖3顯示了兔痘病毒(RPV)的35千道爾頓蛋白質(zhì)，2型CBP家族的一個成員，它與趨化因子的C-C家族(MIP-1β，上面的組)和C-X-C家族(11-8，中間的組)的成員結(jié)合。在上面兩組中，這些放射性標(biāo)記的配體與對照感染BGMK細(xì)胞(MOCK)，或者用粘液瘤(MYX)，粘液瘤的缺失T7的突變體(MYX-T7-)，兔痘病毒(RPV)，和RPV的缺失35千道爾頓的突變體(RPV-35K-)感染的細(xì)胞分泌的病毒蛋白質(zhì)交叉連接。箭頭表示了配體和病毒蛋白之間的交聯(lián)復(fù)合體。雖然粘液瘤1型CBP蛋白質(zhì)(T7)也與趨化因子結(jié)合，2型CBP蛋白質(zhì)(T1)的大小(約35千道爾頓)實際上與底部的組中顯示的一樣。所以T1(2型)和T7(1型)粘液瘤的蛋白質(zhì)都與趨化因子結(jié)合，但只有PRV的35千道爾頓蛋白質(zhì)(2型)具有這一活性。
圖4顯示了從牛痘(Lister毒株)分泌的35千道爾頓蛋白質(zhì)，這種蛋白正從WR毒株中消失，這種蛋白與35千道爾頓的RPV分泌蛋白質(zhì)一樣與趨化因子MIP-1β結(jié)合。箭頭表示了MIP-1β和用Lister牛痘毒株，而不是WR毒株感染的BGMK細(xì)胞分泌的35千道爾頓蛋白質(zhì)之間的復(fù)合物。
本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)提供了重要的抗免疫蛋白的新來源，它具有治療廣泛范圍的免疫病理病癥的潛力，這些病癥與炎癥和對損壞，感染和各種疾病狀態(tài)的免疫應(yīng)答過程中淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)運輸?shù)浇M織位點相關(guān)。
已經(jīng)克隆和測序的2型CBP基因不是已知趨化因子受體的分泌同系物，如最近的綜述中所述，這些受體都具有七個跨膜區(qū)(稱為“蛇根堿”)(Kelvin,D.J.,等人，白細(xì)胞生物學(xué)雜志，54:604-612,1993；Murphy,P.M.,免疫學(xué)年評，12:593-633,1994；Horuk,R.,今日免疫學(xué)，15:169-174,1994；和Horuk,R.,藥學(xué)科學(xué)趨勢，15:159-165,1994)。雖然一些DNA病毒編碼這樣的蛇根堿受體的同系物(Ahuja,S.K.,等人，今日免疫學(xué)，15:281-287,1994)，這些受體至少包括一個痘病毒中的基因候選物(Massung,R.F.,等人，病毒學(xué)，197:511-528,1994)，但本發(fā)明的2型CBP不是這一特殊受體家族的成員。
作為例證的本發(fā)明的2型趨化因子結(jié)合蛋白(2型CBP)是從Shope纖維瘤病毒感染的細(xì)胞中分泌的一種蛋白質(zhì)，是T1開放讀碼框架編碼的(Upton，等人；病毒學(xué)，160:20-30,1987；和基因庫登記號P25946)。這一蛋白質(zhì)與牛痘(Copenhagen和Liser毒株)和兔痘病毒分泌的35千道爾頓蛋白質(zhì)具有明顯的序列相似性。另外，2型CBP蛋白質(zhì)與粘液瘤M-T7蛋白質(zhì)是有區(qū)別的，M-T7蛋白質(zhì)與兔IFN-γ而不是鼠或人IFN-γ結(jié)合(Mossman，等人，生物化學(xué)雜志，270:3031-3038,1995)，但M-T7蛋白質(zhì)也與趨化因子結(jié)合，命名為1型趨化因子結(jié)合蛋白(前面稱為趨化因子結(jié)合蛋白-1(CBP-1))。
術(shù)語“趨化因子結(jié)合蛋白”指結(jié)合和抑制一個或更多趨化因子的蛋白質(zhì)?！摆吇蜃印笔且活惣?xì)胞因子，它負(fù)責(zé)白細(xì)胞的趨化性。將α類趨化因子命名為C-X-C(其中X是任何氨基酸)，包括白細(xì)胞介素-8(IL-8)，結(jié)締組織活化蛋白質(zhì)Ⅲ(CTAP-Ⅲ)，黑素細(xì)胞生長刺激活性(MGSA)gro/MGSA,IFN-γ可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)(IP-10)，嗜中性粒細(xì)胞活化肽2(NAP2),β-血栓珠蛋白和上皮起源的嗜中性粒細(xì)胞引誘物78(ENA-78)；和β類，命名為C-C，包括T-細(xì)胞活化基因-3(TCA-3)，單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1,2和3)，巨嗜細(xì)胞炎癥蛋白(MIP-1α和β)，和當(dāng)活化進(jìn)行調(diào)節(jié)的，正常的T表達(dá)和分泌蛋白質(zhì)(RANTES)。
其它趨化因子可以通過本領(lǐng)域通常使用的方法檢測。例如，利用Boyden室可以檢測分子，Boyden室是優(yōu)選的用于體外研究化學(xué)引誘物質(zhì)的微趨化測試系統(tǒng)。在有機玻璃塊中形成一系列孔，每個孔由兩個室組成，上層和下層，兩層之間是由幾種類型的多孔過濾器中的任一種，如硝酸纖維和聚碳酸酯分開的。在每個孔的頂部的室中加入所感興趣的細(xì)胞如外周血液單核細(xì)胞(PBMC)，并在底部的室中加入測試物質(zhì)，如化學(xué)引誘物。如果將頂部室中的細(xì)胞吸引到底部室中的物質(zhì)上，它們將沿著存在于溶液中的理論濃度梯度遷移并通過過濾器的孔，吸附于過濾器的底部一側(cè)。
現(xiàn)在，利用本發(fā)明的CBP可以篩選懷疑是趨化因子家族成員的多肽。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了篩選和鑒定新趨化因子的方法，該方法包括將本發(fā)明的游離的或結(jié)合基質(zhì)的CBP與懷疑含有一個或更多趨化因子的組合物接觸，并檢測CBP與該組合物的結(jié)合。
如果需要，可以使用各種標(biāo)記作為檢測CBP與趨化因子的結(jié)合的手段。可以將趨化因子或CBP直接或間接地可檢測地標(biāo)記，例如用放射性同位素，熒光化合物，生物熒光化合物，化學(xué)熒光化合物，金屬螯合物或酶。本領(lǐng)域的這些普通技術(shù)人員將知道其它適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物或能夠利用常規(guī)實驗確定這些物質(zhì)。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療受治療者的免疫病理紊亂的方法，該方法包括對受治療者給藥治療有效量的抗炎癥蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的特征是如還原型SDS-PAGE確定的，根據(jù)糖基化程度，分子量約為30-40千道爾頓，具有與SFVT1或RPV35千道爾頓同系物的氨基酸序列同源性，并具有從感染細(xì)胞中分泌出來的特征。術(shù)語“抗炎癥”指減弱或抑制炎癥應(yīng)答。
如在SDS-PAGE中的還原條件下確定的，本發(fā)明的糖基化和分泌形式的2型CBP具有約為35-40千道爾頓的表觀分子量。另外，該蛋白質(zhì)與SFVT1和RPV35千道爾頓分泌蛋白質(zhì)具有同源性。術(shù)語“同源性”指在2型CBP和其它家族成員之間氨基酸水平上的同一性程度。優(yōu)選地，2型CBP與SFVT1蛋白質(zhì)之間的氨基酸序列同源性為50-95％。這一同源性的要求不是嚴(yán)格的，但是，2型CBP必須保留與人趨化因子相互反應(yīng)的生物學(xué)功能。用另一句話說，只要2型CBP結(jié)合和抑制趨化因子，同源性就足夠了。
本發(fā)明包括功能性多肽，2型CBP，和其功能片斷。如本文所用，術(shù)語“功能性多肽”指具有生物學(xué)功能或活性的多肽，這種生物學(xué)功能或活性是通過確定的功能性測試鑒定的，與特殊的生物學(xué)，形態(tài)學(xué)，或表現(xiàn)型應(yīng)答相關(guān)。2型CBP多肽的功能性片斷包括2型CBP的片斷，只要該片斷保留2型CBP活性(如結(jié)合趨化因子)。本發(fā)明包括含有2型CBP的生物學(xué)活性的更小的肽。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所知的方法可以測試這些肽與趨化因子的結(jié)合，這些方法包括本文的實施例中所述的方法。這一生物學(xué)功能可以從抗體分子結(jié)合的多肽片斷以及表位變化到在細(xì)胞中能夠參與表現(xiàn)型變化的特征性誘導(dǎo)或編制的大多肽?！肮δ苄远嗪塑账帷敝妇幋a本文所述的功能性多肽的多核苷酸。
對2型CBP一級氨基酸序列的小的修飾可以產(chǎn)生與本文所述的2型CBP多肽比較，具有基本上相當(dāng)?shù)幕钚缘牡鞍踪|(zhì)。這樣的修飾可以是故意的，如位點特異誘變，或自發(fā)的。這些修飾產(chǎn)生的所有多肽都包括在本文中，只要這些多肽保留了2型CBP活性。另外，缺失一個或更多氨基酸也可以導(dǎo)致得到的分子的結(jié)構(gòu)修飾而不明顯改變它的活性。這可以導(dǎo)致開發(fā)較小的活性分子，從而具有更廣的用途。例如，可以除去氨基或羧基末端的氨基酸，這些氨基酸可能不是2型CBP活性所必需的。
本發(fā)明的2型CBP多肽也包括多肽序列的保守變化。如本文所用，術(shù)語“保守變化”指用另一個生物學(xué)相似的殘基替代一個氨基酸殘基。
保守變化的實施例包括用一個疏水殘基如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸替代另一個，或用一個極性氨基酸殘基替代另一個，如用精氨酸替代賴氨酸，谷氨酸替代天冬氨酸，或谷氨酰胺替代天冬酰胺，和諸如此類。術(shù)語“保守變化”也包括在未替代的親本氨基酸位置使用替代氨基酸，前提是對抗替代多肽的抗體也與未替代多肽發(fā)生免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明的方法中使用的2型CBP的病毒來源的例子包括粘液瘤病毒，牛痘(Lister和Copenhagen毒株)，Shope纖維瘤病毒，兔痘和其它哺乳動物痘病毒，只要2型CBP具有抗炎癥蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，該蛋白的特征是分子量約為30-40千道爾頓，取決于具有與SFVT1蛋白質(zhì)同系物的同源性的糖基化程度，并具有這一蛋白質(zhì)家族的生物學(xué)功能。
通過本發(fā)明的方法治療的免疫病理紊亂可能與趨化因子的產(chǎn)生和在患病組織中導(dǎo)致的反應(yīng)性的白細(xì)胞的積累有關(guān)。治療方法包括對受治療者給藥治療有效量的2型CBP。術(shù)語“免疫病理紊亂”通指涉及免疫應(yīng)答或免疫的任何疾病。本文所用的“治療有效”是指足以改良免疫病理紊亂狀況的2型CBP的量?！案牧肌笔侵笢p輕這種紊亂對接受治療的病人的有害效果。本發(fā)明的受治療者優(yōu)選地是人，但是，可以預(yù)想利用本發(fā)明的方法可以治療任何患有免疫病理紊亂的動物，例如，用人骨髓移植的SCID鼠(人化SCID)。通過本發(fā)明的方法可以治療的免疫病理紊亂的例子包括獲得性免疫缺陷紊亂(AIDS)，毒性休克綜合癥，異源移植排斥，動脈粥樣硬化斑點增長，紫外線和放射反應(yīng)，和與免疫應(yīng)答和急性時期應(yīng)答過程中T細(xì)胞，B細(xì)胞，巨嗜細(xì)胞，和其它炎癥白細(xì)胞的活化相關(guān)的紊亂，和與晚期癌癥如腫瘤壞死因子傳導(dǎo)的惡病質(zhì)相關(guān)的紊亂。
本發(fā)明提供了治療或改良免疫病理紊亂包括內(nèi)毒素血癥或敗血休克(膿毒)，或一種或多種膿毒癥狀的方法，該方法包括對表現(xiàn)出膿毒癥狀或有發(fā)展膿毒危險的受治療者給藥治療有效量的2型CBP。術(shù)語“改良”指減少或減輕治療的紊亂癥狀。
除了用2型CBP治療外，還可以用抗生素或抗病毒藥治療表現(xiàn)出免疫病理紊亂癥狀的病人。典型的抗生素包括氨基糖苷，如慶大霉素或β-內(nèi)酰胺如青霉素，或頭孢菌素。所以，本發(fā)明的治療方法包括基本上同時給藥治療有效量的2型CBP和殺菌量的抗生素或足夠量的抗病毒化合物。
本文所用的術(shù)語“殺菌量”指在接受治療的病人的血液中足以達(dá)到殺死細(xì)菌的濃度的量。通常確認(rèn)為對人能安全給藥的抗生素殺菌量是本領(lǐng)域已知的，正如本領(lǐng)域已知的，該量隨著具體的抗生素和治療的細(xì)菌感染的類型而變化。優(yōu)選地，在大約48小時內(nèi)給藥2型CBP，更優(yōu)選地在大約2-8小時內(nèi)，最優(yōu)選地，基本上與抗生素的給藥同時進(jìn)行。
在本發(fā)明的方法中給藥2型CBP也可以用于改良再灌注后的損傷。當(dāng)治療動脈血栓形成時，凝塊溶解試劑如組織纖溶酶原激活劑(t-PA)誘導(dǎo)的再灌注經(jīng)常與組織損傷相關(guān)。我們認(rèn)為白細(xì)胞包括但不限于多形核白細(xì)胞(PMN)至少部分地介導(dǎo)了這樣的組織損傷。所以，給藥2型CBP將阻止白細(xì)胞或PMN一內(nèi)皮的相互作用，從而減輕或防止再灌注后的損傷。給藥2型CBP也可以用于在動脈損傷后防止動脈粥樣硬化斑點增長的新發(fā)生和重新出現(xiàn)。我們確信對動脈壁的內(nèi)層的局部炎癥應(yīng)答加劇了再狹窄和斑點的新生長。
本發(fā)明的方法也用于治療由于過敏或自我免疫紊亂導(dǎo)致的炎癥。過敏反應(yīng)紊亂的例子包括過敏性鼻炎，哮喘，特異性皮炎，和食物過敏。自我免疫紊亂的例子，其中免疫系統(tǒng)攻擊寄主自我的組織，包括但不限于，1型依賴胰島素的糖尿病，炎癥性腸道疾病，皮炎，腦膜炎，血栓形成中血小板減少形成的紫斑，Sjogern綜合癥，腦炎，眼色素層炎，白細(xì)胞粘連缺陷，類風(fēng)濕病和其它形式的免疫關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕性發(fā)燒，Reiter綜合癥，關(guān)節(jié)病型牛皮癬，急進(jìn)的系統(tǒng)性硬化癥，初期的膽硬化，天皰瘡，類天皰瘡，壞死性脈管炎，重癥肌無力，多重硬化，紅斑狼瘡，多肌炎，結(jié)節(jié)病，肉芽腫病，脈管炎，惡性貧血，CNS炎癥紊亂，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，自身免疫溶血貧血，Hashimoto甲狀腺炎，Graves病，習(xí)慣性自發(fā)流產(chǎn)，Reynard綜合癥，腎小球性腎炎，皮肌炎，慢性活動性肝炎，腹腔疾病，AIDS的自身免疫并發(fā)癥，萎縮性胃炎，關(guān)節(jié)粘連性脊椎炎，和Addison病。
本方法也用于治療非惡性的或與免疫相關(guān)的細(xì)胞增殖疾病如，牛皮癬，天皰瘡vulgaris,Behcet綜合癥，急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，局部貧血心臟病，動脈粥樣硬化，透析后綜合癥，白血病，獲得性免疫缺陷綜合癥，敗血病休克和其它類型的急性炎癥，和脂質(zhì)組織細(xì)胞增多癥。任何由于趨化因子的產(chǎn)生(如誘導(dǎo)IL-8,MIP-1α或β的表達(dá))導(dǎo)致的紊亂基本上被認(rèn)為對治療是敏感的，這些紊亂與炎癥前過程和細(xì)胞滲濾有病原學(xué)聯(lián)系。
本發(fā)明的方法也用于治療微生物感染。許多微生物如細(xì)菌，立克次氏體，各種寄生蟲，和病毒與血管內(nèi)皮和白細(xì)胞結(jié)合，并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致例如白細(xì)胞介素的產(chǎn)生。所以，可以將用于本發(fā)明的方法的2型CBP對病人給藥以防止與這樣的感染相關(guān)的炎癥。
本發(fā)明的2型CBP的給藥劑量范圍足夠大以致能產(chǎn)生期望的效果，即免疫應(yīng)答的癥狀顯示了一些程度的抑制。該劑量不應(yīng)該大到引起不利的副作用，如不需要的交叉反應(yīng)，過敏反應(yīng)，和諸如此類。通常，劑量將隨著病人的年齡，癥狀，性別和疾病的程度而變化，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在任何有相反跡象的事件中各醫(yī)生可以判斷劑量。劑量可以從約10皮克變化到100微克/劑量，每天給藥一次或多次劑量，給藥一天或幾天。
可以通過任何適當(dāng)?shù)氖侄谓o藥2型CBP，包括腸胃外的，皮下的，肺內(nèi)的，動脈內(nèi)的，直腸內(nèi)的，肌肉內(nèi)的，和鼻內(nèi)的給藥。腸胃外的注入包括肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，或腹膜內(nèi)的給藥。2型CBP也可以以慢慢釋放的皮下植入的形式經(jīng)皮給藥，或以膠囊，粉末或顆粒形式口服。2型CBP也可以吸入給藥。例如，當(dāng)治療性地用于治療肺的炎癥疾病，優(yōu)選的給藥途徑是通過入肺的氣霧劑。
腸胃外給藥的藥學(xué)可接受載體制劑包括無菌的或含水的或不含水的溶液，懸浮液和乳液。不含水的溶劑的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，和可注射的有機酯如油酸乙酯。含水的載體包括水，醇/水溶液，乳液或懸浮液，包括鹽溶液和緩沖介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液，Ringer葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸鈉林格氏溶液，或固定油。活性治療成分經(jīng)常與賦形劑混合，這些賦形劑是藥學(xué)上可接受的并且與活性成分相容。適當(dāng)?shù)馁x形劑包括水，鹽溶液，葡萄糖，甘油和乙醇，或它們的混合物。靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)補充劑，電解質(zhì)補充劑，如基于Ringer葡萄糖，和諸如此類的那些。也可以存在防腐劑和其它添加劑如抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑和惰性氣體和諸如此類。
本發(fā)明也涉及制備含有本發(fā)明的2型CBP的藥劑或藥物組合物的方法，該藥劑用于治療不期望的免疫應(yīng)答/炎癥反應(yīng)，其中免疫應(yīng)答導(dǎo)致產(chǎn)生趨化因子，這些趨化因子與本發(fā)明的2型CBP結(jié)合。
本發(fā)明提供于藥學(xué)載體中的藥物組合物，其含有至少一個劑量的免疫治療有效量的抗炎癥蛋白，該蛋白質(zhì)根據(jù)糖基化程度，具有分子量約為30-40千道爾頓，具有與粘液瘤T1干擾素γ受體同系物同源的氨基酸序列，和具有粘液瘤T1干擾素γ受體同系物的生物學(xué)功能。
本發(fā)明提供本發(fā)明的方法中所使用的，含有本發(fā)明的2型CBP的藥物制劑和組合物。它的形式將根據(jù)給藥途徑而不同。例如，可以提供注射用的組合物，形式是針劑，每針劑含有單位劑量，或容器形式，含有多個劑量。
可以將2型CBP配制成中性的藥學(xué)可接受鹽形式的治療組合物。這些包括加入酸加成鹽，它們是用無機酸如，鹽酸或磷酸，或有機酸如乙酸，草酸，酒石酸和諸如此類形成的。鹽也包括由無機堿，如氫氧化鈉，鉀，銨，鈣或鐵，和有機堿如異丙胺，三甲胺，組氨酸，普魯卡因和諸如此類形成的那些。
通過選擇適當(dāng)?shù)拇蠓肿涌梢詫崿F(xiàn)控制釋放，大分子例如聚酯，聚氨基酸，聚乙烯吡咯烷酮，乙烯乙酸乙烯酯，甲基纖維素，羧甲基纖維素，魚精蛋白硫酸鹽，或丙交酯/乙交酯共聚物。通過改變大分子的濃度可以控制2型CBP的釋放速度。
控制持久作用的另一個方法包括在聚合物物質(zhì)如聚酯，聚氨基酸，水凝膠，丙交酯/乙交酯共聚物，或乙烯乙酸乙烯酯共聚物的顆粒中摻入2型CBP?？蛇x擇地，例如通過凝聚技術(shù)，或通過界面聚合，例如通過分別使用羥甲基纖維素或膠狀微膠囊或聚methymethacrolate微膠囊，可以將2型CBP包裹進(jìn)制備的微膠囊中，或包裹進(jìn)膠態(tài)藥物送遞系統(tǒng)。膠態(tài)分散系統(tǒng)包括大分子復(fù)合物，納米膠囊，微球體，小珠，和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)包括水包油乳劑，膠粒，混合膠粒，和脂質(zhì)體。
下面的實施例用于敘述但不限制本發(fā)明。它們是可以使用的那些典型的例子，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它過程也可以替代使用。
實施例1材料和方法損傷誘導(dǎo)動脈粥樣硬化的鼠模型誘導(dǎo)Sprague Dawley鼠使其右左髂股動脈具有氣囊血管成形術(shù)介導(dǎo)的損傷。在通常的戊巴比妥麻醉(每100克重通過i.m.注射6.5毫克，Somnotrol,MTC藥學(xué)公司，劍橋，Ontario)下剖開和切開動脈使1.5毫米USCI血管成形術(shù)氣囊逆向進(jìn)入動脈。通過動脈內(nèi)注射將CBP或?qū)φ杖芤鹤⑸溥M(jìn)入后氣囊介導(dǎo)的傷害的位點上游的血管成形術(shù)氣囊導(dǎo)管的遠(yuǎn)側(cè)的腔中，給予500皮克CBP(6只鼠)或鹽水(6只鼠)。然后將氣囊中的壓力膨脹到8巴，維持1分鐘。在血管成形術(shù)后，抽掉氣囊中的氣并排出，局部應(yīng)用氰基丙烯酸正丁酯單體(Nexaband，獸醫(yī)學(xué)產(chǎn)品實驗室，Phoenix,Arizona)封閉動脈切開位點。每只鼠維持正常的鼠飲食方式，并且在手術(shù)后隨污4星期。隨訪時，每公斤用2.0毫升euthanyl使鼠死亡，收集主動脈進(jìn)行組織檢查。
損傷誘導(dǎo)動脈粥樣硬化的兔模型通過在遠(yuǎn)側(cè)的腹部主動脈進(jìn)行氣囊血管成形術(shù)處理8只喂食膽固醇的新西蘭白兔。在氣囊傷害之前2星期開始用10％的花生油食物中的2％的膽固醇每星期4天喂養(yǎng)所有兔子(新西蘭白兔品系)。在麻醉(肌肉內(nèi)注射40毫克/公斤ketalean,8毫克/公斤塞拉嗪，和0.5毫克/公斤乙酰丙嗪)后，通過切下的股動脈中導(dǎo)入3-3.5毫米血管成形術(shù)氣囊導(dǎo)管(氣囊與主動脈直徑比例≥1∶1)。在遠(yuǎn)側(cè)腹部主動脈中，使氣囊的壓力膨脹到8巴，逆向前進(jìn)到遠(yuǎn)處胸部主動脈。在每只兔中，在熒光屏檢查控制下使氣囊前進(jìn)和后退3次以便保證除光內(nèi)皮。在氣囊血管成形術(shù)介導(dǎo)損傷之前和之后，和接著的4星期隨訪中記錄差別懸殊的血管造影片。在獲得股入口后立即給予肝素(400單位)以便降低與導(dǎo)管相關(guān)的血栓形成。
在4只兔的腹部主動脈遠(yuǎn)側(cè)中進(jìn)行氣囊介導(dǎo)損傷后，對每個樣品立即注入500皮克純化的2型CBP。在4只兔的腹部主動脈的末梢局部地平行注入鹽水。在進(jìn)行氣囊傳導(dǎo)的損傷后通過Wolinsky導(dǎo)管每次注入在無菌0.9％鹽水中即時稀釋的10毫升總體積的注入液。所有的注入過程都是通過在靠近髂分叉的腹部主動脈中的3.25mm Wolinsky氣囊(膨脹到最后壓力為6±1巴，維持2分鐘)進(jìn)行的。在熒光屏檢查控制下，將Wolinsky氣囊定位于緊挨髂分叉的上面，使灌注的氣囊通常定位于分叉上面0.5-2.5厘米，記為第一注入位點。在靠近髂分叉2.5厘米以上的區(qū)域中確定上游的第二個位點。在所有實驗中，注入液是在氣囊介導(dǎo)損傷后通過Wolinsky導(dǎo)管，以在無菌0.9％鹽水中即時稀釋的10毫升總體積給予的。所有注入過程是通過在靠近髂分叉的腹部主動脈中的3.25毫米Wolinsky氣囊(膨脹到最后壓力6±1巴，維持2分鐘)進(jìn)行的。
組織學(xué)和形態(tài)計量分析在遠(yuǎn)側(cè)腹部主動脈(兔)或上部髂股動脈分支(鼠)中Wolinsky注入的第一位點進(jìn)行組織學(xué)分析，這代表了灌注氣囊的原始定位確定的第一注入位點。在兔中，從下游，靠近髂分叉的非注入位點(在分叉的上面0.5厘米到分叉的下面0.5厘米)和上游，非注入位點(腹部主動脈上部，髂分叉上面2.5厘米-3.5厘米)取內(nèi)部對照切片。髂分叉上面1.5-2.5厘米的區(qū)域被認(rèn)為是放置氣囊造成的注入劑量潛在地可變的寬區(qū)域，所以不包括在這一分析中。在鼠中，將T1處理和注入鹽水的鼠的第一氣囊位點用于組織學(xué)評價。如前面所述，對福爾馬林固定的樣品進(jìn)行蘇木精和曙紅染色。簡要地說，將每個樣品在10％(v/v)磷酸鈉緩沖的福爾馬林中固定，加工，浸漬，包埋在石蠟中，用切片機切成5微米的切片。然后用蘇木精和曙紅將每個樣品(每個位點最少2個切片)的切片染色，用光學(xué)顯微鏡檢查。
實施例2細(xì)胞因子與新的病毒蛋白的結(jié)合簡要地說，將用125I放射性標(biāo)記各種人細(xì)胞因子，與從對照或痘病毒感染的BGMK細(xì)胞收集的分泌蛋白接觸，交聯(lián)，然后通過SDS-PAGE分析新的細(xì)胞因子/蛋白質(zhì)復(fù)合物。
交聯(lián)測試發(fā)現(xiàn)，新的特異于病毒的蛋白質(zhì)明顯地與各個測試的人趨化因子IL-8和MIP-1β結(jié)合(圖2)。圖2(上面兩組)顯示了使用碘化配體和組織培養(yǎng)上清液的凝膠遷移率變動分析。如下制備了組織培養(yǎng)上清液(Sups)讓BGMK(新生的Green猴子腎細(xì)胞)保持未處理(模擬實驗)或用粘液瘤(MYX)，粘液瘤的T7缺失突變體(myx-T7-)，兔痘(RPV)或缺失35千道爾頓的RPV重復(fù)感染(MOI)3次。在感染后4小時，通過用PBS洗滌單層細(xì)胞3次，并用無血清培養(yǎng)基補充，制備分泌的蛋白質(zhì)；然后在感染后18小時，收集這些上清液(升)。以同樣方法，在沒有病毒存在下，制備模擬實驗的上清液。利用Amicon濃縮器將上清液濃縮約15倍。根據(jù)制造商的說明利用碘化珠(Pierce)上的125I標(biāo)記人趨化因子IL-8和MIP-1β。
如下進(jìn)行凝膠遷移率變動分析將5微升碘化配體與10微升SUP混合，允許在室溫下停留2小時。然后加入2微升化學(xué)交聯(lián)試劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)(200毫摩爾/升，于100毫摩爾/升磷酸鉀中，pH7.5)，維持15分鐘。接著加入另外2微升，維持15分鐘。然后加入2微升Tris-HCl(1.0摩爾/升，pH7.5)淬滅反應(yīng)。利用SDS-PAGE和放射自顯影分析得到的混合物。箭頭指出了遷移的復(fù)合物。底部的組指出了考馬斯染色的凝膠，顯示了在myx-T7-感染中沒有T7蛋白和在RPV-35k-感染中沒有35千道爾頓蛋白。
實施例3在鼠股動脈中血管成形術(shù)氣球介導(dǎo)的損傷中顯示的2型CBP(T1)作為抗再狹窄蛋白質(zhì)的效力的分析炎癥與加速動脈壁中動脈粥樣硬化的斑點的發(fā)展相關(guān)。在應(yīng)用了為了打開堵塞的動脈設(shè)計的氣囊血管成形術(shù)和其它相關(guān)的血管成形術(shù)裝置后，發(fā)生了斑點高速地再出現(xiàn)或再狹窄。也已經(jīng)有報道在導(dǎo)致動脈損傷，病毒感染，脈管炎，高胱氨酸尿癥頰炎，糖尿病，高血壓，hyperlipideuria，吸煙和免疫復(fù)合物產(chǎn)生的紊亂的條件下，動脈粥樣硬化斑點加速增長。較大的DNA病毒具有進(jìn)化的機制，如抗炎癥蛋白，允許病毒在寄主中增殖，而寄主免疫和炎癥防御機制對病毒的抑制下降。測試了2型CBP(T-1)作為潛在的治療試劑用于防止血管成形術(shù)后斑點的增長。我們確信2型CBP作為干擾素γ的受體同系物和趨化因子的抑制劑起作用。在損傷誘導(dǎo)動脈粥樣硬化的動物模型中測試2型CBP，結(jié)果顯示在注入后4星期，斑點的形成明顯減少。在單獨進(jìn)行靜脈內(nèi)注射后(表1)，在氣囊血管成形術(shù)損傷后，從牛痘病毒分離的35千道爾頓蛋白質(zhì)2型CBP明顯降低內(nèi)膜增生(動脈粥樣硬化斑點生長)。這表明2型CBP可以用作抗炎癥試劑治療或防止基于免疫的紊亂。
在通常的麻醉下，在10只Sprague Dawley鼠的右髂股動脈中誘導(dǎo)氣囊損傷。通過切開的股動脈導(dǎo)入1.5毫米的血管成形術(shù)氣囊，將氣囊的遠(yuǎn)側(cè)點前進(jìn)到髂分叉。在氣囊膨脹之前立即向動脈中注入1.0毫升鹽水(5只鼠)或增加濃度的50皮克純化牛痘35千道爾頓蛋白質(zhì)(5只鼠)。然后將血管成形術(shù)氣囊膨脹到6-8atm，維持2分鐘，抽掉氣體，除去。在除去導(dǎo)管后，用nexaband在穿刺位點封閉股動脈。使鼠蘇醒，監(jiān)測4星期。在4星期后，殺死鼠，收集動脈用于組織學(xué)評價。通過形態(tài)計量分析檢測內(nèi)膜區(qū)。與對照注入鹽水(p＜0.0089)的比較，在注入35千道爾頓的蛋白質(zhì)后檢測到內(nèi)膜增生(斑點面積)的明顯減少(表1)。
表1
實施例4CBP-Ⅱ抑制趨化因子與人單核細(xì)胞的細(xì)胞受體結(jié)合根據(jù)下面方案，證明分別來自牛痘(Lister毒株)(表2)的35千道爾頓蛋白質(zhì)和M-T1(表3)抑制人MIP-1α與原代人單核細(xì)胞和THP-1細(xì)胞中的表面受體的結(jié)合。(注意表1和2中的實驗3利用了THP-1細(xì)胞，所有其它結(jié)果是從原代單核細(xì)胞得到的)獲得放射性標(biāo)記的125I MIP-1α(25微居里/毫升)，在試管中加入適當(dāng)體積的放射性標(biāo)記(熱)MIP-1α使每管中含有50,000cpm。作為對照，將未標(biāo)記(冷)的MIP-1α(400納克)與熱MIP-1α一起加入證明存在背景結(jié)合。為了測定35千道爾頓的M-T1(CBP-2)和M-T7(CBP-1)的抑制特性，將不同劑量的抑制劑與放射性標(biāo)記的配體一起加入，將樣品在37℃(5％CO2)溫育30分鐘。在含有1％BSA的RPMI 1640中將從人血液分離和Percoll梯度上分開的原代單核細(xì)胞稀釋到1×107個細(xì)胞/毫升的濃度，向每個反應(yīng)中加入200微升這些細(xì)胞。同樣的濃度用于THP-1細(xì)胞(單核細(xì)胞系)。在室溫下，將樣品管離心1小時，其中在13,000rpm下離心細(xì)胞5分鐘。除去上清液，用800微升10％蔗糖溶液洗滌細(xì)胞。細(xì)胞又一次在13,000rpm離心10分鐘。除去上清液。然后利用γ計數(shù)器測量沉淀中的放射性。作為第二套對照，在存在抑制劑時，也測試H3-fMLP與它的細(xì)胞受體的結(jié)合特性(表4)。遵照上面的方案，除了在每個試管中同樣分配1微升體積使每管的計數(shù)約為180,000cpm。注意到35千道爾頓和M-T1兩者都定量地阻止趨化因子與MIP-1α的細(xì)胞受體的結(jié)合。
表2
注意實驗3使用THP-1細(xì)胞；實驗1和2使用原初單細(xì)胞。
表3
表4
雖然參考給出的優(yōu)選實施方案已經(jīng)敘述了本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，不脫離本發(fā)明的精神可以進(jìn)行各種修飾。因此，本發(fā)明僅受下面的權(quán)利要求書的限制。
權(quán)利要求
1．治療受治療者與趨化因子相關(guān)的免疫病理紊亂的方法，該方法包括對受治療者給藥治療有效量的具有SEQ ID NO:2中闡述的氨基酸序列的趨化因子結(jié)合蛋白。
2．權(quán)利要求1的方法，其中趨化因子是α類或β類趨化因子。
3．權(quán)利要求2的方法，其中趨化因子選自CTAP-Ⅲ,gro/MGSA,ENA-78,MCP-1，白細(xì)胞介素-8,RANTES,MIP-1α,MIP-1β,PF-4,IP-10，和NAP-2。
4．權(quán)利要求1的方法，其中免疫病理紊亂選自微生物感染，惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移，哮喘，冠狀動脈再狹窄，自身免疫疾病，肝硬化，內(nèi)毒素血癥，粥樣動脈硬化，和再灌注損傷。
5．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括對受治療者給藥抗生素或抗病毒藥。
6．權(quán)利要求1的方法，其中給藥的抗炎癥蛋白的劑量為每次給藥約10皮克到100微克。
7．權(quán)利要求1的方法，其中抗炎癥蛋白的給藥途徑選自皮下，靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，直腸內(nèi)和經(jīng)皮。
8．藥物組合物，藥學(xué)可接受載體中含有至少一個劑量的免疫治療有效量的抗炎癥蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:2中闡述的氨基酸序列。
9．權(quán)利要求8的組合物，其中抗炎癥蛋白是2型趨化因子結(jié)合蛋白。
10．權(quán)利要求9的組合物，其中趨化因子是α類或β類趨化因子。
11．權(quán)利要求10的組合物，其中趨化因子選自CTAP-Ⅲ,gro/MGSA,ENA-78,MCP-1，白細(xì)胞介素-8,RANTES,MIP-1α，和MIP-1β,PF-4,IP-10，和NAP-2。
12．鑒定趨化因子的方法，該方法包括將具有約30-40千道爾頓分子量和與SFV-T1蛋白質(zhì)家族有氨基酸同源性的趨化因子結(jié)合蛋白與懷疑是趨化因子的組合物接觸，并檢測趨化因子組合物與趨化因子結(jié)合蛋白的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的趨化因子結(jié)合蛋白(2型CBP)的使用方法,該蛋白質(zhì)是由痘病毒編碼的,并且具有與Shope纖維瘤病毒T1蛋白質(zhì)家族同源的氨基酸序列,該蛋白質(zhì)能抵抗一些疾病綜合癥,這些疾病綜合癥與急性或慢性調(diào)節(jié)異常的炎癥應(yīng)答相關(guān)。
文檔編號A61P31/04GK1226171SQ97196663
公開日1999年8月18日 申請日期1997年5月21日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月22日
發(fā)明者G·麥法登, A·盧卡斯 申請人:艾伯塔大學(xué)