專利名稱：特異性檢測癌細(xì)胞的抗原結(jié)合片段、編碼所述片段的dna、以及它們在預(yù)防和檢測癌癥上 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在腫瘤細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)但在正常細(xì)胞上沒有的抗原的特異性抗體。所述抗原在此稱為“C-抗原”。C-抗原為被稱為“H11”的人單克隆抗體(Mab)所識別。本發(fā)明包含了許多抗體及其功能性衍生物，它們保留了H11的免疫特異性，它們被稱為“αC”。本發(fā)明還包括包含H11和產(chǎn)生H11的雜交瘤的實例性抗體H11組合物。本發(fā)明還包括H11V區(qū)的聚核苷酸和由其編碼的多肽，以及含有所述聚核苷酸的重組分子。本發(fā)明還包括αC抗體用于治療和診斷的使用方法。
背景技術(shù)：
盡管醫(yī)學(xué)研究已取得許多進(jìn)展，癌癥仍然是美國第二大死亡原因。工業(yè)化國家大約每五人中就有一人死于癌癥。傳統(tǒng)的臨床治療，例如手術(shù)切除、放射治療和化學(xué)治療的失敗率很高，尤其是對于實體瘤。失敗或者是由于初期腫瘤對治療無反應(yīng)，或者是由于腫瘤的原位重新生長和/或轉(zhuǎn)移造成的復(fù)發(fā)。即使象乳房癌等癌后的死亡率已有所下降，對癌癥的成功干預(yù)仍有賴于對癌細(xì)胞的早期檢測。癌癥的病因?qū)W、診斷和切除仍然是醫(yī)學(xué)研究和開發(fā)的重中之重。
導(dǎo)致良性瘤的腫瘤一般可通過手術(shù)切除腫塊來完全治愈。如果腫瘤變成惡性，出現(xiàn)侵入周圍組織的癥狀，就很難根除。一旦惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，那就幾乎不可能根除。
就發(fā)病率和死亡率而言，三大主要癌癥是結(jié)腸癌、乳房癌和肺癌。新的手術(shù)方法提高了結(jié)腸癌的存活率。改進(jìn)的篩選方法提高了乳房癌的檢出率，從而允許采取更早和傷害性較低的治療方法。許多研究證明，早期檢出提高了存活率和治療方法的選擇范圍。然而肺癌一般仍難以治愈。
除基底細(xì)胞癌外，單美國每年就有100,000以上的新癌癥病例，美國癌癥死亡數(shù)每年50,000例以上。在全世界，5種最常見的癌癥是肺癌、胃癌、乳房癌、結(jié)腸/直腸癌和子宮頸癌，每年新病例的總數(shù)超過600,000例，只有約一半的癌癥患者死于癌癥。
黑色素瘤是一種急需新治療方法的人類疾病。它是一種特別的侵襲性皮膚癌，經(jīng)常性無保護(hù)地遭受日曬者發(fā)病率上升。在此病早期，黑色素瘤的特征是表皮-上皮接壤處細(xì)胞增生，迅速侵入毗鄰組織并廣泛轉(zhuǎn)移。一旦轉(zhuǎn)移，一般不可能根除，結(jié)果是致死性的。
在全世界，70,000人被診斷患有黑色素瘤，據(jù)報道，每年造成25,000例死亡。美國癌癥協(xié)會指出，到2000年，每75個美國人中將有1人被診斷患有黑色素瘤。
成神經(jīng)細(xì)胞瘤是發(fā)生在嬰兒期和幼兒早期的一種高度惡性腫瘤。除Wilm氏腫瘤之外，它是兒童中最常見的腹膜后腫瘤。這種腫瘤轉(zhuǎn)移早，播散廣，涉及淋巴結(jié)、肝、骨、肺和骨髓。雖然原發(fā)瘤可以手術(shù)切除，但復(fù)發(fā)率高。
估計在1997年，將診斷出178,100例肺癌，占癌診斷的13％。估計1997年將有160,400例死于肺癌，占癌癥死亡總數(shù)的29％。肺癌的一年存活率已經(jīng)由1973年的32％上升至1993年的41％，這主要是因為外科技術(shù)的改進(jìn)。各階段肺癌的5年存活率的總和只有14％。而尚局限于局部時就檢出的病例存活率為48％，但是只有15％的肺癌能夠在那么早被發(fā)現(xiàn)。
小細(xì)胞性肺癌是肺癌中最惡性和生長最快的，占肺癌新病例的20至25％。1996年美國將診斷出60,000例。原發(fā)瘤一般對化學(xué)療法有反應(yīng)，但隨后會廣泛轉(zhuǎn)移。診斷后的平均存活時間約為1年，5年存活率是5％至10％。
乳房癌是最常見的癌癥之一，是美國癌癥死亡的第三大原因，1997年美國婦女新病例的年發(fā)病率約為180,200，1997年男性診斷乳房癌新病例1,400例。在工業(yè)化國家，8個婦女中約有1人發(fā)出乳房癌。自1930年以來，乳房癌的總死亡率保持不變。每年以平均0.2％的比例增長，但65歲以下婦女以平均0.3％的比例下降。初步槳料提示，乳房癌的死亡率也許正在開始下降，這可能是因為對局限性癌和原位癌的診斷率升高之故。參見，例如Marchant(1994)ContemporaryManagment of Breast Disease IIBreast Cancer，inObstetrics and Gynecology clinicsof North America 21555-560；和Coldiz(1993)Cancer Suppl.711480-1489。據(jù)估計，1997年乳房癌造成的死亡將有44,190例(43,900例婦女，290例男性)。在婦女中，這是繼肺癌之后的第二大癌癥死因。局限性乳房癌的5年存活率已由40年代的72％上升至現(xiàn)在的97％。但是，如果癌癥發(fā)生區(qū)域性擴(kuò)散，存活率為76％，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的婦女是20％。診斷出乳房癌之后的5年以上存活率逐漸下降。診斷為乳房癌的婦女65％活過10年，56％活過15年。
非何杰金氏(Hodgkin)B細(xì)胞淋巴瘤是免疫系統(tǒng)癌癥，估計1996年美國有約225,000的患者。這類癌癥的預(yù)后和治療類型很多，通常分為三級。最低級的平均存活率為6.6年，更高級的癌癥其存活期短得多。實際上，幾乎所有的非何杰金氏B細(xì)胞淋巴瘤都是不可治愈的。在過去10年中，新診斷出的非何杰金氏淋巴瘤每年增加約7％，1996年新診斷病例估計為52,700。上述增加有一部分是因為AIDS患者群體該淋巴瘤的高發(fā)性。
結(jié)腸癌和直腸癌1997年估計將達(dá)131,200例，其中包括94,100例結(jié)腸癌和37,100例直腸癌。結(jié)腸直腸癌約占新診斷癌癥的9％。1997年，結(jié)腸直腸癌據(jù)估計將造成54,900例死亡，約占癌癥死亡的10％。在過去20年中，結(jié)腸直腸癌死亡率婦女下降了32％，男性下降了14％，反映出發(fā)病率下降和存活率上升。然而，非洲裔美國男性死亡率仍然持續(xù)上升。結(jié)腸癌和直腸癌患者的1年和5年存活率分別是82％和61％。如果在早期、局限性階段診斷出結(jié)腸直腸癌，5年存活率是91％；但是，只有37％的結(jié)腸直腸癌在此階段被發(fā)現(xiàn)。在癌癥區(qū)域性擴(kuò)散涉及毗鄰器官或淋巴結(jié)后，5年存活率降至63％，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的存活率為7％。5年以上的存活率逐漸下降，50％的患者活得過10年。
雖然困難，但人們一直試圖用抗癌藥物(單獨(dú)或聯(lián)用其它療法)來有效治療某些先前高度致死性的癌癥。這些癌癥中尤其值得注意的是何杰金氏淋巴瘤、睪丸癌、絨毛膜癌和部分白血病及其它兒童癌癥。對于更為常見的幾種癌癥來說，早期診斷、合適的手術(shù)或局部放射治療能使大部分患者康復(fù)。
目前的癌癥治療方法相對而言是非選擇性的。手術(shù)切除患病組織，放射治療使實體瘤收縮，化學(xué)療法殺死迅速分裂的細(xì)胞。尤其是化療，它引起許多副作用，在某些情況下嚴(yán)重到阻礙了潛在有效藥物的應(yīng)用。而且，癌瘤常會產(chǎn)生對化療藥物的抗藥性。
人們正在進(jìn)行各種努力加強(qiáng)癌癥治療方法的選擇性。參見，Kohn和Liotta(1995)Cancer Res 551856-1862。尤其是，鑒定出僅僅或主要在某種腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原允許形成更具有選擇性的治療戰(zhàn)略。針對這些抗原的抗體已經(jīng)被用于幾種癌癥的免疫治療。
脊椎動物系統(tǒng)中基本免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)單元由兩條相同的多肽輕鏈(“L”)(約23KDa)和兩條相同的多肽重鏈(“H”)(約53至70KDa)組成。這四條鏈通過二硫鍵連接成“Y”構(gòu)型。在Y的基部，兩條H鏈通過共價二硫鍵結(jié)合。


圖1顯示抗體的結(jié)構(gòu)。L鏈和H鏈各由N末端的的可變區(qū)(V)和C末端的恒定區(qū)(C)構(gòu)成。L鏈中，V區(qū)(稱為“VLJL”)是由通過連接區(qū)(JL)與C區(qū)(CL)連接的V區(qū)(VL)構(gòu)成。H鏈中，V區(qū)(VHDHJH)是由通過多變區(qū)(DH)和連接區(qū)(JH)與C區(qū)(CH)連接的可變區(qū)(VH)構(gòu)成。L鏈和H鏈的VLJL和VHDHJH分別在Y的兩頂端聯(lián)合成抗原結(jié)合部位，決定了抗原結(jié)合特異性。
CH區(qū)決定同種型，即抗體的類或亞類。不同同種型的抗體其效應(yīng)器功能，如激活補(bǔ)體的能力、與多種類型細(xì)胞上特異性受體(如Fc受體)結(jié)合的能力、穿過粘膜和胎盤屏障的能力、以及形成基本的四鏈IgG聚合物的能力，明顯不同。
抗體按其免疫球蛋白分子所用的CH型分成幾“類”(IgM，IgG，IgD，IgE或IgA)。至少有5種CH基因型(Cμ、Cγ、Cδ、Cε和Cα)，有些生物有多種CH亞型(如人有Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4)。人單倍體基因組總共有9種CH基因，小鼠和大鼠有8種，其它種動物略少。相反，L鏈C區(qū)(CL)通常只有兩種κ和λ，而且在一條L鏈蛋白中只有其中之一種(即，對于每一種形成的VLJL只可能有一個L鏈C區(qū))。各類H鏈可以與兩類L鏈中之一類相聯(lián)合(即CHγ區(qū)可以與κ或者λL鏈存在于同一抗體中)，但是特定的一類免疫球蛋白的H鏈和L鏈的C區(qū)是不隨抗原特異性而變化的(即不論抗原特異性如何，IgG抗體總是具有CγH鏈的C區(qū))。
H和L鏈的V、D、J和C區(qū)是由不同的基因組序列編碼的?？贵w的多樣性是由于H鏈不同的VH、DH和JH基因片段及L鏈的VL和JL基因片段之間的重組而產(chǎn)生。不同VH、DH和JH基因的重組是在B細(xì)胞分化階段由DNA重組完成的。簡而言之，H鏈?zhǔn)紫戎亟M產(chǎn)生DHJH復(fù)合體，然后經(jīng)第二次重組產(chǎn)生VHDHJH復(fù)合體。功能性H鏈?zhǔn)窃谵D(zhuǎn)錄后由RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物剪接而產(chǎn)生的。功能性H鏈的生成引發(fā)L鏈序列內(nèi)的重組，產(chǎn)生重排的VLJL區(qū)，接著形成功能性的VLJLCL區(qū)，即功能性L鏈。
本領(lǐng)域早已認(rèn)識到抗體作為診斷和治療劑的價值和潛力。但是，該領(lǐng)域的開發(fā)因大量生產(chǎn)所需特異性的抗體需要的過程緩慢而冗長而受阻。經(jīng)典細(xì)胞融合技術(shù)通過將產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞與可無限繁殖細(xì)胞系融合，能夠高效地生產(chǎn)Mab。此法得到的細(xì)胞系是雜交瘤細(xì)胞系。
抗體及其功能性衍生物已經(jīng)被廣泛用于各種臨床情況。例如，地高辛-特異性Fab抗體片段被用于治療致死性的洋地黃藥中毒?？贵w被越來越常規(guī)地用于診斷技術(shù)，例如結(jié)腸癌的放射免疫診斷。Koda等(1995)，Am.J.Castroenterol.901644。許多過去被認(rèn)為不確切的Mab用途最近已用于實踐。例子參見Hall(1995)Science 279915-916。
已發(fā)現(xiàn)許多的人的自身抗體(識別和結(jié)合自身抗原的抗體)。其中許多與特定的疾病有關(guān)，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、原發(fā)膽汁性肝硬變、多肌炎、系統(tǒng)性脈管炎、自發(fā)性壞死性和新月形腎小球性腎炎和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥。參見Shattner(1986/1987)Immunol.Lett.14143-153。其它自身抗體是天然存在的。Lutz和Wipp(1982)J.Immunol.1281965；和Guilbert等(1982)J.Immunol.1282779-2787。最近抗特定癌抗原的人自身抗體被檢鑒定出來，在某些病例中，正利用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。這類抗體也已用主動免疫方法來生產(chǎn)。美國專利5,474,755。最早，用Epstein-Barr病毒或鼠骨髓瘤令人B細(xì)胞無限繁殖。參見Buck等(1984)“Monoclonal Antibodies”NY.，Plenum Press。更新的技術(shù)已經(jīng)能不用這種有潛在危害性的病毒來實現(xiàn)無限繁殖。例子參見美國專利4,618,477；和Glassy(1987)Cancer Res.475181-5188。在大多數(shù)情況下，抗體對一種，有時對數(shù)種癌癥型具有特異性。例如，一種Mab據(jù)稱只特異性識別神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞而不識別其它腫瘤或正常細(xì)胞。這類抗體被用于患者腦部的神經(jīng)膠質(zhì)瘤造影。Fischer等(1991)Immunobiol.Prot.Pep.VI(M.Atassi編輯)Plenum Press，NY.pp.263-270。還沒有關(guān)于能識別多種腫瘤但不能或只能勉強(qiáng)識別正常的非癌細(xì)胞的抗體的報道。
基因重組技術(shù)已經(jīng)能夠克隆和表達(dá)抗體、其功能性片段和被其識別的抗原。這些工程抗體提供了新的生產(chǎn)方法和治療方式。例如，已在細(xì)菌和轉(zhuǎn)基因煙草種子和植株中表達(dá)了功能性免疫球蛋白片段。Skerra(1993)Curr.Opin.Immunol.5256-262；Fiedler和Conrad(1 995)Bio/Technology 131090-1093；Zhang等(1993)Cancer Res.553384-3591；Ma等(1995)Science 268916；另外，有關(guān)合成抗體，參見Barbas(1995)Nature Med.1836-839。
已經(jīng)生產(chǎn)并鑒定了幾種抗腫瘤相關(guān)抗原的人Mab。被人Mab識別的腫瘤相關(guān)抗原包括細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核抗原。Yoshikawa等(1989)Jpn.J.CancerRes.(Gann)80546-553；Yamaguchi等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842416-2420；Haspel等(1985)Cancer Res.453951-3961；Cote等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 832959-2963；Glassy(1987)Cancer Res.475181-5188；Borup-Christensen等(1987)Cancer Detect.Prevent.Suppl.1207-215；Haspel等(1985)Cancer Res.453951-3961；Kan-Mitchell等(1989)Cancer Res.494536-4541；Yoshikawa等(1986)Jpn.J.Cancer Res.771122-1133；和McKnight等(1990)Human Antibod.Hybridomas 1125-129。
人Mab已被用于癌造影、診斷和治療。Olsson(1985)J.Nat.Cancer Inst.75397-404；Larrick和Bourla(1986)J.Biol.Resp Mod.5379-393；McCabe等(1994)Cancer 73858-863；和Alonso(1991)Am.J.Clin.Oncol.4463-471。已經(jīng)報道了具有腫瘤細(xì)胞高毒性的重組單鏈雙特異性抗體。該抗體分子識別人T細(xì)胞的CD3抗原和EpCAM，能與殘留有極少量結(jié)腸直腸癌的患者體內(nèi)擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞結(jié)合。Mack等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927021-7025。
據(jù)報道，幾種抗-GD2鼠單克隆抗體能抑制無胸腺(nu/nu)小鼠神經(jīng)外胚層源(neuroectodermal origin)腫瘤的生長或引起轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的緩解。抗-GD2人-鼠嵌合抗體引起轉(zhuǎn)移性成神經(jīng)細(xì)胞瘤患者的緩解?？贵w作用機(jī)制認(rèn)為涉及到抗體依賴性細(xì)胞毒(ADCC)或補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞毒(CMC)。用抗GM2、GD2和GD3的Mab治療黑色素瘤已獲得了臨床應(yīng)答反應(yīng)。Cheresh等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825155-5159。用含有GM2的神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗進(jìn)行主動免疫，58個患者中有50人產(chǎn)生了抗-GM2抗體，其平均存活期比未測出該抗體者延長。
還發(fā)現(xiàn)抗GD2抗體特異性地與小細(xì)胞肺癌反應(yīng)。Cheresh等(1986)CancerRes.465112-5118。對其它癌癥(包括肺癌、黑色素瘤、胃癌、鱗狀細(xì)胞癌、子宮頸癌和乳房癌)的特異性人Mab也已經(jīng)生產(chǎn)出來。Murakami(1985)in Vitro CellDev.Biol.21593；Schadendor(1989)J.Immunol.1421621-1625；Yoshikawa等(1986)Jpn.J.Cancer Res.771122-1133；Pickering和Misra(1 984)Clin.Immunol.Immunopathol.32253-260；Hagiwara和Sato(1983)Mol.Biol.Med.1245-252；和Schlom等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 776841-6845?？拱┤薓ab及其識別抗原還被提議用在疫苗中。例子參見Finn等(1995)Immunol.Rev.14561-89。對惡性腦腫瘤的人Mab在I期臨床試驗中，沒有不良副作用。Matsumoto等(1994)The Clinical Report 28118-126。在轉(zhuǎn)移性胃腸癌中用鼠Mab和集落刺激因子合用的II期臨床結(jié)果也已有報道。Saleh等(1995)Cancer Res.554339-4346。還發(fā)現(xiàn)一種單鏈免疫毒素在大鼠模型中能夠治愈癌性蛛網(wǎng)膜腦炎。Pastan等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 922765-2769。特異性識別卵巢癌細(xì)胞的人Mab已被證明能有效造影該癌瘤。Chaudhuri等(1994)Cancer 731098-1104。
如果有一種簡單可靠的方案，可提供對各癌癥共同抗原的免疫反應(yīng)性而不是癌癥特異性免疫力，癌癥診斷治療的臨床前景將全面改善。本文參考了以上引用的所有參考文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括含有抗體的抗原結(jié)合性片段組合物，所述抗體特異性識別的抗原可被H鏈V區(qū)具有氨基酸序列SEQ ID NO2和L鏈V區(qū)具有氨基酸序列SEQ IDNO4的抗體所識別。較好的所述抗體是H11。本發(fā)明還包括含有H11的H鏈和L鏈V區(qū)(分別為SEQ ID NO2和4)的抗體。H11特異性識別多種癌癥的癌細(xì)胞，但不識別正常的非癌細(xì)胞?！安蛔R別”指非癌細(xì)胞或者不與H11特異性結(jié)合，或者只被H11抗體勉強(qiáng)識別。這些抗體被稱為αC，包括H11及任何具有H11“免疫學(xué)特異性”的抗體，即此類抗體識別H11所識別的抗原，而且至少對一種癌細(xì)胞具有特異性，但不識別正常細(xì)胞。這類抗原結(jié)合性片段包括(但不限于)完整的天然抗體，以H11為例；包括雙特異性抗體；嵌合抗體；Fab，F(xiàn)ab’；單鏈V區(qū)片段(scFv)和融合多肽。
本發(fā)明還包括含有一個與H鏈C區(qū)連接的具有抗原性、治療性、毒性或標(biāo)記分子多肽區(qū)的H11抗體融合分子、其單鏈VH-VL或VH-VLV區(qū)，和編碼所述多肽的聚核苷酸。
本發(fā)明還包括具有H11免疫特異性的多肽，此多肽含有來自αC抗體V區(qū)的至少5個連續(xù)氨基酸。V區(qū)可以是L鏈或是H鏈的。5個連續(xù)氨基酸最好是在免疫學(xué)特異性中起作用的，而且可以來自CDR(抗體的互補(bǔ)決定區(qū))。完整H11、H11的功能性活性片段、融合蛋白、嵌合抗體、多價抗原蛋白和αC抗體其它多肽衍生物也包括在內(nèi)。尤其重要的是其單鏈V區(qū)和融合蛋白。
本發(fā)明的化合物和組合物可以和其它藥物一起用于檢測和治療癌癥；包括對所述癌癥的治療和預(yù)防，特別是用于降低復(fù)發(fā)的危險性。
本發(fā)明還包括產(chǎn)生αC抗原結(jié)合性片段的細(xì)胞和細(xì)胞系。
本發(fā)明的另一實施方案是一種聚核苷酸，它包含編碼具有H11免疫學(xué)特異性的多肽的序列，此被編碼多肽含有來自H11V區(qū)的至少5個連續(xù)氨基酸，此V區(qū)可來自H11的L鏈或是H鏈的。5個連續(xù)氨基酸最好是在H11的免疫學(xué)特異性中起作用的，而且可來自CDR。H11的V區(qū)被發(fā)現(xiàn)具有一個與A6抗體有同源性的小區(qū)。需特別注意的是，只含這一同源性小區(qū)而沒有其它H11-特有氨基酸殘基的肽不包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。A6在WO953574中有所說明。
本發(fā)明還包括至少有20個連續(xù)核苷酸的分離的聚核苷酸，它能夠與H11H或L鏈的編碼序列，但不與其它先前已描述過的免疫球蛋白分子的編碼序列形成穩(wěn)定的雙鏈。任何這類聚核苷酸可以是克隆載體、表達(dá)載體或轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)的形式。
本發(fā)明另一實施方案包括用至少一種αC抗原結(jié)合性片段預(yù)防性治療癌癥患患者。較好的是，αC與治療性分子融合而有效地將治療性分子遞送給癌細(xì)胞。個體可能患有臨床可檢測的腫瘤，或腫瘤已被治療過而變得不可檢測。該方法可以用來緩解疾病，或減少復(fù)發(fā)的危險性。
本發(fā)明的另一實施方案是提供檢測和定量樣品中αC識別抗原(后文稱“C抗原”)的試劑盒，它包括合適包裝的H11或本發(fā)明多肽。本發(fā)明還包括通過使用本發(fā)明試劑或試劑盒來檢測C抗原或細(xì)胞表達(dá)的C抗原的方法。
附圖簡要說明
圖1繪制了一般抗體的結(jié)構(gòu)。
圖2描述H11識別細(xì)胞的流式細(xì)胞計數(shù)分析。
圖3描述H11識別細(xì)胞的流式細(xì)胞計數(shù)分析。
圖4描述H11識別細(xì)胞的流式動細(xì)胞計數(shù)分析。A是A-375(黑色素瘤)，B是SKMG-1(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)，C是SK-BR-3(乳房腺癌)，D是HT-29(結(jié)腸腺癌)，E是MB-468(乳房癌)，F(xiàn)是T47D(乳房癌)。
圖5描述H11與腫瘤細(xì)胞提取物的結(jié)合。淺色柱表示H11，暗色柱表示對照抗體。
圖6描述H11與腫瘤細(xì)胞提取物的結(jié)合。
圖7通過固定細(xì)胞ELISA(cell-fixed ELISA)描述H11與人腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合。淺色柱表示H11，暗色柱表示對照抗體。
圖8描述表達(dá)載體pSJF1的圖。
圖9描述用固定細(xì)胞ELISA作Mab H11和H11-scFv之間抗原相似性測定。
圖10描述生物素化、淋巴瘤細(xì)胞特異性H11-scFv(粗線)和BGA scFv(細(xì)線)的相對熒光強(qiáng)度。
圖11描述用固定細(xì)胞ELISA測定生物素化H11-scFv與淋巴瘤細(xì)胞、RAMOS、Daudi、CA-46和CCRF-CEM細(xì)胞結(jié)合的活性效價?？贵w濃度從起初的10微克/毫升(空心柱)降至5微克/毫升，然后降至2.5微克/毫升，最后降至1.25微克/毫升(雙交叉線)。
圖12描述與腫瘤細(xì)胞系結(jié)合的H11-scFv和對照scFv的相對熒光強(qiáng)度。A是A-375(黑色素瘤)，B是SK-BR-3(乳房腺癌)，C是HT-29(結(jié)腸腺癌)，D是CA-46(Burkitt氏淋巴瘤)、E是RAMOS(Burkitt氏淋巴瘤)、F是H9(T細(xì)胞淋巴瘤)、G是CCRF-CEM(急性淋巴母細(xì)胞淋巴瘤)。
圖13描述125I-H11-scFv與LS174T細(xì)胞的結(jié)合。
圖14描述111I-H11-scFv與A-375細(xì)胞的結(jié)合。
圖15描述用于轉(zhuǎn)染和表達(dá)H11-IgG的哺乳動物表達(dá)載體pNB2。
圖16描述用于轉(zhuǎn)染和表達(dá)H11-IgG的哺乳動物表達(dá)載體pNB3。
圖17描述125I-H11-scFv在P-2微型色譜柱上的純化(A)和125I-H11-scFv在85％甲醇中的紙上色譜(B)分析。
圖18描述125I-H11 IgM在Sephadex G-25微型色譜柱上的純化(A)和125I-H11IgM在85％甲醇中的紙上色譜(B)分析。
圖19描述111In-DTPA-H11-scFv在Sephadex G-50微型色譜柱上的純化(A)和111In-DTPA-H11-scFv用ITLC-SG/0.1檸檬酸所作的分析(B)。
圖20描述在裸鼠體內(nèi)111In-H11-scFv與A375異種移植腫瘤的結(jié)合。
本發(fā)明最佳實施方案
本發(fā)明包括抗原結(jié)合性片段，例如一新鑒定的特異性識別癌細(xì)胞的人Mab。此特異性只擴(kuò)展到癌細(xì)胞，所述抗體不識別非癌細(xì)胞。實例性抗體被稱為H11，其可變區(qū)由SEQ ID NO1和4編碼(SEQ ID NO3和6分別是1和4的互補(bǔ)鏈)，并且識別稱為“C抗原”的抗原。H11的特異性包括(但不限于)對以下癌癥的特異性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、惡性黑色素瘤、乳房腺癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸腺癌和前列腺腺癌。
如本文實施例所述，H11和H11-scFv不識別來自被測正常組織的非癌細(xì)胞。H11和αC抗原結(jié)合性片段因此可以用來緩解與多種癌癥相關(guān)的臨床病癥。本發(fā)明包括抗原結(jié)合性片段，該片段識別的抗原是H11特異性識別的抗原(稱為C抗原)的抗原結(jié)合性片段。本發(fā)明還包括H11的多肽衍生物和將所述組合物用于診斷、治療和制造新藥的方法。本發(fā)明還包括編碼αC、H11及它們的衍生物的聚核苷酸。本發(fā)明還包括該聚核苷酸的使用方法。
本發(fā)明還包括對C抗原具有免疫學(xué)特異性的αC衍生物。所述衍生物包含多肽序列區(qū)，后者包含部分H11的VDJ連接。本發(fā)明還包括橫跨至少1個H11 CDR氨基酸序列的區(qū)域，跨2個為佳，跨3個更好。
沒有測定H11 L鏈和H鏈C區(qū)的完整序列，但是估計與其它人免疫球蛋白的C區(qū)相同或近乎相同。而且，對V區(qū)氨基酸序列的認(rèn)識使我們能用任何C區(qū)作亞克隆。所述的亞克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的。用此類克隆技術(shù)產(chǎn)生的嵌合分子也包括在本發(fā)明之內(nèi)。
用H11 IgM和scFv抗體克隆篩選一市售七肽噬菌體文庫，證明在N末端有一段高度共有序列，具有以下氨基酸序列Phe-His-Arg-Tyr-Ser/Thr。結(jié)果列于表1。
表1
H11 IgM篩選出的序列M1 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Leu-Pro
M2 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Asp-Tyr
M3 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Leu-Pro
M4 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Pro-Thr
M7 Phe-His-Arg-Tyr-Thr-Pro-Gly
M8 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Leu-Pro
M10 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Pro-Thr
scFv H11篩選出的序列 S2 Phe-His-Arg-Tyr-Ser-Leu-Pro
S5 Met-His-Arg-Tyr-Thr-Pro-Leu
DNA序列使用多種密碼子，表明來自差異較大的噬菌體。例如，Arg由三聯(lián)密碼子CGx和AGx族編碼，此外，將H11五肽共有序列與序列數(shù)據(jù)庫比較顯示與Ca+2結(jié)合蛋白S100族有同源性。結(jié)果見表2。
表2
H11 五肽 Phe-His-Arg-Tyr/Thr
S.griseus蛋白 Phe-His-Arg-Tyr-Ser(氨基酸251-255)
花生矮小病毒 Phe-His-Arg-Tyr-Ser(氨基酸540-544)
人鈣細(xì)胞周期蛋白 Phe-His-Lys-Tyr-Ser(氨基酸16-20)
囊性纖維化Ag Tyr-His-Lys-Tyr-Ser(氨基酸16-21)
在此所述的共有五肽序列屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本申請所述的某些化合物、組合物和方法主要涉及αC及其衍生物，它們通常由經(jīng)典免疫化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生。其中包括經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)與其它化合物交聯(lián)的αC，或者與賦形劑或佐劑混合的αC?！翱乖Y(jié)合性片段”包括以癌細(xì)胞特異性方式與C抗原結(jié)合的肽。典型的是，所述衍生物包括諸如Fab、F(ab’)2、scFv(單體或聚合體形式)和分離的H和L鏈等免疫球蛋白片段?？乖Y(jié)合性片段保留了H11的特異性，但是親和力和/或親和性可能改變。尤其是在此所述的H11-scFv。
抗原結(jié)合性片段(又稱“衍生物”)通常由遺傳工程產(chǎn)生，雖然它們也可以利用其它方法和將多種方法組合產(chǎn)生。這類片段包括但不限于H11 CDR的多肽片段、含有細(xì)胞因子效應(yīng)成分的抗體融合蛋白，包含佐劑或藥物的抗體融合蛋白，以及單鏈V區(qū)蛋白。
本發(fā)明還包括編碼H11抗體V區(qū)及其衍生物的聚核苷酸。其中包括分離的聚核苷酸片段、重組聚核苷酸和包含聚核苷酸的治療用質(zhì)粒和載體例如牛痘載體。所述的聚核苷酸以SEQ ID NO1、3、4、6、13、15、16和18為例。
本發(fā)明的藥物組合物和治療方法適用于激發(fā)抗瘤形成的免疫應(yīng)答。特別適用的治療對象包括但不限于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、軟組織肉瘤和各種癌癥(包括小細(xì)胞肺癌)的癌癥人患者。
由于H11已顯示出能特異性地識別多種癌，它尤其適用于癌癥的診斷、造影和治療。合適的癌癥包括腫瘤學(xué)領(lǐng)域已知的任何一種，包括但不限于星形細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、初級神經(jīng)外胚層腫瘤(PNET)、胰管腺癌、小細(xì)胞和大細(xì)胞肺癌、鱗狀細(xì)胞癌、支氣管肺泡癌、上皮腺癌、和上述癌癥的肝轉(zhuǎn)移、肝癌、膽管腺癌、乳房腫瘤(如導(dǎo)管性和小葉性腺癌)、子宮頸鱗狀細(xì)胞癌和腺癌、子宮和卵巢上皮癌、前列腺腺癌、膀胱移變性鱗狀細(xì)胞癌、B細(xì)胞和T細(xì)胞淋巴瘤(淋巴結(jié)和擴(kuò)散性)漿細(xì)胞瘤、急性和慢性白血病、惡性黑色素瘤、軟組織肉瘤和平滑肌肉瘤。
患者可能處在疾病的彎曲，此時治療目標(biāo)可能包括減緩或逆轉(zhuǎn)病情進(jìn)展，以及改善副作用?；颊呖赡苡羞^該病病史并接受過治療，此時治療目標(biāo)通常包括減少或延遲復(fù)發(fā)的危險性。
此外，本發(fā)明的抗原結(jié)合性片段可用作診斷和造影劑。對此，后文將作詳細(xì)說明。
“H11”是將一患有低等級神經(jīng)膠質(zhì)瘤的64歲男性的外周血淋巴細(xì)胞融合而得到的，系與人骨髓細(xì)胞系融合產(chǎn)生的雜交瘤稱為NBGM1/H11。實施例1對H11的產(chǎn)生和鑒定進(jìn)行了說明?！唉罜”代表抗體或其抗原結(jié)合性片段，可以是單克隆的、多克隆的或者是它們的衍生物，它們特異性地識別C抗原并能夠區(qū)別癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞。αC包括H11。
αC的“免疫學(xué)活性”指與C抗原特異性結(jié)合的能力。所述的結(jié)合可能激發(fā)也可能不激發(fā)免疫應(yīng)答。特異性免疫應(yīng)答可能包含抗體、B細(xì)胞、T細(xì)胞和它們的各種形式組合、以及因此而產(chǎn)生的效應(yīng)器功能。其中包括抗體介導(dǎo)的功能ADCC和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解(CDC)。T細(xì)胞應(yīng)答包括T輔助細(xì)胞功能、細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能、炎性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞功能和T細(xì)胞介導(dǎo)的抑制。能夠誘導(dǎo)以上標(biāo)準(zhǔn)中任何一項特異性免疫應(yīng)答的化合物被稱為是“免疫原性的”。
αC“活性”或“功能”指本發(fā)明中所述αC的各種免疫活性，或者指H11的任何其它生物活性，其中包括H11在檢測、改善或緩解癌癥中的作用。
H11的“V區(qū)”指H11的L鏈或H鏈的V區(qū)，單獨(dú)的或二者組合的。SEQID NO2和5中有所描述；編碼它們的DNA在SEQ ID NO1和4對分別作了描述。
GM-CSF、IL-2和其它生物活性分子在此指包括以生物或生理功能相同的相應(yīng)親本分子為基礎(chǔ)的片段和衍生物。
“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在此相互替用，都表示各種長度的氨基酸殘基聚合物。聚合物可以是直鏈或者是支鏈的，它可能包含修飾過的氨基酸或氨基酸類似物，而且，它可能被非氨基酸的其它化學(xué)基團(tuán)間斷。該術(shù)語還包括經(jīng)天然修飾或人工修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵的形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化、或任何其它操作或修飾，例如與標(biāo)記性或生物活性成分交聯(lián)。若非另作說明，αC或H11包括具有H11免疫學(xué)特性的任何多肽單體或聚合物，其中包括完整的αC抗體和比它小或大的功能相當(dāng)?shù)亩嚯摹?br> “融合多肽”是所含若干區(qū)域在序列中的位置不同于天然的多肽。所述區(qū)域可能是在分開的蛋白質(zhì)中，但在融合多肽中被放在一起；它們也可能通常存在于同一蛋白但在融合多肽中被重排了；或者，通過合成而被重排。例如，如下文所述，本發(fā)明由αC的功能性部分和某毒素構(gòu)成的重組蛋白(及編碼該蛋白的聚核苷酸)。產(chǎn)生此類融合蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的，例子常見WO93/07286中有所說明。
αC多肽的“功能等價的片段”因各種添加、缺失或取代的聯(lián)合運(yùn)用而不同于天然序列，但是它至少保留了本文所用有關(guān)片段的一個功能。αC聚核苷酸的“功能等價的片段”或者編碼表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的功能與H11相當(dāng)?shù)亩嚯?，或者用在雜交測試中具有與H11聚核苷酸相同的雜交特異性。αC多肽“功能等價的片段”通常具有以下一項或多項特性結(jié)合C抗原的能力；以特異性方式結(jié)合至少一種癌細(xì)胞的能力；和激發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)的能力，所述的應(yīng)答反應(yīng)與H11激發(fā)的應(yīng)答反應(yīng)具有相同的抗原特異性。
“聚核苷酸”是各種長度核苷酸的聚合形式，含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和其任何類似組合物。
聚核苷酸可能具有三維結(jié)構(gòu)，并可能具有任何已知或未知的功能。“聚核苷酸”包括雙鏈、單鏈和三螺旋分子。除非另作說明，在此所述的任何聚核苷酸實施例既包括雙鏈形式，也包括兩條互補(bǔ)的單鏈，所述單鏈形成已知的或預(yù)計會產(chǎn)生的DNA或RNA雙鏈或雜交分子形式。
以下是聚核苷酸的非限制性舉例基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組聚核苷酸、分支聚核苷酸、質(zhì)粒、載體、分離的各種序列的DNA、分離的各種序列的RNA、核酸探針和引物。聚核苷酸可能包含經(jīng)修飾的核苷酸、如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物、尿嘧啶基(uracyl)、其它糖和連接基團(tuán)如含氟核糖和硫酯(thioate)、和核苷酸支鏈。核苷酸序列可能被非核苷酸間斷。聚核苷酸可以在聚合后(如與標(biāo)記成分交聯(lián))作進(jìn)一步修飾。其它修飾包括加帽、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、引入某種結(jié)構(gòu)將核苷酸與蛋白質(zhì)、金屬離子、標(biāo)記成分、其它聚核苷酸或固相支持物連接。
“重組”聚核苷酸指基因組、cDNA、半合成或合成的聚核苷酸，它們不是天然存在，或者以不同于天然的排列方式與其它聚核苷酸連接。
“載體”指重組DNA或RNA質(zhì)粒或病毒，它們包有經(jīng)體外或體內(nèi)向靶細(xì)胞傳遞的異源聚核苷酸。異源聚核苷酸可含有對治療目的有用的序列，并可選擇表達(dá)盒形式。本文所用，載體不一定是能夠在最終靶細(xì)胞或機(jī)體中復(fù)制的載體。該術(shù)語包括用于復(fù)制聚核苷酸的克隆載體，和用于翻譯聚核苷酸編碼序列的表達(dá)載體，還包括含有包裹在病毒粒子中的聚核苷酸的病毒載體。
“細(xì)胞系”或“細(xì)胞培養(yǎng)物”指體外生長或維持的細(xì)菌、植物、昆蟲或較高等真核細(xì)胞。某細(xì)胞的子代可能與親本細(xì)胞在形態(tài)上、基因型上或表型上不完全一樣。Mab可以由雜交瘤細(xì)胞或其它細(xì)胞產(chǎn)生。制備小鼠或人的雜交瘤細(xì)胞的方法是該領(lǐng)域已知的。本發(fā)明描述和參考了具體的產(chǎn)生人雜交瘤的特殊方法。
“宿主細(xì)胞”指可用遺傳方法改變，或通過給予外源性聚核苷酸(如重組質(zhì)?；蜉d體)而遺傳上改變的原核或真核細(xì)胞。遺傳上改變的細(xì)胞指最初被改變的細(xì)胞及其后代。
“異源”指衍生自基因型與之不同的實體，與該實體相比有共同處，而其余部分則不同。例如，一段聚核苷酸可以通過基因工程技術(shù)植入不同來源的質(zhì)?；蜉d體中，成為異源聚核苷酸。從其天然編碼序列中分離出來并與不同于天然序列的另一編碼序列連接的啟動子就是異源啟動子。
“信號肽”或“引導(dǎo)序列”指一段短氨基酸序列，它引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)通過細(xì)胞質(zhì)膜(在真核細(xì)胞通常是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而細(xì)菌是內(nèi)膜或者內(nèi)外壁膜)。信號肽通常位于多肽的N末端，而且通常在多肽生物合成到細(xì)胞分泌期間被酶切除。信號肽不存在于分泌蛋白質(zhì)中，只存在于蛋白質(zhì)產(chǎn)生期間。
“分離的”聚核苷酸或多肽，指基本上沒有天然環(huán)境中與之結(jié)合的物質(zhì)?！盎旧蠜]有”是指至少50％，較好是至少70％，更好是至少80％，最好是至少90％沒有這種物質(zhì)。
聚核苷酸的“穩(wěn)定雙螺旋”，或任何兩或多個成份在生物化學(xué)反應(yīng)中形成的“穩(wěn)定復(fù)合體”，指從形成到以后的檢測期間(包括各種選擇的洗滌步驟或可能于此間發(fā)生的其它操作)持續(xù)存在足夠久的雙螺旋或復(fù)合體。
“生物樣品”包括各種樣品，包括生物來源的血液和其它液體樣品，諸如組織活檢樣品或組織培養(yǎng)基等固體樣品，或由其衍生的細(xì)胞或細(xì)胞的后代。該定義還包括在得到后用各種方式處理過(如用試劑、增溶或富集蛋白質(zhì)或聚核苷酸等成份)的樣品。該術(shù)語還包括從各種生物獲得的臨床樣品，也包括培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解物。尤其是，就本發(fā)明目的而言，生物樣品包括腫瘤組織或被認(rèn)為是腫瘤性的組織，和通過手術(shù)切除、組織活檢、抽吸等該領(lǐng)域已知方法獲得的樣品。
“免疫原”指用于人或動物的組分，其使用目的是使接受者對某特定抗原產(chǎn)生一定程度的特異性免疫反應(yīng)性。免疫反應(yīng)性由對目標(biāo)或目標(biāo)組合的具有免疫活性的抗體或細(xì)胞(具體是B細(xì)胞、漿細(xì)胞、T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，及其前體細(xì)胞)來執(zhí)行。就本發(fā)明目的而言，目標(biāo)主要是與癌癥相關(guān)的C抗原或其腫瘤特異性部分。免疫反應(yīng)性可能是試驗?zāi)康乃?，治療某病癥所需，消除某物質(zhì)所需，或預(yù)防所需?；钚悦庖咴竽芗ぐl(fā)在缺乏疫苗成份時也能持續(xù)存在的免疫應(yīng)答。
“佐劑(可疑患者)(adjuvant)”在此具有幾種含義，這取決于使用該詞的上下文內(nèi)容。就藥物制備而言，佐劑指一些化學(xué)性或生物性物質(zhì)當(dāng)其和抗原一同給予或與抗原重組融合時能加強(qiáng)抗原的免疫原性。就癌癥的診斷或治療而言，可疑患者指這樣一類患者，它們沒有臨床可測見的瘤塊，但被懷疑有復(fù)發(fā)的危險。
當(dāng)說到一般稱為實體瘤的癌癥時，“臨床可檢測的”腫瘤指對腫瘤塊通過CAT掃描、X光或觸診之類方法可測知的腫瘤。而單用生物學(xué)、組織學(xué)或免疫學(xué)檢測就不完全符合這個定義。
此地，“治療”指為了改變接受治療的個體或細(xì)胞的自然進(jìn)程而進(jìn)行的臨床干預(yù)，可以為預(yù)防而進(jìn)行，也可在臨床病理期間進(jìn)行。要求的治療效果包括防止疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)，緩解癥狀、消除疾病的任何直接或間接病理結(jié)果、防止轉(zhuǎn)移、減緩疾病進(jìn)展的速度、改善或緩解疾病狀態(tài)、以及消除或改善預(yù)后。
與某病癥相關(guān)的“病理學(xué)”指包括患病個體的健康、正常生理或生活質(zhì)量等各種情況。它包括但不限于病發(fā)組織向先前健康組織的破壞性入侵、以正常組織功能損失為代價的生長、生物活性的失調(diào)或抑制、炎性反應(yīng)或免疫反應(yīng)的加劇或抑制、對其它病原生物或因子易感性增加和護(hù)理醫(yī)師即可確定的疼痛、發(fā)燒、惡心、疲倦、性格改變及其它不良臨床癥狀。
“有效量”指足以引起有益或所需臨床效果的量。有效量可一劑或多劑給予。就治療而言，有效量是足以緩解、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)或減緩疾病進(jìn)展或疾病病理結(jié)果的量。就佐劑而言，有效量是足以增強(qiáng)對抗原免疫應(yīng)答的量。有效量通常由醫(yī)師根據(jù)具體病例確定，屬于該領(lǐng)域一般技術(shù)范圍之內(nèi)。在確定合適劑量時有幾個因素通常需要考慮。這些因素包括患者的年齡、性別和體重，接受治療的病癥，病癥的嚴(yán)重程度和所用抗體的形式。例如，為了達(dá)到治療效果，scFv的濃度不必和天然抗體一樣高。
“個體”，“患者”或“受治療者”指脊椎動物，以哺乳動物為佳，最好是人。哺乳動物包括但不限于人、家畜、運(yùn)動動物和寵物。
除非另作說明，本發(fā)明的實施運(yùn)用了分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的解釋，例如“Molecular CloningA LaboratoryManual”第二版(Sambrook等，1989)；“Oligonucliotide Synthesis”(M.J.編輯，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney編輯，1987)；“Methods inEnzymology”(Academic Press，Inc.)；“Handbook of Expeimental Immunology”(D.M.Wei & C.C.Blackwell編輯)；“Gene Transfer Vector for Mammalian Cells”(J.M.Miller & M.P.Calos編輯，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等編輯，1987)；“PCRThe Polymerase Chain Reaction”(Mullis等編輯，1994)；“Current Protocols in Immunology”(J.E.Coligan等編輯，1991)。這些技術(shù)可用來生產(chǎn)本發(fā)明的聚核苷酸和多肽，并因此可以被考慮用于本發(fā)明的再現(xiàn)和實施。為了具體實施，特別有用的技術(shù)將在后文的段落中加以論述。
本發(fā)明還包括與化學(xué)功能性物質(zhì)交聯(lián)的αC。典型的是，此類物質(zhì)是能夠產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記物。例如這種交聯(lián)的αC可以用于檢測系統(tǒng)，如腫瘤負(fù)荷的定量、轉(zhuǎn)移病灶的造影和腫瘤造影。此類標(biāo)記物是該領(lǐng)域已知的，包括但不限于放射性同位素、酶、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、生物發(fā)光化合物底物輔助因子和抑制劑。例子參見講述此類標(biāo)記用途的專利美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。此類物質(zhì)可與αC共價連接、重組連接、或者通過第二抗體、蛋白質(zhì)A或生物素-親和素復(fù)合物與αC交聯(lián)。
其它功能性物質(zhì)包括信號肽，增強(qiáng)免疫反應(yīng)性的物質(zhì)，促進(jìn)與固相支持物偶聯(lián)的物質(zhì)，疫苗載體，生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，順磁性標(biāo)記物和藥物。信號肽前文已經(jīng)說過，包括原核和真核形式。增強(qiáng)免疫反應(yīng)性的物質(zhì)包括但不限于細(xì)菌超抗原。促進(jìn)與固相支持物偶聯(lián)的物質(zhì)包括但不限于生物素或親和素。免疫原載體包括但不限于生理學(xué)上可接受的緩沖劑。生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，尤其是腫瘤壞死因子(TNF)，白介素-2、白介素-4、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和γ干擾素。
合適的藥物材料包括抗致瘤性物質(zhì)，包括但不限于放射性同位素、長春花堿、長春新堿和硫酸長春地新等長春花生物堿、阿霉素、硫酸博來霉素、卡鉑、順鉑、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、放線菌素D、鹽酸duanorubicin、鹽酸阿霉素、依托泊甙、氟尿嘧啶、洛莫斯汀、鹽酸氮芥、美法侖、硫汞啉、氨甲蝶呤、絲裂霉素、米托坦、噴司他丁、哌泊溴烷、鹽酸procarbaze、鏈佐星、紫杉醇、硫尿嘌呤、和烏拉莫司汀。
包括單鏈分子在內(nèi)的免疫毒素可用重組技術(shù)產(chǎn)生。各種免疫毒素的產(chǎn)生是該領(lǐng)域所熟知，例如此類方法見于“Monoclonal Antibody-toxin ConjugatesAimingthe Magic Bullet”，Thorpe等，(1982)，Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine，Academic Press，pp.168-190；Vitatta(1987)Science 2381098-1104；和Winter和Milstein(1991)Nature 349293-299。合適的毒素包括但不限于蓖麻毒蛋白、放射性核素、商陸抗病毒蛋白、假單孢桿菌外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒蛋白A鏈、真菌毒素(例如局限性曲酶素(restrictocin)和磷脂酶)。參見，“Chimeric Toxins”，Olsnes和Pihl，Pharma.Ther.15355-381(1981)；和“Monoclonal Antidodies forCancer Detection and Therapy”，Baldwin和Byers編輯，PP.159-179，224-266，Academic Press(1985)。
可用重組法制造化學(xué)功能性物質(zhì)，例如創(chuàng)造一融合基因，該基因編碼其它抗原結(jié)合性片段或基因(例如酶)的功能區(qū)。在基因融合中，兩種成分存在于同一多肽基因中?；蛘?，αC抗原結(jié)合性片段可用各種已知化學(xué)方法與該物質(zhì)化學(xué)結(jié)合。例如，當(dāng)該物質(zhì)是蛋白質(zhì)時，可用異質(zhì)雙功能交聯(lián)劑(例如SPDP、碳二亞胺戊二醛等)連接。這些物質(zhì)可共價連接，或者通過第二抗體、蛋白A或生物素-親和素復(fù)合物之類的第二反應(yīng)劑連接。順磁性物質(zhì)及其與抗體的交聯(lián)在該領(lǐng)域是熟知的。例子參見Miltenyl等，(1990)Cytometry 11231-238。
本發(fā)明的αC抗體可以幾種方法制備。最方便的是從表達(dá)含有SEQ ID NO1和5的抗原結(jié)合性片段或編碼αC結(jié)合性片段的其它聚核苷酸的工程化細(xì)胞來獲得。例如，可將細(xì)胞培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)液中，此培養(yǎng)液可作為抗體來源?？蛇x擇的是，用包被基質(zhì)的管道或微珠，或細(xì)胞共培養(yǎng)物來加強(qiáng)抗體產(chǎn)生細(xì)胞的生長。為了產(chǎn)生大量的抗體，通常以獲取腹水更為方便。產(chǎn)生腹水的方法一般包括將雜交瘤細(xì)胞注入給原初性組織相容性或免疫耐受性哺乳動物，具體是小鼠。為了產(chǎn)生腹水可以通過給予合適物質(zhì)(如降植烷)對哺乳動物進(jìn)行預(yù)處理。
或者，可以利用本文揭示的序列資料和其它信息，結(jié)合蛋白質(zhì)合成的標(biāo)準(zhǔn)方法，化學(xué)合成αC。合適的方法指固相Merrifield技術(shù)。有市售的自動化肽合成儀，如Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)生產(chǎn)的此種儀器。
αC還可用Sambrook等(1989)所述的常規(guī)重組方法來獲得。例如，用本文提供的氨基酸和聚核苷酸序列(SEQ ID NO1-6和13-18)和信息，可將編碼αC的H鏈或L鏈的聚核苷酸克隆到合適的表達(dá)載體(含轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，如啟動子)中。然后將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在合適的條件下宿主細(xì)胞，生長聚核苷酸被轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)?？梢苑謩e產(chǎn)生αC的H和L鏈，然后通過二硫鍵重排來聯(lián)合?；蛘?，將攜有分別編碼αC兩條鏈聚核苷酸的載體，或者將攜有編碼兩條鏈(作為分開來的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)聚核苷酸的載體轉(zhuǎn)染到一個宿主細(xì)胞內(nèi)，該細(xì)胞即會產(chǎn)生并組裝出完整的αC分子。宿主細(xì)胞來自能提供正常糖補(bǔ)給的較高等真核生物為好。這樣，產(chǎn)生的αC可用該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來純化。然后，可從產(chǎn)生αC抗體的雜交瘤獲得編碼αC的聚核苷酸用于產(chǎn)生αC，或者根據(jù)本文提供的DNA序列通過合成或重組產(chǎn)生。
獲得αC的另一方法是用C抗原免疫合適的宿主動物，然后按標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)多克隆或Mab抗體。由此產(chǎn)生的Mab可用該領(lǐng)域已知技術(shù)“人源化”。人源化抗體的例子可參見美國專利5,530,101和5,585,089。
“人源化”抗體，是為了使它更象人免疫球蛋白，至少其部分序列經(jīng)改變而不同于其原來形式的抗體。在一種人源化抗體中，H鏈和L鏈的C區(qū)被人序列取代。這是一種含有H11的V區(qū)和異源免疫球蛋白C區(qū)的融合多肽。在另一種人源化抗體中，CDR區(qū)含有H11的氨基酸序列，而V框架區(qū)被換成人的序列。例子參見，歐洲專利EP0329400。在第三種人源化抗體中，通過設(shè)計人和小鼠V區(qū)的共有序列，并換掉CDR區(qū)以外不同于共有序列的殘基來將V區(qū)人源化。本發(fā)明包括人源化的Mab。
在制造人源化抗體時，框架殘基的選擇對保留高結(jié)合親和性甚為關(guān)鍵。原則上，來自任何HuAb人抗體的框架序列都可作為CDR移植的模板；但是，業(yè)已證明，直接將CDR替換成這類框架可能嚴(yán)重?fù)p失對抗原的結(jié)合親和性。Glaser等(1992)，J.Immunol.1491606；Tempest等(1992)Biotechnology 9266；和Shalaby等(1992)J.Exp.Med.17217。HuAb與原muAb(小鼠抗體)越是同源，人框架擾亂鼠CDR降低親和性的可能性越小。根據(jù)對抗體序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的序列同源性檢索發(fā)現(xiàn)，HuAb IC4與muM4TS.22具有良好的框架同源性，雖然其它高度同源性HuAb也適合，特別是人I亞群的κL鏈或人III亞群的H鏈。Kabat等(1987)。可得到各種計算機(jī)程序如ENCAD(Levitt等(1983)J.Mol.Biol.168595)來預(yù)測理想的V區(qū)序列。所以，本發(fā)明包括具有不同V區(qū)的HuAb。確定合適的V區(qū)序列并優(yōu)化這類序列屬于該領(lǐng)域技術(shù)人員的一般技能。獲得免疫原性降低的抗體的方法也可參見美國專利5,270,202和699,755。
產(chǎn)生和分離抗體的方法是該領(lǐng)域熟知的。例子參見，Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Mannual，Cold Spring Harbour Laboratory，NewYork。H11抗體是一種IgM亞類人免疫球蛋白，可用適合該型免疫球蛋白的技術(shù)來分離。純化方法包括鹽析(如用硫酸銨)、離子交換色譜(如陽離子或陰離子交換柱以中性pH上樣。用離子強(qiáng)度梯級液洗脫)、凝膠過濾色譜(包括凝膠過濾HPLC)和蛋白A、蛋白G、羥基磷灰石和抗免疫球蛋白之類親和樹脂色譜。H11還可以在含有C抗原的親和色譜柱上純化；例如以純化Ab1或Ab3的形式。較好的方法是，H11用蛋白A-CL-SepharoseTM4B色譜柱純化，隨后用DEAE-SepharoseTM4B離子交換色譜柱純化。
本發(fā)明還包括雜交抗體，其一對H和L鏈來自第一抗體，而另一對H和L鏈來自不同的第二抗體。就本發(fā)明目的而言，一對L和H鏈系來自αC。在實施例之一中，各對L-H鏈結(jié)合C抗原的不同位點(diǎn)，這樣的雜交體也可用人源化的H或L鏈形成。
本發(fā)明構(gòu)想的另一種αC是H或L鏈經(jīng)修飾后提供附加特性的抗體。例如，氨基酸序列變化可能導(dǎo)致所得多肽免疫原性降低。這種變化的范圍從一個或幾個氨基酸的改變到完全成重新設(shè)計某個區(qū)域(如C區(qū)結(jié)構(gòu)域)。典型的變化包括但不限于與補(bǔ)體固定有關(guān)的變化、與膜受體相互反應(yīng)有關(guān)的變化，和與其它效應(yīng)器功能有關(guān)的變化?？稍O(shè)計重組抗體來幫助將某物質(zhì)(如細(xì)胞因子)向腫瘤細(xì)胞特異性傳遞。本發(fā)明還包括各個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域排列順序不同于天然的肽。
如果αC用于人，宜至少80％純，至少90％純更好，至少95％純還有好，而且應(yīng)無熱原和其它雜質(zhì)。本文中，百分純度是按制劑中總蛋白成份的重量百分比計算的，不包括在αC純化后特地加入組合物中的組份。
αC抗體具有多種用途。包括激發(fā)產(chǎn)生ααC(抗αC)的抗體應(yīng)答，ααC再用于激發(fā)對αC或C抗原的T細(xì)胞應(yīng)答，和治療各類癌癥。后文將對這些用途進(jìn)行更詳細(xì)的說明。
本發(fā)明包括αC的多肽片段，它至少含有αCV區(qū)的一部分。優(yōu)選的片段是具有H11免疫活性的片段。優(yōu)選的還有含有實質(zhì)上不同于其它免疫球蛋白的氨基酸序列的片段，和含有CDR的片段。在一個實施方案中，本發(fā)明包括一個αCH鏈V區(qū)的多肽片段，它含有SEQ ID NO2的至少25個連續(xù)氨基酸(30個連續(xù)氨基酸更好)，或者其CDR1的5個連續(xù)氨基酸，或者其CDR2或CDR3的至少7個連續(xù)氨基酸，至少9個連續(xù)氨基酸更好。本發(fā)明還包括一段αCL鏈V區(qū)的多肽片段，它含有SEQ ID NO5的至少25個連續(xù)氨基酸(30個連續(xù)氨基酸更好)，或者其CDR2的7個連續(xù)氨基酸，或CDR1或CDR3的至少8個連續(xù)氨基酸，10個連續(xù)氨基酸更好。
αC多肽的大小可以是僅僅提供所需功能的最小長度。多肽可根據(jù)需要或任選地含有αC原有的、或者異源來源的附加序列。αC多肽可以只含有不同于A6同源區(qū)的H11 V區(qū)序列內(nèi)的5個連續(xù)氨基酸。含有αCL或H鏈V區(qū)內(nèi)7個氨基酸，較好的是大約10個，更好的大約15個，還要好的是大約25個，再好的是大約50個，更加好的是大約75個氨基酸的多肽也包括在內(nèi)。最好的是含有完整αCL鏈和H鏈V區(qū)的多肽。多肽來自H11為好。多肽是SEQ ID NO14和17所描述的scFv更好。
本發(fā)明包括經(jīng)修飾的αC多肽，它們與H11功能等價，或者具有雖有改變但可測的H11免疫活性。具有改進(jìn)的H11免疫活性的修飾多肽為優(yōu)。修飾多肽的例子包括顯著損害H11免疫活性的氨基酸殘基的保守性取代、一個或幾個氨基酸的缺失或加入的那些。
實例之一是與原型H11序列相比，含有一個或幾個被轉(zhuǎn)換氨基酸的H11多肽。此種轉(zhuǎn)換范圍從改換或修飾一個或幾個氨基酸殘基到完全重新設(shè)計一個區(qū)域(例如V區(qū))。如果存在氨基酸取代，以不損害肽的折疊或功能特性的保守性取代為佳。可作保守性取代的功能相關(guān)性氨基酸分組是甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷胺酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；絲氨酸/蘇氨酸/甲硫氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。本發(fā)明的多肽可以是糖基化形式或非糖基化形式，可以在翻譯后修飾(例如，乙?；土姿峄?，或者通過合成來修飾(如連接標(biāo)記基團(tuán))。
可以如下形成含有H11的L鏈和H鏈的H11多肽衍生物，即先形成單獨(dú)的L鏈和H鏈然后組裝，或者由表達(dá)兩鏈的同一表達(dá)系統(tǒng)原位組裝而成。這類表達(dá)系統(tǒng)可用含有分開的L鏈和H鏈各自轉(zhuǎn)錄區(qū)的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞，或者用各鏈的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染同一細(xì)胞來創(chuàng)建。第三種方法，將含有H鏈編碼區(qū)的合適質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到H鏈缺失的突變體中。
H鏈缺失的突變體可以通過用熒光標(biāo)記的抗小鼠IgG(H鏈特異性，DAKOCorporation，Carprinteria，CA)按照供應(yīng)商的說明處理約2×107個H11產(chǎn)生細(xì)胞來獲得。著色和未著色細(xì)胞群用熒光激活細(xì)胞分析儀分析。將未著色細(xì)胞收集在一無菌試管中， 用有限稀釋法置入96孔板中，每孔1個細(xì)胞。然后用山羊抗小鼠IgG(H鏈特異性)和山羊抗小鼠κELISA來測定培養(yǎng)上清液。將κ陽性和IgG陰性的克隆進(jìn)行亞克隆至少3次以獲得穩(wěn)定的H11(-H)突變細(xì)胞?？煞蛛x出假定為H鏈缺失的H11(-H)克隆的mRNA，并確定其L鏈V區(qū)cDNA的序列。反向PCR用用于克隆H11(-H)cDNA兩組5’-和3’-引物進(jìn)行反向PCR(實施例7)。H鏈缺失的突變細(xì)胞不產(chǎn)生可測得的DNA條帶。所述細(xì)胞的轉(zhuǎn)染用合適的H鏈質(zhì)粒進(jìn)行。
本發(fā)明包括的另一種αC衍生物，是αCH或L鏈經(jīng)修飾以提供附加功能的抗體。例如，氨基酸序列的改變可能使所得的多肽具有更大的免疫原性。這種改變的范圍從一個或幾個氨基酸的變化到完全重新設(shè)計一個區(qū)域(如C區(qū)結(jié)構(gòu)域)。構(gòu)想的變化影響到補(bǔ)體固定、與膜受體的相互作用和其它效應(yīng)器功能。還可設(shè)計重組H11抗體來幫助將某物質(zhì)(如細(xì)胞因子)向腫瘤細(xì)胞特異性傳遞。本發(fā)明還包括各個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域排列順序不同于天然的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還包括H11的單鏈V區(qū)片段(scFv)。單鏈V區(qū)片段是通過用一段短連接肽將L鏈和/或H鏈的V區(qū)連接產(chǎn)生的。Bird等(1988)Science 242423-426。具有足夠柔性和長度的任何肽都可以用作scFv內(nèi)的接頭。通常，應(yīng)選擇幾乎沒有或完全沒有免疫原性的接頭。連接肽的一個實例是(GGGGS)3，它跨接在一個V區(qū)的羧基末端和另一V區(qū)的氨基末端，約3.5納米長。其它接頭序列也可以使用，并可能提供附圖功能，例如用于連接藥物或固體支持物的結(jié)構(gòu)。
H或L鏈的所有或任何部分可以各種組合形式使用。典型的是，將整個V區(qū)被包含在scFv中。例如，L鏈的V區(qū)可以與H鏈的V區(qū)連接?；蛘?，L鏈V區(qū)的一部分可以與H鏈的V區(qū)或其一部分連接。還考慮這樣的scFv，其中H鏈的V區(qū)來自H11，而L鏈的V區(qū)來自另一免疫球蛋白。還可能構(gòu)建這樣的雙相scFv，其中的一個組份是H11多肽，而另一組份是不同多肽(如T細(xì)胞表位)。
scFv可以任意順序組裝，例如VH-(接頭)-VL或者VL-(接頭)-VH。例如，SEQID NO13和16顯示具有VL-(接頭)-VH形式的H11-scFv2結(jié)構(gòu)。但是，SEQ IDNO13中顯示的結(jié)構(gòu)形成了單體，而SEQ ID NO16中顯示的結(jié)構(gòu)形成二聚體。在具體的表達(dá)系統(tǒng)中，這兩種構(gòu)型可能在表達(dá)水平上有差異，其中一種形式可能被優(yōu)選表達(dá)。還可以形成串聯(lián)scFv，例如(X)-(接頭)-(X)-(接頭)-(X)，其中的X是αC多肽，或αC多肽與其它多肽的組合體。在另一種實施方案中，單鏈抗體多肽沒有接頭多肽，或者只有一段很短的柔性接頭。實例性構(gòu)型包括VL-VH和VH-VL。連接鍵太短，以致于同一鏈中的VL與VH之間無法相互作用，故這兩條鏈在兩端由VL/VH的抗原結(jié)合位點(diǎn)形成同樣的二聚體。這種分子在該領(lǐng)域中稱為“孿生雙體(diabody)”。
scFv可用重組法或合成法產(chǎn)生。scFv的合成產(chǎn)生，可使用自動化合成儀。scFv的重組產(chǎn)生，可將含有編碼scFv的聚核苷酸的合適質(zhì)粒引入合適的宿主細(xì)胞(真核細(xì)胞如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物，或原核細(xì)胞如大腸桿菌)，并用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)分離聚核苷酸表達(dá)的蛋白質(zhì)。
產(chǎn)生scFv的特別有用的系統(tǒng)是質(zhì)粒pET-22b(+)(Novagen，Madison，WI)在大腸桿菌中表達(dá)。pET-22b(+)具有由6個連續(xù)組氨酸殘基構(gòu)成的鎳離子結(jié)合區(qū)，這允許表達(dá)蛋白質(zhì)可用合適的親和性樹脂純化。另一例合適的載體是前文所述的pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)。
表達(dá)條件必須確保scFv具有功能，具有最佳的三級結(jié)構(gòu)則更好。根據(jù)所用的質(zhì)粒(特別是啟動子的活性)和宿主細(xì)胞，可能需要調(diào)節(jié)產(chǎn)生速度。例如，使用較弱的啟動子，或在低溫下表達(dá)，可能是在原核系統(tǒng)中產(chǎn)生正確折疊的scFv進(jìn)行條件優(yōu)化所必需的?；蛘咭栽谡婧思?xì)胞中表達(dá)scFv為佳。
優(yōu)選的scFv包含SEQ ID NO2中的至少10個連續(xù)氨基酸和SEQ ID NO5中的至少10個連續(xù)氨基酸，具體地說，SEQ ID NO2中的氨基酸與SEQ ID NO5中的氨基酸通過一個5至20個氨基酸接頭多肽連接，或者是含有H11的L鏈V區(qū)和H鏈V區(qū)。
本發(fā)明還包括αC多肽的聚合物形式，它含有許多αC多肽。實例之一是αC多肽的線性聚合物，或選擇與載體交聯(lián)。這種線性聚合物可以包含同一αC多肽的多個拷貝，或者由不同的αC多肽組合而成，并且可以是串聯(lián)的αC多肽，或者被其它氨基酸序列隔開的多個αC多肽。另一實例是αC多價抗原肽(MAP)。MAP具有一個小的免疫惰性核心，核心具有呈放射分枝狀的賴氨酸樹突，樹突上共價連接了許多αC多肽。例子參見，Posnett等(1988)J.Biol.Chem.2631719-1725；和Tam(1989)Meth.Enz.1687-15。結(jié)果是形成一巨大分子，具有很高的αC多肽與核心之摩爾比。MAPs是免疫試驗的有效免疫原和有用抗原。用于構(gòu)建αC MAP的核心可用標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)來制造，或者購買。例如購自Quality ControlledBiochemicals，Inc.，Hopkinton，MA。一種典型的核心基質(zhì)是由三層賴氨酸和8個氨基酸構(gòu)成的。
在使用αC多肽作為免疫原時，多肽最好以與載體聯(lián)接形式傳遞。各種載體均可使用，只要它對宿主無害。合適的載體一般是大的代謝清除慢的分子，如蛋白質(zhì)、多糖(如功能化的乳膠Sepharose、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠之類)、聚氨基酸(如聚谷氨酸、聚賴氨酸等)、氨基酸共聚物和無活性病毒粒子或減毒細(xì)菌(如沙門氏菌)。尤其有用的載體蛋白是血清白蛋白、鑰孔藍(lán)血蛋白(KLH)、某些Ig分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白和破傷風(fēng)類毒素，特別以KLH為優(yōu)。
本發(fā)明的αC多肽可用多種方法來鑒定。例如，可用下法篩選L和H鏈的V區(qū)，即制備一系列短的聚核苷酸，它們加起來覆蓋了整個V區(qū)的氨基酸序列。使用長度為20或50個氨基酸的一系列多肽，可以檢測出功能特性有用的各種αCV區(qū)。還可進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的計算機(jī)分析，以鑒定出可能有用的多肽，例如那些具有D2形態(tài)的多肽，或與獨(dú)特型-抗-獨(dú)特型接觸有關(guān)的多肽。
本發(fā)明還包括以各種形式聯(lián)合的本節(jié)所述αC的各種版本，以產(chǎn)生具所需性能的其它αC多肽。例如MAP中可包含氨基酸殘基被修飾的αC多肽。另一個例子是αC scFv與細(xì)胞因子(如IL-2)融合。設(shè)想到的所有這些聯(lián)合均屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的多肽可用任何一種合適的方法來制備，包括αC抗體的蛋白水解、重組法或化學(xué)合成法。這些方法是該領(lǐng)域已知的，在此沒有必要詳細(xì)說明。蛋白水解酶的實例有但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、血纖蛋白溶酶和凝血酶。完整的αC可以同時或者先后與一種或多種蛋白酶一起孵育?；蛘哌€有，可用二硫鍵還原劑來處理完整抗體。然后可用該領(lǐng)域已知技術(shù)來分離肽，這些技術(shù)包括但不限于凝膠過濾、色譜、凝膠電泳和反向HPLC。
制備αC多肽，還可在合適的表達(dá)系統(tǒng)中以編碼多肽(根據(jù)本申請其它部分所述的信息)的聚核苷酸來表達(dá)。通常，將編碼αC多肽的聚核苷酸連到表達(dá)載體上，在合適的啟動子控制下，并用在遺傳上改變的所需宿主細(xì)胞。真核和原核宿主系統(tǒng)均可使用。然后從裂解的細(xì)胞或培養(yǎng)液中分離多肽，并純化到使用所需的純度。本發(fā)明適用的原核宿主細(xì)胞如大腸桿菌，真核細(xì)胞如禽類、昆蟲、植物和動物細(xì)胞，包括但不限于COS7，HeLa和CHO細(xì)胞。
在某些應(yīng)用中，例如在合適的保藏介質(zhì)(例如植物種子)中表達(dá)H11多肽時，H11多肽可以不經(jīng)純化而使用。Fiedler等(1995)Biotechnology 131090-1093。就大多數(shù)應(yīng)用而言，通常多肽從其它細(xì)胞組份中至少部分純化為佳。較好的是，按總蛋白重量百分率計，多肽純度至少約50％。更好的是，蛋白質(zhì)純度至少50-75％。對臨床使用而言，多肽純度宜至少約80％。
本發(fā)明還包括在生物樣品中檢測C抗原的方法。該方法包括獲取生物樣品，在允許抗體抗原結(jié)合的條件下將生物樣品與αC接觸，以及測定抗體與抗原的結(jié)合，如果有的話。
本發(fā)明還包括在生物樣品中檢測抗H11和抗αC的方法。抗αC一旦與H11交叉反應(yīng)就可被檢測到。具有此活性的抗αC會在腫瘤相關(guān)性疾病的病程中自發(fā)產(chǎn)生。有此活性的抗αC尤其可能存在于接受過一段αC治療的個體中。這些方法可以在臨床環(huán)境中進(jìn)行，例如用于監(jiān)測個體體內(nèi)的抗體水平，也可以在工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中(如商品化生產(chǎn)抗H11或抗αC時)進(jìn)行。
此種試驗方法要求在允許靶抗原與H11形成穩(wěn)定復(fù)合物的合適條件下，讓本品中的抗H11或抗αC靶抗體與H11抗體或多肽相接觸，并檢測形成的穩(wěn)定復(fù)合物。在測試前，以合適的方法制備樣品，可以是抗體濃度進(jìn)行富集。在使用完整的鼠αC時，通常宜消除樣品中所有可能存在的抗鼠免疫球蛋白活性。例如用正常鼠IgG沉淀或用鼠Ig吸附劑吸附來去除樣品中的抗鼠免疫球蛋白抗體。通過對測試試劑的經(jīng)驗性選擇，可以將抗鼠免疫球蛋白抗體(特別是對Fc區(qū)特異性的)的結(jié)合減至最小。合適的試劑有鼠抗原決定基甚少的鼠αC的F(ab’)2或Fab片段，和人源化αC或H11等其它試劑。
在以合適的方法制備了樣品后，在允許αC與可能存在的靶抗體之間形成復(fù)合物的條件下，將樣品與過量αC混合。然后測定復(fù)合物的量，并與用標(biāo)準(zhǔn)樣品(含有預(yù)計范圍內(nèi)已知量的靶抗體)形成的復(fù)合物比較。復(fù)合物的形成可通過各種該領(lǐng)域已知方法來觀測，例如免疫沉淀或濁度法，但是，通常，使用標(biāo)記(如125I等放射性同位素標(biāo)記，過氧化物酶和β-半乳糖苷酶等酶，或熒光素之類熒光染料)試劑時的靈敏度更高。
本發(fā)明提供編碼抗體H11或H11的片段的各種聚核苷酸，它們的根據(jù)是本文提供的聚核苷酸序列(SEQ ID NO1和4)。本節(jié)所說各種實施方案，包括H11的H鏈或L鏈的V區(qū)序列的許多不同組合。簡而言之，本發(fā)明的H11聚核苷酸編碼了H11分子的至少一個專有特性(與其它免疫球蛋白，尤其是與A6抗體相比)。該特性在一定程度上與H11的反應(yīng)性有關(guān)為好。
本發(fā)明包括編碼H11的L鏈V區(qū)一部分的聚核苷酸，它含有SEQ ID NO4中至少約70個連續(xù)核苷酸，較好的是至少約80個連續(xù)核苷酸，更好的是至少約100個連續(xù)核苷酸，還要好的是至少約150個連續(xù)核苷酸的聚核苷酸。本發(fā)明還包括編碼H11 L鏈V區(qū)一部分的聚核苷酸，它包含CDR1編碼序列的至少約25個連續(xù)核苷酸，較好的是至少約30個連續(xù)核苷酸，更好的是至少約35個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明還包括編碼H11 L鏈V區(qū)一部分的聚核苷酸，它包含CDR2或CDR3編碼序列中至少約20個連續(xù)核苷酸，至少約25個連續(xù)核苷酸更好，至少約35個連續(xù)核苷酸則還有好。
本發(fā)明還包括編碼H11的H鏈V區(qū)的一部分的聚核苷酸，它包含SEQ IDNO1中的至少約70個連續(xù)核苷酸，至少約80個連續(xù)核苷酸為佳，至少約100個連續(xù)核苷酸更好，至少約150個連續(xù)核苷酸則還有好。本發(fā)明還包括編碼H11L鏈V區(qū)一部分的聚核苷酸，它包含CDR1編碼序列中的15個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明還包括編碼H11 L鏈V區(qū)一部分的聚核苷酸，它包含CDR2或CDR3編碼序列中的至少約20個連續(xù)核苷酸，至少約25個連續(xù)核苷酸更好，至少約35個連續(xù)核苷酸則還有好。
本發(fā)明包括分離的編碼具有H11免疫活性的多肽的H11聚核苷酸，其中的聚核苷酸編碼SEQ ID NO5中所示H11的VL鏈的至少5個氨基酸。本發(fā)明還包括分離的編碼具有H11免疫活性的多肽的H11聚核苷酸，其中的聚核苷酸編碼SEQ ID NO2中所示H1 1的VH鏈的至少5個氨基酸。此聚核苷酸序列可能與SEQID NO1或SEQ ID NO4所示的相似，但是具有為了優(yōu)化密碼子的使用、穩(wěn)定性、促進(jìn)克隆或其它目的而設(shè)計了一些變化。根據(jù)SEQ ID NO2或SEQ ID NO5氨基酸的序列設(shè)計這類聚核苷酸屬于該領(lǐng)域技術(shù)人員的一般技能。優(yōu)選的聚核苷酸編碼H11的CDR的至少5個氨基酸。
本發(fā)明還包括編碼H11的功能等價的變異體和衍生物，以及它們的功能等價片段的聚核苷酸，它們可能加強(qiáng)、減弱或不明顯影響由其編碼多肽的特性。這些功能相當(dāng)?shù)淖儺愺w、衍生物和片段顯示出特異性識別C抗原的能力。例如，不會改變由其編碼氨基酸序列的一段DNA序列內(nèi)的改變、以及導(dǎo)致氨基酸殘基保守性取代的改變、一個或幾個氨基酸殘基的缺失或增加或以同類氨基酸取代氨基酸殘基是不明顯影響由其編碼多肽性能的那類改變。保守性氨基酸取代有甘氨酸/丙氨酸、纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸、天冬酰胺/谷胺酰胺、天冬氨酸/谷氨酸、絲氨酸/蘇氨酸/甲硫氨酸、賴氨酸/精氨酸和苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。
本發(fā)明的聚核苷酸可以包含其它序列，例如同一轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)的其它編碼序列、調(diào)控元件(諸如啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和聚腺苷酸化位點(diǎn))、處于相同或不同啟動子調(diào)控下的其它轉(zhuǎn)錄單元、允許克隆、表達(dá)和轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的序列、和提供本發(fā)明實施方案所需的任何結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明包括與編碼H11的L鏈或H鏈的V區(qū)的聚核苷酸，而不與本申請時限內(nèi)已知的其它免疫球蛋白編碼區(qū)形成穩(wěn)定雜交體的聚核苷酸，它具有至少約15個連續(xù)氨基酸、至少約20個核苷酸為佳，至少約25個連續(xù)核苷酸更好，至少約35個連續(xù)核苷酸也較好，至少約50個連續(xù)核苷酸也較好，至少約75個核苷酸則更好，至少約100個核苷酸則還有好，至少約200個核苷酸更加好，至少約300個核苷酸則更好。為作上述測試也許要用一系列條件，只要有至少一組這樣的條件存在，即可測試聚核苷酸是否表現(xiàn)出所要求的特異性。較好的是，測試聚核苷酸所結(jié)合的H11編碼序列是SEQ ID NO1和4中所示的那些序列。因為已知免疫球蛋白序列與H11的序列有一定程度的相似性，可以通過待測聚核苷酸與H11序列的雜交和與最密切相關(guān)序列的雜交相比較來進(jìn)行這種測試。較好的是一組約10個與SEQ ID NO1、3、4或5最密切相關(guān)的序列。
雜交反應(yīng)可以在不同“嚴(yán)謹(jǐn)”程度的條件下進(jìn)行。提高雜交反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)度的條件是眾所周知的。例子參見Sambrook和Maniatis。有關(guān)條件的實例包括(為了提高嚴(yán)謹(jǐn)度)25℃、37℃、50℃和68℃的孵育溫度；10×SSC，6×SSC，1×SSC，0.1×SSC的緩沖液濃度(其中的SSC是0.15M的NaCl和15mM檸檬酸緩沖液)以及與之用處相當(dāng)?shù)钠渌彌_系統(tǒng)；0％。25％。50％個75％的甲酰胺濃度；5分鐘至24小時的孵育時間；1次、2次或更多次的洗滌步驟；1、2或15分鐘的洗滌孵育時間；和作為洗滌溶液的6×SSC、1×SSC、0.1×SSC或去離子水。
可按下述方法鑒定有用的編碼H11片段的H11聚核苷酸，即產(chǎn)生聚核苷酸片段(例如，根據(jù)SEQ ID NO1或SEQ ID NO4)并測試由其編碼的多肽是否有所需功能?；蛘?，可以制備由特定聚核苷酸編碼的多肽片段，并測試是否有所需功能?；蛘?，如果已知具有所需特性的αC多肽，可以設(shè)計出編碼該多肽的聚核苷酸。
所有實施方案包括具有以下多肽的編碼區(qū)的聚核苷酸，這些多肽有H11聚合體、融合蛋白、人源化免疫球蛋白、單鏈V區(qū)和其它有意義的特定多肽。前文已對上述多肽進(jìn)行了說明。
本發(fā)明還提供共價連接可測標(biāo)記物的聚核苷酸。例如，這種聚核苷酸可用作探針來檢測相關(guān)核苷酸序列。
本發(fā)明聚核苷酸可以通過化學(xué)合成、重組克隆方法、PCR或它們的聯(lián)合應(yīng)用來獲得。聚核苷酸化學(xué)合成法是該領(lǐng)域熟知的，在此沒有必要詳細(xì)說明。使用DNA合成儀或向商業(yè)機(jī)構(gòu)購買，該領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用本文提供的序列資料獲得所需的聚核苷酸。
或者，可以從產(chǎn)生αC抗體的細(xì)胞系、αC克隆載體或αC表達(dá)載體來獲得αC聚核苷酸序列。編碼所需序列的RNA或DNA可用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)來分離、擴(kuò)增和加工。這些技術(shù)包括用限制性核酸酶消化和用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增、或它們的適當(dāng)聯(lián)用。PCR技術(shù)可參見美國專利4,683,195，4,800,159，4,754,065和4,683,202，以及PCR；The Polymerase Chain Reaction，Mullis等編輯，Birkauswer Press，Boston(1994)。
可以將含所需序列的聚核苷酸插入到適當(dāng)載體內(nèi)，然后將載體引入合適的宿主細(xì)胞來復(fù)制和擴(kuò)增。聚核苷酸可用該領(lǐng)域的已知方法引入宿主。細(xì)胞通過直接攝取、胞吞作用、轉(zhuǎn)染、f-交配或電穿孔引入外源聚核苷酸而被轉(zhuǎn)化。外源聚核苷酸一旦被引入可以非整合載體如質(zhì)粒維持在細(xì)胞內(nèi)，或者整合到宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)?？捎脴?biāo)準(zhǔn)方法將擴(kuò)增的DNA從宿主細(xì)胞分離。例子參見，Sambrook等(1989)。RNA可以取自轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或者可用依賴于DNA的RNA聚合酶直接從DNA獲得。
本發(fā)明還包括許多含有H11聚核苷酸的載體。這些載體可用來表達(dá)重組多肽，也是H11聚核苷酸的來源之一?？寺≥d體可用來獲取所含H11聚核苷酸的復(fù)制拷貝，或者作為聚核苷酸保存?zhèn)溆玫囊环N保藏手段。表達(dá)載體(和含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞)可用來獲得所含聚核苷酸產(chǎn)生的多肽。它們還可在需要時(如在基因療法時)，用來在個體內(nèi)表達(dá)H11，從而具有能夠合成多肽的完整細(xì)胞。合適的克隆和表達(dá)載體包括該領(lǐng)域已知的任何一種，例如用作細(xì)菌、哺乳動物、酵母和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中的那些。具體的載體和合適的宿主細(xì)胞是該領(lǐng)域已知的，在此不再詳細(xì)說明。例子參見，Gacesa和Ramji，Vectors，John Wiley & Sons(1994)。
克隆和表達(dá)載體通常含有一個選擇標(biāo)記(例如，編碼載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞存活或生長所需蛋白質(zhì)的基因)，雖然這樣的選擇標(biāo)記基因可以攜帶在共同導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的另一個聚核苷酸序列上。只有引入了選擇標(biāo)記的宿主細(xì)胞才能夠在選擇性培養(yǎng)基上生長。典型的選擇基因或者是(a)提供對抗生素或其它毒素，如氨芐青霉素、新霉素、氨甲蝶呤的抗性基因；(b)補(bǔ)充自養(yǎng)缺陷性基因；或者是(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基中沒有的關(guān)鍵營養(yǎng)素的基因。正確的標(biāo)記基因的選擇取決于宿主細(xì)胞，適合不同宿主細(xì)胞的基因在該領(lǐng)域是已知的。載體通常還含有宿主識別的復(fù)制系統(tǒng)。
合適的克隆載體可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法來構(gòu)建，或者從該領(lǐng)域已有的大量克隆載體中挑選。所選的克隆載體可根據(jù)要用的宿主細(xì)胞而不同，有用的克隆載體通常具有自我復(fù)制的能力，可能具有一個某特定限制性核酸內(nèi)切酶的靶位，或者帶有標(biāo)記基因。合適的實施例包括質(zhì)粒和細(xì)菌病毒，例如pUC18，mp18，mp19，pBR322，pMB9，ColE1，pCR1，RP4、噬菌體DNA和pSA3和pAT28等穿梭載體。上述和其它克隆載體可以從BioRad，Stratagene和Invitrogen等供應(yīng)商處購買。
表達(dá)載體通常是含有編碼有用αC多肽聚核苷酸的可復(fù)制性聚核苷酸結(jié)構(gòu)。編碼αC多肽的聚核苷酸與合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如啟動子、加強(qiáng)子和終止子)操作性連鎖。為了表達(dá)(即翻譯)，通常還要求的一個或多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)和終止密碼子。調(diào)控元件(轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件)可以來自H11基因，或是異源的(即來自其它基因或其它生物)。還可以包含編碼信號肽的聚核苷酸序列，以讓αC多肽穿越或進(jìn)入細(xì)胞膜或由細(xì)胞分泌出來。許多適合在酵母、禽類和哺乳動物細(xì)胞等真核細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體是該領(lǐng)域已知的。表達(dá)載體的實例之一是pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)，在其中，轉(zhuǎn)錄由巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動子/加強(qiáng)子驅(qū)動。該載體還含有多種限制性酶的識別位置，用于插入有用的αC聚核苷酸。表達(dá)載體(系統(tǒng))的另一實例是桿狀病毒/昆蟲系統(tǒng)。
本發(fā)明還包括適用于抗體導(dǎo)向(antibody-targeted)基因治療的表達(dá)系統(tǒng)、它含有αC聚核苷酸。有關(guān)合適系統(tǒng)的說明可參見Brown等(1994)Virol.198477-488；和Miyamura等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 918507-8511。
包含有用的聚核苷酸的載體可用許多合適的方法引入宿主細(xì)胞內(nèi)，其中包括電穿孔，用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質(zhì)轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂質(zhì)轉(zhuǎn)染；和感染(載體是下文訴述的感染性物質(zhì)，如牛痘病毒)。載體或αC聚核苷酸引入方法的選擇一般取決于宿主細(xì)胞的性質(zhì)。
一旦引入了合適的宿主細(xì)胞，可用該領(lǐng)域已知的任何一種試驗來測定αC多肽的表達(dá)。例如，可以通過對培養(yǎng)上清液(如果H11多肽被分泌出來)或細(xì)胞裂解液的RIA或ELISA來測定αC多肽的存在。
特別有用的H11聚核苷酸表達(dá)載體是可用于制備疫苗的含有H11聚核苷酸序列的牛痘病毒。Moss(1991)Science 2521662-1667。為了將編碼H11多肽(包括H11多肽片段)的聚核苷酸序列導(dǎo)入牛痘苗，先將有用的聚核苷酸序列插入含有牛痘病毒啟動子的質(zhì)粒和與牛痘DNA同源的而非復(fù)制所需的側(cè)翼序列的質(zhì)粒內(nèi)。然后用牛痘病毒感染含質(zhì)粒細(xì)胞，造成了質(zhì)粒與病毒之間低水平的同源性重組，結(jié)果是牛痘啟動子和編碼H11多肽的聚核苷酸序列進(jìn)入牛痘病毒的基因組。通常，H11聚核苷酸插入病毒TK(胸腺嘧啶激酶)基因內(nèi)。在TK位置內(nèi)的插入使得病毒與其野生型相比毒性減低了10,000倍以上。Flexner等(1980)Vaccine88(Cold Spring Harbor Laboratory)，pp.179-184。根據(jù)TK-表型鑒定出重組病毒。較好的是，H11聚核苷酸的表達(dá)處于牛痘早期/晚期啟動子(7.5K)的調(diào)控之下，由此所得的H11多肽可在病毒的整個生命周期中在其感染的細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)。然而，該領(lǐng)域已知的其它啟動子或合成啟動子也可以使用，例如pH6。H11多肽的表達(dá)發(fā)生在重組牛痘感染的細(xì)胞內(nèi)，或用活的重組牛痘病毒免疫的個體內(nèi)。多種牛痘病毒株均可使用，包括但不限于WR、ALVAC和NYVAC。
本發(fā)明的載體可含有一個或多個編碼αC多肽的聚核苷酸，也可含有編碼加強(qiáng)、促進(jìn)或調(diào)節(jié)所需結(jié)果的其它多肽的聚核苷酸序列，例如淋巴因子，包括(但不限于)IL-2，IL-4，GM-CSF，TNF-α和IFN-γ。優(yōu)選的淋巴因子是GM-CSF。優(yōu)選的GM-CSF結(jié)構(gòu)是這樣的，它們?nèi)笔Я?’非翻譯區(qū)的富含AU的元件和5’非翻譯區(qū)能夠形成發(fā)卡環(huán)的的序列。本發(fā)明還包括編碼重組αC變異體如scFv、嵌合體和聚合體的牛痘載體。
本發(fā)明的其它實施方案是用上述αC聚核苷酸和含有αC聚核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。原核和真核宿主細(xì)胞均可使用。原核宿主包括細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌和分枝桿菌。真核宿主包括酵母、昆蟲、禽類、植物和哺乳動物細(xì)胞。宿主系統(tǒng)在該領(lǐng)域是已知的，在此不必詳細(xì)說明。哺乳動物宿主細(xì)胞實例包括CHO和NSO，可向歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Cell Culture)(英國)獲取。例如用受CMV啟動子驅(qū)動的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSO細(xì)胞，然后用谷胺酰胺合成酶擴(kuò)增細(xì)胞中的該質(zhì)粒，提供了生產(chǎn)蛋白質(zhì)的有用系統(tǒng)。Cockett等(1990)Bio/Technology 8662-667。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可以用來保藏αC聚核苷酸，或者用作產(chǎn)生αC聚核苷酸和多肽的媒體。它們還可以被用作體內(nèi)表達(dá)αC多肽的媒體。本發(fā)明的H11聚核苷酸可以用來在表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生H11多肽、完整的H11或H11的重組形式，例如下文所述。
本發(fā)明的聚核苷酸具有多種用途。例如，它們可以用來在表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生αC。它們還可以用作雜交探針用該領(lǐng)域熟知的方法檢測樣品中有否αC聚核苷酸或其相關(guān)序列的存在。而且，所述的聚核苷酸還可用作引物來引發(fā)所需聚核苷酸的擴(kuò)增。本發(fā)明的聚核苷酸還可以用于疫苗等藥物組合物和基因療法。
所述聚核苷酸還可以用作檢測αC編碼序列的雜交探針。合適的樣品包括用于基因療法的體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在有關(guān)說明中，從樣品中提取DNA或RNA，或選性地進(jìn)行凝膠電泳和/或用限制性核酸內(nèi)切酶消化。處理后的樣品聚核苷酸按常規(guī)轉(zhuǎn)移到適合洗滌的介質(zhì)中。然后，如果樣品中含有配對αC序列在可形成穩(wěn)定雙螺旋的條件下，樣品聚核苷酸與H11聚核苷酸探針接觸。用合適的方法檢測所形成的穩(wěn)定雙螺旋。例如，可以提供標(biāo)記形式的αC聚核苷酸探針，洗滌后樣品上留存的標(biāo)記將直接反映出所形成的穩(wěn)定雙螺旋的量。在另一說明中，雜交是原位進(jìn)行的。在以合適方法制備的組織樣品上鋪以標(biāo)記探針，以顯示αC編碼序列的位置。
一段短αC聚核苷酸還可以用作PCR反應(yīng)的引物，具體地說，是用以擴(kuò)增含有可與引物雜交區(qū)域的較長聚核苷酸序列。擴(kuò)增可以制備規(guī)模進(jìn)行，為了產(chǎn)生用于將來基因操作的聚核苷酸。也可以分析規(guī)模進(jìn)行，例如用于測定待診斷樣品中是否存在編碼αC的聚核苷酸。
聚核苷酸的另一用途是疫苗和基因療法?？偟脑瓌t是，使用聚核苷酸，結(jié)果要么促進(jìn)要么減弱其編碼多肽的表達(dá)。這樣，本發(fā)明就包括誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法和治療的方法，包括給予個體有效量的αC聚核苷酸。在這些方法中，編碼αC多肽的αC聚核苷酸被直接或者通過用αC聚核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞給予個體。所用αC聚核苷酸是環(huán)狀質(zhì)粒形式的較好，以超螺旋構(gòu)型為佳。αC聚核苷酸在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制更好。所以，αC聚核苷酸應(yīng)與合適的啟動子(例如在靶組織細(xì)胞內(nèi)具有天生活性的異源啟動子)操作性連鎖。較好的是，一旦進(jìn)入細(xì)胞核，質(zhì)粒保持為環(huán)狀非復(fù)制性游離基因分子。例如，用質(zhì)粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行體外突變來編碼具有更高親和性和親合力的分子。
為了確定含有αC聚核苷酸的質(zhì)粒是否能夠在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)αC，可以用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7，CHO或HeLa等細(xì)胞。然后用免疫試驗，如用Western印跡法來測定αC的表達(dá)。較小的αC多肽可用下法測定，例如，構(gòu)建質(zhì)粒使所得αC多肽與一標(biāo)記(如靶表位或酶標(biāo)記)融合。通過純化此肽，然后用本文所述的一種功能性試驗可進(jìn)一步鑒定所表達(dá)的αC多肽。
在一種基因療法中，用本發(fā)明的聚核苷酸在體外從遺傳上改變細(xì)胞。在這種方法中，用編碼αC多肽的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)自供體取出或由細(xì)胞系獲得的細(xì)胞，然后給予接受者。適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞。
在另一種基因療法中，本發(fā)明的聚核苷酸被用來在體內(nèi)從遺傳上改變細(xì)胞。其目的包括但不限于治療各種類型的癌癥。
αC多肽可用幾種方法鑒定。例如，可測試αC多肽與癌細(xì)胞特異性結(jié)合的能力，測試其特異性抑制癌細(xì)胞與完整H11結(jié)合的能力。αC多肽還可與抗CDR3多肽反應(yīng)。還可測試αC多肽緩解或改善瘤形成性疾病(如癌癥)的能力。可以理解，雖然具有上述特性中一種以上特性的多肽為佳，但只要有其中一種，就可認(rèn)定該多肽屬于本發(fā)明范圍。
可用免疫試驗來測試αC多肽結(jié)合癌細(xì)胞或其抗原性片段的能力。任何形式的直接結(jié)合試驗都合適。在所述測試之一中，癌細(xì)胞或推定αC多肽是經(jīng)標(biāo)記的。合適的標(biāo)記包括放射性同位素例如125I，酶例如過氧化物酶，熒光標(biāo)記例如熒光素和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。通常，為了方便洗滌，另一結(jié)合配對體是不可溶的(例如包被在微滴板上)。將標(biāo)記組份與不可溶組份結(jié)合后，洗滌固定相，并測定與之結(jié)合的標(biāo)記物量。另一種試驗是夾心試驗。試驗中，推定αC多肽被固定相上的第一抗免疫球蛋白捕獲，并利用αC抗體來顯現(xiàn)。在上述兩個例子中，αC的結(jié)合程度都和與固相結(jié)合的標(biāo)記物量直接相關(guān)。
為了進(jìn)行抑制試驗，對推定αC多肽減少H11與癌細(xì)胞結(jié)合的能力進(jìn)行了滴定。反應(yīng)中結(jié)合的對中被抑制的那一個是標(biāo)記的，而另一個通常是不可溶的以方便洗滌。推定αC多肽按常規(guī)與標(biāo)記組份混合，然后此混合物與固相結(jié)合。與對照多肽相比，具有H11特性的多肽將視固相連接的標(biāo)記物量按比例減少。這個試驗可能比測定直接結(jié)合的靈敏度更高，因為αC和C抗原之間的低親和性結(jié)合反應(yīng)太弱以致于不能形成穩(wěn)定的鍵，但在足夠高濃度時，卻足以干擾其它配體-受體對的結(jié)合。
本發(fā)明包括單單含有αC的或αC與其它物質(zhì)結(jié)合的藥物組合物和免疫原性組合物。這些藥物組合物和疫苗要么單獨(dú)使用要么與其它治療形式(如化療或放療)聯(lián)用，以激發(fā)免疫應(yīng)答和治療腫瘤疾病。
含αC抗體、或其聚核苷酸或多肽衍生物作為活性成份的藥物組合物的制備是根據(jù)廣泛認(rèn)可的藥物制劑制備方法來進(jìn)行的。例子參見，Remington’sPharmaceutical Science第18版(1990)，E.W.Martin編輯，Mack Publishing Co.，PA。根據(jù)目的用途和使用方式，在制備藥物組合物時，活性成分可能需要進(jìn)一步處理。合適的處理包括穩(wěn)定化、與合適的無毒且非干擾性成份混合、分成劑量單元并包裝在傳遞裝置中。
例如，液體的藥學(xué)上可接受的組合物可通過將本文所述多肽溶解或分散在液體賦形劑中來制備，訴述的賦形劑如水、鹽水、葡萄糖水溶液、乙二醇或乙醇。組合物還可以含有其它藥物、藥劑、佐劑、載體和輔料(例如潤濕劑或乳化劑，和pH緩沖劑)。
本發(fā)明的藥物組合物用與組合物形式相合適的方式來使用。典型的給藥途徑包括皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、透皮、口腔、鼻內(nèi)和肺內(nèi)(例如用氣霧劑)。本發(fā)明的人用藥物組合物通常是腸胃外途徑給藥，最常用的是皮內(nèi)、皮下或肌內(nèi)。
口鼻或局部使用的藥物組合物可以以固體、半固體或液體形式使用，包括片劑、膠囊、粉劑、液劑和懸浮液。注射用組合物可以以液體溶液或懸浮液的形式、以乳液的形式、或以適合在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式使用。經(jīng)呼吸道給藥，較好的組合物是用合適的噴霧裝置提供固體、粉末或液體噴霧的組合物。雖然不是必需的，藥物組合物最好以適合準(zhǔn)確量給予的單應(yīng)劑型提供。而且，本發(fā)明構(gòu)思的還有緩釋或持續(xù)釋放形式，利用上述劑型可以在更長的時間內(nèi)提供相對恒定水平的活性化合物。
還可以測定本發(fā)明組合物特異性識別腫瘤的能力。為此，測試化合物被制備成合適的藥物組合物，給予受試者。初步研究最好在鼠或兔之類小動物中進(jìn)行，可以接著在非人靈長目動物中進(jìn)行，然后最終在人體內(nèi)進(jìn)行。免疫原性宜在過去沒有抗體應(yīng)答的個體中進(jìn)行。根據(jù)合適的治療方案，給予合適劑量的待測組合物?？赡苄枰陬A(yù)定范圍內(nèi)比較不同的劑量和方案。上述測試是該領(lǐng)域技術(shù)人員的一般技能。
本發(fā)明的組合物尤其適合給患有腫瘤疾病的人使用。特別相關(guān)的是黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、淋巴瘤和小細(xì)胞肺癌。
本發(fā)明還包括治療癌癥的方法。這些方法包括給予有效量的含αC藥物組合物來獲得所需效果(如緩解存在的腫瘤或防止復(fù)發(fā))。癌癥的治療，給予藥物組合物的量是能有效產(chǎn)生所需效果的量。有效量可以一次給予或多次給予。
所用αC抗原結(jié)合性片段的有效量將取決于幾種因素，如給藥途徑、個體狀況和所需目的?！爸委熡行А敝杆每乖Y(jié)合性片段的量足以緩解癌癥?！熬徑狻敝赴┌Y對個體的損傷減少。通常，如果直接給藥，每次給藥的量約為10微克至20毫克，以250微克至10毫克為佳，300微克至5毫克更好，500微克至2.5毫克則還有好。給藥通常每周或兩周一次，直至檢測到所需的、可測的參數(shù)(如疾病癥狀的減輕)。根據(jù)需要，然后可以較低的頻度繼續(xù)給藥，例如兩周或每月一次。
本發(fā)明各種組合物可以單獨(dú)使用，也可以與其它活性藥劑合用，此種活性藥劑促進(jìn)所需的目的，或者提供所需的輔助治療。合適的活性藥劑包括前文所述的抗瘤藥和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和效應(yīng)細(xì)胞(例如Douillard等(1986)在Hybridomas(同上，15139)中描述的那些)。
當(dāng)用于免疫治療時，αC可以是非標(biāo)記的或如前文所述用治療藥物標(biāo)記的。這類藥物可以直接或間接地與本發(fā)明多肽偶聯(lián)。間接偶聯(lián)的例子之一是用臂結(jié)構(gòu)。這類臂結(jié)構(gòu)可以是不溶性或可溶性的(Diener等，(1986)Science 231148)，并可以挑選能使藥物在靶部位從αC上釋放出來的?；蛘?，αC和治療藥物可以被翻譯、合成、連接或以其它方式產(chǎn)生成單一分子，該分子具有C和治療藥物的兩種功能?？梢耘cαC偶聯(lián)用于免疫治療的治療藥物的實例，包括但不限于生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、藥物、放射性同位素、凝集素和毒素。生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑包括淋巴因子，后者包括但不限于腫瘤壞死因子、白介素1、2和3、淋巴毒素、巨噬細(xì)胞活化因子、移動抑制因子、集落刺激因子和干擾素?？梢杂糜跇?biāo)記αC的干擾素包括干擾素、β干擾素和干擾素(IFN-γ)，以及它們的亞型。
放射性同位素交聯(lián)的αC用于免疫治療時，根據(jù)白細(xì)胞的分布和同位素的穩(wěn)定性和放射性，某些同位素可以比其它的更好。如需要，可用下文的體內(nèi)診斷技術(shù)來評價惡性細(xì)胞的分布。根據(jù)惡性程度，某些放射體可能優(yōu)于其它。一般講，免疫治療選發(fā)射α和β粒子的放射性同位素為好。例如，如果動物有實體瘤病灶(例如在癌癥中那樣)，能夠穿透幾毫米厚組織的高能β放射體可能較好，例如90Y。另一方面，如果惡性瘤由簡單的靶細(xì)胞組成(如白血病)，短程高能α放射體可能較好，例如212Bi?？梢耘c本發(fā)明的抗原結(jié)合性片段結(jié)合用于治療目的的放射性同位素包括但不限于125I、131I、90Y、67Cu、212Bi、211At、212pb、47Sc、109Pd和188Re。
凝集素通常是從植物性材料分離的蛋白質(zhì)，它們結(jié)合特定的糖基。許多凝集素還能夠凝集細(xì)胞和刺激淋巴細(xì)胞。但是，蓖麻毒蛋白是一種已被用于免疫治療的毒性凝集素。免疫治療宜將產(chǎn)生毒性的蓖麻毒蛋白的α肽鏈與抗體分子結(jié)合，使毒性作用可定位特異性傳遞(給癌細(xì)胞)。
毒素是由植物、動物或微生物產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，其在足夠劑量時常是致命的。白喉毒素是一種由白喉棒狀桿菌產(chǎn)生的可以用于治療的物質(zhì)。這種毒素由α和β亞基構(gòu)成，在合適的條件下二亞基可以相互分開。毒性的A鏈可以與抗體結(jié)合并用于向瘤細(xì)胞作定位特異性傳遞。
例如，這樣αC可以與α干擾素合用。這種治療方式通過增加黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)的Mab反應(yīng)性抗原增強(qiáng)了Mab的黑色素瘤定向作用。Greiner等(1987)Science 235895。或者，例如αC可與IFN-γ合用來激活和增加效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體表達(dá)，繼而加強(qiáng)抗原結(jié)合性片段與效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合并殺死惡性靶細(xì)胞。該領(lǐng)域技術(shù)人員能夠從多種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑中選擇出能構(gòu)建出增強(qiáng)αC效果的所需效應(yīng)器功能。
當(dāng)αC如與前文所述的各種治療藥物合用時，兩種物質(zhì)的給藥通?；旧鲜峭瑫r的?！盎旧贤瑫r”指就時間而言，它們的給藥相當(dāng)靠近。通常，治療藥物宜先于αC給藥。例如，治療藥物可以比αC早1至6天給藥。治療藥物的給藥可以逐日，或任何合適的間隔，這取決于惡性瘤的特性、患者狀況和藥物半衰期之類因素。
使用αC，可以設(shè)計聯(lián)合治療方法。在與效應(yīng)細(xì)胞或相同治療藥物、或不同治療藥物合用的αC給藥之前，可能需要先給以某種治療藥物。例如，患者可以先每日給以IFN-γ和白介素2(IL-2)，治療3至5天，在第5天給予與效應(yīng)細(xì)胞、IFN-γ和白介素2合用的αC。
本發(fā)明還包括以下脂質(zhì)體的使用，脂質(zhì)體其膜上結(jié)合αC后，它將脂質(zhì)體特異性地送至表達(dá)C抗原的腫瘤或瘤形成性細(xì)胞。這類脂質(zhì)體可制造成含有除αC之外的其它免疫治療藥物，該種藥物如前文所述能夠在惡性瘤部位釋放。Wolff等(1984)Biochem.Biophys.Acta.802259。Brown等(1994)Virology 198477-488；和Miyamura等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 918507-8511所述的另一種此類傳遞系統(tǒng)利用嵌合性細(xì)小病毒B19衣殼來提呈抗原結(jié)合性片段。此類嵌合系統(tǒng)被包括在本發(fā)明的用途權(quán)利要求中。
αC的給藥劑量范圍大到足以產(chǎn)生所需的效果，即惡性腫瘤疾病的癥狀得到緩解，但是不引起不希望的交叉反應(yīng)、過敏反應(yīng)等過度的副作用。劑量根據(jù)患者的年齡、狀況、性別和疾病程度而不同，而且可以由該領(lǐng)域技術(shù)人員來確定，由醫(yī)生根據(jù)并發(fā)癥來校正，劑量為約0.1毫克/千克(體重)至約2000毫克/千克，約0.1毫克/千克至約500毫克/千克更好，可以每日一次或多次給藥，持續(xù)數(shù)天。通常，將αC與治療藥物交聯(lián)后使用時，可以使用低于在體內(nèi)免疫診斷造影中所用的劑量。
αC治療組合物可以注射或逐步灌注來給藥。αC抗原結(jié)合性片段可經(jīng)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、鞘內(nèi)或透皮給藥，可以單獨(dú)給藥或與效應(yīng)細(xì)胞合用。
另一種給藥方法是損傷區(qū)內(nèi)給藥，例如直接注入腫瘤。對癌癥患者進(jìn)行各種免疫治療的損傷區(qū)內(nèi)給藥不會導(dǎo)致免疫藥物全身給藥那樣的毒性。Fletcher等(1987)Lymphokine Res.645；Rabinowich等(1987)Cancer Res.47173；Rosenberg等(1989)Science 2331318；和Pizz等(1984)Int.J.Cancer 34359。
αC尤其適用于腦癌的治療和造影。當(dāng)傳遞部位是腦時，治療藥物必須能被傳遞到腦。血腦屏障限制了腦和脊索從總循環(huán)中吸收許多藥物。穿越血腦屏障的分子主要用兩種機(jī)制自由擴(kuò)散；和促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)。由于血腦屏障的存在，要獲得某特定治療藥物在CNS內(nèi)的有效濃度可能需要使用特殊的藥物傳遞方法。治療藥物向CNS的傳遞可以通過幾種方法實現(xiàn)。
方法之一依賴于神經(jīng)外科技術(shù)。如果是重癥患者，盡管有風(fēng)險，但是外科方法是可行的。例如，治療藥物可以通過直接物理引導(dǎo)(例如心室內(nèi)、損傷區(qū)內(nèi)或鞘內(nèi)注射)傳遞到CNS內(nèi)。心室內(nèi)注射可用與容器(例如Ommaya容器)連接的心室內(nèi)導(dǎo)管。引入方法還可用可重復(fù)充電或生物降解的裝置。另一種方法是用提高血腦屏障通透性的物質(zhì)破壞血腦屏障。實施例包括動脈輸注擴(kuò)散性較差的藥物(如山梨醇)、提高腦血管透性類藥物(如依托泊甙)、或者作用于血管的藥物(如白三烯)。Neuwelt和Rappoport(1984)Fed.Proc.43214-219；Baba等(1991)J.Cereb.bloodFlow Metab.11638-643；和Gennuso等(1993)Cancer Invest.11638-643。
此外，可能需要在有治療需要的區(qū)域局部使用組合物；例如，在手術(shù)中局部灌注、注射、利用導(dǎo)管、或用植入物來進(jìn)行。所述植入物是一種有孔性、非孔性或凝膠樣物質(zhì)，它包括膜(如硅化橡膠膜)或纖維，一種此類合適的膜是Gliadel，由Guilford Pharmaceuticals Inc.提供。
另一種方法涉及αC的修飾或選擇等藥物技術(shù)以提供可穿越血腦屏障的類似物。實施例包括，提高分子的疏水性、降低分子的凈電荷或分子量、或者修飾分子(例如接上通常能穿越血腦屏障的分子)。Levin(1980)J.Med.Chem.23682-684；Pardridge(1991)Peptide Drug Delivery to the Brain；和Kostis等(1994)J.Clin.Pharmacol.34989-996。
將αC包裹在疏水性環(huán)境(如脂質(zhì)體中)也可有效地將藥物傳遞到CNS。例如，WO91/04014說明了一種脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)，藥物被包在脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體上加入了通常能夠穿越血腦屏障的分子。
另一種制備能通過血腦屏障的αC制劑的方法是將其包裹在環(huán)糊精中。任何能通過血腦屏障的合適環(huán)糊精都適用，包括但不限于β-環(huán)糊精、γ環(huán)糊精及其衍生物。參見，美國專利5,017,566，5,002,935和4,983,586。此類組合物還可以包含乙二醇衍生物，如美國專利5,153,179所述。
還有其它方法，利用生理技術(shù)來產(chǎn)生新的嵌合型可轉(zhuǎn)運(yùn)αC，例如將αC與可轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)交聯(lián)。例如，作用于血管的腸肽類似物(VIPa)只有在與特定的載體分子運(yùn)鐵蛋白受體的Mab交聯(lián)后才發(fā)揮其血管作用，這將刺激VIPa-Mab交聯(lián)物通過血腦屏障的吸收。Pardridge(1991)；和Bickel等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA902618-2622。已鑒定了其它幾種特異性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，它們包括但不限于用于傳遞胰島素或I型和II性類胰島素生長因子的系統(tǒng)。其它合適的非特異性載體包括但不限于吡啶鎓、脂肪酸、肌醇、膽固醇和葡萄糖衍生物。已報告了幾種前藥，利用前藥，藥物在進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后與載體分離釋放成活性藥物。美國專利5,017,566。
合適的受治療者包括被懷疑處于腫瘤(特別是癌)病理作用危險中的人，他們適合接受本發(fā)明藥物組合物的治療。有癌癥病史的患者尤其合適。適合用此療法的人按照臨床標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分，包括兩類。患有“晚期疾病”或“腫瘤高負(fù)荷”的人指有著臨床可測見腫瘤的患者。臨床可測見腫瘤即瘤體可被檢測到(例如通過觸診、CAT掃描、或X光；生化或組織病理學(xué)標(biāo)記陽性本身可能并不足以確定該患者群)。為了緩解它們的病情，本發(fā)明的藥物組合物被用于此類患者來激發(fā)抗腫瘤應(yīng)答。理想的是引起瘤體減小，但是有益效果包括任何臨床改善。臨床改善包括腫瘤引起的病理后果的風(fēng)險減小、發(fā)展速度減慢和減弱。
另一類合適的受治療者在該領(lǐng)域被稱為“可疑患者組(adjuvant group)”。這類個體有癌癥病史，但對其它治療已有過效果。先前的治療可能包括但不限于手術(shù)切除、放療、和常規(guī)化療。結(jié)果這些個體沒有臨床可測見的腫瘤。但是，它們被懷疑有癌癥發(fā)展的危險性，或者在原腫瘤部位附近，或由于轉(zhuǎn)移。
這類人可進(jìn)一步分為高危和低危個體。該次級分類是根據(jù)最初治療前后觀察到的特征。這類特征在臨床上是眾所周知的，根據(jù)各種癌癥有相應(yīng)的規(guī)定。高危亞組病人的典型特征是腫瘤已經(jīng)侵入鄰近組織，或涉及淋巴結(jié)。
另一類合適的受治療者是具有遺傳癌癥易患性但是還沒有癌癥臨床癥狀證據(jù)的。例如，乳房癌相關(guān)性基因突變測試呈陽性的育齡婦女，他們可能希望接受預(yù)防性αC治療以防止癌癥的發(fā)生，不至于發(fā)展到實施預(yù)防性手術(shù)。
為了激發(fā)抗癌應(yīng)答，對可疑患者組患者，或兩亞組病人使用本發(fā)明的藥物組合物。理想的是，組合物延遲了癌癥的復(fù)發(fā)，更好的是，消除了復(fù)發(fā)的危險性(即提高了治愈率)。此類參數(shù)可以通過與其它患者群及其它治療方式的比較來確定。
當(dāng)然，兩亞類患者之間有重疊，而本發(fā)明化合物可以在任何合適的時候使用。例如，αC治療可在高腫瘤負(fù)荷患者進(jìn)行常規(guī)治療之前或期間進(jìn)行，并在腫瘤變?yōu)榕R床不可測之后繼續(xù)進(jìn)行。αC治療可在最初屬于可疑患者組但正呈現(xiàn)復(fù)發(fā)跡象的患者中持續(xù)進(jìn)行。護(hù)理醫(yī)師將決定如何以及何時使用本發(fā)明組合物。
本發(fā)明的各種化合物和組合物還有其它臨床適應(yīng)征，對此下文只是一個綜述。
適應(yīng)征之一是體外細(xì)胞治療。這可能是因試驗?zāi)康模蚴菫榱酥委熌[瘤患者。一個實施例中，給予培養(yǎng)細(xì)胞αC，此種培養(yǎng)細(xì)胞為獻(xiàn)血者的外周血細(xì)胞或合適的細(xì)胞系。為此目的H11的有效劑量約為0.5至2微克/毫升。第二個實施例中，獻(xiàn)血者細(xì)胞用本發(fā)明的表達(dá)載體作遺傳改變，將細(xì)胞給于接受者后提供αC的不斷分泌。
本發(fā)明還包括體內(nèi)檢測癌細(xì)胞的方法。給予需要腫瘤造影的人診斷有效量的帶有可測性標(biāo)記的αC。“診斷有效量”指帶有可測性標(biāo)記的αC的用量足以使得腫瘤被檢出。
帶可測性標(biāo)記αC的使用濃度必須足以與帶有C抗原的細(xì)胞結(jié)合，與背景比較，可被測出。而且，為了提供最佳的目標(biāo)-背景信號比，要求帶可測性標(biāo)記的αC從循環(huán)系統(tǒng)中被迅速清除。
原則上，用于體內(nèi)診斷的帶可測性標(biāo)記的αC劑量在某種程度上是患者特異性的，取決于年齡、性別和疾病嚴(yán)重程度等因素。αC的劑量可以從0.01毫克/平方米至約500毫克/平方米不等，0.1毫克/平方米至約200毫克/平方米為佳，約0.1毫克/平方米至約100毫克/平方米最好。這種劑量可根據(jù)該領(lǐng)域技術(shù)人員已知的輸注次數(shù)、腫瘤負(fù)荷及其它因素而變化。例如，用花青苷交聯(lián)的Mab體內(nèi)標(biāo)記腫瘤。Ballou等(1995)Cancer Immunol.Immunother.41257-263。
就體內(nèi)診斷性造影而言，在放射性同位素選擇中，檢測儀器的類型是主要考慮因素。所選的放射性同位素必須具有可以被給定類型儀器測中的衰變類型。體內(nèi)診斷選擇放射性同位素的另一個重要因素，是放射性同位素的半衰期必須長到足以在被目標(biāo)最大吸收時仍能被測出，但又短到足以對個體的有害輻射減至最低。理想的是，用于體內(nèi)造影的放射性同位素沒有粒子發(fā)射，但是產(chǎn)生大量140-250keV范圍內(nèi)的光子，它們很容易被常規(guī)的γ攝影儀檢測到。就造影而言，111In-H11-scFv(例如2毫克用5毫居里111銦標(biāo)記的scFv)的劑量范圍是每個患者約0.01毫克至20毫克，約0.1至10毫克為佳，約1至5毫克則更好。
為了進(jìn)行體內(nèi)診斷，放射性同位素可以直接與αC結(jié)合，或者利用一個中間官能團(tuán)與之間接結(jié)合。常被用來將金屬離子放射性同位素與免疫球蛋白連接的中間功能性基團(tuán)是雙功能螯合劑，例如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)以及類似分子?？梢耘cαC結(jié)合的金屬離子典型例子有111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr、90Y和201Tl。
為了體內(nèi)診斷(例如在磁共振造影(MRI)或電子自旋共振(ESR)中)的目的，αC還可以用順磁性同位素來標(biāo)記?？傊?，為了顯示診斷造影的任何常規(guī)方法均可使用。通常，將發(fā)射γ和正電子的放射性同位素用于攝影造影，而將順磁性同位素用于MRI。此類技術(shù)中特別有用的元素包括157Gd、55Mn、162Dr、152Cr和56Fe。αC還可以用熒光染料標(biāo)記用于體內(nèi)診斷。
αC還可在體外測試中用來檢測瘤形成。從患者獲取樣品，然后用αC進(jìn)行合適的免疫測試，以檢測C抗原的存在。這在檢測攜C抗原的腫瘤細(xì)胞在患者血流中循環(huán)的淋巴瘤和白血病中特別適用。
αC還可以用來監(jiān)測個體內(nèi)惡性腫瘤的緩解過程。所以，通過測定表達(dá)C抗原的細(xì)胞數(shù)量的增加或減少，或者各種體液中C抗原濃度的改變，可能確定以緩解惡性腫瘤為目標(biāo)的特定治療方法是否有效。
本發(fā)明包括包含αC的試劑盒。使用αC的診斷程序可由診斷實驗室、使用實驗室、醫(yī)師或私人進(jìn)行。臨床樣品可以但不必須為了富集待測物而進(jìn)行預(yù)處理。然后，用戶使用盒內(nèi)試劑檢定診斷組份的變化水平。
每個試劑盒包括用于檢測樣品C抗原的αC?；蜻x的是，試劑與標(biāo)記交聯(lián)，使得能檢測出樣品中與C抗原形成的復(fù)合物。在另一種選擇中，提供第二試劑，它能夠在第一試劑找到目標(biāo)后與第一試劑結(jié)合從而提供可測標(biāo)記。例如，標(biāo)記的抗鼠IgG可作為第二試劑與完整αC合用。如果基本試劑已經(jīng)用生物素標(biāo)記，則可將標(biāo)記的親和素作為第二試劑。
試劑盒可以用來測試包括液體樣品、細(xì)胞懸浮液和組織樣品在內(nèi)的各種生物樣品。本文所述的試驗都屬于可以試劑盒形式提供的使用αC的合適試驗。各種試劑均以適合保存的固體或溶解/懸浮在緩沖液形式提供，在測試時交換或加入反應(yīng)介質(zhì)中。試劑盒具有合適的包裝。試劑盒還可以但不必須提供用于測試過程的其它組分。這些任選的組分包括但不限于緩沖劑、捕俘劑、顯影劑、標(biāo)記、反應(yīng)表面、檢測裝置、對照樣品、說明書和解釋資料。
以上提供了制備H11、以及編碼H11的聚核苷酸、H11多肽片段及其它衍生物的詳細(xì)說明。參照本文提供的H11的序列資料，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的方案。以下實施例用于說明而非限制本發(fā)明范圍。
實施例1獲取Mab H11的方法
Mab NBGM1/H11(“H11”)是一種人單克隆IgM抗體，它可與以下人腫瘤組織和相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞系反應(yīng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性黑色素瘤、結(jié)腸腺癌和乳房腺癌。實施例2說明了Mab NBGM1/H11的體外鑒定。
H11融合細(xì)胞是將取自一64歲低等級神經(jīng)膠質(zhì)瘤男性患者的8×106外周血淋巴細(xì)胞與TM-H2-SP2人骨髓細(xì)胞系融合得到的。TM-H2-SP2細(xì)胞系是IgG(κ)親本細(xì)胞系TM-H2的一個免疫球蛋白非分泌性亞系，是一未知的人骨髓瘤樣細(xì)胞系的次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.2.8)缺陷型衍生細(xì)胞，它選擇性生長在6-硫代鳥嘌呤(6微克/毫升)抗性的0.8％甲基纖維素培養(yǎng)基上但是不能生長在次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶培養(yǎng)基中。TM-H2-SP2的核型是46±2，XX。
將所得的活的雜交瘤細(xì)胞分散在40個微格中，密度為2×105細(xì)胞/格即0.2毫升/格。融合H11的生長率為40個可能含有雜交瘤的格中有12個(30％)。持續(xù)生長的生長定義為培養(yǎng)物不斷增加，持續(xù)生長3個月以上；雜交瘤生長失敗的情況發(fā)生為融合3個月后未見細(xì)胞生長。
用抗原俘獲酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)在微滴板上進(jìn)行雜交克隆的篩選，使用多克隆抗人IgM或IgG作為包被抗原。如果測得的光密度(O.D.)值超過對照培養(yǎng)上清液平均本底水平2標(biāo)準(zhǔn)離差(standard deviation)以上，則認(rèn)為雜交瘤培養(yǎng)上清液呈陽性。
NBGM1/H11雜交瘤克隆的選擇是通過固定細(xì)胞ELISA進(jìn)行的。對6個(經(jīng)測定具有高IgM或IgG分泌)微滴格的培養(yǎng)物上清液用預(yù)先附著固定的人腫瘤細(xì)胞系(成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(SKMG-1和D-54MG)；黑色素瘤(A-375)；結(jié)腸腺癌(SK-CO-1))進(jìn)行篩選。如果測得的O.D.值超過對照培養(yǎng)上清液平均本底水平2標(biāo)準(zhǔn)離差以上，則認(rèn)為雜交瘤上清液呈陽性。由NBGM1/H11雜交瘤產(chǎn)生的Mab持續(xù)與上述腫瘤細(xì)胞系反應(yīng)?！癏11”抗體是IgM(κ)。
對NBGM1/H11雜交瘤種子庫的鑒定由微生物學(xué)協(xié)會(MicrobiologicalAssociates)(Rockville，MD)進(jìn)行。這些細(xì)胞對以下測試呈陰性(1)細(xì)菌和真菌污染，(2)支原體污染，(3)HIV-1和HIV-2抗原和(4)HTLV-1和HTLV-2抗原。
用于鑒定Mab NBGM1/H11的方法包括抗原捕獲ELISA，抗原ELISA，固定細(xì)胞ELISA，流式細(xì)胞計數(shù)，人腫瘤細(xì)胞系的免疫過氧化物酶染色和人腫瘤或正常組織的免疫組織化學(xué)(參見后文實施例)。
實施例2
Mab H11與人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(SKMG-1)和黑色素瘤(A375)細(xì)胞系結(jié)合
的流式細(xì)胞計數(shù)分析
為了測定Mab H11與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，通過與PBS-EDTA孵育使生長在T形瓶中的腫瘤細(xì)胞脫下。低速離心收集細(xì)胞，用冰冷卻的PBS-1％FBS洗滌，再離心，吸棄上清液。沉淀細(xì)胞重懸在分別添加了以下成分的培養(yǎng)液中對照人黑色素瘤IgM；雜交瘤NBGM/H11培養(yǎng)上清液；或含有純化Mab H11的PBS；在冰上孵育30分鐘。孵育后，離心收集細(xì)胞，重懸在PBS-FBS中進(jìn)行洗滌，離心。然后沉淀細(xì)胞再與FITC交聯(lián)的山羊抗人IgM孵育30分鐘。孵育后，細(xì)胞用PBS-FBS洗滌。最后，將細(xì)胞重懸在PBS-FBS中，加入碘化丙錠(PI)，并洗滌細(xì)胞。對PI陽性和FITC陽性的細(xì)胞作流式細(xì)胞計數(shù)。
流式動細(xì)胞計數(shù)分析的結(jié)果列于圖2、3和4。這些結(jié)果顯示，粗制和純化形式的Mab H11與活的人腫瘤細(xì)胞系(包括成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、乳房腺癌和結(jié)腸腺癌)上表達(dá)的細(xì)胞表面相關(guān)抗原結(jié)合。
實施例3
Mab H11與人腫瘤細(xì)胞系的凍融提取物結(jié)合
的ELISA分析
為了測定H11特異性結(jié)合人腫瘤抗原的能力，ELISA測試板被用人腫瘤細(xì)胞提取物包被，提取物是通過反復(fù)凍融成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(SKMG-1)、乳房腺癌(BT-20，MB-468和MB-453)、結(jié)腸腺癌(SK-CO-1和HT-29)細(xì)胞制備的。
包被的ELISA測試板在2至8℃孵育16至18小時，室溫下用PBS-3％BSA封閉1小時。然后，測試板在室溫下用Mab H11的PBS溶液、或?qū)φ誌gM的PBS溶液、或培養(yǎng)液孵育2小時。洗滌測試板，用生物素化的抗人IgM孵育，接著用鏈霉親和素交聯(lián)的堿性磷酸酶孵育1小時。洗滌后，在各測試板上加入磷酸對硝基苯底物，孵育后，在ELISA測試板讀數(shù)儀中于405納米處讀數(shù)。
Mab H11與人腫瘤細(xì)胞提取物的結(jié)合顯示在圖5和6中。這些結(jié)果表明，Mab H11以劑量依賴性方式，與由成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳房腺癌和結(jié)腸腺癌細(xì)胞制備的腫瘤細(xì)胞提取物結(jié)合。
實施例4
用免疫過氧化物酶染色法測定
Mab H11與人腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合
為了測定H11的免疫反應(yīng)性，進(jìn)行了以下實驗。腫瘤細(xì)胞在24格測試板中在蓋玻片上培養(yǎng)48至96小時。用PBS洗滌細(xì)胞，用甲醛固定、用5％正常山羊血清的PBS溶液孵育30分鐘。洗滌后，細(xì)胞與雜交瘤NBGM1/H11培養(yǎng)上清液或純化的Mab H11(10微克/毫升)或加有對照的人骨髓瘤IgM培養(yǎng)液一起孵育2小時。然后，洗滌細(xì)胞，并與抗人IgM交聯(lián)HRP孵育。最后洗滌細(xì)胞，與DAB底物孵育以顯示Mab H11的結(jié)合，用蘇木精反染色，并在GVA中計數(shù)。
Mab H11免疫反應(yīng)性的結(jié)果顯示在表3中，其中反應(yīng)性以陰性(--)、弱陽性(+)、陽性(++)、強(qiáng)陽性(+++)表示。這些結(jié)果顯示，根據(jù)免疫過氧化物酶染色法測定，被Mab H11識別的表位可由多種不同類型的人腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞系表達(dá)。
表3細(xì)胞系/腫瘤種類 反應(yīng)性
對照IgM Mab H11人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤SKMG 1 -- +++U-118 MG -- ++U-87 MG -- ++人惡性黑色素瘤A-375-- +++SK-MEL-5 -- ++人結(jié)腸腺癌SK-CO-1 -- ++人乳房腺癌MG-468 -- ++MB-453 -- +BT-20-- ++BT-474 -- ++人腎腺癌SW-839 -- ++人成骨肉瘤SAOS-2 -- ++人卵巢腺癌SK-OV-3 -- ++
實施例5
用固定細(xì)胞ELISA測定的Mab H11與人腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合
也用固定細(xì)胞ELISA測定了H11與人腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞系的結(jié)合。通過與EDTA-PBS的孵育將生長中的腫瘤細(xì)胞從T形瓶上脫附。離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌，重懸在培養(yǎng)液中，計數(shù)，在96格ELISA測試板的每格中加入含5,000-10,000個細(xì)胞的50微升細(xì)胞懸液。在細(xì)胞附著測試板后，去除培養(yǎng)物上清液，測試板用PBS-BSA封閉。然后，細(xì)胞與不同濃度(1-20微克/毫升)的Mab H11或?qū)φ杖斯撬枇鯥gM孵育2小時。孵育后，洗滌測試板，與生物素交聯(lián)山羊抗人IgM孵育，再次洗滌，然后與鏈霉親和素交聯(lián)堿性磷酸酶孵育。最后，洗滌測試板，與磷酸對硝基苯底物一起孵育，在ELISA測試板讀數(shù)儀中于405納米處讀數(shù)。
用固定細(xì)胞ELISA測得的MabH11對人腫瘤細(xì)胞系的反應(yīng)性結(jié)果顯示在表4和圖7中。在表4中，用對照IgM 10微克/毫升和H11 10微克/毫升來檢測反應(yīng)性，所得值以405納米處的吸光度±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。這些結(jié)果顯示1)Mab H11即使在1微克/毫升低濃度仍與成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(SKMG-1)強(qiáng)烈反應(yīng)，而20微克/毫升的對照IgM不與SKMG-1細(xì)胞反應(yīng)；2)Mab H11識別多種腫瘤(乳腺癌、結(jié)腸腺癌、惡性黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌和前列腺腺癌)細(xì)胞系上的腫瘤抗原。Mab反應(yīng)性的程度隨腫瘤和腫瘤細(xì)胞系種類而不同。MabH11對癌和腫瘤細(xì)胞的的反應(yīng)性比對照IgM高3至10倍。
表4細(xì)胞系/腫瘤種類 反應(yīng)性(405納米處的O.D.)
對照IgM Mab H11人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤SKMG 1 0.21±0.01 0.95±0.06D-54-MG0.13±0.02 0.43±0.07U-87 MG0.13±0.02 0.60±0.01成神經(jīng)細(xì)胞瘤SK-N-SH0.14±0.02 0.96±0.06SK-N-MC0.17±0.03 1.00±0.05惡性黑色素瘤SK-MEL-5 0.18±0.03 1.42±0.04SK-MEL-28 0.19±0.03 1.79±0.05乳房腺癌MB-453 0.68±0.18 2.85±0.14MB-468 0.60±0.03 2.39±0.10SK-BR-30.60±0.03 2.14+0.13T47D 0.58±0.01 2.13±0.04BT-20 0.57±0.02 2.70±0.13BT-474 0.61±0.03 2.20±0.17肺腺癌SW-900 0.20±0.02 0.68±0.10SK-LU-1 0.19±0.02 0.57±0.07A-4270.22±0.01 0.88±0.07小細(xì)胞肺癌NCI-H69 0.25±0.04 1.42±0.20NCI-H82 0.20±0.09 1.16±0.13結(jié)腸腺癌SK-Co-1 0.27±0.03 0.98±0.11HT-290.37±0.02 1.78±0.20前列腺腺癌PC-3 0.17±0.01 0.60±0.01DU-145 0.15±0.01 0.52±0.01腎腺癌SW-839 0.2±0.01 1.43±0.01成骨肉瘤SAOS-2 0.24±0.02 1.22±0.07U-2OS0.13±0.0 1.93±0.05膀胱細(xì)胞癌T-24 0.13±0.01 1.25±0.03 卵巢腺癌SK0-OV-3 0.12±0.01 1.14±0.02喉癌HEP-20.25±0.01 1.25±0.01正常人成纖維細(xì)胞GM-8333 0.13±0.01 0.39±0.01
實施例6
H11的免疫解剖學(xué)分布和免疫病理學(xué)分析
免疫組織化學(xué)被用來確定H11對組織和腫瘤內(nèi)顯微解剖學(xué)細(xì)節(jié)和異質(zhì)性的特異性。該技術(shù)的局限性在于可能因被研究的分子表達(dá)水平低而造成假陰性結(jié)果，和由于抗體結(jié)合類似表位或其它抗原所共有的表位而造成假陽性結(jié)果(交叉反應(yīng)性)。為了克服此局限性，本研究以不含出現(xiàn)非特異性結(jié)合的高抗體濃度進(jìn)行。這可以測出不同組織中交叉反應(yīng)性。此外，固定分析確立了抗原染色強(qiáng)度和形態(tài)保存之間的最佳組合。本實施例提供了IMPATH公司，New York的結(jié)果，系在一組選定的正常和腫瘤組織冷凍切片上對H11的細(xì)胞特異性和抗原表達(dá)進(jìn)行的研究。該研究使用了直接免疫過氧化物酶技術(shù)。
從手術(shù)和解剖標(biāo)本獲取組織學(xué)正常的人組織。在低溫模具中將這些新鮮的組織包埋在OCT(Miles Laboratories，Inc.，Naperville，IL)中，在異戊烷中迅速冷凍，用液氮冷卻。將來自IMPATH冷凍組織庫的組織切成5微米，放在涂有聚-L-賴氨酸的載玻片上，自然風(fēng)干，-70℃保存。
非生物素化的H11在冰水中提供并于2至8℃保存的，濃度為200微克/毫升，總體積為3.0毫升。用Novopharm提供的人骨髓瘤IgM(Pierce目錄號#31146)作為陰性對照。兩種抗體都用磷酸鹽緩沖液稀釋至相同的工作濃度(抗體H11滴定實驗所指)。過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體是山羊抗人IgM(American Qualex，SanClemente，CA，批號#A112PN)，用PBS稀釋至1∶500。
免疫過氧化物酶技術(shù)用間接免疫過氧化物酶法進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。從-70℃的冰箱中取出冷凍切片，自然風(fēng)干，并按固定方案(固定化細(xì)節(jié)如下文所述)進(jìn)行固定。組織切片用5％正常山羊血清的PBS稀釋液封閉10分鐘，然后與第一抗體(primary antibody)4℃孵育過夜。載玻片用PBS洗滌，再用0.5％的吐溫PBS溶液洗滌，然后再用PBS洗滌。用3％過氧化氫/甲醇孵育30分鐘封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后用PBS洗滌3次。切片然后與山羊抗人IgM(以過氧化物酶標(biāo)記的)第二抗體室溫孵育15分鐘，并如前所述用PBS洗滌。
將組織切片與四氯3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)孵育2至5分鐘來顯示過氧化物酶反應(yīng)。徹底洗滌組織切片，用通過梯級醇脫水的改良Harris蘇木精反染色(Fisher Scientific.Fairlawn NJ)，在二甲苯中洗滌，加上蓋玻片。陰性對照抗體背景染色重的組織應(yīng)反復(fù)徹底洗滌。IMPATH提供的人乳房癌(F95-036)是H11的陽性對照。用純化的人骨髓瘤IgM替代第一測試抗體作為陰性對照。
固定分析的目的是確定具有抗原染色強(qiáng)度和形態(tài)保持之間最佳組合的條件。對陽性對照組織用了包括不固定在內(nèi)的5種固定方案進(jìn)行測試。測試的固定方案為10％中性緩沖福爾馬林(23-25℃)，丙醇(2-8℃)，甲基/丙酮(1∶1V/V，2-8℃)和95％乙醇(23-25℃)。就此研究而言，對H11來說，10％中性緩沖福爾馬林具有最佳效果。
使用10％NBF作為固定劑，在陽性對照、人乳房癌組織上測試了一系列抗體稀釋度(20.0微克/毫升至0.1微克/毫升)。10.0微克/毫升的抗體濃度具有最佳效果-染色強(qiáng)度最大，陰性對照背景染色不明顯。
所得的結(jié)果見表5和表6。表5說明H11在正常組織上的反應(yīng)性，表6說明H11在人腫瘤組織上的反應(yīng)性。
表5組織 測得的陽性/總數(shù) 反應(yīng)性范圍(0-3+)腎上腺 0/3 0膀胱 0/3 0骨髓 1/3 1+腦 0/3 0乳房 0/3 0子宮頸 0/3 0食道 0/3 0眼睛 0/3 0心臟 0/3 0腎 0/3 0大腸 0/3 0肝 0/3 0肺 0/3 0淋巴結(jié) 0/3 0肌肉 0/3 0卵巢 0/2 0胰腺 0/3 0腮腺 0/3 0垂體 0/1 0前列腺 0/3 0皮膚 0/3 0小腸 0/3 0脊索 0/3 0脾 0/3 0胃 0/3 0睪丸 0/3 0胸腺 0/3 0甲狀腺 0/30扁桃腺 1/31+子宮 0/30WBC 0/30
表6腫瘤 測得的陽性/總數(shù) 腫瘤細(xì)胞染色％ 反應(yīng)性范圍(0-3+)乳房癌 2/3 30-901-3+結(jié)腸癌 3/3 40-701-2+神經(jīng)膠質(zhì)瘤 4/6 30-901-2+胃癌 3/3 30-501-2+肺腺癌 3/4 10-701-2+肺鱗癌 3/3 10-951-3+小細(xì)胞肺癌 1/2 30 1+淋巴瘤 8/8 10-951-3+黑色素瘤 3/3 20-951-2+卵巢癌 3/3 20-301-3+前列腺癌 3/3 20-951-2+肉瘤 0/3 00
所得的結(jié)果表明，在70％以上的陽性對照樣品中觀察到了弱(1+)至強(qiáng)(3+)的反應(yīng)性。被H11識別的抗原具有限制性分布方式。在IMPATH系統(tǒng)中，H11-般不與被測正常人組織反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)不同器官的所有簡單上皮細(xì)胞，以及分層的上皮細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞無反應(yīng)性。在神經(jīng)外胚層細(xì)胞(包括腦、脊索和外周神經(jīng)中的那些)也沒有發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性。中胚層成分例如骨骼、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞陰性。淋巴起源的組織(包括骨髓、淋巴結(jié)、脾臟和胸腺)一般不與抗體H11反應(yīng)。在被測的一份骨髓樣品中的少數(shù)細(xì)胞和三份扁桃腺樣品中一份的生發(fā)中心觀察到弱(1+)的反應(yīng)性。
在幾乎所有被測的腫瘤(包括乳房、結(jié)腸、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃、肺(腺性、鱗性和小細(xì)胞性))樣品中都觀察到了陽性免疫反應(yīng)性。在這些樣品中10％至95％以上的腫瘤細(xì)胞中觀察到了反應(yīng)性；染色強(qiáng)度從弱(1+)到強(qiáng)(3+)。但是，抗體H11與被測的三份肉瘤樣品都不反應(yīng)。當(dāng)樣品中存在腫瘤細(xì)胞的對應(yīng)正常細(xì)胞時，其中有些但非全部與H11反應(yīng)。乳房癌、胃癌和前列腺癌中的少數(shù)正常細(xì)胞與抗體H11反應(yīng)。具有與抗體H11反應(yīng)性的大顆粒細(xì)胞被認(rèn)為是嗜伊紅性肥大細(xì)胞譜系的炎性細(xì)胞。
總之，H11一般不與正常人組織反應(yīng)，但是腫瘤中的某些正常組織除外。H11抗體檢測的抗原在幾乎所有腫瘤內(nèi)表達(dá)。實施例7H11的克隆、表達(dá)和免疫反應(yīng)性
為了確定H11-scFv抗體片段特異性結(jié)合癌細(xì)胞的能力進(jìn)行了以下實驗。
按下法制備單鏈抗體結(jié)構(gòu)。在Applied Biosystems DNA合成儀上合成H11κ和muV區(qū)5’和3’端的特異性引物。所有引物均含有一個用于克隆的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。引物5和6還另含有編碼(SGGGG)3接頭的核苷酸。表7列出了所用的引物，限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)加以下劃線。
表7引物 序列(5’-3’) 引入的位置1 TATGAAGACACCAGGCCGATATTGTGTTGACGCAG Bbs1 (SEQ ID NO7)2 TATCCGGATGCAGCCACAGTTCGTTT BspE1 SEQ ID NO8)3 TATTCGGACA GGTGCAGCTG GTGGAG BspE1 (SEQ ID NO9)4 TATGGATCCT GAGGAGACGG TGACCGT BamH1 (SEQ ID NO10)5 TATATATCCGGAGGTGGTGGATCAGGTGGAGGTGGCTCCBspE1 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT (SEQ ID NO11)6 ACCTCCGGAACCGCCACCGCCAGAGACAGATGGTGCAGCBspE1
CACATTC(SEQ ID NO12)
用引物1和2進(jìn)行PCR反應(yīng)合成κ二聚體，用引物3和4合成mu二聚體，用引物1和6合成κ單體，用引物4和5合成mu單體。然后純化PCR片段，并用它們相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶消化。SEQ ID NO13和16描繪了編碼核苷酸，SEQ ID NO15和18則分別描述了互補(bǔ)核苷酸。
用Bbs1和BamH1切割制備含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)、OmpA信號肽序列、c-myc(9E10)檢測標(biāo)記和組氨酸尾的表達(dá)載體pSJF1(參見圖8)。通過將相應(yīng)的κ和mu片段連接到pSJF1中并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的TG1大腸桿菌中來組裝單體和二聚體結(jié)構(gòu)。利用菌落PCR和限制性核酸內(nèi)切酶消化篩選所得的菌落以確認(rèn)大小準(zhǔn)確的插入片段，并利用雙脫氧熒光測序來驗證序列。
含有H11單體或二聚體表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化TG1在26℃振蕩培養(yǎng)24小時，然后加入IPTG至最終濃度0.1微摩爾。細(xì)胞再培養(yǎng)16小時，然后離心收獲。通過先用蔗糖緩沖液(25％蔗糖，1毫摩爾濃度EDTA，10毫摩爾濃度pH8.0的Tris)處理再用冰冷的休克緩沖液(10毫摩爾濃度pH8.0的Tris，0.5毫摩爾濃度MgCl2)處理來釋放含有H11抗體的周質(zhì)蛋白。用聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡法來驗證表達(dá)。用載鎳色譜柱(Pharmacia HiTrap螯合柱)純化抗體，用漸進(jìn)梯度的咪唑洗脫被結(jié)合的抗體。純化后的抗體以PBS/0.02％疊氮化鈉進(jìn)行透析，濃縮至0.5毫克/毫升。
還用固定細(xì)胞ELISA測定了Mab H11和H11-scFv片段間的抗原相似性。ELISA板以A375細(xì)胞包被，與Mab H11、對照IgM、H11-scFv或?qū)φ誃GA-scFv孵育，然后根據(jù)需要與兔抗人IgM抗體或兔抗-scFv抗體孵育。先加入山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶然后加入底物來進(jìn)行檢測。結(jié)果(如圖9所示)證明H11 IgM和H11-scFv都具有高親和性，而對照IgM和BGA-scFv具有低親和性。
為了確定生物素化的H11-scFv對生物素化的對照scFv的相對特異性，進(jìn)行以下實驗。將人腫瘤細(xì)胞固定到ELISA測試板上，如前所述地與生物素化的H11-scFv或生物素化的對照scFv孵育。
在固定細(xì)胞ELISA中，生物素化的H11-scFv表現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞系的親和力大大高于對照(8至50倍)。表8和圖10顯示了濃度為2.5微克/毫升的H11-scFv或BGA-scFv的相應(yīng)數(shù)據(jù)。
圖11說明的是表8中與滴定生物素化的H11-scFv結(jié)合以下細(xì)胞的反應(yīng)性有關(guān)的部分淋巴瘤細(xì)胞Daudi、Ramos、CA-46和CCRF-CEM細(xì)胞。H11-scFv在每一被測濃度(1.25至10微克/毫升)均表現(xiàn)出與淋巴瘤細(xì)胞的高親和性，但BGAscFv不這樣。
表8腫瘤細(xì)胞系 反應(yīng)性(450納米處的O.D.±標(biāo)準(zhǔn)偏差)
生物素化BGAscFv 生物素-H11-scFv人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤SKMG 1 0.01±0.01 0.56±0.04U-118 MG 0.01±0.02 0.47±0.03D-54 MG0.01±0.00 0.50±0.02成神經(jīng)細(xì)胞瘤SK-N-MC0.01±0.00 0.50±0.02惡性黑色素瘤SK-MEL-5 0.02±0.01 0.61±0.04A-375 0.12±0.03 0.97±0.03SK-MEL-28 0.02±0.00 0.71±0.04乳房腺癌T47D 0.02±0.00 0.64±0.03MB-468 0.01±0.00 0.65±0.01SK-BR-30.01±0.00 0.58±0.02BT-20 0.01±0.00 0.54±0.06BT-474 0.01±0.00 0.60±0.01肺腺癌SW-900 0.01±0.00 0.41±0.02SK-LU-10.01±0.00 0.45±0.03A-427 0.01±0.00 0.40±0.05結(jié)腸腺癌SK-Co-10.01±0.00 0.56±0.01HT-29 0.01±0.00 0.53±0.06LS17T 0.01±0.00 0.57±0.02成骨肉瘤SAOS-2 0.02±0.00 0.88±0.06U-2OS 0.02±0.00 0.93±0.01膀胱細(xì)胞癌T-24 0.02±0.01 0.97±0.05卵巢腺癌SK-V-3 0.01±0.00 0.77±0.02喉癌HEP-2 0.02±0.00 0.08±0.04前列腺癌DU-145 0.01±0.00 0.42±0.02PC-3 0.01±0.00 0.36±0.01小細(xì)胞肺癌NCI-H820.01±0.00 0.44±0.02NCI-69 0.01±0.00 0.44±0.01淋巴瘤細(xì)胞系慢性骨髓性白血病K-562 0.02±0.00 0.65±0.00急性成淋巴細(xì)胞性白血病CEM0.04±0.00 1.4±0.03Burkitt淋巴瘤CA-46 0.02±0.00 1.2±0.02RAMOS 0.04±0.00 1.3±0.02DAUDI 0.02±0.00 1.38±0.01
為了驗證生物素化的H11-scFv對癌細(xì)胞的特異性，進(jìn)行以下實驗。如前所述，制備惡性腫瘤和正常組織的樣本，并與生物素化H11-scFv孵育。
用H11-scFv來染色腫瘤和正常組織的切片。表8顯示正常組織的結(jié)果，表9顯示腫瘤組織的結(jié)果。
圖12描述的是H11-scFv和對照scFv結(jié)合腫瘤細(xì)胞系的相對熒光強(qiáng)度。
表9中的數(shù)據(jù)證明，生物素化的H11-scFv一般不與正常組織反應(yīng)。幾乎所有被測正常組織都顯示無可測反應(yīng)性，只有正常的胰腺和外周神經(jīng)組織產(chǎn)生一個弱陽性信號。在表9中，-ve表示沒有可測反應(yīng)性，+/-表示弱陽性活性。
表9正常組織 生物素化的H11-scFv的反應(yīng)性
(50微克/毫升)外皮層 -ve乳房 -ve結(jié)腸 -ve心臟 -ve肝 -ve淋巴結(jié) -ve前列腺 -ve甲狀腺 -ve腎上腺 -ve小腦 -ve肺 -ve胰腺 +/-外周神經(jīng) +/-皮膚 -ve脾 -ve平滑肌 -ve胃 -ve胸腺 -ve
表10組織類型陽性數(shù)量/ 腫瘤細(xì)胞染色 反應(yīng)性范圍
被測樣品總數(shù) 百分比(0-+3)乳房癌27/31 40/60 1-3+結(jié)腸癌23/26 80/100 1-3+黑色素瘤 13/14 50/70 1-3+前列腺癌 17/20 20/70 1-2+子宮頸鱗狀細(xì)胞癌 22/24 nd1-2+子宮頸腺癌 9/9nd1-2+Kaposi肉瘤 7/8nd1-2+良性結(jié)腸 0/20 0
nd沒有測定
表10中的結(jié)果表明，在大多數(shù)被測的乳房癌(27/31)和結(jié)腸癌(23/26)和前列腺癌(17/20)樣品中發(fā)現(xiàn)了陽性染色。陽性染色被發(fā)現(xiàn)于用25微克/毫升濃度的H11-scFv時。雖然發(fā)現(xiàn)染色主要存在于腫瘤細(xì)胞中，但是在健康和鄰近組織上也發(fā)現(xiàn)了不同程度的反應(yīng)性。還測試了H11-scFv對正常組織的特異性。所得的結(jié)果列于表11，其中概括了H11-scFv與正常人組織切片的免疫組織化學(xué)染色情況。
表11組織 H11-scFv(25微克/毫升) 3B1 scFv(25微克/毫升)腎上腺±-～±小腦 - -外皮層- -結(jié)腸 ±-乳房 -～± -腎±-～±大動脈-～± -心臟 ±-～±肝±～+ ±肺- -淋巴結(jié)- -胰腺 -～± -垂體 ±～+ -前列腺-(病灶±) -(病灶±)外周神經(jīng) -～± -皮膚 -(汗腺±) -(汗腺±)脾臟 -～± -小腸 -～± -胃-～± -St.肌(骨骼肌) -～± -～±胸腺 -～± -甲狀腺-～± -S94-7474-2(結(jié)腸Car.對照)++-
實施例8
用流式細(xì)胞計數(shù)測定H11-scFv與活的腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性
為了測試H11-scFv與活的腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性，如實施例2所述制備用于流式細(xì)胞計數(shù)的各腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞。如前所述，腫瘤細(xì)胞與生物素酰化的H11-scFv或生物素?；膶φ誷cFv孵育，其蛋白質(zhì)濃度為100微克/毫升或200微克毫升。測定平均熒光強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比作為反應(yīng)性。如前所述，制備蛋白質(zhì)濃度為100微克/毫升或200微克/毫升的生物素?；腍11-scFv。平均熒光強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比列于表12，#是作為對照scFv的生物素?；?B1；*是作為對照scFv的生物素?；腂GA SL-6；**是作為對照的PBS5％FCS；***是作為對照scFv的生物素-5B1。
表12
125I標(biāo)記的H11-scFv顯示與LS174T細(xì)胞的結(jié)合親和力為3×108升/摩爾(Ka)(如圖13所示的特異性結(jié)合)。111In-H11-scFv顯示與A-375細(xì)胞結(jié)合親和力為3.6×108升/摩爾(Ka)，與SKMG1細(xì)胞結(jié)合親和力為1.4×109升/摩爾(Ka)。結(jié)果列于圖14。A-375細(xì)胞約有24,000結(jié)合位點(diǎn)/細(xì)胞，SKMG1約有5000結(jié)合位點(diǎn)/細(xì)胞。
以上結(jié)果表明，純化形式的Mab H11結(jié)合于乳房腺癌(SK-BR-3)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(SKMG-1)和黑色素瘤(A-275)淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞系上表達(dá)的細(xì)胞表面相關(guān)抗原。
為了進(jìn)一步測試生物素?；腍11-scFv與活的淋巴瘤細(xì)胞的反應(yīng)性，如實施例2所述制備來自腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞，并與蛋白質(zhì)濃度為100微克/毫升或200微克/毫升生物素?；腍11-scFv孵育，并用流式細(xì)胞計數(shù)分析。用流式細(xì)胞計數(shù)測定平均熒光強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比。scFv結(jié)合的對照是生物素?；腂GAscFv。結(jié)果列于表13。
表13
實施例9
用免疫過氧化物酶染色法測定
生物素酰化的H11-scFv與人腫瘤細(xì)胞的結(jié)合
為了測定H11-scFv的免疫反應(yīng)性，進(jìn)行以下實驗。將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)在T形瓶中，制備cytospins，并與生物素?；腍11-scFv或PBS孵育，由此確定結(jié)合情況。
H11-scFv的免疫反應(yīng)性結(jié)果列于表14，反應(yīng)性以陰性(-)，弱陽性(±)，陽性(+或++)表示。以上結(jié)果說明，根據(jù)免疫過氧化物酶染色測定，有多種不同類型的人腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞系表達(dá)了Mab H11識別的表位。
表14細(xì)胞系/腫瘤種類 反應(yīng)性
PBSH11-scFv(50微克/毫升)人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤SKMG1 -- +U-87 MG -- +人惡性黑色素瘤A-375 -- +SK-MEL-5 -- ++人結(jié)腸腺癌SK-CO-1 -- +HT-29 -- +174T +人乳房腺癌SK-BR-3 -- +BT-20 -- +人淋巴瘤細(xì)胞系U-937組織細(xì)胞性淋巴瘤 -- ±H9 T細(xì)胞性淋巴瘤 -- +CEM急性成淋巴細(xì)胞樣白血病 -- -MOLT-3急性成淋巴細(xì)胞樣白血病 -- ±HL-60前髓細(xì)胞性白血病 -- +KG-1急性髓性白血病-- +K-562慢性骨髓性白血病 -- +胃癌KATO III-- ++人成骨肉瘤SAOS-2 -- ±人卵巢腺癌SK-OV-3 -- ±膀胱細(xì)胞癌T-24-- +喉癌Hep-2 -- +
實施例10
重組法產(chǎn)生的H11 gG1的反應(yīng)性
按下法在中國倉鼠卵細(xì)胞(CHO)中產(chǎn)生H11 IgG1。制備幾種含有編碼H11輕鏈和重鏈序列的cDNA的載體。表15顯示了這些結(jié)構(gòu)的取向、DNA插入片段和抗生素選擇標(biāo)志，其中，CMV是巨細(xì)胞病毒；DHFR是二氫葉酸還原酶；HC是重鏈；LC是輕鏈。
表15
這些表達(dá)載體對抗體輕鏈和重鏈的編碼序列具有相互隔開的插入位點(diǎn)。重鏈和輕鏈的高水平組成型表達(dá)都是由巨細(xì)胞病毒介導(dǎo)的早期(CMV)加強(qiáng)子/啟動子指導(dǎo)的。在這個已被證明常能加強(qiáng)基因表達(dá)水平的啟動子的下游有一嵌合內(nèi)含子，該內(nèi)含子含有人β球蛋白第一內(nèi)含子的5’供體位置和免疫球蛋白基因內(nèi)含子3’受體位置(重鏈可變區(qū))。由來自猿病毒40(SV40)的聚腺苷酸化信號提供mRNA的聚腺苷酸化作用。
質(zhì)粒中還含有編碼二氫葉酸還原酶的基因，因而能夠培養(yǎng)在中國倉鼠卵巢(CHO)DHFR缺陷型細(xì)胞中生長。用氨甲蝶呤、葉酸類似物和強(qiáng)DHFR抑制劑進(jìn)行的擴(kuò)增導(dǎo)致DHFR基因及其側(cè)翼序列(即，結(jié)構(gòu)中抗體的輕鏈和重鏈)擴(kuò)增。逐步增加氨甲蝶呤的濃度(從0.01納摩爾濃度至約800納摩爾濃度)可以從目標(biāo)基因產(chǎn)生高水平的蛋白質(zhì)。該結(jié)構(gòu)中還含有作為選擇標(biāo)記的提供抗生素抗性的基因，所述抗生素或者使用新霉素或者使用zeomycin。載體參見圖15和16。
表16顯示了重組法產(chǎn)生的H11 IgG1的流式細(xì)胞計數(shù)分析結(jié)果，表明，可以在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)與乳房癌細(xì)胞SK-BR-3上的抗原結(jié)合的H11 IgG1。
實施例11
H11與癌細(xì)胞系的結(jié)合
用放射性碘或放射性銦標(biāo)記H11，測定H11 IgM和H11-scFv與各種人腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合親和力。125I-H11-scFv制備成比放射性為7、20或150微居里/微克，125I-H11 IgM的比放射性為0.6微居里/微克。此外，如實施例12所述制備比放射性為13和38微居里/微克的111In-H11-scFv。不識別C抗原的scFv 3B1被用作對照來指示非特異性結(jié)合，它以150微居里/微克進(jìn)行標(biāo)記。
如圖17所示，用P-2微柱純化125I-H11-scFv，并在85％甲醇中進(jìn)行紙上色譜分析。如圖18所示，用Sephadex G-50微色譜柱(Pharmacia)純化125I-H11 IgM，并在85％甲醇中進(jìn)行紙上色譜分析。如圖19所示，111In-H11-scFv用SephadexG-50色譜柱純化，然后在0.1摩爾濃度的檸檬酸中進(jìn)行ITLC-SG分析。
圖13和14顯示了H11結(jié)合的結(jié)果。圖13顯示125I-H11-scFv與LS174T人結(jié)腸癌細(xì)胞的特異性結(jié)合。圖14顯示111In-H11-scFv與A375細(xì)胞的總結(jié)合。
所獲結(jié)果表明H11特異性結(jié)合LT174和人黑色素瘤細(xì)胞，但以較低親和力與乳房癌細(xì)胞系結(jié)合。
表12
用111In-DPTA-H11-scFv的腫瘤造影
以10∶1(DTPA∶H11-scFv)摩爾比將H11-scFv與二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)的二環(huán)酸酐交聯(lián)，形成每摩爾H11-scFv 2摩爾DTPA的取代水平。在SephadexG-25(Pharmacia)微色譜柱上從過量的DTPA中純化DTPA-H11-scFv并用Centricon-30微型濃縮儀(Amicon)再濃縮至10毫克/毫升。用乙酸111In放射性標(biāo)記DTPA-H11-scFv，至25毫居里/毫克比放射性。用Sephadex G-25微色譜柱去除沒有被結(jié)合的111In。乙酸111In是由氯化111In(Nordion)和1摩爾濃度pH6.0的乙酸緩沖液制備的。根據(jù)100毫摩爾濃度pH5.0的檸檬酸鈉中的薄層硅膠柱色譜測定，最終111In-DTPA-H11-scFv的放射化學(xué)純度為99％以上。圖19描述了純化過程和TLC。
給一雌性裸鼠尾靜脈注射100微居里的111In-DTPA-H11-scFv，該鼠右側(cè)有皮下有A375黑色素瘤異種移植物，中腹部區(qū)皮下有HT-29人結(jié)腸癌異種移植物。馬上將該鼠置于以一臺GE Star 4000i計算機(jī)為界面的γ攝影儀之下(SeimansZL3700)，進(jìn)行120分鐘的動態(tài)攝影，總共480幅，每幅15秒。然后將所有照片并成12×10分鐘圖象。早至注射后30分鐘就可以在鼠的右側(cè)看見A375腫瘤。
對兩種腫瘤的目標(biāo)區(qū)分析顯示，A375腫瘤在120分鐘的研究全程中累積放射性，而HT-29腫瘤在第一個小時內(nèi)累積放射性，然后放射性強(qiáng)度則保持相對恒定。圖20顯示了12幅照片，右下方照片(攝于第120分鐘)中的兩個箭頭指示的是兩種腫瘤中的放射性累積。細(xì)箭頭指示的是A375，粗箭頭指示的是HT-29腫瘤?？梢栽趫D象上看到的正常組織包括心臟、肝、腎和膀胱。心臟可以看到是因為血循環(huán)中的放射性量，腎和膀胱可以看到是因為111In-DTPA-H11-scFv的腎排除。肝的少量吸收可能是因為流向肝臟的血液或111In-DTPA-H11-scFv與肝臟的部分結(jié)合。
雖然以上通過說明和實施例對本發(fā)明進(jìn)行了較為詳細(xì)的描述，目的是清楚說明和使人理解，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，可以進(jìn)行某些改變和修飾。因此，說明和實施例不能理解成是對本發(fā)明范圍的限定，本發(fā)明范圍僅由所附的權(quán)利要求限定。
序列表(1)一般信息
(i)申請人Dan，Michael D.
Maiti，Pradip K.
Kaplan，Howard A.
(ii)發(fā)明名稱特異性檢測癌細(xì)胞的抗原結(jié)合片段H11、編碼所述片段
的DNA、以及它們在預(yù)防和檢測癌癥上的用途 (iii)序列數(shù)量18
(iv)聯(lián)系地址
(A)地址Morrison & Foerster
(B)街道755 Page Mill Road
(C)城市Palo Alto
(D)州CA
(E)國家USA
(F)郵政編碼94304-1018
(v)計算機(jī)可讀形式
(A)媒質(zhì)類型軟盤
(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)
(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS
(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30 (vi)本申請信息
(A)申請?zhí)朥S
(B)申請日
(C)分類
(viii)律師/代理人信息
(A)姓名Lehnhardt，Susan K.
(B)登記號33,943
(C)參考文獻(xiàn)/檔案號31608-20001.20
(ix)通訊信息
(A)電話(415)813-5600
(B)傳真(415)494-0792
(C)電傳706141
(2)SEQ ID NO1的信息
(i)序列特征
(A)長度543堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ix)特征
(A)名稱/代碼CDS
(B)位置1..543
(xi)序列描述SEQ ID NO1CAAGCTATTT AGGTGACACT ATAGAATACT CAAGCTATGC ATCCAACGCG TTGGGAGCTC 60TCCCATATGG TCGACCTGCA GGCGGCCGCA CTAGTGATTT CAAGCTTCAT CACTGAACAC120AGAGGACTCA CCATGGAGTT TGGGCTGAGC TGGGTTTTCC TCGTTGCTCT TTTAAGAGGT180ATCCAGTGTC AGGTGCAGCT GGTGGAGTCT GGGGGAGGCG TGGTCCAGCC TGGGAGGTCC240CTGAGACTCT CCTGTGCAGC CTCTGGATTC CCCTTCAGAA GCTTTGCTAT GCACTGGGTC300CGCCAGGCTC TAGGCAAGGG GCTGGAGTGG GTGGCAGTTA TATCATATGA TGGAAGCACT360AAATACTACG CAGACTCCGT GAAGGGGCGA TTCACCATCT CCAGAGACAC TTCCAAGAAC420ACGGTGTATC TAAAAATGAA CAGGCTGAGA ACTGAGGACA CGGCTGTCTT TTACTTGTGC480GAAAGACAGA GCCTGCTGGG TGACTATGAC CACTACTACG GNTTGGACGC TTGGGGAAAG540GGA 543
(2)SEQ ID NO2的信息
(i)序列特征
(A)長度179氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO2
Gln Ala Ile Val Thr Leu Asn Thr Gln Ala Met His Pro Thr Arg Trp
15 10 15
Glu Leu Ser His Met Val Asp Leu Gln Ala Ala Ala Leu Val Ile Ser
20 25 30
Ser Phe Ile Thr Glu His Arg Gly Leu Thr Met Glu Phe Gly Leu Ser
35 40 45
Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly Ile Gln Cys Gln Val Gln
50 55 60
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
65 70 75 80
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Ser Phe Ala Met His
85 90 95
Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile
100 105 110
Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
115 120 125
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Lys Met
130 135 140
Asn Arg Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Leu Cys Glu Arg
145 150 155 160
Gln Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Asp His Tyr Tyr Gly Leu Asp Ala Trp
165 170 175
Gly Lys Gly(2)SEQ ID NO3的信息
(i)序列特征
(A)長度543堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO3TCCCTTTCCC CAAGCGTCCA ANCCGTAGTA GTGGTCATAG TCACCCAGCA GGCTCTGTCT 60TTCGCACAAG TAAAAGACAG CCGTGTCCTC AGTTCTCAGC CTGTTCATTT TTAGATACAC120CGTGTTCTTG GAAGTGTCTC TGGAGATGGT GAATCGCCCC TTCACGGAGT CTGCGTAGTA180TTTAGTGCTT CCATCATATG ATATAACTGC CACCCACTCC AGCCCCTTGC CTAGAGCCTG240GCGGACCCAG TGCATAGCAA AGCTTCTGAA GGGGAATCCA GAGGCTGCAC AGGAGAGTCT300CAGGGACCTC CCAGGCTGGA CCACGCCTCC CCCAGACTCC ACCAGCTGCA CCTGACACTG360GATACCTCTT AAAAGAGCAA CGAGGAAAAC CCAGCTCAGC CCAAACTCCA TGGTGAGTCC420TCTGTGTTCA GTGATGAAGC TTGAAATCAC TAGTGCGGCC GCCTGCAGGT CGACCATATG480GGAGAGCTCC CAACGCGTTG GATGCATAGC TTGAGTATTC TATAGTGTCA CCTAAATAGC540TTG 543
(2)SEQ ID NO4的信息
(i)序列特征
(A)長度450堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ix)特征
(A)名稱/代碼CDS
(B)位置1..450
(xi)序列描述SEQ ID NO4CTCGAGATGG ACATGGAGTT CCAGGCGCAG CTTCTCTTCC TCCTGCTACT CTGGCTCCCA 60GATATCACCG GAGATATTGT GTTGACGCAG TCTCCAGGCA CCCTGTCTTT GTCTCCAGGG120GAAAGAGCCA CCCTCTCCTG CAGGGCCAGT CAGAGTGTTA GTAGCAGCTA CTTAGCCTGG180TACCAGCAGA AACCTGGCCA GGCTCCCAGG CTCCTCATCT ATGGTGCATC CACCAGGGCC240ACTGGCATGC CAGACAGGTC CAGTGGCAGT GGGTCCGGGA CAGACTTCAC TCTCACCATC300AGTAGACTGG AGCCTGAAGA TTTTGCAGTG TATTACTGTC AGCAGTATGG TAGCTCACCT360CAGACACCTC AGATCACTTT CGGCGGAGGG ACCAAGGTGG AGATCAAACG AACTGTGGCT420GCACCATCTG TCTTCATCTT CCCGCCATCT 450
(2)SEQ ID NO5的信息
(i)序列特征
(A)長度150氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO5
Leu Glu Met Asp Met Glu Phe Gln Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu
1 510 15
Leu Trp Leu Pro Asp Ile Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
20 25 30
Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
35 40 45
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala
65 70 75 80
Thr Gly Met Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Thr Pro Gln Ile Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
130 135 140
Phe Ile Phe Pro Pro Ser
145 150(2)SEQ ID NO6的信息
(i)序列特征
(A)長度450堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO6AGATGGCGGG AAGATGAAGA CAGATGGTGC AGCCACAGTT CGTTTGATCT CCACCTTGGT 60CCCTCCGCCG AAAGTGATCT GAGGTGTCTG AGGTGAGCTA CCATACTGCT GACAGTAATA120CACTGCAAAA TCTTCAGGCT CCAGTCTACT GATGGTGAGA GTGAAGTCTG TCCCGGACCC180ACTGCCACTG AACCTGTCTG GCATGCCAGT GGCCCTGGTG GATGCACCAT AGATGAGGAG240CCTGGGAGCC TGGCCAGGTT TCTGCTGGTA CCAGGCTAAG TAGCTGCTAC TAACACTCTG300ACTGGCCCTG CAGGAGAGGG TGGCTCTTTC CCCTGGAGAC AAAGACAGGG TGCCTGGAGA360CTGCGTCAAC ACAATATCTC CGGTGATATC TGGGAGCCAG AGTAGCAGGA GGAAGAGAAG 420CTGCGCCTGG AACTCCATGT CCATCTCGAG 450 (2)SEQ ID NO7的信息
(i)序列特征
(A)長度34堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO7TATGAAGACA CCAGGCCGAT ATTGTGTTGA CGCA 34 (2)SEQ ID NO8的信息
(i)序列特征
(A)長度26堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO8TATCCGGATG CAGCCACAGT TCGTTT 26 (2)SEQ ID NO9的信息
(i)序列特征
(A)長度26堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO9TATTCGGACA GGTGCAGCTG GTGGAG26
(2)SEQ ID NO10的信息
(i)序列特征
(A)長度27堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO10TATGGATCCT GAGGAGACGG TGACCGT 27
(2)SEQ ID NO11的信息
(i)序列特征
(A)長度60堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO11TATATATCCG GAGGTGGTGG ATCAGGTGGA GGTGGCTCCC AGGTGCAGCT GGTGGAGTCT 60
(2)SEQ ID NO12的信息
(i)序列特征
(A)長度46堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO12ACCTCCGGAA CCGCCACCGC CAGAGACAGA TGGTGCAGCC ACATTC 46
(2)SEQ ID NO13的信息
(i)序列特征
(A)長度918堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ix)特征
(A)名稱/代碼CDS
(B)位置連接(1..906，913..918)
(xi)序列描述SEQ ID NO13GAA TTC ATG AAA AAA ACC GCT ATC GCG ATC GCA GTT GCA CTG GCT GGT48Glu Phe Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly 1 5 10 15TTC GCT ACC GTT GCG CAG GCC GAT ATT GTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC96Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
20 25 30ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC144Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
35 40 45AGT CAG AGT GTT AGT AGC AGC TAC TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CCT192Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC ACC AGG GCC ACT240Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 65 70 75 80GGC ATG CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCC GGG ACA GAC TTC ACT288Gly Met Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95CTC ACC ATC AGT AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT336Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110CAG CAG TAT GGT AGC TCA CCT CAG ACA CCT CAG ATC ACT TTC GGC GGA384Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Thr Pro Gln Ile Thr Phe Gly Gly
115 120 125GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TCT432Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Ser
130 135 140GGC GGT GGC GGT TCC GGA GGT GGT GGA TCA GGT GGA GGT GGC TCC CAG480Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln145 150 155 160GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG TCC528Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
165 170 175CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC CCC TTC AGA AGC TTT GCT576Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Ser Phe Ala
180 185 190ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CTA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA624Met His Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
195 200 205GTT ATA TCA TAT GAT GGA AGC ACT AAA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG672Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
210 215 220GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC ACT TCC AAG AAC ACG GTG TAT CTA720Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu225 230 235 240AAA ATG AAC AGC CTG AGA ACT GAG GAC ACG GCT GTC TAT TAC TGT GCG768Lys Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
245 250 255AGA GAT CAG AGC CTG TTG GGT GAC TAT GAC CAC TAC TAC GGT TTG GAC816Arg Asp Gln Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Asp His Tyr Tyr Gly Leu Asp
260 265 270GTC TGG GGC AAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGA TCC GAA CAA864Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Gln
275 280 285AAA CTG ATC AGC GAA GAA GAT CTG AAC CAT CAC CAT CAC CAT906Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn His His His His His
290 295 300TAGTGA AAG CTT 918
Lys Leu (2)SEQ ID NO14的信息
(i)序列特征
(A)長度304氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型蛋白質(zhì)
(xi)序列描述SEQ ID NO14Glu Phe Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly 1 5 10 15Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
20 25 30Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
35 40 45Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 65 70 75 80Gly Met Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Thr Pro Gln Ile Thr Phe Gly Gly
115 120 125Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Ser
130 135 140Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln145 150 155 160Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
165 170 175Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Ser Phe Ala
180 185 190Met His Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
195 200 205Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
210 215 220Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu225 230 235 240Lys Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
245 250 255
Arg Asp Gln Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Asp His Tyr Tyr Gly Leu Asp
260 265 270
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Gln
275 280 285
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn His His His His His Lys Leu
290 295 300
(2)SEQ ID NO15的信息
(i)序列特征
(A)長度918堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO15AAGCTTTCAC TAATGGTGAT GGTGATGGTT CAGATCTTCT TCGCTGATCA GTTTTTGTTC 60GGATCCTGAG GAGACGGTGA CCGTGGTCCC TTTGCCCCAG ACGTCCAAAC CGTAGTAGTG120GTCATAGTCA CCCAACAGGC TCTGATCTCT CGCACAGTAA TAGACAGCCG TGTCCTCAGT180TCTCAGGCTG TTCATTTTTA GATACACCGT GTTCTTGGAA GTGTCTCTGG AGATGGTGAA240TCGGCCCTTC ACGGAGTCTG CGTAGTATTT AGTGCTTCCA TCATATGATA TAACTGCCAC300CCACTCCAGC CCCTTGCCTA GAGCCTGGCG GACCCAGTGC ATAGCAAAGC TTCTGAAGGG360GAATCCAGAG GCTGCACAGG AGAGTCTCAG GGACCTCCCA GGCTGGACCA CGCCTCCCCC420AGACTCCACC AGCTGCACCT GGGAGCCACC TCCACCTGAT CCACCACCTC CGGAACCGCC480ACCGCCAGAG ACAGATGGTG CAGCCACAGT TCGTTTGATC TCCACCTTGG TCCCTCCGCC540GAAAGTGATC TGAGGTGTCT GAGGTGAGCT ACCATACTGC TGACAGTAAT ACACTGCAAA600ATCTTCAGGC TCCAGTCTAC TGATGGTGAG AGTGAAGTCT GTCCCGGACC CACTGCCACT660GAACCTGTCT GGCATGCCAG TGGCCCTGGT GGATGCACCA TAGATGAGGA GCCTGGGAGC720CTGGCCAGGT TTCTGCTGGT ACCAGGCTAA GTAGCTGCTA CTAACACTCT GACTGGCCCT780GCAGGAGAGG GTGCCTCTTT CCCCTGGAGA CAAAGACAGG GTGCCTGGAG ACTGCGTCAA840CACAATATCG GCCTGCGCAA CGGTAGCGAA ACCAGCCAGT GCAACTGCGA TCGCGATAGC900GGTTTTTTTC ATGAATTC 918
(2)SEQ ID NO16的信息
(i)序列特征
(A)長度867堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ix)特征
(A)名稱/代碼CDS
(B)位置連接(1..855，862..867)
(xi)序列描述SEQ ID NO16GAA TTC ATG AAA AAA ACC GCT ATC GCG ATC GCA GTT GCA CTG GCT GGT48Glu Phe Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly 1 5 10 15TTC GCT ACC GTT GCG CAG GCC GAT ATT GTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC96Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
20 25 30ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC 144Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
35 40 45AGT CAG AGT GTT AGT AGC AGC TAC TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CCT 192Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC ACC AGG GCC ACT 240Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 65 70 75 80GGC ATG CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCC GGG ACA GAC TTC ACT288Gly Met Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95CTC ACC ATC AGT AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT336Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110CAG CAG TAT GGT AGC TCA CCT CAG ACA CCT CAG ATC ACT TTC GGC GGA384Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Thr Pro Gln Ile Thr Phe Gly Gly
115 120 125GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA TCC GGA CAG GTG432Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Ser Gly Gln Val
130 135 140CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG480Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu145 150 155 160AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC CCC TTC AGA AGC TTT GCT ATG528Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Ser Phe Ala Met
165 170175CAC TGG GTC CGC CAG GCT CTA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA GTT576His Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val
180 185 190ATA TCA TAT GAT GGA AGC ACT AAA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC624Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
195 200 205CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC ACT TCC AAG AAC ACG GTG TAT CTA AAA672Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Lys
210 215 220ATG AAC AGC CTG AGA ACT GAG GAC ACG GCT GTC TAT TAC TGT GCG AGA720Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg225 230 235 240GAT CAG AGC CTG TTG GGT GAC TAT GAC CAC TAC TAC GGT TTG GAC GTC768Asp Gln Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Asp His Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
245 250 255TGG GGC AAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGA TCC GAA CAA AAA816Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Gln Lys
260 265 270CTG ATC AGC GAA GAA GAT CTG AAC CAT CAC CAT CAC CAT TAG TGA AAG864Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn His His His His His Lys
275 280 285CTT867Leu (2)SEQ ID NO17的信息
(i)序列特征
(A)長度287氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型蛋白質(zhì)
(xi)序列描述SEQ ID NO17
Glu Phe Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
35 40 45
Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
65 70 75 80Gly Met Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Thr Pro Gln Ile Thr Phe Gly Gly
115 120 125Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Ser Gly Gln Val
130 135 140Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu145 150 155 160Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Ser Phe Ala Met
165 170 175His Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val
180 185 190Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
195 200 205Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Lys
210 215 220Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg225 230 235 240Asp Gln Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Asp His Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
245 250 255Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Gln Lys
260 265 270Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn His His His His His Lys Leu
275 280 285(2)SEQ ID NO18的信息
(i)序列特征
(A)長度867堿基對
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO18AAGCTTTCAC TAATGGTGAT GGTGATGGTT CAGATCTTCT TCGCTGATCA GTTTTTGTTC 60GGATCCTGAG GAGACGGTGA CCGTGGTCCC TTTGCCCCAG ACGACCAAAC CGTAGTAGTG120GTCATAGTCA CCCAACAGGC TCTGATCTCT CGCACAGTAA TAGACAGCCG TGTCCTCAGT180TCTCAGGCTG TTCATTTTTA GATACACCGT GTTCTTGGAA GTGTCTCTGG AGATGGTGAA240TCGGCCCTTC ACGGAGTCTG CGTAGTATTT AGTGCTTCCA TCATATGATA TAACTGCCAC300CCACTCCAGC CCCTTGCCTA GAGCCTGGCG GACCCAGTGC ATAGCAAAGC TTCTGAAGGG360GAATCCAGAG GCTGCACAGG AGAGTCTCAG GGACCTCCCA GGCTGGACCA CGCCTCCCCC420AGACTCCACC AGCTGCACCT GTCCGGATGC AGCCACAGTT CGTTTGATCT CCACCTTGGT480CCCTCCGCCG AAAGTGATCT GAGGTGTCTG AGGTGAGCTA CCATACTGCT GACAGTAATA540CACTGCAAAA TCTTCAGGCT CCAGTCTACT GATGGTGAGA GTGAAGTCTG TCCCGGACCC600ACTGCCACTG AACCTGTCTG GCATGCCAGT GGCCCTGGTG GATGCACCAT AGATGAGGAG660CCTGGGAGCC TGGCCAGGTT TCTGCTGGTA CCAGGCTAAG TAGCTGCTAC TAACACTCTG720ACTGGCCCTG CAGGAGAGGG TGGCTCTTTC CCCTGGAGAC AAAGACAGGG TGCCTGGAGA780CTGCGTCAAC ACAATATCGG CCTGCGCAAC GGTAGCGAAA CCAGCCAGTG CAACTGCGAT840CGCGATAGCG GTTTTTTTCA TGAATTC86權(quán)利要求
1.一種組合物，其中含有抗體的抗原結(jié)合性片段，所述的抗體特異性識別C抗原，所述的C抗原是被所含H鏈的V區(qū)具有氨基酸序列SEQ ID NO2而所含L鏈的V區(qū)具有氨基酸序列SEQ ID NO5的抗體特異性識別的抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中的抗原結(jié)合性片段選自天然全抗體、雙特異性抗體、嵌合抗體、Fab、F(ab)2、單鏈V區(qū)片段(scFv)和融合多肽，所述的融合多肽包含與化學(xué)功能團(tuán)融合的抗原結(jié)合性片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中的天然全抗體是αC抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中的αC抗體被稱為H11，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2的H鏈和具有氨基酸序列SEQ ID NO5的L鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中的scFv與SEQ ID NO14和17基本相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中的功能團(tuán)選自信號肽、加強(qiáng)免疫反應(yīng)性的制劑、有助于與固體載體偶聯(lián)的制劑、疫苗載體、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、毒素、可檢測標(biāo)記、順磁性標(biāo)記和藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中的信號肽是原核生物的或是真核生物的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中的信號肽是真核生物的。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中的加強(qiáng)免疫反應(yīng)性的試劑是細(xì)菌超抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中有助于與固體載體偶聯(lián)的試劑選自生物素和親和素。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中的免疫原載體選自任何生理學(xué)上可接受的緩沖劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞因子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中的細(xì)胞因子選自腫瘤壞死因子、白介素-2、白介素-4、白介素-12、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和γ干擾素。
14.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物。其中的抗腫瘤藥物是選自放射性同位素、長春花生物堿、阿霉素、硫酸博來霉素、卡鉑、順鉑、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、放線菌素D、鹽酸duanorubicin、鹽酸阿霉素、依托泊甙、氟尿嘧啶、洛莫斯汀、鹽酸氮芥、美法侖、硫汞啉、氨甲蝶呤、絲裂霉素、米托坦、噴司他丁、哌泊溴烷、鹽酸procarbaze、鏈佐星、紫杉醇、硫尿嘌呤、和烏拉莫司汀。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中的長春花生物堿選自硫酸長春花堿、硫酸長春新堿和硫酸長春地新。
16.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中的毒素選自蓖麻毒蛋白、放射性核素、商陸抗病毒蛋白、假單孢桿菌外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒蛋白A鏈、真菌毒素例如局限曲霉素(restrictocin)和磷脂酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中的可檢測標(biāo)記選自放射性同位素、熒光化合物、膠質(zhì)金屬、化學(xué)發(fā)光化合物、生物發(fā)光化合物、酶、底物、輔因子和抑制物。
18.一種多肽，它包含SEQ ID NO2或5中至少5個連續(xù)氨基酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多肽，其中的5個連續(xù)氨基酸殘基來自CDR。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多肽，它還包含異源免疫球蛋白C區(qū)。
21.一種人源化抗體，它包含權(quán)利要求18所述的多肽。
22.一種聚合肽，它包含大量權(quán)利要求18所述的肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中的賦形劑是脂質(zhì)體制劑。
25.一種免疫原性組合物，其中包含權(quán)利要求1中的抗原結(jié)合性片段，還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和加強(qiáng)免疫應(yīng)答有效量的佐劑。
26.一種基本上分離的聚核苷酸序列，它編碼抗體的抗原結(jié)合性片段，所述抗體特異性識別C抗原，所述的C抗原是被所含H鏈的V區(qū)具有氨基酸序列SEQ IDNO2而所含L鏈的V區(qū)具有氨基酸序列SEQ ID NO5的抗體特異性識別的抗原。
27.一種基本上分離的聚核苷酸序列，它編碼SEQ ID NO2或5中至少5個連續(xù)氨基酸殘基。
28.根據(jù)權(quán)利要求32所述的聚核苷酸，其中的編碼序列包括在SEQ ID NO1中。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的聚核苷酸、其中的編碼序列包括在SEQ ID NO4中。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的聚核苷酸，其中的聚核苷酸編碼CDR的至少5個連續(xù)氨基酸。
31.一種分離的聚核苷酸，其中包含一個至少有20個核苷酸的區(qū)域，該區(qū)域能夠選擇性地與具有SEQ ID NO1或3的聚核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋。
32.一種分離的聚核苷酸，其中包含一個至少有20個核苷酸的區(qū)域，該區(qū)域能夠選擇性地與具有SEQ ID NO4或6的聚核苷酸形成穩(wěn)定的雙螺旋。
33.根據(jù)權(quán)利要求26所述的聚核苷酸，所述的聚核苷酸是克隆載體。
34.根據(jù)權(quán)利要求26所述的聚核苷酸，所述的聚核苷酸是表達(dá)載體。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體是牛痘苗。
36.一種宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求32所述的聚核苷酸。
37.一種藥物組合物，其中包含權(quán)利要求26所述的聚核苷酸和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
38.一種免疫組合物，其中包含權(quán)利要求26所述的聚核苷酸序列和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
39.一種治療腫瘤形成疾病患者的方法，它包括給予患者有效量的權(quán)利要求1所述的抗原結(jié)合性片段。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，所述的患者患有臨床可測見的腫瘤。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，所述的方法用于緩解腫瘤形成。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，患者體內(nèi)曾測得的所述腫瘤已經(jīng)接受過治療，在給予抗原結(jié)合性片段時臨床上已不可測見腫瘤。
43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，它是減少臨床可測見腫瘤復(fù)發(fā)危險的方法。
44.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中抗原結(jié)合性片段的給予是選用皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腔內(nèi)、鞘內(nèi)、透皮或靜脈注射的腸胃外給藥方法。
45.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，給藥劑量從約0.01毫克/千克/劑至約2000毫克/千克/劑。
46.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中的抗原結(jié)合性片段用治療性物質(zhì)標(biāo)記。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中的治療性物質(zhì)選自放射性同位素、抗腫瘤形成藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、凝集素和毒素。
48.一種組合物，其中包含基本上純化的C抗原，所述的C抗原是被所含H鏈的V區(qū)具有氨基酸序列SEQ ID NO2而所含L鏈的V區(qū)具有氨基酸序列SEQ IDNO5的抗體特異性識別的抗原。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的組合物，其中的C抗原以免疫原性量存在，組合物還包含加強(qiáng)對C抗原免疫應(yīng)答有效量的佐劑。
50.檢測樣品中C抗原的方法，它包括以下步驟
a)將樣品與權(quán)利要求1所述的抗原結(jié)合性片段在允許形成穩(wěn)定的抗體-抗原復(fù)合物的條件下接觸；和
b)檢測步驟a)中形成的任何穩(wěn)定復(fù)合物；
所述的C抗原是被所含H鏈的V區(qū)具有氨基酸序列SEQ ID NO2而所含L鏈的V區(qū)具有氨基酸序列SEQ ID NO5的抗體特異性識別的抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及單克隆抗體H11和其抗原結(jié)合性片段,它們特異性地結(jié)合被H11識別的抗原即C抗原。C抗原發(fā)現(xiàn)特異性存在于腫瘤形成細(xì)胞上,而在正常細(xì)胞上則沒有。本發(fā)明還展示了以H11為基礎(chǔ)的聚核苷酸和多肽衍生物,包括單鏈V區(qū)分子和融合蛋白,以及各種藥物組合物。用于個體時,H11抗體能夠有效地診斷、定位和/或治療新生腫瘤。本發(fā)明還提供治療腫瘤形成疾病的方法,尤其是治療黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤和小細(xì)胞肺癌。用傳統(tǒng)癌癥治療方法處于緩解期的患者可以用本發(fā)明組合物治療,以期降低復(fù)發(fā)的危險性。患者還可以同時用本發(fā)明抗體和傳統(tǒng)抗腫瘤形成藥物的治療。
文檔編號A61K39/00GK1229436SQ9719481
公開日1999年9月22日 申請日期1997年5月22日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月22日
發(fā)明者M·D·丹, P·K·梅蒂, H·A·卡普蘭 申請人:諾弗法姆生物技術(shù)股份有限公司