專利名稱：抗生素混合物及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于移植的組織如心臟瓣膜等的去污，且同時(shí)保持組織的生存力的方法。本發(fā)明還涉及用于此方法的抗生素混合物(cocktail)。
背景技術(shù)：
心臟瓣膜同種移植物的臨床效能與移植中的瓣小葉成纖維細(xì)胞的生存力相互關(guān)聯(lián)。參見，O’Brien等，《心外科雜志》[J.Card.Surg.]2，(增刊)，153-167(1987)和Stark，《胸心血管外科雜志》[J.Thoracic Cardiovasc.Surg.],97,1-9(1989)。因此，貫穿整個(gè)處理程序，包括獲取、轉(zhuǎn)輸、去污、冷凍、貯存、解凍和移植中，必須保持最高的生存力標(biāo)準(zhǔn)。
對(duì)于去污步驟而言，用于組織的微生物去污的抗生素混合物是已知的。具有地說，已知有幾種含有多種抗細(xì)菌劑和一種抗真菌劑的抗生素混合物(兩性霉素B，或者偶爾是，nystatin)。參見，例如Watts等，《胸外科年鑒》[Ann.Thorac.Surg.]，21,230-36(1976)；Strichett等，《病理學(xué)》[Pathology],15,457-62(1983)；Armiger等，《病理學(xué)》[Pathology],15,67-73(1983)；Kirklin和Barratt-Boyes，《心外科》[Cardiac Surgery],421-22(1986)；Heacox等，于《心臟瓣膜同種移植物1962-1987》[Cardiac ValveAllografts 1962-1987],37-42(Yankah等編，1988)；Angell等，《胸心血管外科雜志》[J.Thorac.Cardiovasc.Surg.],98,48-56(1989)；Lange和Hopkins，于《使用同種移植心臟瓣膜的心臟重建》[Cardiac Reconstruction With Allografts Heart Valves],37-63(Hopkins編1989)；USP 4,890,457；USP 4,695,536；和PCT申請(qǐng)WO 92/12632。
兩性霉素B被認(rèn)為是可用的最有效的抗真菌劑。然而，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，兩性霉素B對(duì)患者的同種移植壽命負(fù)有責(zé)任的細(xì)胞有毒性，且因此，已從一些心臟瓣膜去污溶液中除去。參見，Hu等，《心血管研究》[Cardiovasc.Res.],23,960-64(1989)；Lange和Hopkins，于《使用同種移植心臟瓣膜的心臟重建》[Cardiac Reconstruction WithAllograft Heart Valves],37-63(Hopkins編1989)；Mcnally和Brockbank，《醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)雜志》[J.Med.Engineer. & Tech.]，16,34-38(1992)。結(jié)果，目前酵母菌污染導(dǎo)致大量心臟瓣膜被排斥。參見，Mcnally和Brockbank，《醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)雜志》[J.Med.Engineer. & Tech.],16,34-38(1992)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于組織去污的抗生素混合物。該混合物包含1)抗真菌劑兩性霉素B和氟康唑；和2)多種抗細(xì)菌劑。這些藥劑是以基本上抑制酵母和細(xì)菌生長(zhǎng)，而同時(shí)基本上保持組織生存力的有效量存在于混合物中。
本發(fā)明還提供一種去除組織污染的方法，它包含將所述組織與本發(fā)明抗生素混合物接觸。該接觸所用溫度和持續(xù)時(shí)間要基本上能有效抑制酵母和細(xì)菌生長(zhǎng)，而同時(shí)又基本保持組織的生存力。
由于使用本發(fā)明的抗生素混合物，結(jié)果許多先前因?yàn)榻湍富蚣?xì)菌污染而被排斥的組織現(xiàn)可以用于移植。鑒于可用于移植的組織十分稀少，因此這是一項(xiàng)明顯的成就。發(fā)明詳述使用“有效量”一詞是指每一種藥劑以充分的濃度存在，這樣混合物基本上能抑制酵母和細(xì)菌生長(zhǎng)，但又基本上不降低被污染的組織的生存力。這些量可以通過描述于下文的本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)微生物測(cè)試和生存力試驗(yàn)的劑量響應(yīng)測(cè)試來確定。優(yōu)選各藥劑以能殺滅由組織分離的酵母和細(xì)菌之量存在于混合物中。
“基本上抑制”是指用混合物去污的組織上的酵母和細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到完全抑制的至少90％，優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選99％。“完全抑制酵母和細(xì)菌生長(zhǎng)”是指在組織用混合物處理之后，酵母和細(xì)菌生長(zhǎng)不能用標(biāo)準(zhǔn)的微生物化驗(yàn)檢測(cè)出來。
生存力可以用多種方式確定。然而，優(yōu)選將組織與放射性標(biāo)記的氨基酸一起培育，并且氨基酸進(jìn)入蛋白質(zhì)的結(jié)合作用通過計(jì)數(shù)每單位組織的每分鐘衰變(DPM)來監(jiān)測(cè)。因此，“基本上保持生存力”定義為，用混合物處理的組織的結(jié)合相當(dāng)于未用混合物處理組織之結(jié)合的每單位組織每分鐘衰變值的至少約85％。
用于本發(fā)明混合物的抗真菌劑是兩性霉素B和氟康唑.組合使用這二種抗真菌劑基本上抑制酵母的生長(zhǎng)，而同時(shí)基本上保持用這些藥劑處理的組織的生存力。鑒于有報(bào)道說兩性霉素B對(duì)組織的毒性(參見上述背景部分)，此結(jié)果是出人意外的。
兩性霉素B和氟康唑的適合的濃度可以通過描述于下文的本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)微生物測(cè)試和生存力試驗(yàn)的劑量響應(yīng)測(cè)試來確定。單獨(dú)的兩性霉素B或氟康唑在基本上保持組織生存力的劑量下基本上不抑制酵母的生長(zhǎng)，但這二種抗真菌劑的組合卻抑制酵母的生長(zhǎng)。的確，兩性霉素B和氟康唑的組合具有協(xié)同抗酵母活性的發(fā)現(xiàn)是出人意外的(見實(shí)施例14和15)。
用于心臟瓣膜消毒的抗生素混合物中的兩性霉素B的優(yōu)選濃度是約0.3μg/ml至約2.0μg/ml。用于心臟瓣膜消毒的抗生素混合物中的氟康唑的優(yōu)選濃度是約50μg/ml至約100μg/ml。
對(duì)實(shí)際可用于本發(fā)明的抗細(xì)菌劑作出選擇，使得抗細(xì)菌劑的組合將可以有效地抗廣譜細(xì)菌，包括格蘭氏陰性、格蘭低陽性、需氧和厭氧細(xì)菌。此外，選擇抗細(xì)菌劑，使得這些藥劑的組合有效地抗常見于污染被處理組織的細(xì)菌。許多這樣的細(xì)菌是已知的(例如，葡萄球菌科、鏈球菌科和丙酸桿菌科)和其它可以通過標(biāo)準(zhǔn)微生物試驗(yàn)鑒定的細(xì)菌(參見，例如下文實(shí)施例19)。因此，屬于二或多個(gè)種類的廣譜的抗細(xì)菌藥劑是優(yōu)選的。最后，抗細(xì)菌劑的組合必須基本上不降低被處理的組織的生存力。
優(yōu)選的多種抗細(xì)菌劑選自下列種類頭孢菌素類、糖肽類、氨基糖苷類、林可酰胺類、β-內(nèi)酰胺類扣利福霉素類。更優(yōu)選的抗細(xì)菌劑的組合包含萬古霉素和亞胺培南，且最優(yōu)選的是萬古霉素、亞胺培南和萘替米星。對(duì)于心臟瓣膜的去污而言，優(yōu)選的是50μg/ml萬古霉素，約10-100μg/ml亞胺培南和約20-50μg/ml萘替米星的組合。
亞胺培南是β-內(nèi)酰胺抗生素。它對(duì)大多數(shù)需氧格蘭氏陽性和格蘭氏陰性細(xì)菌和大多數(shù)厭氧格蘭低陽性和格蘭氏陰性細(xì)菌有活性。
萬古霉素是三環(huán)狀糖肽。它對(duì)許多格蘭氏陽性菌包括葡萄球菌科、鏈球菌科、腸球菌科、梭菌屬和棒桿菌屬有活性。它對(duì)格蘭氏陰性菌無活性。
萘替米星是氨基糖苷類，且對(duì)大多數(shù)需氧格蘭氏陰性菌和一些需氧格蘭氏陽性菌有效。萘替米星對(duì)大多數(shù)鏈球菌和大多數(shù)厭氧細(xì)菌無活性。
對(duì)抗菌劑的濃度作選擇，使之至少4至8倍于通過標(biāo)準(zhǔn)微生物敏感性測(cè)定確定的對(duì)靶體細(xì)菌的最小抑制濃度。這些參數(shù)的范圍內(nèi)，使用如下文所描述的那些標(biāo)準(zhǔn)微生物試驗(yàn)和生存力試驗(yàn)對(duì)組織進(jìn)行劑量響應(yīng)測(cè)試，依據(jù)此結(jié)果，可以對(duì)抗細(xì)菌劑的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)。
由上文可見，優(yōu)選的本發(fā)明抗生素混合物含有兩性霉素B、氟康唑、萬古霉素、亞胺培南和萘替米星。對(duì)于心臟瓣膜消毒而言，含有約0.3-1.0μg/ml兩性霉素B、約50-100μg/ml氟康唑、約50μg/ml萬古霉素、約10-100μg/ml亞胺培南和約20-50μg/ml萘替米星的抗生素混合物是優(yōu)選的。最優(yōu)選的是下列混合物1.0μg/ml兩性霉素B，100μg/ml氟康唑，50μg/ml萬古霉素，96μg/ml亞胺培南，和50μg/ml萘替米星。
本發(fā)明還提供將組織消毒的方法，所述的方法包含將組織與本發(fā)明抗生素混合物接觸。用此方式，可以將各種組織去污，包括心臟瓣膜、心包、脈管和肌與骨胳連接組織。如本文中所使用的，術(shù)語“肌與骨胳連接組織”包括諸如腱、韌帶和半月板等組織，但不包括骨等組織。
將該組織與抗生素混合物在能基本上抑制酵母和細(xì)菌生長(zhǎng)，而同時(shí)保持組織生存力的溫度下接觸，并持續(xù)一段時(shí)間。這些時(shí)間和溫度可以按本領(lǐng)域已知的方法經(jīng)驗(yàn)地確定。我們發(fā)現(xiàn)，心臟瓣膜可以通過將它們與本發(fā)明的抗生素混合物一起在35-39℃的溫度下溫育24-48小時(shí)而有效地去污。
實(shí)施例實(shí)施例1此實(shí)施例描述四種抗生素混合物在心臟瓣膜組織上的試驗(yàn)。
A．心臟瓣膜獲取和準(zhǔn)備當(dāng)從負(fù)責(zé)與捐獻(xiàn)者家庭聯(lián)系的器官獲取機(jī)構(gòu)得到同意的信息之時(shí)，將發(fā)現(xiàn)不適合用于同種移植移植術(shù)的心臟瓣膜收集來作為實(shí)驗(yàn)之用。如USP4,890,457中所述，解剖心臟瓣膜。
B．消毒將心臟瓣膜小葉切成二半，每一半均在4ml的Dulbecco’sModified Eagle Medium(DMEM)(GIBCO)中溫育，上述培養(yǎng)基用25mM4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖，并含有10％的胎牛血清(下文稱作“溶液B”)和下述類型和濃度的抗生素。所述抗生素包括具有下列配方的被稱作混合物B和混合物C的二種抗菌劑組合物混合物B62μg/ml利福平57μg/ml萘替米星114μg/ml萬古霉素136μg/ml頭孢氨噻136μg/ml林可霉素混合物C12μg/ml亞胺培南50μg/ml萬古霉素此外，試驗(yàn)了二種其它的混合物。除了它們還含有100μg/ml氟康唑之外這些混合物與混合物B和C相同。
制備利福平的母液時(shí)，將600mg消毒利福平溶解于10ml消毒水中。利福平由Merrell Dow(商品名RIFADIN)獲得。
100mg/ml萘替米星硫酸鹽的溶液由Schering-Plough獲得(商品名NETROMYCIN)用作該抗菌母液。
萬古霉素的母液通過將500mg消毒萬古霉素鹽酸鹽溶解于10ml消毒水中而制得。萬古霉素鹽酸鹽由Eli Lilly & Co.獲得(商品名VANCOCIN HCl)。
頭孢氨噻母液通過將2.0克消毒頭孢氨噻鈉溶解于3ml消毒水中而制得。頭孢氨噻鈉由Hoechst-Roussel獲得(商品名CLAFORAN)。
300mg/ml林可霉素鹽酸鹽的溶液由Upjohn獲得(商品名LINCOCIN)，用作所述的抗生素的母液。
亞胺培南的母液通過將20ml消毒鹽水加入到由Merck & Co.獲得的250mg瓶裝亞胺培南(商品名PRIMAXIN)而制備。
最后，2mg/ml氟康唑的溶液由Pfizer Roerig獲得(商品名DIFLUCAN)，用作其母液。
將適合量的每一種母液加入至溶液B中，給出用在混合物B和C和混合物B和C加氟康唑中的終濃度。
實(shí)驗(yàn)1成對(duì)的半個(gè)小葉用混合物B或混合物B加氟康唑處理。類似地，將成對(duì)的半個(gè)小葉用混合物C或混合物C加氟康唑處理。所有的瓣膜小葉半在37℃下于抗生素混合物中溫育48小時(shí)，之后冷凍保存。
實(shí)驗(yàn)2再次使用成對(duì)的半個(gè)小葉。一半用作新鮮對(duì)照，一半即刻用3H-甘氨酸標(biāo)記，確定小葉成纖維細(xì)胞的生存力(參見下文)。每一小葉另一半于混合物B或混合物加氟康唑中溫育。類似地，另一對(duì)的一半用作新鮮對(duì)照，且另一半于混合物C或混合物C加氟康唑中溫育。抗生處理的小葉在37℃下在抗生素混合物中溫育48小時(shí)，之后冷凍保存。
B．冷凍保存在用抗生素混合物處理完畢后，將各瓣膜小葉半塊包裝，冷凍保存和如USP 4,890,457中描述的貯存，對(duì)冰凍程序作些改進(jìn)，使單個(gè)的瓣膜小葉半塊可以以約-1℃/分鐘的冷卻速率在～1.6ml冷冰保存溶液中保存。使用1.8ml Nalge冷凍管來盛放此小葉組織。組織從+4℃至-80℃的冰凍程序大約需要80-90分鐘。
C．貯存瓣膜小葉半塊在解凍前，液氮冰箱中貯存至少二天，但不超過三周。
D．解凍通過將要解凍的瓣膜組織從液氮冰箱中取出，將瓣膜小葉半塊解凍。盡可能快地將組織轉(zhuǎn)移到37℃的水浴中。當(dāng)所有的冰溶化后(約2分鐘)，將冷凍管轉(zhuǎn)移到通風(fēng)櫥中，并向每一正在解凍的冷凍管中，將4ml室溫的加5％葡萄糖的泌乳林格注射液(D5LR)配入5-ml帶有snap蓋的試管(Falcon)。冰凍管的外部用70％異丙醇淋洗，并在開蓋前抹去所余物。使用消毒鑷子，將小葉組織轉(zhuǎn)移到含有D5LR的試管中。讓此組織在D5LR中停留5分鐘。
E．生存力測(cè)試組織生存力如下通過3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白質(zhì)的測(cè)定來評(píng)價(jià)。將解凍的瓣膜小葉半塊放置于snap蓋試管(Falcon)中，試管中含有添加15μg/ml抗壞血酸的于1ml DMEM中的16μCi的含氚甘氨酸(DuPontNew England Nuclear)。在37℃下由5％二氧化碳組成氣氛中的空氣中溫育48小時(shí)后確定放射性甘氨酸結(jié)合。之后用磷酸緩沖鹽水洗滌四次，用乙醇和乙醚脫水，空氣干燥并稱重。之后將組織樣品用200μl水再水合，并通過加500μl的1M NaOH溶解。在60℃溫育1小時(shí)后，將樣品聲處理二次，每次20秒。均化液在12,000xg下離心，并100μl等份的上清液放置于玻璃纖維濾紙盤(Whatman No.1822024；Whatman Chemical Separation Inc.,Clifton,N.J.)。將濾紙盤干燥，并將蛋白質(zhì)通過加入冰冷的10％三氯乙酸持續(xù)30分鐘來沉淀。接著用乙醇淋洗五次，用乙醚淋洗二次，并干燥。之后將濾紙盤放置于10ml閃爍液中(Cytoxcint ES,ICN Biomedicals,Inc.,Irvine,CA)。通過使用LS1701(Beckman Instruments,Inc.,Palo Alto,CA)閃爍計(jì)數(shù)確定氚結(jié)合。
在實(shí)驗(yàn)1中，生存力也通過用3H-次黃嘌呤標(biāo)記一些小葉半塊用于放射自顯影術(shù)來評(píng)價(jià)。為了做到這點(diǎn)，制備出含有5mg/100ml慶大霉素(Sigma)和15mg/100ml抗壞血酸(Sigma)的無血清培養(yǎng)基(DMEM)中含有15μCi/ml的3H-次黃嘌呤(DuPont/NEN)的溶液。每一小葉半塊放置于5ml消毒的snap蓋試管中。使用微量移液管，將0.75ml的3H-次黃嘌呤溶液加入于試管中的組織中。將試管于37℃下在5％CO2中溫育48小時(shí)。之后，潷去氚化的培養(yǎng)基，并將此組織用3-4ml PBS(GIBCO)洗滌二次。加入另一份3-4ml PBS，并在去除液體前將試管在室溫下溫育30分鐘。之后，向每一試管中加入3-4ml PBS，并將試管于4℃下溫育18-72小時(shí)。潷去PBS，并將組織轉(zhuǎn)移到7ml玻璃閃爍管中。向閃爍管中加入10％中性緩沖福爾馬林(Fi sher)，蓋好，并貯存在室溫下，直到樣品如下進(jìn)行放射自顯影術(shù)分析。
將組織于0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.4中的15％蔗糖中浸泡2小時(shí)至過夜。將溶液先置于在室溫下，之后置于低于4℃下。將組織解剖，鑲嵌在帶有0CT的塑料模中，之后于液氮下冷冰。冷凍切片在恒冷切片機(jī)中切成6微米，并安放在鉻明礬涂覆的載玻片上解凍(載玻片在37℃下用含有3.0g白化明膠275和0.3g硫酸鉻鉀的1000ml蒸餾水溶液中浸蘸二次)。載玻片在37℃下干燥過夜至48小時(shí)，并將OCT從這些部分中去除。之后將切片在從95％、75％降到50％的乙醇中水合。將載玻片留在50％的乙醇中10分鐘，之后用蒸餾水淋洗30秒。將切片在乙醇至二甲苯中脫水去脂肪。將載片在稀釋至二倍蒸餾水中的同樣乙醇溶液中水合。載片放置在37℃烘箱中至干燥(1小時(shí)至過夜)。將液體Emulsion Kodak NTB2在40℃水浴中溶解30分鐘，之后用蒸餾水1∶1稀釋。將載片緩慢地單個(gè)浸蘸于此稀釋乳液中2次(6秒)，并讓之靜置1小時(shí)或直到干燥。將盒密封好，并貯存在冷室(4℃)中的干燥器中，直到載片顯影。
為使載片顯影，使它們?nèi)跃兔芊夂?，回到約14℃(在室溫下約11分鐘)。這樣可避免在載片上凝聚，而凝聚會(huì)減少信號(hào)。所有的步驟在14℃的溫度下進(jìn)行。將載片放置在玻璃載片架上，并即刻在D-19顯影液(Kodak Catalog#146 4593)中顯影2.5分鐘。之后將載片在蒸餾水中淋洗30秒，在這之后，將它們用Kodak定影液(Polymax Tfixer,Catalog # 829-5321)定影5分鐘。將載片在14℃下于流動(dòng)的自來水下淋洗，將水溫緩慢升至室溫，21℃，持續(xù)10分鐘。最后，將載片用Harris Hematoxylin(Sigma Cat # HHS-32)和Eosin Y醇溶液(Sigma,Cat.#HT 110-1-32)對(duì)染。
結(jié)果示于下列表格中。3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白質(zhì)用每mg干組織每分鐘衰變(DPM)來表示。放射自顯影結(jié)果用計(jì)數(shù)的活細(xì)胞占每次計(jì)數(shù)的細(xì)胞總數(shù)的百分率來表示。
實(shí)驗(yàn)1混合物C 混合物C加氟康唑瓣膜 DPM/mg 放射自顯影 DPM/mg放射自顯影B11262088 78％ 3232 79％B11275996 71％ 6322 62.5％混合物B 混合物B加氟康唑瓣膜 DPM/mg放射自顯影DPM/mg放射自顯影B11281430 18％ 152611％B11292754 28％ 281627％
實(shí)驗(yàn) 2(DPM/mg)混合物B 混合物B瓣膜 小葉 新鮮組織混合物B 加氟康唑的平均％B1134 1 1847 1589(86％)*2 2112 1882(89％)3 1826 2244(123％)*129％B1135 1 1830 2114(116％)2 1536 810(53％)45％3 2255 1091(48％)B1137 1 2179 2674(123％)2 2776 4375(158％)3 1724 2811(163％) 80％B1138 1 1934 3320(172％)2 1449 3412(235％) 85％3 1499 2250(150％)B1139 1 9765 7596(78％)2 5084 5276(104％)3 105193786(36％) 59％B1140 1 2154 3804(177％)2 5530 5483(99％) 106％4105 2597(63％)混合物C 混合物C瓣膜小葉 新鮮組織 混合物C加氟康唑 的平均％B1141 12410 4955(206％)222874714(206％) 95％33762 4661(124％)B1144 12736 4355(159％)255505128(92％) 112％34752 4611(97％)B1147 11526 2116(139％)218193959(217％) 148％31582 2287(145％)B1148 14448 9922(223％)23144 8075(257％)337088290(224％) 92％B1150 12484 5085(205％)22796 4999(179％)331397109(226％)141％B1151 13938 3868(98％)25279 7160(136％)341556055(146％)110％*與新鮮組織相比的百分?jǐn)?shù)實(shí)驗(yàn)1結(jié)果表明，用含有氟康唑的混合物C處理，使瓣膜組織的生存力至少與用不加氟康唑的混合物C處理后瓣膜組織的生存力一樣。這點(diǎn)可見于閃爍計(jì)數(shù)結(jié)果和放射自顯影。含有氟康唑的混合物B也實(shí)際上等同于不加氟康唑的混合物B。然而，用混合物B，該組織開始時(shí)生存力稍低。
實(shí)驗(yàn)2平均而言，含有氟康唑的混合物B給出的結(jié)果是不含氟康唑的混合物B獲得的結(jié)果的84％。平均而言，含有氟康唑的混合物C給出的結(jié)果是不加氟康唑的混合物C的116％。當(dāng)任一種抗生處理與新鮮的組織瓣膜相比時(shí)，它們均高于新鮮組織。
由實(shí)驗(yàn)1和2的結(jié)果，可以得出這樣的結(jié)論，向混合物B或C中加入100μg/ml氟康唑?qū)υ摻M織無害。
實(shí)施例2如實(shí)施例1中所述，制備并試驗(yàn)含有下列濃度的下列抗生素的混合物。
亞培胺南12μg/ml萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml利福平 0、10、30或100μg/ml。
使用成對(duì)的瓣膜小葉半塊。每一小葉的一半作為對(duì)照。將它溫育在不含利福平的抗生素混合物中。另一半用含有利福平的抗生素混合物之一處理。對(duì)3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白質(zhì)的評(píng)價(jià)的結(jié)果以DPM/mg和相對(duì)于對(duì)照的百分率示于下列表格中。
實(shí)施例3如實(shí)施例1中所述，制備并試驗(yàn)抗生素混合物。使用成對(duì)的瓣膜小葉半塊。每一小葉的一半作為對(duì)照并用下列抗生素混合物處理亞培胺南12μg/ml萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml。
另一半用下列試驗(yàn)抗生素混合物處理亞培胺南12、24或48μg/ml萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml利福平 10μg/ml。
對(duì)3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白質(zhì)的評(píng)價(jià)的結(jié)果以DPM/mg和相對(duì)于對(duì)照的百分率示于下列表格中。標(biāo)記為12、24和48μg的欄指在每ml試驗(yàn)(非對(duì)照)混合物中所用的亞胺培南的量。
實(shí)施例4如實(shí)施例1中所述，制備并試驗(yàn)含有下列濃度的下列抗生素的抗生素混合物。
亞培胺南12、24、48或96μg/ml萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml。
使用成對(duì)的瓣膜小葉半塊。每一小葉的一半作為對(duì)照，并用含有12μg/ml亞胺培南的抗生素混合物處理。另一半用含有24、48或96μg/ml亞胺培南的試驗(yàn)抗生素混合物處理。對(duì)3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白質(zhì)的評(píng)價(jià)的結(jié)果以DPM/mg和相對(duì)于對(duì)照的百分率表示列于下表中。標(biāo)記為24、48和96μg的欄指在每ml試驗(yàn)(抗生)混合物中所用的亞胺培南的量。
實(shí)施例5如實(shí)施例1中所述，制備并試驗(yàn)含有下列濃度的下列抗生素的混合物。
亞培胺南12、24、48或96μg/ml萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml利福平 10μg/ml。
兩性霉素B 0、0.3、1.0或3.0μg/ml。
兩性霉素B的稀釋液如下制備。將含有50mg兩性霉素(E.R.Squibb & Sons,Inc。Princeton,NJ；商品名FUNGIZONE)的瓶子用10ml消毒水再構(gòu)建。取出一毫升這樣的溶液，并再用9ml溶液B稀釋，給出500μg/ml的濃度。由此母液用溶液B制成進(jìn)一步的稀釋液。
使用成對(duì)的瓣膜小葉半塊。每一小葉的一半作為對(duì)照并用含有不加任何兩性霉素B的抗生素混合物處理。另一半用含有兩性霉素B的抗生素混合物處理。對(duì)3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白質(zhì)的評(píng)價(jià)的結(jié)果以DPM/mg和相對(duì)于對(duì)照的百分率示于下列表格中。表格中，濃度是指使用于試驗(yàn)抗生素混合物中的兩性霉素B的濃度。
p><p>在抗生素混合物中0.3μg/ml兩性霉素B的濃度產(chǎn)生具有平均生存力大于對(duì)照物的組織。使用1和3μg/ml兩性霉素B，組織生存力分別降低到對(duì)照物的74％和72％。實(shí)施例6如實(shí)施例1和5中所述，制備并試驗(yàn)含有下列濃度的下列抗生素的混合物，只是瓣膜小葉半塊只在抗生素混合物中溫育24小時(shí)，而不是48小時(shí)。亞培胺南48μg/ml萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml利福平 0、10、30或60μg/ml.兩性霉素B 0.3μg/ml.
使用成對(duì)的瓣膜小葉半塊。每一小葉的一半作為對(duì)照，并用不加任何利福平的抗生素混合物處理。另一半用含有利福平的試驗(yàn)抗生素混合物之一處理。對(duì)3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白質(zhì)的評(píng)價(jià)的結(jié)果以DPM/mg和相對(duì)于對(duì)照的百分率示于下列表格中。表格中，濃度是指使用于試驗(yàn)抗生素混合物中的利福平的濃度。
實(shí)施例7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較被新鮮組織結(jié)合的3H-甘氨酸與被各種方式處理的組織結(jié)合的3H-甘氨酸。所有的程序與實(shí)施例1和5中描述的那些相同，除非在下文中另有說明。
每八個(gè)瓣膜中取出三片小葉，并將每片小葉切成二半。將六片小葉半塊處理如下小葉1A新鮮對(duì)照，無抗生素處理，無冷凍保存。
小葉1B與溶液B一起在37℃下溫育24小時(shí)并冷凍保存。
小葉2A新鮮對(duì)照，無抗生素處理，無冷凍保存。
小葉2B與抗生素混合物一起在37℃下溫育24小時(shí)并冷凍保存。
小葉3A與溶液B一起在37℃下溫育24小時(shí)并冷凍保存。
小葉3B與抗生素混合物一起在37℃下溫育24小時(shí)并冷凍保存。
所有的新鮮對(duì)照瓣膜小葉半塊均即刻用3H-甘氨酸標(biāo)記，并進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)處理。解冰后，將溶液B處理和抗生素處理的瓣膜小葉半塊也用3H-甘氨酸標(biāo)記，并進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)處理。
抗生素混合物由下列組成亞胺培南 48μg/ml萬古霉素 50μg/ml氟康唑 100μg/ml兩性霉素 0.3μg/ml。
結(jié)果示于下文表格中。數(shù)字是DPM/mg。
瓣膜 小葉 新鮮組織溶液B抗生素B12221 5097 71102 4155 93113 6610 6439B12231 4684 94002 5582 81313 8364 6841
B1226 13670 8153239871142537817 7757B1229 16107 817728470 96833 7945 6297B1230 16067 741224098 693534258 5523B1232 13022 547422534 75743 6138 4051B1233 12451 443623701108613 6364 5402B1234 15666 287025006 34763 4185 3233平均 4643 6545 7059STD DEV 1544 1852 2450SEM 386463 612新鮮對(duì)照組與在冷凍保存前在37℃溫育的二個(gè)組間存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在溶液B處理和抗生素處理的組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。統(tǒng)計(jì)分析使用Student-Newman-Keuls方法進(jìn)行。實(shí)施例8如實(shí)施例1和5中所述，制備并試驗(yàn)含有下列濃度的下列抗生素的抗生素混合物。
亞培胺南48、72或96μg/ml萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml兩性霉素B 0.3μg/ml。
每一瓣膜取三片小葉，并將小葉切成二半。每一小葉的一半與含有特定濃度的亞胺培南的抗生素混合物一起溫育24小時(shí)，并將另一半與相同的抗生素混合物一起溫育48小時(shí)，如下所示小葉1A-48μg/ml亞胺培南，24小時(shí)1B-4μg/ml亞胺培南，48小時(shí)2A-72μg/ml亞胺培南，24小時(shí)
2B-72μg/ml亞胺培南，48小時(shí)3A-96μg/ml亞胺培南，24小時(shí)3B-96μg/ml亞胺培南，48小時(shí)對(duì)3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白質(zhì)的評(píng)價(jià)的結(jié)果以DPM/mg表示列下表格中。表格中，濃度是指試驗(yàn)抗生素混合物中所用的亞胺培南的濃度。
這些數(shù)據(jù)通過Student T-試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析顯示，任何處理組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)施例9如實(shí)施例1和5中所述，制備并試驗(yàn)含有下列濃度的下列抗生素的抗生素混合物，只是瓣膜小葉半塊只在抗生素混合物中溫育24小時(shí)。
亞培胺南96μg/ml萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml和下列之一
0.3μg/ml兩性霉素B對(duì)照0.6μg/ml兩性霉素BⅠ1.0μg/ml兩性霉素BⅡ0.6μg/ml兩性霉素B加上50μg/ml萘替米星 Ⅲ對(duì)3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白質(zhì)的評(píng)價(jià)的結(jié)果示于下文表格中(單位DPM/mg)。要說明的是，瓣膜B1307、B1310和B1311具有不正確的加在混合物中的萘替米星濃度。因此，這些數(shù)據(jù)未包括。
瓣膜對(duì)照 Ⅰ Ⅱ ⅢB1307 4438 72646370 5770B1310 1773 25222107 4091B1311 2712 16171560 1495B1313 3940 37904644 30582841 1598B1315 3678 35884727 49413570 4476B1316 7255 96248867 109545510 7924B1317 4039 42617180 50962703 3240B1318 5461 70257704 90137838 7346B1319 3178 34352983 29633190 2847B1320 9820 85355527 52567530 7866B1321 4528 28705439 44863872 3763B1322 3815 35443511 22694205 3249B13246268 70654692 44387847 6492B13254839 52734516 44625922 6478統(tǒng)計(jì)分析平均Std.Dev·SEM對(duì)照48871997 3200.6 Amp B 50302451 6551.0 Amp B 48782502 6696 Amp B + 萘替米基 5025 2255 680使用Kruskal-Wallis one way anova on ranks法分析，各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.994)。因此，試驗(yàn)的抗生素組合物為組織提供相等的生存力。實(shí)施例10如實(shí)施例1和5中所述，制備并試驗(yàn)抗生素混合物，只是瓣膜小葉半塊只在抗生素混合物中溫育24小時(shí)。使用成對(duì)的瓣膜小葉半塊。每一小葉的一半作為對(duì)照，并用下列抗生素混合物處理亞培胺南96μg/ml萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml兩性霉素B 0.6μg/ml。
另一半用下列試驗(yàn)抗生素混合物之一處理亞培胺南96μg/ml萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml兩性霉素B 0.6μg/ml萘替米星20、30或50μg/ml。
對(duì)3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白質(zhì)的評(píng)價(jià)的結(jié)果以DPM/mg和相對(duì)于對(duì)照的百分率表示列入下表中。標(biāo)記為20、30或50μg/ml的欄指用于試驗(yàn)(非對(duì)照)抗生素混合物中的萘替米星的濃度。
實(shí)施例11如實(shí)施例1和5中所述，制備并試驗(yàn)抗生素混合物，只是瓣膜小葉半塊只在抗生素混合物中溫育24小時(shí)。使用成對(duì)的瓣膜小葉半塊。每一小葉的一半作為對(duì)照，并用下列抗生素混合物處理亞培胺南96μg/ml
萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml萘替米星50μg/ml。
另一半用下列抗生素混合物之一處理亞培胺南96μg/ml萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml萘替米星50μg/ml兩性霉素B 0.3、0.6、1.0、2.0或3.0μg/ml。
對(duì)3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白質(zhì)的評(píng)價(jià)的結(jié)果以DPM/mg表示列入下表中。3H-次黃嘌呤放射自顯影的結(jié)果以相對(duì)于細(xì)胞總數(shù)的活細(xì)胞百分率示于第二個(gè)表格中。標(biāo)記為0.3、0.6、1.0、2.0或3.0μg/ml的欄指用于試驗(yàn)(非對(duì)照)抗生素混合物中的兩性霉素B的濃度。
實(shí)施例12進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定使用混合物C、混合物D或混合物B加混合物C處理的瓣膜小葉的生存力。混合物B和C的配方參見實(shí)施例1?；旌衔顳具有下列配方亞胺培南96μg/ml萬古霉素50μg/ml氟康唑 100μg/ml兩性霉素0.3μg/ml。
除非另有說明，按實(shí)施例1和5中所述配制混合物并進(jìn)行試驗(yàn)。
使用十一只人瓣膜。每一瓣膜取一小葉用混合物D溫育24小時(shí)(方法G)。另一小葉于混合物C中溫育24小時(shí)(方法D)或于混合物C中溫育24小時(shí)，接著于混合物B中溫育24小時(shí)(方法E)。解凍后，將每一小葉切成二半。一半用3H-甘氨酸標(biāo)記，并將另一半用3H-次黃嘌呤標(biāo)記。3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白質(zhì)的結(jié)果示于下文表格中(DPM/mg單位)。
瓣膜 方法 方法方法GD/EB1272 D 20081576B1274 D 14843858B1276 D 25272110B1277 D 35788432平均 23993994SD8943115B1273 E 7422012B1275 E 44496267B1278 E 23172383B1279 E 388 410B1280 E 8421047B1281 E 5892122B1282 E 4701326平均 14002224SD 14961911
因此，用含有抗真菌劑氟康唑和兩性霉素B的混合物D處理(方法G)產(chǎn)生的瓣膜小葉的生存力與用不含抗真菌劑的混合物B和C處理(方法D和E)差不多或更好。實(shí)施例13進(jìn)行一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，比較用下列方式處理的心臟瓣膜組織的生存力方法F用混合物C溫育24小時(shí)心肌缺血時(shí)間較長(zhǎng)的組織(潛在的較低細(xì)胞生存力)，任選接著用混合物B溫育24小時(shí)(實(shí)施例1中給出的配方)。是否用混合物B處理，要由以混合物C處理之前所作微生物培養(yǎng)結(jié)果來決定，如Mcnally和Brockbank，《醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)雜志》[J.Med.Engineer. &amp; Tecknol.]16,34-38(1992)和PCT申請(qǐng)WO 92/12631中所述。
方法H用下列被稱作混合物E的抗生素混合物溫育24小時(shí)亞胺培南94-100μg/ml萬古霉素50μg/ml萘替米星50μg/ml氟康唑 100μg/ml兩性霉素1.0μg/ml。
如實(shí)施例1和5中所述，制備并試驗(yàn)混合物B、C和E，除非另有指明。
解剖時(shí)從每一瓣膜取出一片小葉，并切成二半。一半即刻用3H-甘氨酸標(biāo)記，另一半即刻用3H-次黃嘌呤標(biāo)記。這些均是新鮮對(duì)照物。
余下的瓣膜切成二半，每一半留下一個(gè)完整的小葉。半個(gè)瓣膜之一用方法F處理(混合物C，任選接著用混合物B處理)。另半個(gè)瓣膜用方法H處理(混合物E)。冰凍的半個(gè)瓣膜解凍，并切成二半。一半用3H-甘氨酸標(biāo)記，另一半用3H-次黃嘌呤呤標(biāo)記。
結(jié)果示于下文表格中(DPM/mg單位用于表示3H-甘氨酸結(jié)合入蛋白的結(jié)果，活細(xì)胞百分比是與3H-次黃嘌呤放射自顯影的總細(xì)胞數(shù)相比)。
用非參數(shù)Mann-Whitney排序累加試驗(yàn)，對(duì)各處理組進(jìn)行比較。當(dāng)使用3H-甘氨酸來標(biāo)記組織時(shí)，各處理間無明顯差異(P=0.665)。同樣，當(dāng)使用3H-次黃嘌呤來標(biāo)記組織時(shí)，二組處理之間無明顯差異(P=0.684)。使用Kruskal-Wallis one way anova on ranks分析法，當(dāng)使用3H-甘氨酸時(shí)，三組中任二者間均無明顯差別
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*ND=無數(shù)據(jù)**非常厚重的噬菌斑實(shí)施例14使用于這些研究中的白色假絲酵母(Candida albicans)是ATCC菌種14053(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)。多種這些菌種在培養(yǎng)前與培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定。
試驗(yàn)有機(jī)體在Sabouraud瓊脂板上培養(yǎng)，劃線分離，并在35℃溫育24小時(shí)。使用消毒棉球移出單個(gè)的菌落，并放置于5.0ml消毒鹽水中。將混合物渦旋，并制成稀釋液，并與標(biāo)準(zhǔn)的濁度圖進(jìn)行比較，直到濁度相當(dāng)于0.5濁度標(biāo)準(zhǔn)液(0.5 MacFarland濁度標(biāo)準(zhǔn)懸浮液)。如下制成系列稀釋液(1)0.5ml的0.5 MacFarland濁度標(biāo)準(zhǔn)液加入到4.5ml消毒的正常鹽水中(試管A；預(yù)期種群數(shù)105cfu/ml)；(2)0.1ml的試管A懸浮液加入到9.9ml消毒的正常鹽水中(試管B；預(yù)期種群數(shù)103cfu/ml)；和(3)0.1ml的試管B懸浮液加入到9.9ml消毒的正常鹽水中(試管C；預(yù)期種群數(shù)10cfu/ml)。每一系列稀釋液在進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)移前渦旋30秒。
用溶液B制得具有下列表格中給出的濃度的氟康唑和兩性霉素B的溶液。
混合物 氟康唑兩性霉素B對(duì)照 0 0Ⅰ 100μg/ml 0Ⅱ 100μg/ml 0.3μg/mlⅢ00.6μg/ml試管B和C用這些混合物殺菌處理。將每一種上述抗生素混合物(24.0ml)放置入消毒的115ml塑料杯中，并加入1.0ml來源于試管B或C的酵母種群。將這些杯輕輕地混合，蓋好，并放置在培養(yǎng)箱中于35℃下溫育24小時(shí)。在前述溫育之后，從每一試管中取出1.0ml的酵母-上述抗生素混合物的混合物，并處理，獲得存活著的酵母有機(jī)體。將所剩的混合物放回培養(yǎng)箱中，并再溫育24小時(shí)。在此溫育期之后，將杯取出，輕輕地渦旋，并取出1.0ml，重復(fù)這些步驟。
如下進(jìn)行酵母的計(jì)數(shù)；每一樣品重復(fù)試驗(yàn)。將一毫升(1.0ml)酵母懸浮液加入到含有99ml消毒正常鹽水的消毒的一次性裝置的頂部配件上。將內(nèi)容物輕輕混合并過濾。使用消毒的一次性鑷子無菌地去除濾紙墊，并放置在Sabouraud瓊脂板上。并將此板在35℃下溫育24小時(shí)，之后計(jì)數(shù)菌落。
結(jié)果示于下列表格中。在時(shí)間為零時(shí)，試管B中每ml溶液中含有734個(gè)菌落形成單位(CFU)的白色假絲酵母，在時(shí)間為零時(shí)，試管C含有13cfu/ml
試管B的結(jié)果顯示，100μg/ml氟康唑有效地將白色假絲酵母生物負(fù)載在24小時(shí)內(nèi)由734個(gè)菌落降低到31個(gè)菌落。在48小時(shí)時(shí)，菌落計(jì)數(shù)(45)表示產(chǎn)生耐藥性或者說處于固定狀態(tài)。0.6μg/ml的兩性霉素B和100μg/ml氟康唑和0.3μg/ml兩性霉素B的組合是殺真菌的。實(shí)施例15如實(shí)施例1和5所描述，制備出下列抗生素混合物，并對(duì)十種酵母分離菌進(jìn)行試驗(yàn)混合物 內(nèi)容Ⅰ 亞胺培南-50μg/ml萬古霉素-50μg/ml氟康唑-100μg/ml兩性霉素B 0.3μg/ml
Ⅱ 亞胺培南-50μg/ml萬古霉素-50μg/ml氟康唑-100μg/ml兩性霉素B0.6μg/mlⅢ 亞胺培南-50μg/ml萬古霉素-50μg/ml氟康唑-100pg/ml兩性霉素B1.0pg/mlⅣ 亞胺培南-50μg/ml萬古霉素-50μg/ml兩性霉素B0.3μg/mlⅤ 亞胺培南-50μg/ml萬古霉素-50μg/ml兩性霉素B 0.6μg/mlⅥ 亞胺培南-50μg/ml萬古霉素-50μg/ml兩性霉素B 1.0pg/ml選擇出所用的十種酵母分離菌，是因?yàn)樗鼈兙徽J(rèn)為具有臨床意義的人酵母分離菌。試驗(yàn)的十種酵母分離菌是1．深紅酵母(Rhodotorula rubra*)2．葡萄牙假絲酵母(Candida lusitaniae*)3．啤酒糖酵母(Saccharomyces cervisae*)4．羅侖氏隱球酵母(Cryptococcus laurentii*)5．季邊蒙氏假絲酵母(Candida guilliermondii*)6．光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata*)7．熱帶假絲酵母(Candida tropicalis*)8．白色假絲酵母(Candida albicans@)9．白吉利氏絲孢酵母(Trichosporon beigeli*)10．近平滑假絲酵母(Candida parasilosis*)*由美國病理學(xué)家學(xué)院提供@白色假絲酵母分離菌由捐獻(xiàn)組織獲得，其中此酵母分離菌在抗菌混合物溫育中存活。使用用于確定白色假絲酵母的病菌試管試驗(yàn)(Germ Tube Test)來證實(shí)所做的鑒定。病菌試管試驗(yàn)涉及用商業(yè)化制備的牛血清溶液(REMEL)制成分離菌的懸浮液。將此混合物在35℃下溫育2-4小時(shí)，并進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)。陽性病菌試管的確認(rèn)是有酵母芽細(xì)胞上生芽掉下的假菌絲形成(萌發(fā))。
將抗生素混合物用來將前述實(shí)施例中描述的十種單個(gè)的預(yù)先確定的生物負(fù)載酵母懸浮液進(jìn)行殺菌處理。將Sabouraud瓊脂板在計(jì)數(shù)前于35℃溫育5天，并在第7天再檢查一次有無任何其它酵母菌落生長(zhǎng)。由于抗真菌劑存在，酵母分離菌可能會(huì)受損，在恢復(fù)之后它可能會(huì)生長(zhǎng)。選擇5-7天溫育/計(jì)數(shù)期是為任一存活著的酵母分離菌提供最佳的恢復(fù)。
結(jié)果示于下文表格中。混合物Ⅲ對(duì)所有酵母分離菌表現(xiàn)出最大的殺真菌活性。24小時(shí)的酵母分離菌結(jié)果 (CFU/ml)
48小時(shí)時(shí)酵母分離菌結(jié)果(CFU/ml)
24和48小時(shí)后的混合物Ⅰ(0.3μg兩性霉素B)之比較
比較24小時(shí)后的混合物Ⅰ與48小時(shí)后的混合物Ⅰ，可看出酵母的常見耐藥現(xiàn)象。
24小時(shí)后的混合物Ⅰ和Ⅳ(0.3μg兩性霉素B加和不加氟康唑)之比較
在24小時(shí)后，不加氟康唑的混合物Ⅳ沒有加氟康唑的混合物Ⅰ有效。數(shù)據(jù)表明，二種抗真菌劑一起使用時(shí)給出協(xié)同效果。同樣參見前述實(shí)施例。
24小時(shí)后的混合物Ⅱ和Ⅴ(0.6μg兩性霉素B加和不加氟康唑)之比較
在24小時(shí)后，不加氟康唑的混合物Ⅴ沒有加氟康唑的混合物Ⅱ有效。數(shù)據(jù)表明，二種抗真菌劑一起使用時(shí)給出協(xié)同效果。同樣參見前述實(shí)施例。
24小時(shí)后的混合物Ⅲ和Ⅵ(1.0μg兩性霉素B加和不加氟康唑)之比較
在24小時(shí)后，不加氟康唑的混合物Ⅵ沒有加氟康唑的混合物Ⅲ有效。數(shù)據(jù)表明，二種抗真菌劑一起使用時(shí)給出協(xié)同效果。同樣參見前述實(shí)施例。實(shí)施例16使用下列抗生素混合物重復(fù)實(shí)施例15混合物 成分含量Ⅰ 亞胺培南-50μg/ml萬古霉素-50μg/ml氟康唑-100μg/ml兩性霉素B0.3μg/mlⅦ亞胺培南-50μg/ml萬古霉素-50μg/ml萘替米星-50μg/ml氟康唑-50μg/ml兩性霉素B1.0μg/mlⅧ亞胺培南-50μg/ml萬古霉素-50μg/ml萘替米星-50μg/ml氟康唑-100μg/ml兩性霉素B1.0μg/ml使用不同的酵母分離菌。選擇這些有機(jī)體是因?yàn)樗鼈円褟男难芫璜I(xiàn)組織中采集到。它們是11．白色假絲酵母(Candida albicans)12．白色假絲酵母(Candida albicans)13．白色假絲酵母(Candida albicans)14．白色假絲酵母(Candida albicans)15．白色假絲酵母(Candida albicans)16．酵母，非白色假絲酵母(yeast,not Candida albicans)17．酵母，非白色假絲酵母(yeast,not Candida albicans)18．白色假絲酵母(Candida albicans)19．酵母，非白色假絲酵母(yeast,not Candida albicans)20．酵母，非白色假絲酵母(yeast,not Candida albicans)。
使用病菌試管試驗(yàn)來進(jìn)行鑒定。在抗生素混合物中溫育24小時(shí)后的結(jié)果示于下列表格中(單位CFU/ml)。
加50μg/ml萘替米星(混合物Ⅶ和Ⅷ)對(duì)氟康唑和兩性霉性B的殺真菌活性無不利影響。將兩性霉素B的濃度由0.3μg/ml(混合物Ⅰ)增加到1.0μg/ml(混合物Ⅶ和Ⅷ)，顯示出更強(qiáng)的殺真菌活性。在存在1.0μg/ml兩性霉素B(混合物Ⅶ對(duì)混合物Ⅷ)時(shí)將氟康唑的濃度由100μg/ml降到50μg/ml，對(duì)殺真菌活性無大的影響。實(shí)施例17如美國專利4,890,457中所述，解剖來自223個(gè)捐獻(xiàn)者的心臟瓣膜。解剖的瓣膜用下文所列方法之一去污。
解剖時(shí)，準(zhǔn)備由大約一克組織組成的樣本兩組。一組樣本由前述方法D、E或F處理(如實(shí)施例12和13所述)。所剩的樣本組用單個(gè)抗生素混合物-一本發(fā)明混合物E處理。方法D抗生素混合物C時(shí)間/溫度12μg/ml亞胺培南22-26小時(shí)/37℃50μg/ml萬古霉素12μg/ml亞胺培南22-26小時(shí)/37℃50μg/ml萬古霉素+B62μg/ml利福平 22/26小時(shí)/37℃57μg/ml萘替米星114μg/ml萬古霉素136μg/ml頭孢氨噻136μg/ml林可霉素12μg/ml亞胺培南22-26小時(shí)/37℃50μg/ml萬古霉素+任選B62μg/ml利福平 22-26小時(shí)/37℃57μg/ml萘替米星114μg/ml萬古霉素136μg/ml頭孢氨噻136μg/ml林可霉素94-100μg/ml亞胺培南22-26小時(shí)/37℃50μg/ml萬古霉素57μg/ml萘替米星100μg/ml氟康唑1.0μg/ml兩性霉素B
如下進(jìn)行微生物分析。對(duì)于每一解剖的心臟，在解剖時(shí)制備三組組織樣本以代表用抗生素處理前的產(chǎn)物(處理前)和隨后進(jìn)行抗生處理(處理后)。取出的樣本是外部心肌組織片、二尖瓣或三尖瓣瓣膜片、接近主動(dòng)脈的和肺瓣膜的肌組織片，以及接納心臟的幾毫克溶液。
在解剖后，將處理前一組的樣本進(jìn)行微生物實(shí)驗(yàn)分析是否有微生物存在。所剩的二組樣本之一用方法D、E或F與心臟瓣膜一同處理。另一組用方法Z處理。
在每一處理期結(jié)束時(shí)，將樣本無菌收集，并送去進(jìn)行微生物實(shí)驗(yàn)分析。每一組樣本分別化檢。
通過將樣本倒入消毒塑料袋中來均化組織樣本，并放置入stomacher中30-60秒。均化的組織樣本在下列培養(yǎng)基中培養(yǎng)血瓊脂板；巧克力瓊脂板；血瓊脂板(厭氧的)；富巰基乙酸肉湯；加慶大霉素的Sabouraud瓊脂；和加血的Sabouraud心臟浸制瓊脂。
二種血瓊脂和巧克力瓊脂板在5-10％CO2的空氣中在35℃下溫育4天，并在第2天和第4天觀察。將巰基乙酸肉湯試管在35℃下溫育14天，并在頭7天每天觀察，之后定期觀察。Sabouraud瓊脂板在30℃下溫育，并將這些板在各頭周觀察2次，之后在第14天再觀察。
目測(cè)觀察培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。制備所有的陽性培養(yǎng)物和任一種陰性巰基乙酸肉湯的格蘭氏菌種，確定“陰性”目測(cè)觀察。利用可接受的現(xiàn)行微生物試驗(yàn)來確定陽性培養(yǎng)物。
微生物分析結(jié)果示于下文方法D對(duì)比方法H134心臟捐獻(xiàn)者方法D132個(gè)無生長(zhǎng)；2個(gè)分離出痤瘡丙酸桿菌；98％有效方法H134個(gè)無生長(zhǎng)；100％有效方法E對(duì)比方法H64心臟捐獻(xiàn)者 方法E60個(gè)無生長(zhǎng)；4個(gè)分離出酵母；94％有效方法H64個(gè)無生長(zhǎng)；100％有效方法F對(duì)比方法H
24心臟捐獻(xiàn)者方法F23個(gè)無生長(zhǎng)；組B中1個(gè)分離鏈球菌和腸桿菌種，96％有效方法H24個(gè)無生長(zhǎng)；100％有效總結(jié)果方法D,E,F 方法H216 無生長(zhǎng)，97％有效223無生長(zhǎng)，100％有效7 生長(zhǎng)方法H樣本中任何一個(gè)均未觀察到細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)。因此，在抑制細(xì)菌生長(zhǎng)以及酵母生長(zhǎng)上，混合物E優(yōu)于混合物B和C(使用單一的或組合的方法D、E和F)。方法H樣本中任何一個(gè)均未觀察到細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)。因此，在抑制細(xì)菌生長(zhǎng)以及酵母生長(zhǎng)上，混合物E優(yōu)于方法B和C(使用單一的或組合的方法D、E和F)。
前面的詳細(xì)描述旨在說明，而非限定，并應(yīng)當(dāng)理解正是下面的權(quán)利要求書(包括所有的等同物)才可限定本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1．一種去除組織污染的抗生素混合物，它包含抗真菌劑兩性霉素B和氟康唑；以及多種抗細(xì)菌劑；這些藥劑以基本上能抑制酵母和細(xì)菌生長(zhǎng)，而同時(shí)又基本上保持組織生存力的有效之量存在。
2．權(quán)利要求1的抗生素混合物，其中抗細(xì)菌劑包括萬古霉素和亞胺培南。
3．權(quán)利要求2的抗生素混合物，其中抗細(xì)菌劑還包括萘替米星。
4．權(quán)利要求1的抗生素混合物，其中兩性霉素B濃度為約0.3μg/ml至約2.0μg/ml，而氟康唑濃度為約50μg/ml至約100μg/ml。
5．權(quán)利要求4的抗生素混合物，其中抗細(xì)菌劑包括萬古霉素和亞胺培南。
6．權(quán)利要求5的抗生素混合物，其中萬古霉素濃度為約50μg/ml，而亞胺培南濃度為約10-100μg/ml。
7．權(quán)利要求6的抗生素混合物，其中兩性霉素B濃度為0.3μg/ml，氟康唑濃度為100μg/ml，萬古霉素濃度為50μg/ml，而亞胺培南濃度為96μg/ml。
8．權(quán)利要求5的抗生素混合物，其中抗細(xì)菌劑還包括萘替米星。
9．權(quán)利要求8的抗生素混合物，其中萬古霉素濃度約為50μg/ml，亞胺培南濃度為約10-100μg/ml，而萘替米星濃度為約20-50μg/ml。
10．權(quán)利要求9的抗生素混合物，其中兩性霉素B濃度為1.0μg/ml，氟康唑濃度為100μg/ml，萬古霉素濃度為50μg/ml，亞胺培南濃度為96μg/ml，而萘替米星濃度為50μg/ml。
11．一種去除組織污染的方法，包含將該組織與權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的抗生素混合物在基本上能抑制酵母和細(xì)菌生長(zhǎng)，而又同時(shí)保持組織生存力的有效溫度和持續(xù)時(shí)間條件下相接觸。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所述組織是心臟瓣膜、血管、心包或肌骨組織。
13．權(quán)利要求12的方法，其中溫度是35-39℃，持續(xù)時(shí)間是24-48小時(shí)。
全文摘要
一種用于組織消毒的抗生素混合物,包含抗真菌劑兩性霉素B和氟康唑和多種抗細(xì)菌劑。這些藥劑以基本上抑制真菌和細(xì)菌生長(zhǎng),而同時(shí)基本上保持組織的生存力的有效量存在。一種將組織消毒的方法,包含將組織與本發(fā)明的抗生素混合物在基本上能抑制酵母和細(xì)菌生長(zhǎng),而又同時(shí)保持組織生存力的有效溫度和持續(xù)時(shí)間下相接觸。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1219103SQ97194759
公開日1999年6月9日 申請(qǐng)日期1997年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月29日
發(fā)明者K·G·M·布羅克班, S·戈?duì)柎奶? C·阿多馬, J·K·舍爾頓, P·E·道森 申請(qǐng)人:克萊約生命公司