專利名稱：一種抗生素及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是通過培養(yǎng)具有保藏號為CGMCC NO.0703的不吸水鏈霉菌，得到一種新的抗生素及其應(yīng)用。
本發(fā)明的主要技術(shù)方案通過培養(yǎng)不吸水鏈霉菌(Streptomycesahygroscopicus)。再從其發(fā)酵液中分離、純化提取物，得到具有側(cè)鏈為-C4H9O9的氮取代胞苷的抗生素。
本發(fā)明的抗生素具有側(cè)鏈為-C4H9O9的氮取代胞苷、分子式為C13H21N3O14分子量為443的化合物，其結(jié)構(gòu)式為 通過紅外光譜、碳譜、氫譜測得具體側(cè)鏈為 的分子結(jié)構(gòu)式 本發(fā)明的抗生素的制備方法，包括以下過程(1)抗生素生物發(fā)酵培養(yǎng)將有機(jī)碳源、有機(jī)氮源、速效碳源、無機(jī)氮源、無機(jī)鹽以及水和不吸水鏈霉菌加入到容器中，培養(yǎng)不吸水鏈霉菌，在20-34℃下進(jìn)行一級發(fā)酵、兩級發(fā)酵或三級發(fā)酵，一級發(fā)酵時間45-100小時，兩級發(fā)酵時間分別為16-45小時、30-80小時，三級發(fā)酵時間分別為16-45小時、16-45小時、30-80小時，得到抗生素含量為1000-3500微克/毫升的培養(yǎng)物培養(yǎng)方法采用轉(zhuǎn)速為90-300轉(zhuǎn)/分的搖床震蕩培養(yǎng)或者采用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)罐壓維持0.02-0.10MPa、風(fēng)量比為1∶0.15-1∶1，攪拌轉(zhuǎn)速為50-300轉(zhuǎn)/分鐘接種量為2-15％(V/V)，所述的有機(jī)碳源為1-5％、有機(jī)氮源為0.2-5％、速效碳源0.5-4％、無機(jī)氮源0.2-1.5％、無機(jī)鹽0.01-1.0％，以上百分?jǐn)?shù)以水的重量為100計。
(2)抗生素的分離將步驟(1)收集的含抗生素的培養(yǎng)物，用草酸酸化到pH值為2.0，攪拌后靜置12-24小時后過濾，濾液經(jīng)顆?；钚蕴苛Ｃ撋?，活性炭柱流出液再用732#陽離子樹脂吸附，先用水先脫，再用0.5N氨水洗脫，流速0.5-3ml/分鐘，當(dāng)流出液pH值大于7.0后開始接收，濃縮接收液至，原體積的1/10-1/20再經(jīng)中性氧化鋁柱脫色，先用水洗脫，再用氨水洗脫，收集活性高的流出液濃縮至干，干粉用1-5毫升水溶解后上LH-20葡聚糖凝膠柱，用蒸餾水洗脫，流速0.5-1.5ml/分鐘，收集活性高的流出液濃縮至干，即得到抗生素含量為30-45％的粗制品。
(3)抗生素的純化將步驟(2)得到的粗制品經(jīng)葡聚糖凝膠G-25柱層析，水洗脫，流速為0.5-1.5ml/分鐘，經(jīng)高壓液相色譜(HPLC)檢查后將主要成份量在75％以上部分合并，然后冷凍干燥，再經(jīng)HPLC半制備柱進(jìn)行制備，得到抗生素含量達(dá)70-86％精制品。
步驟(1)所述的不吸水鏈霉菌包括不吸水鏈霉菌黃山變種。不吸水鏈霉菌黃山變種是從安徽省黃山土壤中分離得到的一株編號為2-16的能產(chǎn)生有生物活性物質(zhì)的鏈霉菌，經(jīng)分離鑒定，將該鏈霉菌定名為不吸水鏈霉菌黃山變種(Streptomyces ahygroscopicus var.huangsanensis)(石義萍等，微生物學(xué)報，3984-86，1999)。該菌株已交中國科學(xué)院微生物所菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCC NO.0703。該菌株的傳代培養(yǎng)采用高氏合成一號瓊脂培養(yǎng)基(中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)編菌種目錄，第三版，中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1997年)步驟(1)所述的有機(jī)碳源包括玉米粉、糊精、山芋淀粉，可溶性沉粉、小麥粉；所述的有機(jī)氮源包括黃豆粉、花生餅粉、棉籽餅粉、菜籽餅粉、黃豆餅粉、蠶蛹粉、酵母粉、酵母膏、魚粉、蛋白胨，所述速效碳源包括麥芽糖、葡萄糖、蔗糖，所述的無機(jī)氮源包括硝酸銨、硫酸胺、氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀，所述的無機(jī)鹽包括硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、氯化鈉。
本發(fā)明的抗生素的生物活性檢測以巨大芽孢桿菌ACCC10008(Bacillus megatherium)(中國普通微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心編中國農(nóng)業(yè)菌種目錄，中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1991年)為檢測菌，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基20％土豆汁，2％葡萄糖，0.8％瓊脂)為檢測培養(yǎng)基，采用管碟法檢測抗生素的生物活性。
本發(fā)明的抗生素的應(yīng)用方法含抗生素的發(fā)酵培養(yǎng)物、粗制品或精制品均可用于防治農(nóng)作物真菌病害，可直接使用或添加助劑或與其它農(nóng)藥混合使用，直接使用時通常用水稀釋至使用濃度為25-200微克/毫升。對于含抗生素為1000-3500微克/毫升的不吸水鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)物，在田間使用時，將發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)過濾得到的濾液經(jīng)減壓濃縮至原液的1/8-1/3倍，濃縮溫度40-70℃，制得濃縮液，或者通過噴霧干燥方法制得粉劑，濃縮液或粉劑可直接使用，也可添加助劑或與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)農(nóng)藥或生物農(nóng)藥混合使用，對于不同的農(nóng)作物、不同部位發(fā)病部位采用不同方法和不同濃度對葉、莖部病害，常對濃縮液加水稀釋使用，用稀釋100-400倍的藥液噴霧，蔬菜病害一般噴2-3次，間隔期7-10天；對種傳病害常進(jìn)行種子消毒，一般用50-100倍水稀釋后的藥液浸種1-24小時；對苗床、營養(yǎng)缽，可采用100-250倍水稀釋后的藥液進(jìn)行土壤消毒，對土傳病害以藥液灌根；對果樹莖部病害可直接用濃縮液對患部進(jìn)行涂抹。本發(fā)明的抗生素用于防治真菌病害效果較好，對各種作物真菌病害防治效果有一定差異，一般在60-99％之間。
本發(fā)明的抗生素切忌與強(qiáng)酸、強(qiáng)堿混用。噴施抗生素的時間以晴天、陰天為宜，不要在大雨前后或露水未干以及陽光強(qiáng)烈的中午噴藥。貯存地點應(yīng)選擇在通風(fēng)、干燥、陽光不直接照射的地方，在低溫條件下貯存，可大大延長貯存期。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果本發(fā)明的抗生素是一種結(jié)構(gòu)不同于已知的任何核苷類抗生素一種新的抗生素，用于防治農(nóng)作物真菌病害效果較好，一般防治效果為60-99％。例如防治黃瓜白粉病，防治效果為91％以上，防治番茄葉霉病可達(dá)86.93％，而且與化學(xué)農(nóng)藥相比，產(chǎn)品無毒，不污染環(huán)境，是一種無公害的生物農(nóng)藥。綜上所述，本發(fā)明提供了一種自行開發(fā)研究的具有高效、廣譜、低毒特性的用于防治農(nóng)作物病害的新的抗生素，對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展有著重要意義。
實例中附圖簡要說明

圖1是本發(fā)明抗生素(a)以及殺稻瘟菌素S(b)、多氧霉素(c)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；圖2是本發(fā)明抗生素的質(zhì)譜圖；圖3是本發(fā)明抗生素的紅外吸收光譜；圖4是本發(fā)明抗生素的碳譜圖(13C-NMR)；圖5是本發(fā)明抗生素的碳譜圖(DEPT)；圖6是本發(fā)明抗生素的氫譜圖(DMSO)；圖7是本發(fā)明抗生素的氫譜圖(D2O交換)。
實例1本實例采用搖床震蕩方法進(jìn)行抗生素生物發(fā)酵培養(yǎng)。
在含黃豆粉2％，葡萄糖3％，可溶性淀粉1％，酵母膏0.2％，MgSO4·7H2O0.05％、CaCO30.7％的培養(yǎng)基中接種保藏號為CGMCC NO.0703的不吸水鏈霉菌，24℃搖床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘，先培養(yǎng)45小時，再按10％的接種量接種到相同的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)80小時。
實例2
本實例采用液體深層發(fā)酵方法進(jìn)行抗生素生物發(fā)酵培養(yǎng)。
在含黃豆餅粉5％、葡萄糖1％，可溶性淀粉2％，蛋白胨0.2％，NaCl0.2％，(NH4)2SO4·7H2O 0.25％，MgSO4·7H2O 0.05％、K2HPO40.02％、CaCO30.8％的培養(yǎng)基中接種保藏號為CGMCC NO.0703的不吸水鏈霉菌，34℃液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘，通氣1∶0.9，罐壓0.10Mpa，培養(yǎng)45小時。
實例3本實例是對抗生素的生物活性檢測將3ml PDA固體培養(yǎng)基置于15×150mm試管中，滅菌后擺放成3.5cm長的斜面；于斜面上接種巨大芽孢桿菌ACCC10008，28℃培養(yǎng)1天，用50ml帶玻璃珠的無菌水將斜而上的菌體洗下，并將菌體打散混勻，制成菌懸液，按1-5％的加量將菌懸液加至PDA培養(yǎng)基中，于直徑15厘米的培養(yǎng)皿中倒入該PDA菌液60-100毫升，同時，用濾紙過濾實例1或?qū)嵗?的培養(yǎng)液，收集濾液用于測定，待含有ACCC10008的PDA平板凝同后，用管碟法測定樣品的抑菌活性。
實例4本實例是抗生素的分離和純化。
從實例1和實例2收集的發(fā)酵培養(yǎng)物，分別用0.5-1％草酸酸化到pH2.5，攪拌后靜置過夜，過濾；濾液經(jīng)顆粒活性炭柱脫色，活性碳流出液用732#陽離子樹脂柱吸附，先用水洗脫，再用0.5N氨水洗脫，流速2ml/分鐘，當(dāng)流出液pH值大于7.0后開始接收，濃縮接收液到原體積的1/10-1/20(30-50ml)；再過中性氧化鋁柱脫色，先用水洗脫，再用3％氨水洗脫，收集活性高的流出液深縮至干；干粉用少量水(1-5毫升)溶解，上LH-20葡聚糖凝膠柱，用蒸餾水洗脫，流速1ml/分鐘，收集活性高的流出液濃縮到干，即得粗品；粗品經(jīng)葡聚糖凝柱G-25柱層析，水洗脫，洗脫速度1ml/分鐘，經(jīng)HPLC檢測后將主要成分含量在75％以上部分合并，冷凍干燥后再經(jīng)HPLC半制備柱進(jìn)行制備，制備后可得到含抗生素86％的精制品。經(jīng)常規(guī)分析，本發(fā)明的抗生素的理化性質(zhì)冷干物為微黃色粉末，易吸潮，熔點239℃(碳化)，極易溶于水，微溶于甲醇，不溶于丙酮、氯仿、吡啶等有機(jī)溶劑。
實例5本實例是對本發(fā)明的抗生素的結(jié)構(gòu)鑒定。
根據(jù)高分辨質(zhì)譜，確定抗生素的分子量為443(見圖2)，元素分析表明，本發(fā)明抗生素分子中含有C，H，N及O原子(C31.94％，H4.73％，N11.7％)，根據(jù)氮規(guī)則，推算其分式為C13H21N3O14紫外吸收光譜顯示出典型的核苷類抗生素的特征吸收峰(單峰)λmax(H2O)269.4nm，λmax(0.1NNaOH)265.8nm，λmax(0.1N HCL)275.0nm。經(jīng)過各種光譜的綜合分析，比較本發(fā)明的抗生素和胞苷碳原子化學(xué)位移后，確定本發(fā)明抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)為具有一含過氧鍵側(cè)鏈的氮取代胞苷，本發(fā)明抗生素與胞苷碳原子化學(xué)位移對照如下


本發(fā)明抗生素 胞苷

紅外光譜3350cm-1處非平滑的寬峰說明本發(fā)明抗生素A中除存在-NH-外，還有羥基存在(圖3)。本發(fā)明抗生素的分子式為C13H21N3O14，不飽和度為5，故-NH-上所連-C4H9O9為飽和側(cè)鏈。從碳譜(圖4、5)中可得出該側(cè)鏈上的碳原子信息，其化學(xué)位移(ppm)分別為58.3(-CH-)，55.9(-CH-)，52.1(-CH2-)，35.5(-CH3-)，根據(jù)氫譜(圖6DMSO，圖7 D2O交換)可得出活潑氫的信息，低場9ppm處為過氧鍵上所連氫(C-O-O-H)的化學(xué)位移，而紅外光譜中839cm-1、1134cm-1兩個吸收峰也提示有過氧鍵的存在。綜合以上信息，得出側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)為

綜合以上結(jié)論，本發(fā)明抗生素的結(jié)構(gòu)式如附圖1(a)。圖1(b)為殺稻菌素S(Blasticidin S)結(jié)構(gòu)。圖1(c)為多氧霉素(Polyoxins)結(jié)構(gòu)圖。其中多氧霉素結(jié)構(gòu)圖中的R1、R2、R3數(shù)值見下表PolyoxinR1R2R3A CH2OH OHB CH2OH OH OHD COOH OH OHE COOH OH HF COOHOHG CH2OH OH HH CH3OHJ CH3OH OHK H OHL HOH OHM HOH H實例6本實例是本發(fā)明抗生素的毒性試驗。
將含量為10000微克/毫升的本發(fā)明抗生素的濃縮液用于進(jìn)行毒性試驗，根據(jù)天津市化學(xué)品毒性檢定所的試驗結(jié)果，本發(fā)明的抗生素對大鼠急性經(jīng)口毒性最大耐受量，LD50＞5000mg/kg，屬低毒；對大鼠急性經(jīng)皮毒性最大耐受量LD50＞2000mg/kg，屬低毒；對家兔眼刺激試驗，其眼刺激強(qiáng)度無刺激性級，對家兔急性皮膚試驗，其皮膚刺激強(qiáng)度屬無剌激性級。安全可靠。
實例7本實例為本發(fā)明的田間農(nóng)作物應(yīng)用實施例。
將實例1收集的發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)過濾得到濾液，減壓濃縮至原液的1′5倍，濃縮溫度為65℃，濃縮液本發(fā)明抗生素為含量10000微克/毫升，用于防治黃瓜白粉病、番茄葉霉病、油菜菌核病和草霉灰霉菌。
(1)防治黃瓜的白粉病黃瓜白粉病(Spharotheca fuliginea)是黃瓜主要病害之一，一般造成減產(chǎn)10-20％，嚴(yán)重的達(dá)50％以上。濃縮液用150倍的水稀釋噴霧，每畝噴200斤水，防治效果為91.46％，同時使用的化學(xué)農(nóng)藥粉銹寧稀釋500倍，防治效果96.36％。
(2)防治番茄葉霉病番茄葉霉病(Cladosporium fulvum)是番茄主要病害之一。濃縮液分別用200倍、250倍的水稀釋后噴霧，每畝噴200斤水，防治效果分別為86.93％、83.07％，使用的對照農(nóng)藥為75％代森錳鋅用300倍水稀釋，防治效果63.41％。
(3)防治油菜菌核病油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)是油菜最主要病害，一般造成減產(chǎn)11-73％，含油量降低1-5％。將濃縮液用水稀釋100倍、150倍、200倍，在油菜盛花期噴霧防治油菜菌核病，噴藥1次，每畝噴150斤水，防治效果分別為82.6％、78.1％、69.8％；同時使用的化學(xué)農(nóng)藥36％粉霉靈懸浮劑100ml/667m2、40％治萎靈可濕性粉劑60g/667m2，防治效果分別為94.4％和66.1％。
(4)防治草莓灰霉病草莓灰霉病是草莓主要病害之一。用濃縮液稀釋100倍防治草莓灰霉病，在草莓發(fā)病初期噴藥，每畝噴100斤水，防治效果為65.37％。
權(quán)利要求
1.一種抗生素，其特征在于具有-C4H9O9側(cè)鏈的氮取代胞苷、分子式為C13H21N3O14的抗生素，其分子結(jié)構(gòu)式為
2.按照權(quán)利要求1所述的抗生素，其特征在于分子結(jié)構(gòu)為
3.權(quán)利要求1所述的抗生素的制備方法，包括以下步驟(1)抗生素生物發(fā)酵培養(yǎng)將有機(jī)碳源、有機(jī)氮源、速效碳源、無機(jī)氮源、無機(jī)鹽以及水和不吸水鏈霉菌加入到容器中，培養(yǎng)不吸水鏈霉菌，在20-34℃下進(jìn)行一級發(fā)酵、兩級發(fā)酵或三級發(fā)酵，一級發(fā)酵時間45-100小時，兩級發(fā)酵時間分別為16-45小時、30-80小時，三級發(fā)酵時間分別為16-45小時、16-45小時、30-80小時，得到抗生素含量為1000-3500微克/毫升的培養(yǎng)物；培養(yǎng)方法采用轉(zhuǎn)速為90-300轉(zhuǎn)/分的搖床震蕩培養(yǎng)或者采用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)罐壓維持0.02-0.10MPa、風(fēng)量比為1∶0.15-1∶1，攪拌轉(zhuǎn)速為50-300轉(zhuǎn)/分鐘；接種量為2-15％(V/V)，所述的有機(jī)碳源為1-5％、有機(jī)氮源為0.2-5％、速效碳源0.5-4％、無機(jī)氮源0.2-1.5％、無機(jī)鹽0.01-1.0％，以上百分?jǐn)?shù)以水的重量為100計。(2)抗生素的分離將步驟(i)收集的含抗生素的培養(yǎng)物，用草酸酸化到pH值為2.0，攪拌后靜置12-24小時后過濾，濾液經(jīng)顆?；钚蕴苛Ｃ撋?，活性炭柱流出液再用732#陽離子樹脂吸附，先用水先脫，再用0.5N氨水洗脫，流速0.5-3ml/分鐘，當(dāng)流出液pH值大于7.0后開始接收，濃縮接收液至原體積的1/10-1/20，再經(jīng)中性氧化鋁柱脫色，先用水洗脫，再用氨水洗脫，收集活性高的流出液濃縮至干，干粉用1-5毫升水溶解后上LH-20葡聚糖凝膠柱，用蒸餾水洗脫，流速0.5-1.5ml/分鐘，收集活性高的流出液濃縮至干，即得到抗生素含量為30-45％的粗制品。(3)抗生素的純化將步驟(2)得到的粗制品經(jīng)葡聚糖凝膠G-25柱層析，水洗脫，流速為0.5-1.5ml/分鐘，經(jīng)高壓液相色譜(HPLC)檢查后將主要成份量在75％以上部分合并，然后冷凍干燥，再經(jīng)HPLC半制備柱進(jìn)行制備，得到抗生素含量達(dá)70-86％精制品。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的不吸水鏈霉菌包括不吸水鏈霉菌黃山變種(Streptomyces ahygroscopicus var.huangsanensis)。
5.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的有機(jī)碳源包括玉米粉、糊精、山芋淀粉，可溶性淀粉、小麥粉；所述的有機(jī)氮源包括黃豆粉、花生餅粉、棉籽餅粉、菜籽餅粉、黃豆餅粉、蠶蛹粉、酵母粉、酵母膏、魚粉、蛋白胨，所述的速效碳源包括麥芽糖、葡萄糖、蔗糖，所述的無機(jī)氮源包括硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀，所述的無機(jī)鹽包括硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、氯化鈉。
6.權(quán)利要求1所述的抗生素應(yīng)用方法，其特征在于含抗生素的不吸水鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)物、粗制品或精制品，用于防治農(nóng)作物真菌病害可直接使用或添加助劑或與其它農(nóng)藥混合使用，使用時用水稀釋至使用濃度為25-200微克/毫升。
7.按照權(quán)利要求6所述的應(yīng)用方法，其特征在于含抗生素為1000-3500微克/毫升的不吸水霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)物，田間應(yīng)用時，發(fā)酵培養(yǎng)物要經(jīng)過濾且在40-70℃下減壓濃縮得到濃縮液或噴霧干燥制成干粉，對葉、莖病害，用濃縮液重量的100-400倍的水稀釋濃縮液，得到的藥液進(jìn)行噴霧，蔬菜病害噴2-3次，間隔期7-10天；對種傳病害，用50-100倍水稀釋后的藥液浸種1-24小時；對苗床、營養(yǎng)缽，用100-250倍水稀釋后的藥液進(jìn)行土壤消毒；對土傳病毒，用100-250倍水稀釋的藥液灌根；對果樹莖部病害直接用濃縮液對患部進(jìn)行涂抹。
全文摘要
本發(fā)明是一種抗生素，其特點是通過培養(yǎng)不吸水鏈霉菌(Streptomyces ahygroscopicus)，再從其發(fā)酵液中分離、純化提取物，得到具有－C
文檔編號C12P19/38GK1436787SQ0210087
公開日2003年8月20日 申請日期2002年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月4日
發(fā)明者曾洪梅, 石義萍, 張克誠, 張震霖, 林德炘, 劉澤銀 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所