專利名稱：用透明質(zhì)酸和生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨生長(zhǎng)的方法
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸是一種天然存在的多糖，包含有以β1-4鍵連接的交替的N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸單糖單位，以及以β1-3糖苷鍵連接的雙糖單位。它通常是作為鈉鹽存在，具有大約50000-8×106的分子量范圍。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種促進(jìn)骨生長(zhǎng)的組合物，由于它含有透明質(zhì)酸和生長(zhǎng)因子，使該組合物具有粘滯性和生物可降解性，足以使它在所需要的骨生長(zhǎng)部位保持足以促進(jìn)骨生長(zhǎng)的一段時(shí)間。
提供了幾種含有透明質(zhì)酸和生長(zhǎng)因子的，具有必要粘滯性和生物可降解性的組合物。
在此所用的名詞“透明質(zhì)酸”縮寫(xiě)為HA，它的含意包括透明質(zhì)酸及其鹽，如鈉鹽，鉀鹽，鎂鹽，鈣鹽等。
在此生長(zhǎng)因子意指那些被發(fā)現(xiàn)對(duì)誘導(dǎo)或引導(dǎo)骨、韌帶、軟骨或者與骨或關(guān)節(jié)有關(guān)的其它組織生長(zhǎng)起作用的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)因子。
這些生長(zhǎng)因子特別包括bGFG,aFGF,EGF(表皮生長(zhǎng)因子)，PDGF(血小板衍生生長(zhǎng)因子)，IGF(胰島素樣生長(zhǎng)因子)，GF-βⅠ至Ⅲ，包括TGF-β超家族(BMP-1至12,GDF1至12,dpp,60A,BIP,OF)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是表示在下面實(shí)施例1中所述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的曲線，圖1A顯示所形成的骨厚度是bFGF劑量的函數(shù)，圖1B顯示骨厚度的形成是作為透明質(zhì)酸濃度的函數(shù)。
圖2是表示在下面實(shí)施例2中所述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的柱狀圖。
圖3表示根據(jù)實(shí)施例3治療，23天和30天之后愈合兔腓骨的斷裂壓力。
圖4表示根據(jù)實(shí)施例3治療，23天和30天之后愈合兔腓骨的沖擊韌性(磅)。
圖5表示大鼠根據(jù)實(shí)施例4處理之后的骨厚度數(shù)據(jù)。
優(yōu)選實(shí)施方案描述將對(duì)該組合物的配制及其使用方法作更詳細(xì)地描述。
優(yōu)選的HA是未交聯(lián)的，具有500,000及以上的分子量，典型的分子量范圍是104-107。這種骨生長(zhǎng)促進(jìn)組合物一般是在水溶液中含有大約0.1-4％重量的未交聯(lián)HA，為了保持生長(zhǎng)因子的生物活性，并維持組合物的適當(dāng)pH，此水溶液中還含有其它的溶液賦形劑，如緩沖劑鹽，糖，抗氧化劑和防腐劑。優(yōu)選的組合物含有大約0.1-2％重量的未交聯(lián)HA。該溶液典型的pH范圍是4-9，優(yōu)選地是大約6.0±1.0，而最優(yōu)選地是大約5.0。
生長(zhǎng)因子在該溶液中存在的典型濃度范圍是大約10-6-100mg/ml，特別在用bFGF時(shí)，優(yōu)選地是大約0.1-20mg/ml。該濃度應(yīng)取決于特定骨的部位和功能，以及注入的體積和生長(zhǎng)因子的比活性。
重要的是，用于促進(jìn)骨生長(zhǎng)的溶液應(yīng)具有一定的粘滯度，使之既能通過(guò)注射器或?qū)Ч茏⑸?，但是在發(fā)揮骨生長(zhǎng)促進(jìn)作用之前又不會(huì)過(guò)早地被體液稀釋。優(yōu)選地，該組合物的粘滯度是在10-106cP(厘泊)的范圍內(nèi)，對(duì)于含有bFGF的組合物，優(yōu)選地是大約75,000cP。
對(duì)此組合物同樣重要的是具有生物可降解性，它足以使該組合物能保留在所需要的骨生長(zhǎng)部位，發(fā)揮骨生長(zhǎng)促進(jìn)活性。
該組合物通常必須在所需要的骨生長(zhǎng)部位保持大約3-30天的時(shí)間，一般是3-14天。如果該組合物過(guò)早地被散開(kāi)了，所希望的骨生長(zhǎng)促進(jìn)作用不是還未發(fā)生，就是所形成的骨沒(méi)有理想的強(qiáng)度。
如果該組合物在所需要的骨生長(zhǎng)部位保持過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間，它在骨該部位的存在就可能會(huì)抑制骨的自然形成，有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致完全沒(méi)有骨形成。
該組合物一般是通過(guò)在適量的賦形劑如檸檬酸鈉，EDTA和蔗糖中混合HA和生長(zhǎng)因子，配制成溶液，以便HA和生長(zhǎng)因子能以所需要的濃度保留在溶液中，并且使溶液表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)恼硿院蜕锟山到庑??？山柚谌魏伪憷姆绞綄⒋巳芤菏┯糜谒枰墓巧L(zhǎng)部位，一般是通過(guò)注射器或?qū)Ч軐?dǎo)入。
給予本發(fā)明的骨生長(zhǎng)組合物，對(duì)于加速創(chuàng)傷愈合，防止在傷害發(fā)生之后的進(jìn)一步組織損傷，消除危害自然愈合過(guò)程的處理，以及為愈合創(chuàng)造最佳的物理學(xué)和生物學(xué)條件，都可能是理想的。所要求的骨生長(zhǎng)部位包括如下骨折部位脛骨/腓骨骨折；股骨/肱骨骨折；前臂骨折；后位移遠(yuǎn)端橈骨(Colles)骨折；應(yīng)力性骨折，包括與脛骨夾板有關(guān)的運(yùn)動(dòng)性骨折，以及腳骨損傷；椎骨壓迫性骨折，肋骨骨折，和鎖骨骨折。所要求的骨生長(zhǎng)部位還包括與下列狀態(tài)有關(guān)的病理性骨缺損部位骨質(zhì)疏松，骨軟化癥，甲狀旁腺分泌過(guò)多，腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良，以及原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性骨癌。
將以下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的描述，提供這些實(shí)施例是為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，而不打算對(duì)權(quán)利要求中列舉的發(fā)明內(nèi)容加以限制。
實(shí)施例1將透明質(zhì)酸鈉(Genzyme,MW 2×106，無(wú)菌，在1％溶液中的粘滯度為6500cP)和bFGF(Scios-Nova，在9％蔗糖，20mM檸檬酸鈉和1mM EDTA溶液(pH 5)中，4.3mg/ml)混合。通過(guò)將過(guò)濾除菌的bFGF溶液以及其它賦形劑(檸檬酸鈉，水等)與適量無(wú)菌的固體HA混合構(gòu)成制劑。迅速使HA分散開(kāi)，通過(guò)用注射器前后反復(fù)沖注，防止形成大顆粒凝塊。無(wú)菌操作配制制劑，用帶有21G針頭預(yù)先充灌的1ml塑料注射器，對(duì)以乙酰丙嗪，甲苯噻嗪和氯胺酮麻醉的雄性Sprague-Dawley大鼠(8-9周齡，160-180克)給藥。對(duì)頸后皮膚橫面作一個(gè)5-10mm的切口，用于定位矢狀縫和人字形縫的交點(diǎn)。以21G針頭在骨膜和頂骨之間注射待測(cè)制劑50微升。給藥后14天將動(dòng)物無(wú)痛苦處死。
用于組織學(xué)分析的組織固定在以中性緩沖液配制的10％甲醛液中。在甲酸(RapidBone Decal)中對(duì)組織脫鈣處理至少2小時(shí)，同時(shí)不斷地緩慢攪動(dòng)。再將樣品脫水，并用石蠟滲透。然后按橫切面方向?qū)悠钒?，并?μm的切片。用蘇木精和曙紅對(duì)切片染色，用于組織學(xué)分析。按照如表1中所示的0-4記分法，對(duì)新骨形成進(jìn)行評(píng)分。
表1對(duì)骨膜下注射后頂骨上網(wǎng)織狀新骨形成的定性描述
以類似于Nada et al.,Endocrinology,124:2991-4,1989中的方法測(cè)定總的頂骨厚度。對(duì)每塊組織學(xué)切片，在矢狀縫側(cè)面2-3mm的部位(大約是矢狀縫與切片邊緣之間的中點(diǎn))拍攝照片。在照片的左，中，右側(cè)取得了整塊骨的三個(gè)骨厚度測(cè)定數(shù)據(jù)，并進(jìn)行評(píng)分，用于確定總的骨厚度。在此測(cè)定中既包括致密的皮層骨，也包括網(wǎng)織狀新骨。
所有組對(duì)每種處理的反應(yīng)在相同處理組中各動(dòng)物之間是一致的。定性測(cè)定表明，以各種bFGF/HA凝膠制劑處理的動(dòng)物組顯示出新骨形成，而以安慰劑處理的和生長(zhǎng)對(duì)照動(dòng)物顯示出極微量的新骨形成或者沒(méi)有新骨形成(表2)。顯然，此項(xiàng)研究所測(cè)定的各種bFGF/HA制劑之間僅存在微小的差異。但是，看來(lái)確實(shí)存在劑量反應(yīng)性作用(圖1A,1B)。
表2接受骨膜下注射bFGF制劑的動(dòng)物，處理后14天組織學(xué)評(píng)分(表1)的定性結(jié)果
表3顯示接受不同制劑骨膜下注射后，大鼠顱蓋的總的骨厚度。含有bFGF和HA的所有制劑部表現(xiàn)出有新骨形成。表3中的頭二行數(shù)據(jù)表示平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果。接受配制在2％HA凝膠中的100μg bFGF的二平行試驗(yàn)動(dòng)物組，總的頂骨厚度在第一試驗(yàn)組是0.49±0.10，在第二試驗(yàn)組是0.59±0.12，有17％的差異。但是，二組動(dòng)物總的骨厚度與對(duì)照相比較，定性和定量測(cè)定都有顯著的差異。與未接受制劑處理的動(dòng)物相比較，含有100μg bFGF和HA的所有制劑都使新骨形成至少增加了61％。
圖1A和1B顯示bFGF和HA的濃度對(duì)總的骨厚度的作用。當(dāng)bFGF的劑量從10μg增加至100μg，總的骨厚度從0.45mm增加至0.54mm，增加了20％。當(dāng)HA的濃度增加，可見(jiàn)總的骨形成也隨之增加，直至接近0.5％HA出現(xiàn)最大的骨形成增加為止，在0.5％以上繼續(xù)增加HA的濃度，不引起由bFGF在此模型中誘導(dǎo)出的新骨形成進(jìn)一步增加(圖1B)。
表3試驗(yàn)處理后14天大鼠顱蓋骨切片的總的骨厚度，切片位置在人字形縫尖前2mm，矢狀縫側(cè)2-3mm。骨厚度是對(duì)每只動(dòng)物3次測(cè)定結(jié)果的平均數(shù)。n是平行試驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)目，增加百分?jǐn)?shù)表示超過(guò)生長(zhǎng)對(duì)照的相對(duì)增加。
因此可見(jiàn)，單次骨膜下注射在HA凝膠中的100μg bFGF，表現(xiàn)出對(duì)膜內(nèi)骨形成顯著超過(guò)對(duì)照的定性和定量作用。給藥后14天，對(duì)于用配制在HA凝膠中的100μg bFGF處理的動(dòng)物，在注射位置新骨形成達(dá)到111％。所有的安慰劑組和對(duì)照組在注射后14天，骨厚度增加都小于18％。當(dāng)bFGF的劑量從10μg增加至100μg，總的骨厚度從0.45mm增加至0.54mm，增加了20％。在0.5％以上繼續(xù)增加HA的濃度，不引起由bFGF在此模型中誘導(dǎo)出的新骨形成進(jìn)一步增加。
實(shí)施例2用8個(gè)不同的制劑進(jìn)行實(shí)施例1中所述的試驗(yàn)。bFGF和透明質(zhì)酸共同使用作為與其它7個(gè)組合物的對(duì)比，這些組合物中bFGF是與其它載體一起使用，或者這些載體是單獨(dú)使用作為安慰劑。結(jié)果概括顯示在如下圖2和表4中。
表4具有不同骨形成評(píng)分的動(dòng)物總數(shù)
*非荷電多糖實(shí)施例3如在實(shí)施例1中配制透明質(zhì)酸鈉(2％)和bFGF(4mg/ml)的制劑，用于對(duì)兔骨折部位給藥。還配制了一種制劑，含有4mg/ml bFGF，6mg/ml兔纖維蛋白原，0.2mg/ml抑酶肽，以及用于保持pH和穩(wěn)定性的其它賦形劑。這種纖維蛋白原制劑類似于以前報(bào)導(dǎo)的用于骨折修復(fù)的組合物1。對(duì)新西蘭白兔在腓骨骨干中段通過(guò)外科手術(shù)制造一個(gè)1mm的斷裂口，用于構(gòu)成骨折模型。這種實(shí)驗(yàn)方法以前曾被用于檢驗(yàn)兔骨折的愈合2。用50μl HA/bFGF制劑，或50μl纖維蛋白原/bFGF制劑對(duì)動(dòng)物進(jìn)行治療，或者不給治療。
在治療后23天，借助于四點(diǎn)彎曲技術(shù)(four point bendingtechnique)對(duì)每個(gè)治療組的10根治愈腓骨測(cè)定其機(jī)械強(qiáng)度。圖3表示各組的斷裂壓力(load at failure)未治療的腓骨，HA/bFGF治療的腓骨，和纖維蛋白原/bFGF治療的腓骨。HA/bFGF治療的腓骨比未治療的對(duì)照強(qiáng)53％，而纖維蛋白/bFGF治療的腓骨比未治療的對(duì)照強(qiáng)30％。圖4顯示全部三個(gè)治療組的沖擊韌性(energy to failure)。這種測(cè)定表明，HA/bFGF治療的腓骨比未治療的對(duì)照強(qiáng)43％，而纖維蛋白/bFGF治療的腓骨比未治療的對(duì)照弱3％。
此外，還在治療后30天測(cè)定了10根未治療腓骨和10根HA/bFGF治療腓骨的機(jī)械強(qiáng)度。圖3顯示，HA/bFGF治療的動(dòng)物與對(duì)照相比較，骨斷裂壓力高36％，并且這種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P=0.02)。圖4表明，HA/bFGF組與對(duì)照相比較，骨沖擊韌性高79％，并且這種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P=0.01)。圖3和圖4還表明，與未治療的腓骨相比較，HA/bFGF治療腓骨的強(qiáng)度能更快地恢復(fù)到未損害骨的強(qiáng)度，表明能加速骨愈合。
1.Hiroshi Kawaguchi,et al.，重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)正常和鏈脲佐菌素-糖尿病大鼠骨折修復(fù)的促進(jìn)作用，Endocrinology,135:774-781,1994。
2.A.A.Pilla,et al.，非損傷性低強(qiáng)度脈沖超聲波加速兔骨愈合，Journal of Orthopaedic Trauma,4:246-253,1990。
實(shí)施例4用實(shí)施例1中的方法比較如下各制劑總的骨形成作用實(shí)施例1中的HA/bFGF制劑，實(shí)施例3中的纖維蛋白/bFGF制劑，以及在蔗糖/檸檬酸鹽緩沖水溶液中的bFGF制劑。以含有100μg bFGF的每種制劑50μl作骨膜下注射給藥，給藥后7天和14天處死動(dòng)物。另外用不給予治療的動(dòng)物作對(duì)照。
四組中的每一組動(dòng)物之間對(duì)每種處理的反應(yīng)非常一致。在第7天，所有bFGF處理的動(dòng)物顯示有對(duì)bFGF反應(yīng)在顱蓋骨上形成的膜內(nèi)骨。對(duì)照動(dòng)物顯示出極微量的，或者沒(méi)有新骨形成。定性測(cè)定表明，以配制在HA凝膠中的bFGF制劑處理的動(dòng)物組，比以任何其它的bFGF制劑處理的動(dòng)物組，有更多的新骨形成。對(duì)于第14天的樣品，在bFGF/HA凝膠處理的動(dòng)物中骨形成量的差異甚至更明顯。盡管在所有bFGF處理的動(dòng)物中都有新骨形成，然而，顯而易見(jiàn)的是，bFGF/HA凝膠處理的動(dòng)物與任何其它處理組動(dòng)物相比較，形成了厚得多的骨體。
圖5顯示骨厚度的定量測(cè)定結(jié)果。處理后第7天，給予配制在2％HA凝膠中的100μg bFGF的動(dòng)物與未受到處理的動(dòng)物(即對(duì)照)相比較，骨厚度增加了95％。對(duì)于用配制在纖維蛋白凝膠中的bFGF和配制在檸檬酸鹽緩沖水溶液中的bFGF處理的其它bFGF處理組，骨形成分別增加了86％和55％。
在第14天，對(duì)于用配制在HA凝膠中的100μg bFGF處理的動(dòng)物，新骨形成增加了111％(圖5)。對(duì)于用配制在纖維蛋白凝膠中的bFGF和配制在檸檬酸鹽緩沖水溶液中的bFGF處理的其它bFGF處理組大鼠，骨形成分別只有25％和21％的增加。
實(shí)施例5通過(guò)對(duì)大鼠頂骨作骨膜下注射，測(cè)定了堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)制劑中透明質(zhì)酸的分子量對(duì)膜內(nèi)骨形成的作用。材料和方法將具有分子量760-2300 KDa的HA(從Genzyme和LifecoreBiomedical得到)用于配制制劑。bFGF是以冷凍液(4.3mg/ml)的形式獲得(Scios-Nova)，是被冷凍在調(diào)整至pH 5.0的9％蔗糖，20mM檸檬酸鈉，和1mM EDTA的溶液中。其它試劑(蔗糖，檸檬酸鈉，EDTA)購(gòu)自Sigma。
通過(guò)將過(guò)濾除菌的bFGF溶液(2mg/ml)與適量的HA(20mg/ml)混合配制制劑。溶液和載體開(kāi)始是在以截止閥連接的各自的注射器中。通過(guò)用注射器反復(fù)前后沖注使制劑混合均勻。無(wú)菌操作配制制劑，用帶有21G針頭的預(yù)先充灌的1ml塑料注射器給藥。
將雄性Sprague-Dewley大鼠(8-9周齡，160-180克)用乙酰丙嗪，甲苯噻嗪和氯胺酮混合液麻醉。對(duì)頸后皮膚橫向作一個(gè)小切口(5-10mm)。確定矢狀縫和人字形縫交點(diǎn)的位置，然后用21G針頭在交點(diǎn)左側(cè)骨膜和頂骨之間分別注射50μl每種制劑。處理后14天，通過(guò)CO2窒息將動(dòng)物無(wú)痛苦處死。
將用于組織學(xué)分析的組織固定在以中性緩沖液配制的10％甲醛溶液中。在甲酸(RapidBone Decal)中對(duì)組織脫鈣處理至少2小時(shí)，同時(shí)不斷地緩慢攪動(dòng)。再將樣品脫水，并用石蠟滲透。然后按橫切面方向?qū)悠钒?，并?μm的切片。用蘇木精和曙紅對(duì)切片染色，用于組織學(xué)分析。按照0-4的記分法對(duì)新骨形成進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分0表示沒(méi)有網(wǎng)織狀新骨，評(píng)分1表示有少量或斑片狀的網(wǎng)織狀骨區(qū)域，評(píng)分2表示有較大的斑片狀骨形成區(qū)域，評(píng)分3表示有薄的，連續(xù)的網(wǎng)織狀骨(少于原有頂骨的50％)，評(píng)分4表示有厚的，連續(xù)的網(wǎng)織狀骨(大于原有頂骨的50％)。骨厚度測(cè)定在注射位置測(cè)定頂骨的總厚度。對(duì)每塊組織學(xué)切片，在矢狀縫側(cè)面2-3mm的部位(大約是矢狀縫與切片邊緣之間的中點(diǎn))拍攝照片。在照片的左、中、右側(cè)取得了整塊骨的三個(gè)骨厚測(cè)定數(shù)據(jù)，并進(jìn)行了評(píng)分，用于確定總的骨厚度。致密的皮層骨和網(wǎng)織狀新骨都包括在此測(cè)定中。結(jié)果定性測(cè)定表明，用bFGF處理的所有動(dòng)物組都顯示有一些新骨形成，而只用HA凝膠處理的動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物顯示有極微量的，或者沒(méi)有新骨形成。組織學(xué)分析表明，bFGF處理的動(dòng)物顯示有網(wǎng)織狀新骨和片層狀成熟骨存在。在注射位置，在更成熟的低層骨表面形成了明顯的網(wǎng)織狀新骨層。偶爾網(wǎng)織狀骨也存在于右側(cè)，但是不會(huì)達(dá)到象在左側(cè)所見(jiàn)到的程度。網(wǎng)狀新骨顯示有正常的逆轉(zhuǎn)線，骨髓隙和通常的染色特征。這些組的大多數(shù)動(dòng)物獲得了骨形成評(píng)分3(28/30)，并有2只動(dòng)物獲得了最高評(píng)分4。在網(wǎng)織狀骨的上面，緊靠網(wǎng)織狀新骨，存在脂肪和纖維組織區(qū)，并且顯示具有正常的結(jié)構(gòu)形式。沒(méi)有任何區(qū)域顯示有指示HA/bFGF制劑可能具有抗原潛在特性的慢性炎癥細(xì)胞病灶。
HA凝膠處理的動(dòng)物沒(méi)有顯示出新骨形成，或者僅顯示有非常少量的新骨形成，大多數(shù)動(dòng)物獲得了骨形成評(píng)分0(26/30)，30只動(dòng)物中的3只獲得骨形成評(píng)分1，并有1只動(dòng)物獲得骨形成評(píng)分3。這種新骨形成可能是外科手術(shù)過(guò)程對(duì)骨膜的刺激結(jié)果。組織的任何部分未見(jiàn)異常，也沒(méi)有征候表明所試驗(yàn)的任何HA具有作為抗原的可能性。
未接受外科手術(shù)也未接受處理的動(dòng)物，沒(méi)有顯示出新骨形成，6只動(dòng)物全部獲得骨形成評(píng)分0。這組動(dòng)物非常類似于接受HA凝膠的動(dòng)物組，不同的是沒(méi)有作為骨膜刺激結(jié)果的新骨形成。這些樣品由成熟的骨組織構(gòu)成，在腔隙中存在正常的骨細(xì)胞，還可見(jiàn)骨髓隙。所有的切片中，在骨組織表面都存在少量微細(xì)纖維組織。
關(guān)于骨厚度，bFGF處理組比生長(zhǎng)對(duì)照組骨厚度增加了68％-100％。以配制在最高分子量HA凝膠中的bFGF處理動(dòng)物，獲得了最大的骨厚度增加(100％)，此凝膠是由從Lifecore購(gòu)得的最大分子量HA所形成。HA分子量對(duì)骨形成有輕微的作用。當(dāng)HA分子量增加，新骨形成量也增加。骨形成的這種增加可能是由于制劑粘滯度增加。當(dāng)粘滯度增加，它將成為較厚的擴(kuò)散屏障，使bFGF較長(zhǎng)時(shí)間保持在局部位置。HA較長(zhǎng)的保留時(shí)間于是將導(dǎo)致較多的骨形成。
實(shí)施例6此實(shí)施例將論述骨膜下注射HA+bFGF凝膠后透明質(zhì)酸的局部分布和存留時(shí)間。這項(xiàng)研究測(cè)定了骨膜下注射含有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的HA凝膠之后骨膜的增生，新骨形成，以及透明質(zhì)酸(HA)的局部分布和存留時(shí)間。通過(guò)組織學(xué)評(píng)定法測(cè)定了第3天骨膜的厚度，第10天的骨厚度。材料和方法材料透明質(zhì)酸鈉(HA)從Lifecore Biomedical購(gòu)得(Chaske,MN,1300KDa)。bFGF是在被校正至pH 5的9％蔗糖，20mM檸檬酸鈉，和1mMEDTA溶液中，以冷凍液(4.3mg/ml)形式由Scios-Nova提供的。制劑緩沖試劑(蔗糖，檸檬酸鈉，EDTA,BSA)購(gòu)自Sigma。己二酰二酰肼(AD)和1-乙基-3[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亞胺(EDC)購(gòu)自Aldrich?；腔?NHS-生物素(SNB),2-(4′羥基苯偶氮基)苯甲酸(HABA),3,3′-二胺基聯(lián)苯胺四氫氯化物(DAB)金屬增強(qiáng)的底物試劑盒，以及親合素-辣根過(guò)氧化物酶(Av-HRP)結(jié)合物購(gòu)自Pierce，吐溫20購(gòu)自Baker。生物素化通過(guò)二步反應(yīng)制備HA-生物素(HA-Bi)結(jié)合物。按照Pouyaniand Prestwich,Bioconjugate Chem.5:370-372(1994)的方法，先合成酰肼基-HA，隨后制備HA-Bi?？赏ㄟ^(guò)將200mg HA溶解于50ml水中來(lái)制備酰肼基-HA。將AD(3.5g)加入此HA溶液，并用0.1N HCl校準(zhǔn)pH至4.75。溶液中再加入EDC(382mg)開(kāi)始反應(yīng)。定時(shí)監(jiān)測(cè)pH，加入0.1N HCl使pH維持在4.75。4小時(shí)之后(此時(shí)未發(fā)現(xiàn)pH進(jìn)一步增加)，通過(guò)以1N NaOH中和至pH 7使反應(yīng)停止。將此產(chǎn)物透析72小時(shí)(Specta/Por，截止分子量為6000-8000)，然后冷凍干燥48小時(shí)。
可通過(guò)將15mg酰肼基-HA溶解于1.5ml 0.1M NaHCO3來(lái)制備HA-Bi結(jié)合物。加入SNB(50mg)開(kāi)始反應(yīng)。此溶液在室溫下用小磁性攪拌棒攪拌20小時(shí)。再將此溶液透析72小時(shí)，然后冷凍干燥48小時(shí)。按照廠商的試驗(yàn)方案(Pierce)借助于取代測(cè)定試驗(yàn)確定其取代程度。簡(jiǎn)單地說(shuō)，是將900μl親合素-HABA試劑置于1ml的比色杯中。將它在500nm的吸光度與900μl親合素-HABA溶液加100μl 1mg/mlHA-生物素溶液的吸光度相比較。平均取代度是每摩爾生物素30摩爾重復(fù)的二糖單位。制劑如表5中所述，通過(guò)將過(guò)濾除菌的bFGF溶液與固體HA混合配制制劑。通過(guò)反復(fù)前后移動(dòng)以截止閥連接的二個(gè)注射器使制劑混合均勻。無(wú)菌操作配制制劑，用帶有21G針頭的預(yù)先充灌的1ml塑料注射器給藥。表5HA-Bi制劑
>動(dòng)物模型將雄性Sprague-Dewley大鼠(6-7周齡，160-180克，每組5只)用乙酰丙嗪，甲基噻嗪和氯胺酮混合液麻醉。對(duì)頸后皮膚橫向作一個(gè)小切口(5-10mm)。確定矢狀縫和人字形縫交點(diǎn)的位置，然后用21G針頭在交點(diǎn)左側(cè)骨膜和頂骨之間分別注射50μl每種制劑。處理后14天，通過(guò)CO2窒息將動(dòng)物無(wú)痛苦處死。組織學(xué)將用于組織學(xué)評(píng)定的組織固定在以中性緩沖液配制的10％甲醛溶液中，然后在13-15％EDTA溶液中脫鈣，同時(shí)不斷地緩慢攪動(dòng)。再將樣品脫水，并用石蠟滲透。然后按橫切面方向?qū)悠钒?，并?μm的切片。每個(gè)樣品制備二塊切片，用蘇木精和曙紅(H&E)染色，或者按照如下的方法，用Bi:Av-HRP對(duì)HA作組織化學(xué)染色，先將組織切片在封閉液(在PBS中的1％BSA和0.05％吐溫)中孵育30分鐘，隨后在檢測(cè)結(jié)合物溶液(1μg/ml親合素-HRP，在1％BSA和0.05％吐溫PBS液中)中孵育60分鐘。然后將這些組織切片置于漂洗液(0.05％吐溫PBS液)中5分鐘。用新鮮的PBS/吐溫液重復(fù)漂洗5次。用金屬增強(qiáng)的DAB試劑盒對(duì)HA-Bi:Av-HRP復(fù)合物染色。施加DAB底物之后5分鐘，將切片在水中漂洗。存在此復(fù)合物則形成黑色沉淀。最后，將這些切片用蘇木精(H)對(duì)細(xì)胞的細(xì)節(jié)部分進(jìn)行復(fù)染。骨膜和骨厚度測(cè)定在注射位置測(cè)定骨膜和頂骨的總厚度。對(duì)每塊組織學(xué)切片，在矢狀縫側(cè)面2-3mm的部位(大約是矢狀縫與切片邊緣之間的中點(diǎn))拍攝照片。在照片的左，中，右側(cè)取得了三個(gè)厚度測(cè)定數(shù)據(jù)，并進(jìn)行評(píng)分，用于確定總的骨厚度或總的骨膜厚度。在此骨膜厚度范圍內(nèi)包含有類似于正常骨膜染色特征和細(xì)胞形態(tài)的組織。致密的皮層骨和網(wǎng)織狀新骨都包括在骨厚度測(cè)定中。結(jié)果以配制在HA凝膠中的bFGF處理的動(dòng)物顯示在第3天有骨膜厚度增加，在第10天有顯著的網(wǎng)織狀骨形成。以不含有bFGF的制劑處理的動(dòng)物顯示出有限的骨膜增厚和骨形成。發(fā)現(xiàn)HA-Bi第3天在緊靠增厚的骨膜組織中，而第10天在緊靠新形成的骨組織中。HA-Bi，給藥后第3天在注射位置，清晰的HA團(tuán)塊存在于骨膜上方，存在一部分由于外科創(chuàng)傷從片層狀骨隆起的骨膜。在對(duì)HA染色的區(qū)域中，存在局部的纖維組織區(qū)和非特異性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中淋巴細(xì)胞和退化的細(xì)胞清晰可見(jiàn)。周?chē)M織由微細(xì)纖維組織構(gòu)成。HA-Bi，給藥后第10天HA-Bi處理的動(dòng)物顯示出帶有非特異性纖維組織區(qū)的正常片層狀骨，這種纖維組織類似于在骨上面的顆粒狀組織。此區(qū)域含有淋巴細(xì)胞，微小血管，脂肪細(xì)胞和少量未染色的物質(zhì)碎片。在左側(cè)顱蓋表面致密的纖維組織內(nèi)有棕黑色的過(guò)氧化物酶染色。HA非特異性地分布在纖維組織內(nèi)。HA-Bi+bFGF，給藥后第3天在注射位置，覆蓋在原先存在的片層狀骨上面的骨膜層有增生。定量測(cè)定表明，HA-Bi+bFGF處理動(dòng)物的骨膜與只用HA-Bi凝膠處理的動(dòng)物相比較，厚度增加了403％。在增厚的骨膜上面，存在大量纖維化的，過(guò)度增生的纖維組織。在這種纖維組織內(nèi)，存在脂肪細(xì)胞，并且存在有非特異性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，包含有一些多形核白細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞。殘留的HA延伸跨越了中線縫，并且看來(lái)是在遭受包裹。這些樣品顯示出濃縮的棕黑色染色物質(zhì)(即HA)，主要集中在被包裹組織的范圍內(nèi)。這種物質(zhì)多數(shù)看來(lái)是非特異性地保留在纖維網(wǎng)內(nèi)，并且有一些看來(lái)是非特異性地聚積在局部巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。HA-Bi+bFGF，給藥后第10天在注射位置，預(yù)先存在的顱蓋片層狀骨已被一厚層具有正常結(jié)構(gòu)和染色特性的，正在成熟的網(wǎng)織狀骨覆蓋了。用HA-Bi+FGF處理的動(dòng)物與接受HA-Bi凝膠處理的動(dòng)物相比較，總的骨厚度增加了70％。這種新骨一般恰好延伸超過(guò)中線縫，到達(dá)顱蓋右側(cè)。在環(huán)繞新形成網(wǎng)織狀骨的纖維增生組織表層，可見(jiàn)DAB染色的HA。過(guò)氧化物酶染色表明，HA一般存在于靠近新形成骨的組織中。在網(wǎng)織狀骨的上面，存在纖維-骨膜層。在它的表面存在一片廣闊的已形成血管并含有脂肪細(xì)胞的微細(xì)纖維組織區(qū)。在此被微細(xì)纖維組織層限定的良好發(fā)育的區(qū)域內(nèi)，還存在一些淋巴細(xì)胞，漿細(xì)胞，以及組織細(xì)胞。HA+bFGF，給藥后第3天和第10天定性和定量試驗(yàn)都表明，生物素結(jié)合了HA不影響對(duì)該制劑的生物反應(yīng)(表6)。HA+FGF處理組與HA-Bi+FGF處理組相比較，骨膜和骨厚度沒(méi)有顯著差別(P＞0.05)，但是與HA-Bi處理的對(duì)照組相比較有顯著差別(P＜0.001)。組織學(xué)檢驗(yàn)表明，用不帶有生物素的HA+bFGF處理的動(dòng)物，類似于用HA-Bi+bFGF處理的動(dòng)物，不同的是前者不存在來(lái)自DAB底物的棕黑色染色區(qū)域。沒(méi)有預(yù)期這些區(qū)域會(huì)被染色，因?yàn)椴淮嬖谏锼?。少?shù)細(xì)胞確實(shí)顯示染色陽(yáng)性，是因?yàn)榇嬖趦?nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。
表6此項(xiàng)研究中三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的骨膜和骨厚度
通過(guò)骨膜下注射給予HA+bFGF凝膠，對(duì)骨膜增生和促進(jìn)主動(dòng)的骨形成有顯著的作用。給藥后3天，骨膜比對(duì)照增厚將近5倍。此外，對(duì)于HA/bFGF處理的大鼠，給藥后10天頂骨厚度比對(duì)照增加了70％。在此所試驗(yàn)的制劑中，HA載體通過(guò)使原材料定位而引導(dǎo)新骨形成，發(fā)現(xiàn)HA存在于主動(dòng)骨形成區(qū)。注射HA+bFGF之后，HA提供了一個(gè)靠近新骨形成位置的bFGF儲(chǔ)存場(chǎng)所。
除了提供引導(dǎo)bFGF釋放的位置之外，看來(lái)HA還具有維持促進(jìn)骨形成環(huán)境的生物特性。HA與FGF可能具有協(xié)同作用。
對(duì)本發(fā)明上述的公開(kāi)內(nèi)容和描述是其例證性的說(shuō)明，按照本發(fā)明的精髓原理，有可能對(duì)其大小、形狀和材料，以及對(duì)其優(yōu)選實(shí)施方案的細(xì)節(jié)作出各種改變。
權(quán)利要求
1．一種含有透明質(zhì)酸和生長(zhǎng)因子的骨生長(zhǎng)促進(jìn)組合物，其中該組合物具有粘滯性和生物可降解性，足以使它在所需要的骨生長(zhǎng)部位保持足以促進(jìn)骨生長(zhǎng)的一段時(shí)間。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的透明質(zhì)酸是未交聯(lián)的。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中該組合物溶液中含有0.1-4％重量的透明質(zhì)酸。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的生長(zhǎng)因子包括bFGF。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中所述的bFGF是以大約10-6-100mg/ml的濃度范圍存在于組合物中。
6．根據(jù)一種在所需要的骨生長(zhǎng)部位促進(jìn)骨生長(zhǎng)的方法，包括對(duì)該部位施用含有透明質(zhì)酸和生長(zhǎng)因子的組合物的步驟，其中該組合物具有粘滯性和生物可降解性，足以使它在該部位保持足以促進(jìn)骨生長(zhǎng)的一段時(shí)間。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中的透明質(zhì)酸是未交聯(lián)的。
8．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述組合物中透明質(zhì)酸占組合物重量的大約0.1-4％。
9．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中的生長(zhǎng)因子包括bFGF。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的bGFG是以大約10-6-100mg/ml的濃度范圍存在于組合物中。
全文摘要
提供了一種含有透明質(zhì)酸和生長(zhǎng)因子的促進(jìn)骨生長(zhǎng)的組合物。此組合物具有粘滯性和生物可降解性,足以使它在所需要的骨生長(zhǎng)部位保持足以促進(jìn)骨生長(zhǎng)的一段時(shí)間。在組合物內(nèi),優(yōu)選的透明質(zhì)酸含量范圍是0.1—4%的重量,而優(yōu)選的生長(zhǎng)因子是bFGF,存在的濃度范圍是大約10
文檔編號(hào)A61K38/27GK1212628SQ97192822
公開(kāi)日1999年3月31日 申請(qǐng)日期1997年3月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月5日
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