專利名稱：抗耳炎的預(yù)防免疫牛奶制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于防治兒童中耳感染(中耳炎)免疫牛奶制劑。該制劑含有所生產(chǎn)的抗引起中耳感染的細(xì)菌的抗體，并且，如果需要，還含有齲牙抑制劑。
通過(guò)接種懷孕的母牛以抗某些病原菌，由此母牛機(jī)體形成對(duì)這些疾病的抗體，該抗體被轉(zhuǎn)移到初乳中，就能夠產(chǎn)生所謂的免疫牛奶。長(zhǎng)期以來(lái)已經(jīng)了解了免疫牛奶的治療作用。從本世紀(jì)初就已在對(duì)各種細(xì)菌和病毒性疾病的治療中試驗(yàn)免疫的羊或母牛的奶。新近的最重要的研究是集中在基于胃腸道的微生物的疾病上，這些疾病尤其是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，齲牙，齦炎，腹瀉，痢疾，胃炎和隱孢子蟲病。已知一種免疫母牛奶的齲齒抑制產(chǎn)品，其含有殺死的變異鏈球菌細(xì)胞的特異性抗體(美國(guó)專利4,324,782)。在美國(guó)常見(jiàn)的免疫牛奶是通過(guò)以激發(fā)劑來(lái)維持抗體水平來(lái)生產(chǎn)的。抗體的量相當(dāng)少，并且效果是以每天給藥為基礎(chǔ)。在臺(tái)灣免疫牛奶是作為健康飲料出售的。在澳大利亞，已將含輪狀病毒抗體的粉末混合到特別是嬰兒配方食品中(Murtomaa-Niskala，1994)。全奶制品還含有可能對(duì)微生物菌群有效的非特異性抗菌因子(Takahashi等人，1992)。
在芬蘭已制成了抗特別是幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)感染的免疫牛奶(Dona等人，1994)，在Turku大學(xué)的牙科系已研究了獲自免疫牛的初乳的抗變異鏈球菌和表兄鏈球菌(Streptococcus sobrinus)的抗體(Loimaranta等人，1996)(Jorma Tenoruo教授，未發(fā)表資料)。這種免疫牛奶已在Jokioninen的農(nóng)業(yè)研究中心生產(chǎn)。
已證明一種由免疫初乳分離的抗變異鏈球菌抗體制劑抑制牙齒表面被變異鏈球菌感染并且在加到限菌鼠的生齲飲食中時(shí)保護(hù)牙齒不生齲齒(Michalek等人，1987)。與對(duì)照組相比較，使用用于早晚漱口一分鐘的溶于水的凍干的基于同樣技術(shù)的免疫乳清粉末兩星期顯著減少了年輕成人的牙斑(dental plaque)中變異鏈球菌的比例(Filler等人，1991)。但是漱口對(duì)于小的兒童來(lái)說(shuō)并不是一種合適的給藥方法，而他們則可能從增加的免疫保護(hù)獲益最多(Aaltonen等人，1987)。
Suhonen(1992)曾提出在用于預(yù)防齲齒的預(yù)防方法中使用一種緩慢釋放氟化物，木糖醇，單克隆齲抗體或乳酸過(guò)氧化物酶系統(tǒng)的成份至口腔中的安慰器樣(pacifier)的給藥裝置的理論基礎(chǔ)。已確立作為氟化鈉，木糖醇和山梨糖醇從片劑釋放的釋放裝置的投藥安慰器的體外可操作性，并建議通過(guò)安慰器給藥抗引起口腔疾病的微生物的被動(dòng)疫苗(passive vaccines)(Suhonen等人，1994)。在本發(fā)明人的在Lohja地區(qū)保健中心對(duì)16個(gè)月大的兒童的區(qū)域?qū)嶒?yàn)中用于投藥氟化鈉，木糖醇和山梨糖醇的安慰器試制型式已證明是一種對(duì)于治療哺乳期兒童的口腔和喉部疾病的研究有潛力的有效工具。在本發(fā)明人隨后的研究中，顯然，與由于一些原因或其它原因而未使用試驗(yàn)的安慰器的對(duì)照組相比，兒童接受試驗(yàn)的安慰器良好的一組表現(xiàn)出在18個(gè)月大之前中耳感染的頻率明顯要低(48％比78％)(Suhonen J.，Aaltonen A.S.，Jenovuo J.，“受齲牙危險(xiǎn)因素影響的嬰兒的睡熟安慰器”(Fall-asleep pacifierin toddlers subject to cariologic risk factors)，Poster，“國(guó)際兒科牙醫(yī)學(xué)會(huì)第十五次大會(huì)”(The 15th Congress of International Association of PediatricDentistry，Gothenburg 1995)。
從理論上說(shuō)，可能是由于在兒童睡熟時(shí)從安慰器緩釋并留下來(lái)在口腔中長(zhǎng)時(shí)間地起作用的木糖醇已阻止肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌屬)在兒童喉部生長(zhǎng)，接受試驗(yàn)的安慰器的兒童才有如此少的中耳感染(Sipponen，1995，Kontiokari等人，1995)。兩歲以下兒童中一半以上的源于細(xì)菌的中耳感染(中耳炎)是由肺炎球菌所造成的。中耳感染中另一種相當(dāng)普通的病原菌是非典型的(非乙型)細(xì)菌種流感嗜血菌，再一種更常見(jiàn)的是粘膜炎布蘭漢氏球菌。在以日托兒童的兩個(gè)月實(shí)驗(yàn)中，每天5次咀嚼木糖醇口香糖5分鐘比使用相應(yīng)的加糖的口香糖的對(duì)照組減少中耳感染50％(Uhari等人，1996)。一種解釋這一作用的可能方式是木糖醇可能已減少肺炎鏈球菌還有流感嗜血菌在粘膜細(xì)胞上的粘著并且因此阻止了這些耳病原菌通過(guò)聽(tīng)音管上升到中耳(助教Matti Uhari，未發(fā)表資料，8，11，1996；Andersson等人，1986)。
在本發(fā)明人的研究中，已在12-14個(gè)月齡時(shí)每晚吮吸一瓶牛奶或牛奶麥片粥的那些兒童比吮吸汁或水的那些兒童的中耳感染顯然要更頻繁些。可能與木糖醇有聯(lián)系的這一觀察和以前的觀察表明所給藥的藥劑的作用可能通過(guò)安慰器擴(kuò)散到鼻咽菌群并由此上升到中耳。本發(fā)明人的一些結(jié)果表明，雖然認(rèn)為這些細(xì)菌的主要位置是鼻咽部，但是兒童會(huì)經(jīng)由通過(guò)口的唾液接觸而獲得引起中耳感染的細(xì)菌。因而在抗目的在于中耳的細(xì)菌中，口腔可能是首要保護(hù)區(qū)。因此，如果將上述預(yù)防齲齒的Suhonen方法拓寬到用于鼻咽區(qū)的病原微生物群，以由該方法已知的給藥裝置或由其改進(jìn)的裝置，還可將針對(duì)中耳感染病原菌起作用的藥劑長(zhǎng)期給藥以預(yù)防兒童中耳感染。
為治療兒童急性中耳炎，現(xiàn)在主要使用抗生素，并且使用耳鼓穿刺和滴耳劑來(lái)立即去痛。大量使用抗生素被擔(dān)心會(huì)促進(jìn)抗性菌株的流行(Bacuero和loza，1994)和對(duì)口腔微生物菌群的選擇，以致以犧牲其它種類為代價(jià)，產(chǎn)生蛋白酶降解免疫球蛋白A(IgA)的種類會(huì)變得更為常見(jiàn)(φstergaard，1983)。反復(fù)經(jīng)受呼吸道感染的兒童比健康對(duì)照唾液中含IgA顯著要少(Lenhtonen等人，1987)。由于該疾病的高發(fā)病率以及與治療相關(guān)的困難，正在研制不經(jīng)腸的有效增加血清特異性IgG免疫應(yīng)答的抗該疾病的疫苗。將來(lái)也可使用以鼻噴霧劑形式提供有效的病毒疫苗，其刺激粘膜上的分泌的IgA應(yīng)答，從而減少患中耳炎的危險(xiǎn)。就本發(fā)明人所知，以前還未公開(kāi)這一構(gòu)思，即兒童中耳炎可能以一種尤其可通過(guò)吮吸裝置來(lái)在延長(zhǎng)的時(shí)間給藥的被動(dòng)的人體外產(chǎn)生的疫苗來(lái)預(yù)防。經(jīng)鼻給藥的針對(duì)乙型流感嗜血桿菌莢膜多糖的IgG型抗體曾抑制這種病原菌在鼠嬰中的鼻咽部繁殖(Kauppi等人，1993)。
為本發(fā)明的目的的預(yù)防用的免疫牛奶產(chǎn)品，即牛初乳的抗耳炎的免疫球蛋白產(chǎn)物，會(huì)補(bǔ)充被動(dòng)免疫防御，其在本質(zhì)上大致相當(dāng)于從母乳獲得的免疫防御，但不同的是，人乳主要含IgA型抗體，牛乳含IgG型抗體。歐洲專利申請(qǐng)0479 579中公開(kāi)了人或牛乳的免疫球蛋白可用于如中耳炎的治療，但該申請(qǐng)?zhí)貏e地涉及IgA。大多數(shù)引起中耳炎的細(xì)菌的特征是其產(chǎn)生降解IgA的蛋白酶，因而需要其本身在喉部微生物群中具有生態(tài)存活優(yōu)勢(shì)。所述蛋白酶不降解IgG型抗體。急性中耳炎的發(fā)病高峰恰好是在兒童的生命的第一年的后半年中最渴望用安慰器時(shí)。在對(duì)抗通過(guò)口感染并且酶解IgA的耳病原菌中，通過(guò)口服裝置或其他經(jīng)口傳送的被動(dòng)IgG型疫苗可能是一種有效的治療。
屬于牛奶乳清蛋白的抗體的化學(xué)和生物學(xué)特性是相當(dāng)熟知的。一升初乳含40-100g抗體，但相同量的乳只含0.5-1g。借助于現(xiàn)代乳品技術(shù)方法，可將抗體濃縮，分離純化并且還可以干燥而不在任何顯著程度上改變其活性?？贵w全部是可溶于水的，無(wú)臭無(wú)味的蛋白。含有抗體的濃縮物或粉末可以加到不同的乳制品，特殊食品或臨床營(yíng)養(yǎng)制劑中(Korhonen，1992)。雖然牛奶以及其中因此還有的天然或免疫產(chǎn)生的抗體是一種普通的營(yíng)養(yǎng)物，但其在嬰兒體內(nèi)的用途與一些缺點(diǎn)相聯(lián)系，其在嬰兒配方食品中被減少且在免疫乳制品中可達(dá)到更大程度的減少，其必定需要的僅僅是牛奶成份的乳清蛋白抗體?？贵w或者換句話說(shuō)為牛奶的免疫球蛋白相對(duì)較少地引起兒童的變應(yīng)化作用。大約20％的芬蘭兒童通常在生命的第一年發(fā)生牛奶變態(tài)反應(yīng)，并且其最經(jīng)常的原因是已從乳清產(chǎn)物除去的牛奶的酪蛋白成份。
在頭三個(gè)月中終止人乳哺育或少量人乳哺育以及變應(yīng)性素因似乎使兒童易患經(jīng)常性的耳炎。在已從免疫乳制品除去大部分變應(yīng)化因子時(shí)，從緊接著終止人乳哺育的相當(dāng)小的年齡或?qū)雰号浞绞称酚米餮a(bǔ)充哺育時(shí)，可將其供應(yīng)給兒童。在睡熟的情況下，抑制耳病原菌生長(zhǎng)的預(yù)防安慰器要優(yōu)于如此使易患耳炎的奶瓶。在本發(fā)明人的研究中，那些使用試驗(yàn)的安慰器的兒童比其他兒童更要減少夜晚使用奶瓶(Suhonen等人，1995)。
要測(cè)試產(chǎn)免疫牛奶的母牛的健康狀況并且必須對(duì)其給予特殊的照料。干燥的免疫牛奶粉末也具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因?yàn)槠浜腥榍宓鞍祝⑶彝ǔ＿€含有一定量的用于穩(wěn)定蛋白和增加口味的乳糖。通過(guò)水解可將乳糖再分解成半乳糖和葡萄糖，即更易被腸吸收并且增加產(chǎn)品甜味的糖。通過(guò)維持嗜酸性雙歧桿菌菌群，乳糖增加?jì)雰旱哪c道健康(Korpela，1992)。但是更長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)，牛奶的糖類會(huì)造成齲齒。
兒童易患齲齒取決于光滑的表面上的小孔底部或正在長(zhǎng)出的牙的咬合的縫隙是否被生齲或非生齲微生物菌群所覆蓋(Sranberg和Loesche，1997)。如果在菌群中建立起由糖產(chǎn)生酸和長(zhǎng)鏈多糖的變異鏈球菌(MS)，就會(huì)形成生齲牙斑。MS陽(yáng)性兒童的齲齒損傷的發(fā)生是一個(gè)多原因的過(guò)程，但被認(rèn)為主要是與在口腔中長(zhǎng)時(shí)間暴露給蔗糖有關(guān)(Gustafsson等人，1953，Aaltonen，1991，Grindefjord等人，1995a，b)。在長(zhǎng)時(shí)間人乳哺育中乳鈣和緩沖的磷酸鹽類已減少時(shí)，還有諸如乳糖的其他糖類增加了齲齒的危險(xiǎn)(Matee等人，1992)。由于宿主的抗性以及病原菌的毒力可能隨著環(huán)境因素改變或與環(huán)境因素?zé)o關(guān)(Aaltonen，1989，1991，1992，Aaltonen和Tenoruo，1994)，在個(gè)體水平上不能預(yù)先知道一個(gè)幼小的嬰兒是否是MS攜帶者，以及因此在長(zhǎng)出乳牙時(shí)是否是齲齒患者。因此，根據(jù)本發(fā)明要從免疫乳制品除去生齲的糖類。另外一個(gè)工藝技術(shù)好的替代方案是要向產(chǎn)品中加入足夠的防護(hù)劑以抑制變異鏈球菌的粘著，牙斑的增加，酸和其他毒力因子的產(chǎn)生。第三個(gè)變通方法是要轉(zhuǎn)向重礦化劑(remineralizing agent)，其抑制齲齒病的損傷癥狀，牙的去礦質(zhì)化。在這些藥劑中，對(duì)氟化物的效果的了解已有半個(gè)多世紀(jì)了。
在本發(fā)明人的平行專利申請(qǐng)(PCT/FI 96/00...)中，本發(fā)明人提出了在一種用于抑制兒童中耳炎的預(yù)防方法中的一種新的用于遞送如本發(fā)明的免疫乳制品的給藥裝置模型。不過(guò)也可將不同形式的此發(fā)明的產(chǎn)品加至給幼兒的不同食品中，以此獲得還可以以其他不同于通過(guò)上述給藥裝置的方式經(jīng)口向兒童給藥的生物活性產(chǎn)物。在此上下文中，生物活性產(chǎn)物是指含對(duì)人體有益的有生物學(xué)效果的活性劑的產(chǎn)物。
對(duì)用于生產(chǎn)抗體的抗原的選擇通過(guò)一種將有效抗體緩慢釋放到口中的給藥裝置，以小劑量達(dá)到了比較持久的對(duì)口腔和喉部微生物菌群的效果。因而重要的是所用抗體不干擾對(duì)口腔健康有重要性的正常菌群的發(fā)育。在口腔部區(qū)域，例如非生齲血鏈球菌和生齲的變異鏈球菌在牙齒表面集群中競(jìng)爭(zhēng)，這是毫無(wú)疑問(wèn)的，但是并不知道相關(guān)的肺炎鏈球菌(肺炎球菌屬)的抗原結(jié)構(gòu)會(huì)與類似每一種，由此為抑制耳病原鏈球菌的交叉反應(yīng)抗體也會(huì)影響上述與齲齒有關(guān)的競(jìng)爭(zhēng)情況。在使用產(chǎn)物前必須在體外檢查交叉反應(yīng)，并且雖然認(rèn)為由幾種抗原得到的組合產(chǎn)物對(duì)于臨床應(yīng)用是誘人的，應(yīng)該選擇一次僅針對(duì)一種病原菌種的抗體產(chǎn)物(可能有不同菌株)以利于以后的研究。只有在已研究了其效果時(shí)，才能將分類擴(kuò)大。
由于在化學(xué)上已知免疫牛奶的安全性和容易生產(chǎn)，如果需要，可將免疫原全部組成成份更快地?cái)U(kuò)大并調(diào)整到例如針對(duì)已變得抗抗生素的細(xì)菌菌株。在這些醫(yī)療情況下，治療以診斷為基礎(chǔ)，待用的抗體應(yīng)盡可能地專一，優(yōu)選是單克隆地生產(chǎn)的。
在選擇用于大規(guī)模的預(yù)防用途的抗原時(shí)，必須注意到與其他治療方法相比可由新的治療方法得到的益處。至于耳病原性肺炎球菌，預(yù)計(jì)一種已在芬蘭試驗(yàn)的八價(jià)的綴合在蛋白質(zhì)載體上的多糖抗原疫苗會(huì)在大的程度上消除由肺炎球菌引起的中耳炎的問(wèn)題(Giebink，1994)。還有流感嗜血菌(非乙型)和粘膜炎布蘭漢氏球菌，其更難治療并且沒(méi)有針對(duì)其的已知疫苗。其中，前者由于其生活習(xí)性而更了解。長(zhǎng)期以來(lái)就已證明其也生活在口部區(qū)域，是5歲以下兒童經(jīng)常發(fā)生的中耳炎的一個(gè)相當(dāng)常見(jiàn)的原因。在那些易經(jīng)?；贾卸椎膬和暮聿?，即使在健康的時(shí)候顯然也比在其他兒童的喉部更經(jīng)常發(fā)現(xiàn)流感嗜血菌(Faden等人，1991)。由于關(guān)于耳病原體，文件最能證明流感嗜血菌的咽部載體與人乳中抗體之間的聯(lián)系，將其作為免疫牛奶預(yù)防的頭一個(gè)目標(biāo)似乎是有道理的，因?yàn)槲创_切了解流感嗜血菌的免疫原性結(jié)構(gòu)，預(yù)計(jì)最可靠的結(jié)果是通過(guò)使用殺死的全細(xì)胞疫苗。由于與中耳炎有關(guān)的非典型且通常無(wú)被膜的形式(非乙型)有相當(dāng)大的變異，在免疫母牛時(shí)同時(shí)使用幾種獲得的菌株是值得的。目前在芬蘭流行的純培養(yǎng)菌株可從Oulu的國(guó)家公共衛(wèi)生研究所獲得，那里收集了在Tampere進(jìn)行的以研究嬰兒喉部是否攜帶了耳病原體的一類研究的樣品材料(Docent Aino K.Takala，未發(fā)表資料)。
除針對(duì)流感嗜血菌的免疫之外，還值得用相應(yīng)的抗粘膜炎布蘭漢氏球菌的疫苗免疫奶牛。當(dāng)然對(duì)耳最具致病性的肺炎鏈球菌菌株(尤其是6，14，19，23)至少在對(duì)比研究的意義上也是有實(shí)際意義的，盡管期望有一種有效的抗它們的不經(jīng)腸疫苗。這種或其他已知的在蛋白質(zhì)載體上綴合的多價(jià)疫苗對(duì)在母牛體內(nèi)生產(chǎn)的免疫牛奶也可能是非常有效的。多糖-蛋白質(zhì)綴合物中的長(zhǎng)鏈堿性化合物是一種免疫佐劑。一種通過(guò)給藥裝置給藥的預(yù)防使用的抗體可能是意想不到地有效，因?yàn)槠鋾?huì)已在細(xì)菌細(xì)胞的浮游生物期在粘膜最外的表面的早期生物膜中起作用，在這里不經(jīng)腸產(chǎn)生的血清抗體的作用不會(huì)達(dá)到任何顯著的程度。疫苗的制備和使用通過(guò)用已知的微生物學(xué)方法，生長(zhǎng)所選擇的用于制備疫苗(參照上文)的純細(xì)菌菌株到培養(yǎng)物足夠大。培養(yǎng)物被如通過(guò)于適宜的溫度下溫育直至該培養(yǎng)物被滅菌而殺死。幾小時(shí)后從樣品證實(shí)無(wú)菌。將殺死的細(xì)菌細(xì)胞洗滌，離心并凍干以貯存。
也可用甲醛水溶液來(lái)滅活。在這一過(guò)程中要考慮到上述細(xì)菌細(xì)胞壁薄度并用已知的實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)試圖將菌毛等可能的抗原結(jié)構(gòu)盡可能地保持完整。稱取同樣量的獲自鼻咽部最常見(jiàn)的流感嗜血菌菌株(或粘膜炎布蘭氏球菌)的干細(xì)胞粉末并混合以得到多價(jià)抗原。然后將干細(xì)胞混合到生理鹽溶液中以形成濃縮的儲(chǔ)備懸液。由此進(jìn)行稀釋直至達(dá)到某一與適于用于疫苗的細(xì)胞數(shù)目相當(dāng)?shù)墓饷芏?。將?chǔ)備懸液分批冰凍保存。根據(jù)預(yù)先測(cè)定的稀釋系數(shù)作最后的稀釋，同時(shí)檢驗(yàn)其無(wú)菌性。在免疫中用一些接受的佐劑(如氫氧化鋁和磷酸鹽，脂質(zhì)體)來(lái)輔助。接種技術(shù)在獸醫(yī)學(xué)中是已知的。在干燥季節(jié)于分娩前通過(guò)肌內(nèi)注射適量抗原懸液來(lái)接種母牛數(shù)次。免疫后從血清取樣。母牛對(duì)所用抗原的免疫可通過(guò)用例如ELISA方法并比較用安慰劑接種的母牛的結(jié)果測(cè)血清的特異抗體來(lái)確定。大量主要為IgG型的抗體被從血清輸送到初乳中。免疫牛奶的收集和加工在分娩后2-2天內(nèi)收集頭3-5次擠奶的初乳。從一頭母牛最多獲得50升初乳。一頭牛犢一次飲大約3升，但其可飲用其他冰凍的初乳。用已經(jīng)使用的乳品技術(shù)從初乳分離含免疫球蛋白的基于乳清的濃縮物。可將免疫牛奶消毒但會(huì)失去大約30％的抗體活性。通過(guò)借助于膜濾器(0.2μm)純化免疫乳清并通過(guò)以微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)母牛是健康的來(lái)保存抗體并達(dá)到足夠高的衛(wèi)生水平。乳清產(chǎn)品可被凍干成粉末?；蛘撸绻捎玫蜏?，也可以采用噴霧干燥，由此也能保存抗體活性?？梢杂门c從血清測(cè)定的相同方法來(lái)檢測(cè)乳清粉末中含有的疫苗中所用抗原的抗體。與由安慰劑疫苗制備的相比，可以證明如本發(fā)明作用的免疫乳清產(chǎn)物中有水平顯著升高的抗流感嗜血菌(非乙型)特異結(jié)構(gòu)抗原和/或全細(xì)胞抗原，或者分別是抗粘膜炎布蘭漢氏球菌全細(xì)胞抗原(如果已將其用作母牛的疫苗)的IgG抗體。流感嗜血菌的已知結(jié)構(gòu)抗原特別是蛋白質(zhì)“e”(FI專利申請(qǐng)914241)和蛋白質(zhì)P6(Harabuchi等人，1994)。肺炎鏈球菌的被膜多糖抗原是已知的，例如為對(duì)肺炎鏈球菌專一的蛋白酶的肺炎球菌溶血素也可被用作識(shí)別抗原。免疫乳清粉末含有穩(wěn)定蛋白質(zhì)并有助于將粉末壓成片劑形式的乳糖。可以除去乳糖并至少部分地用木糖醇代替乳糖。抗齲齒的保護(hù)作用在本發(fā)明人的產(chǎn)品中可使用例如在下面詳細(xì)研究的以下藥劑或藥劑組來(lái)抗齲齒1.木糖醇(C5H12O6)在自然界中幾乎在所有水果中都發(fā)現(xiàn)有少量木糖醇，其為人類代謝的正常中間體(Touster，1960，Makinen，1978)。木糖醇不能產(chǎn)生細(xì)菌酸產(chǎn)物，因而其為一種止齲劑(Muhlemann等人，1970，Scheinin和Makinen，1975)。除已提及的止齲作用外，木糖醇在長(zhǎng)時(shí)間且經(jīng)常給藥時(shí)還有十分明顯的抑齲特性(Isokangas，1994)。已發(fā)現(xiàn)木糖醇特別是增加牙斑中的堿性氨基酸，精氨酸和賴氨酸的量。這使得口腔中引起齲齒的賴酸的和產(chǎn)酸的變異鏈球菌的繁盛更加困難(Makinen和Isokangas，1988，Soderling和Scheinin，1991)。木糖醇抑制生齲的變異鏈球菌的生長(zhǎng)，削弱其他口腔微生物產(chǎn)酸的能力，并阻止胞外多糖和脂磷壁酸(lipoteichoic acid)的生物合成，屬于生齲牙斑特征的形成。
通過(guò)使用一種緩釋活性藥劑的給藥裝置，可在睡著的兒童的口中正在長(zhǎng)出的牙周圍幾小時(shí)內(nèi)營(yíng)造一種口腔液體環(huán)境，根據(jù)本發(fā)明人的研究，這種環(huán)境顯然有止齲特性。在使用這一方法時(shí)，預(yù)計(jì)以相當(dāng)小的劑量會(huì)最大限度增加木糖醇的有益特性而無(wú)輕瀉的副作用。特別是對(duì)于幼兒來(lái)說(shuō)，木糖醇和其他多羥基化合物的缺點(diǎn)是其從腸道吸收緩慢，由此的大劑量會(huì)導(dǎo)致滲透腹瀉。2.氟化物通常認(rèn)為F離子不會(huì)影響變異鏈球菌(MS)在通常的環(huán)境條件下的繁殖(Kiltan等人，1979，Van Houte等人，1978，Zickert和Emilson，1982)。但是根據(jù)一種理論，氟化物至少在較高濃度時(shí)會(huì)通過(guò)減少附著的靜電力來(lái)阻力細(xì)菌在牙齒表面附著(Rolla，1977a)。氟化物在牙齒上的止齲作用通常是和氟離子堅(jiān)固牙齒和促進(jìn)補(bǔ)充礦質(zhì)作用相聯(lián)系的。另外，氟化物離子破壞變異鏈球菌的碳水化合物代謝并因而減少牙斑中的酸的產(chǎn)生。(Hamilton，1997，Harper和Loseche，1986)。氟化物在免疫乳制品中作為齲齒保護(hù)劑的用途受到其過(guò)量的危險(xiǎn)限制。根本就不將其推薦給那些年齡小于6個(gè)月的人，用于那些年齡為6-24個(gè)月的人的最大劑量為1片/天(也就是0.25mgF/天)，對(duì)于那些年齡為2-7歲的人是2片?，F(xiàn)在幼兒中使用含氟牙膏已是常見(jiàn)的了，而兒童可能吞下相當(dāng)大量的氟，以另一種產(chǎn)品形式給藥額外的氟可能是禁忌的。在從夜晚維持的給藥裝置給藥時(shí)，即使本發(fā)明含氟片劑的氟劑量的一部分也能和通過(guò)裝置在正長(zhǎng)出的牙的表面達(dá)到的長(zhǎng)時(shí)間局部效果一樣有效，該表面在未成熟時(shí)期易被MS繁殖脫礦質(zhì)。3.單克隆齲齒抗體以所知的雜交瘤和基因操作技術(shù)，原理上在被鑒定后可以產(chǎn)生MS的任何毒力因子的極專一的抗體，也許因此最有前途的抗齲抗體制劑是抗MS細(xì)胞壁的粘著蛋白抗原SAI/II的單克隆IgG1型抗體(Ma等人，1990)。通過(guò)用這種抗體治療牙齒已成功地阻成人牙斑中MS的復(fù)發(fā)(Ma和Lehner，1990)。在芬蘭西南部的牙齒還沒(méi)有變異鏈球菌的幼兒血清樣中的是相當(dāng)大量的抗SA I/II抗原的IgG型抗體(Aaltonen，1989，Tenovuo等人，1990)。顯然這些天然抗體能通過(guò)正在長(zhǎng)出的牙齒表面的由牙齦滲出的血清液影響來(lái)限制免疫兒童感染MS。但是足夠有效的天然免疫是罕見(jiàn)的。如果在半歲到兩歲半時(shí)脫落的牙長(zhǎng)出時(shí)通過(guò)上述給藥裝置將如本發(fā)明的產(chǎn)品中的所研究的特異抗體送入兒童口中，理論上這種被動(dòng)疫苗即使在后來(lái)的時(shí)期當(dāng)脫落的牙齒將被無(wú)變異的非生齲微生物群覆蓋時(shí)也能抑制齲齒，其可能會(huì)被運(yùn)輸?shù)接谰醚例X上，在競(jìng)爭(zhēng)中有優(yōu)勢(shì)，抑制由給藥裝置給藥的MS的生物活性的特異性和非特異性蛋白質(zhì)的甚至是后來(lái)的擴(kuò)散，而該給藥裝置可能成為在正長(zhǎng)出的牙齒的表面的上形成的且其組成對(duì)病原菌的繁殖有重要意義的糖蛋白表膜的結(jié)構(gòu)部分(Gibbons，1984)。4.免疫牛奶的抗齲抗體在本發(fā)明人的在Jokioinen農(nóng)業(yè)研究中心初步研究中已生產(chǎn)出抗生齲的MS種變異鏈球菌(S，mutans)和表兄鏈球菌(S.sobinus)的免疫牛奶(初乳)(Loimaranta等人，1996)。在Turku大學(xué)的牙科系已體外檢驗(yàn)免疫乳清產(chǎn)品抗-MS的效果(J.Tenovuo，未發(fā)表資料)。這以前已在動(dòng)物和成人實(shí)驗(yàn)中證明相應(yīng)的抗變異鏈球菌的效果(Michalek等人，1987，F(xiàn)iller等人，1991)。如果Turku的研究證實(shí)以往在國(guó)外獲得的結(jié)果，那么用同樣的芬蘭人的方法獲得的抗體作用用于如本發(fā)明的抗肺炎鏈球菌，抗流感嗜血菌和抗布蘭漢氏球菌產(chǎn)品或其組合的止齲劑將是極合適的。但是，由于可期望的相加的抗齲和抗耳炎作用以及對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用，向本發(fā)明人的組合產(chǎn)物加入木糖醇也會(huì)是合適的。非環(huán)狀木糖醇通過(guò)與水分子競(jìng)爭(zhēng)蛋白質(zhì)的初級(jí)水化層來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并由此阻止變性。給藥裝置本發(fā)明人已研制出一種新型的用于最優(yōu)化給藥如本發(fā)明的抗耳炎免疫乳制品的給藥裝置。這種裝置已詳細(xì)描述于本發(fā)明人的平行申請(qǐng)PCT/FI96/00...中。附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1示已免疫的抗流感嗜血菌(非乙型)的母牛初乳的抗體滴度(ELISA)。
圖2示已免疫的抗肺炎鏈球菌的母牛初乳的抗體滴度(ELISA)牛免疫初乳制品在Jokioinen農(nóng)業(yè)研究中心，已用以甲醛水溶液殺死的被膜肺炎鏈球菌和無(wú)被膜(非乙型)流感嗜血菌全細(xì)胞抗原免疫懷孕母牛。在國(guó)家公共衛(wèi)生研究所(Helena Kayhty)制備疫苗。母牛被相當(dāng)充分地免疫(從血清樣測(cè)定抗體)，在初乳中產(chǎn)生抗體，這由所發(fā)現(xiàn)的升高的抗體滴度證實(shí)。圖1示以ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定的用流感嗜血菌(非典型的IH 57501，IH57522，IH57596，IH57602，IH57608)免疫的母牛(Hapero，Astma，Hunnari)初乳抗全細(xì)胞抗原的抗體滴度，圖2分別示用肺炎鏈球菌(血清型4，IH31890，IH32026菌株)免疫的母牛(Esitys，Harmikki)初乳抗血清型特異性多糖抗原(ELISA)的抗體滴度。用作為對(duì)照的母牛(Iretta)僅接受氫氧化鋁佐劑。
可從獲得的初乳分離抗體，如通過(guò)由Loimaranta等人描述的方法(1996)。得到的抗體粉末可用作如本發(fā)明的產(chǎn)品的活性成份。
對(duì)本領(lǐng)域的熟練人員來(lái)說(shuō)，顯然本發(fā)明的實(shí)施方案并不限制于以上所示的實(shí)施例，而是可以在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)變動(dòng)。參考文獻(xiàn)Aaltonen AS.“齲齒的自然免疫，對(duì)和幼兒體內(nèi)與齲齒有關(guān)的變異鏈球菌以及一些物質(zhì)因素反應(yīng)的血清和唾液抗體的平行研究”，博士論文，Turku1989。Aaltonen AS.“母-嬰唾液密切接觸頻率和母親的齲活性影響4歲兒童的齲齒發(fā)病率”，“芬蘭牙科學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)報(bào)”(Proc Finn Dent Soc.)，1991，87，373-382。Aaltonen AS.Lapsen immuunistuminen hammaskariesta vastaan.SuomHammasl L.1992，39，114-118。Aaltonen AS，Tenoruo J.，“母-嬰唾液接觸和兒童對(duì)齲齒抗性之間的聯(lián)系-股研究(acohort study)，“兒科牙科學(xué)”(Pediatr Dent)1994，16，11-16，Aaltonen AS，Tenovuo J，Lehtonen O-P，“具有低基本水平的抗變異鏈球菌細(xì)菌種類的血清IgG抗體的學(xué)齡前兒童體內(nèi)的增加的牙齲活性”，“口腔生物學(xué)文獻(xiàn)”(Arch Oral Biol.)1987，32，55-60Andersson B，Porras O，Hanson LA，Lagergard T，Svanborg EdenC.“通過(guò)人乳和受體寡糖對(duì)肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的附著的抑制”，“傳染病雜志”(Jinfect Dis)1986，153，232-237Bacuero F，Loza E.“涉及耳，鼻及喉部感染的微生物對(duì)抗生素的抗性”，“兒科傳染病雜志”(Pediatr Infect Dis J)1994，13，S9-S14，F(xiàn)aden H，Waz MJ，Benstein JM，Brodsky L，Stanierich J，Ogra 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權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防兒童中耳感染的免疫牛奶制劑，其特征在于該制劑含有引起中耳感染的一種或幾種細(xì)菌的特異IgG型抗體。
2.如權(quán)利要求1的制劑，其特征在于該抗體已從免疫了的抗一種引起中耳感染的細(xì)菌的健康母牛的初乳中通過(guò)分離含免疫球蛋白的基于乳清的部分來(lái)生產(chǎn)。
3.如權(quán)利要求1或2的制劑，其特征在于其含有流感嗜血菌(非乙型)和/或肺炎鏈球菌和/或粘膜炎布蘭漢氏(莫拉氏)球菌特異抗體。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的制劑，其特征在于其還含有牙齲抑制劑，其使得能長(zhǎng)時(shí)間地向有牙兒童給藥該制劑而沒(méi)有增加的生齲的危險(xiǎn)。
5.如權(quán)利要求4的制劑，其特征在于其含有生齲的變異鏈球菌和/或表兄鏈球菌的特異抗體。
6.如權(quán)利要求4或5的制劑，其特征在于用向目標(biāo)區(qū)域緩釋活性劑的安慰器型或口濾網(wǎng)型給藥裝置來(lái)向兒童長(zhǎng)時(shí)間給藥。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的制劑，其特征在于含有作為止齲劑、抑制中耳炎的增甜劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的木糖醇。
8.一種生物活性產(chǎn)品，其特征在于其含有-一種抗一種或多種引起中耳炎的細(xì)菌的特異抗體；和/或-一種抗一種或多種引起齲牙的細(xì)菌的特異抗體，和-一種防止牙或中耳的病原菌粘附，累積或繁殖的藥劑。
9.如權(quán)利要求8的產(chǎn)品，其特征在于其為一種用于幼兒的兒童食品或基于牛奶的乳制品。
全文摘要
一種用于抗耳炎的預(yù)防用途的來(lái)源于用諸如流感嗜血菌(非乙型)、肺炎鏈球菌和布蘭漢氏球菌(莫拉氏菌)的細(xì)菌免疫的母牛的免疫牛奶制劑。該制劑含有抗引起耳炎的細(xì)菌的IgG?？梢匝a(bǔ)充引起齲的細(xì)菌(如變異鏈球菌,表兄鏈球菌)的特異抗體來(lái)預(yù)防齲?？梢杂靡环N橡皮奶頭樣的裝置來(lái)進(jìn)行該制劑的給藥。
文檔編號(hào)A61C19/00GK1207048SQ96199507
公開(kāi)日1999年2月3日 申請(qǐng)日期1996年11月11日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月9日
發(fā)明者安蒂·S·阿爾托南, 喬科·蘇霍南 申請(qǐng)人:安蒂·S·阿爾托南, 喬科·蘇霍南