專利名稱：以可溶性寡糖結(jié)合域為基礎(chǔ)的分離和濃縮系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用聚合物配體對通過親和相分離來分離和/或濃縮多肽和其它化合物的方法，其中配體與可溶性形成相的寡糖結(jié)合。本發(fā)明特別涉及一種相分離系統(tǒng)的應(yīng)用，系統(tǒng)中包含可溶性寡糖，寡糖對以含有糞肥纖維單孢菌(Cellulomonas fimi)纖維素酶的纖維素結(jié)合域作為親和配體的化合物有親和性。
背景技術(shù)：
通過蛋白質(zhì)在微生物系統(tǒng)中表達來生產(chǎn)蛋白質(zhì)已經(jīng)成為極有價值的醫(yī)療上重要的蛋白質(zhì)的來源。在發(fā)酵工藝設(shè)計中重組蛋白質(zhì)的純化和回收是主要的考慮因素。盡管可用常規(guī)的蛋白質(zhì)純化法來分離產(chǎn)物，但是最近，水性兩相提取系統(tǒng)作為簡化大規(guī)模純化蛋白質(zhì)產(chǎn)物(包括高劑量治療藥物如胰島素和工業(yè)蛋白質(zhì)如3-氧合類固醇異構(gòu)酶、醇脫氫酶和果糖磷酸激酶)的手段已有相當高的工業(yè)價值。因此，現(xiàn)在有許多種可用于蛋白質(zhì)純化和細胞分離的兩相系統(tǒng)。水性兩相系統(tǒng)提取為大規(guī)模處理重組蛋白質(zhì)和肽提供了獨特的優(yōu)點，包括高活性得率(即，較大的水性環(huán)境使純化過程中的蛋白質(zhì)失活最小)、可快速平衡、容易放大，最重要的是連續(xù)操作。
水性兩相分配系統(tǒng)的技術(shù)可行性在一些高達100000升規(guī)模的系統(tǒng)中得到證明。它們是通過在水中加入兩種水溶性的但不相容的聚合物或一種水溶性聚合物和一種強電解質(zhì)來形成的。聚乙二醇(PEG)在許多工業(yè)兩相系統(tǒng)中可作為一種聚合物組分，因為聚乙二醇價格低且有很寬的分子量組分可以采用。分級的葡聚糖，一種有α-1，3支鏈的α-1，6葡萄糖，通常作為第二種聚合物。然而，也可用其它許多水溶性聚合物，其中包括其它許多糖類聚合物。水性兩相系統(tǒng)主要含有水，每一相富含一種誘導分離組分且?guī)缀醪缓硪环N。當將來自發(fā)酵液的蛋白質(zhì)和其它生物大分子的混合物加入一個水性兩相系統(tǒng)中時，每一種蛋白質(zhì)根據(jù)它對于形成兩相的組分的相對親和力、大小、表面化學和凈電荷來分配。
常規(guī)水性兩相系統(tǒng)的分配系數(shù)較低和選擇性較差促使了親和分配系統(tǒng)的發(fā)展，它將各種常規(guī)分配系統(tǒng)的多用途性與親和配體單一結(jié)合的選擇性結(jié)合在一起。在許多場合，生物特異性配體是與形成相的聚合物，通常是PEG的一端或兩端共價結(jié)合。相形成時聚合物的強分配使得配體聚集入一個平衡相中。高度不對稱的分配與靶蛋白質(zhì)與配體間的強親和結(jié)合是親和分離和濃縮的基礎(chǔ)。
然而，盡管目前的親和分配系統(tǒng)有一定的工業(yè)用途，但是由于每個聚合物鏈上只有一個或兩個配體存在而導致了配體密度較低，因此它們的容量和分辨能力有限。由于聚合物濃度通常小于15％(重量)，因此配體與聚合物化學計量比為1∶1或2∶1的親和分配系統(tǒng)中靶蛋白質(zhì)的分離系數(shù)(與雜質(zhì)的分離系數(shù)有關(guān))在5至50之間。盡管這些分離系數(shù)足以滿足產(chǎn)物濃度，但在低成本的一步或兩步提取過程中它們通常也不能提供所需的產(chǎn)品純度。典型的親和分配系統(tǒng)也受到產(chǎn)生聚合物-配體共軛物的化學費用的局限。例如，配體與PEG的共軛反應(yīng)首先需要用更活潑的親電子試劑如溴化物、氯化物或環(huán)氧衍生物來取代末端羥基基團。然后第二步親核攻擊反應(yīng)將聚合物和配體共價結(jié)合。配體聚合物的共軛物也必須設(shè)計成對每種待純化的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)類有特異性。
水性兩相分離的一個新的進展是將水性兩相系統(tǒng)與溫度誘導相分離結(jié)合起來。至今為止，這些系統(tǒng)采用熱分離聚合物作為頂相聚合物，葡聚糖或羥基丙基淀粉作為底相聚合物。溫度誘導相分離在純化步驟后，使得可以從生物產(chǎn)物中分離并回收聚合物。這種方式中的該方法有回收熱分離聚合物的優(yōu)點，但也有明顯的缺點，即靶蛋白質(zhì)對熱分離聚合物沒有獨特的強的親和力。將寡糖結(jié)合域技術(shù)用于這些兩相系統(tǒng)可高效親和分離含有與區(qū)域結(jié)合的聚合物的相，然后用簡單的方法來回收并循環(huán)使用聚合物。因此有必要開發(fā)快速、廉價、高容量的方法來純化所需的蛋白質(zhì)，特別是通用的聚合物-配體共軛物的方法。
相關(guān)文獻為回顧形成相寡糖，參見Zaslavsky，“水性兩相分配”Aqueous Two-PhasePartitioning，Marcel Dekker，Inc.New York(1995)；Albertson，P.A.，“細胞顆粒和大分子的分配”Partitioning of Cell Particles and Macromolecules，3rded.，Wiley InterscienceNew York(1986)；Walter，H.Brooks.D.E.，和Fisher，D.，“水性兩相系統(tǒng)中的分配”Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems，AcademicPressorlando，F(xiàn)L(1985)。
下列文獻與熱分離聚合物有關(guān)Malcolm.和Rowlinson，(1975).Trans.Faraday Sac.，53，921；Bailey和Callard，(1959).“聚合物應(yīng)用雜志”J.Appl.Polym，1，56；Home等人，“膠體界面學雜志”J.Colloid Interface Sci.，35，77；Saeki等人，J.Chem Soc.Faraday Trans.1，79，975；Fujishige等人(1989)“物理化學雜志”J.Phys.Chem，93，3311；Galeav和Marttiasson，(1993).“微生物酶學技術(shù)”EnzymeMicrob.Technol.，15，354；和Chen和Hoffman，(1995).“自然”Nature，373，49。
與內(nèi)切葡聚糖酶C有關(guān)的文獻如下。Moser等人，“應(yīng)用和環(huán)境微生物學”Applied and Environmental Microbiology(1989)552480-2487；“分子微生物學”Molecular Microbiology(1991)51221-1233Coutinho等人，“分子微生物學”Molecular Microbiology(1992)61243-1252；和Coutinho等人，“FEMS微生物學雜志”FEMS Microbiology Letters(1993)113211-218。對于b-1，4-葡聚糖酶，參見Gilkes等人(1991)“微生物回顧”Microbial Reviews 55303-315。也參見Miller，Jr.，等人(1995)“紙漿工業(yè)生物技術(shù)第6次國際會議”Proc.6th Int.Conf.onBiotechnology in the Pulp and Paper Industry，Vienna，Austria.
發(fā)明概述本發(fā)明提供水相分離和/或純化系統(tǒng)以及它們的制備和應(yīng)用方法，系統(tǒng)以聚合物-配體共軛物為基礎(chǔ)，其中聚合物是寡糖聚合物，待分離和/或純化的組合物包含與寡糖聚合物結(jié)合的配體。配體是與多糖結(jié)合的肽(PBP)，它是一段、可與形成相的寡糖聚合物結(jié)合的氨基酸序列。組合物通常是發(fā)酵液、細胞裂解液、生物液體或其它含有包含與PBP融合的感興趣的大分子或化學組分的化合物的液體。相分離系統(tǒng)包括一個或多個相形成寡糖聚合物和相誘導聚合物、另一種相誘導劑或誘導相分離的方法。方法包括使相分離系統(tǒng)與組合物接觸，組合物在誘導相分離和組合物分離后分配入寡糖聚合物相。組合物可用低離子強度、高pH的或含有離液序列高的試劑的除去液來從寡糖聚合物中除下。或者，可通過在化合物和多糖結(jié)合物間摻入蛋白水解酶的識別序列來用特異性或非特異性蛋白水解酶將化合物從與寡糖聚合物連接的多糖結(jié)合物上酶法除下。當用蛋白水解酶時，它可與第二種多糖結(jié)合物連接，該多糖結(jié)合物對晶體多糖有親和性而第一種多糖結(jié)合物對晶體多糖無親和性?；蛘?，蛋白水解酶可用后續(xù)的從固體多糖上洗脫下來回收。另外，與第二種多糖結(jié)合物連接的蛋白水解酶可與不連接多糖連接肽的固體多糖支持物連接。本發(fā)明提供分離和/或純化蛋白質(zhì)和其它與PBP連接的化合物的應(yīng)用。
附圖簡述

圖1顯示了根據(jù)糞肥纖維單孢菌(Cellulomonas fimi)內(nèi)切葡聚糖酶C(CenC)的纖維素結(jié)合域(N1和N2)(Coutinho等人，“分子微生物學”Mol.Microbiol.(1991)51221-1233)和CceCelCCE(一種取自纖維分解梭狀芽孢桿菌(Clostridiumcellulolyticum)的纖維素酶)(Bagnarda-Tardif等人，“基因”Gene(1992)11917-28)、MxaEgl(取自黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)的β-1，3-葡聚糖酶)(Quillet等人，“基因”Gene(1995)15823-29)、SreCell(一種取自網(wǎng)狀鏈霉菌(Streptomyces reticuli)的纖維素酶)(Schlochttermeier等人，“分子微生物學”Mol.Microbiol.(1992)63611-3621)，和TfuEl(一種取自褐色熱單孢(Thermomonospora fusca)的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶)(Lao等人，“細菌”Bacteriol.(1991)1733397-3407)的假定的纖維素結(jié)合域的氨基酸序列排列的共有序列。氨基酸殘基用單個字母表示。橫線(-)表示留待改善排列的間隙。
圖2顯示用于在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達PBDN1的pTugA載體的圖式。采用pTugA可導致高水平誘導型轉(zhuǎn)錄、增強的RNA翻譯、便攜性、高拷貝數(shù)、穩(wěn)定性和通用性。pTug載體含有可提高拷貝數(shù)的從pUC13獲得的突變型pMBl ori(Minton等人，F(xiàn)ocus(1988)1056)，和被LacIq強阻抑的高強度誘導型tac啟動子(Ptac)。lacIq等位基因被插入pTug中以維持Ptac和lacIq之比恒定，保證大腸桿菌宿主中阻抑子有足夠的水平。基因10翻譯增強子(Oline等人，Gene(1988)73227)也插入pTug載體中。將糞肥纖維單孢菌的內(nèi)切葡聚糖酶A(CenA)的前導序列插入載體中以便從大腸桿菌上清液中回收重組多肽。圖2A顯示了NcoI-HindIII區(qū)的核苷酸和編碼的氨基酸序列以及NcoI位點上游區(qū)域的核苷酸序列，包括基因10翻譯增強子(“gl0”)和CenA前導序列(“l(fā)eader”)。圖2B顯示了pTug載體圖譜。
圖3顯示了pTugAS載體的圖式。圖3A表示SacI-HindIII區(qū)的核苷酸和編碼的氨基酸序列，以及SacI位點上游區(qū)域的核苷酸序列。圖3B顯示了pTugAS載體圖譜。
圖4表示pTugEO7K3的構(gòu)建過程。將pTugA的衍生物pTugK用NcoI完全酶切，pTugK上的抗氨芐青霉素的選擇性標記用抗卡那霉素的選擇性標記代替。粘性末端用大腸桿菌DNA聚合酶I(Klenow片段)修補成平整末端限制性位點。然后用HindIII完全酶切修飾過的pTugK載體，分離獲得4.2kbp的片段。pTZE07(Ong等人，Biotechnol.Bioeng.(1993)42401-409)用BamHI完全酶切，粘性末端用大腸桿菌DNA聚合物I(Klenow片段)修補成平整末端限制性位點。然后用HindIII完全酶切修飾過的pTZE07載體，分離獲得2.1kbp的片段。連接4.2和2.1kbp片段形成pTugE07K3。
圖5表示pTugKN1的構(gòu)建過程。用NheI和HindIII完全酶切pTugE07K3除去含有CBDCex的1.8kbp片段，分離獲得4.5kbp的片段。在編碼CBDN1的基因片段的5′和3′端用PCR引入合適的限制性位點。相符于成熟CBDN1的N末端(丙氨酸-絲氨酸)，在cbdN1的5′末端用寡核苷酸5′-TTACCTCATATGGCTAGCCCGATCGGGGAGGGAACG-3′引入NheI位點(下劃線)作為沉默誘變。在cbdNI的3′末端用寡核苷酸5′-AGAATGAATTCAAGCTTAGAGCTCGACCTCGGAGTC-3′引入HindIII位點。該引物中也包含翻譯終止密碼子。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)混合物(總體積50ml)中含有10-100ng模板DNA(pTZ-JC3)(Coutinho等人，Mol.Microbiol.(1992)61243-1252)，25-50pmole(300ng)的引物，2mM MgCl2，6％的二甲亞砜，0.2mM 2′-脫氧核苷5′-三磷酸鹽和1單位的TaqDNA聚合酶在50mM，pH8.3的Tris HCl緩沖液中。然后如下進行28次連續(xù)的循環(huán)在94℃下變性15秒，在57℃退火1.4分鐘，在72℃使引物延伸1.5分鐘。得到的CBDN1PCR片段用NheI和HindIII完全酶切，經(jīng)沉淀純化0.5kdp的片段。連接4.5kbp和0.5kbp的片段形成pTugKN1。
圖6顯示了pTugKN1載體。pTugKN1載體通過用抗卡那霉素的選擇性標記來代替抗氨芐青霉素的選擇性標記(β-內(nèi)酰胺酶的編碼序列)從pTugA載體衍生獲得。編碼糞肥纖維單孢菌內(nèi)切葡聚糖酶A(CenA)的前導肽序列用編碼糞肥纖維單孢菌外切葡聚糖酶A(CenA)的前導肽的序列代替(Ong等人，“生物工程生物技術(shù)”Biotechnol.Bioeng(1993)42401-409)。
圖7顯示PBDN1的陰離子交換層析結(jié)果。將部分純化的PBDN1(200ml中有150mg)上樣(1ml/min)在陰離子交換柱(MonoQ)上，柱用20mM，pH6.0的磷酸鉀緩沖液平衡。在用pH6.0的緩沖液200ml洗柱后，用鹽梯度洗脫(600ml，0-1MNaCl，在pH6.0的磷酸鉀緩沖液中)回收連接的蛋白質(zhì)(8ml組分)。PBDN1在300mM鹽濃度時從柱中獲得(峰1)。雜蛋白連接更加牢固，在更高鹽濃度下除去(峰2)。
圖8表示在純化過程中對培養(yǎng)上清液中的PBDN1進行SDS-PAGE分析。在含有12.5％的丙烯酰胺凝膠上分析有pTugKN1(誘導)的JM101培養(yǎng)基上清液(泳道2)、整個培養(yǎng)基懸浮液(細胞和培養(yǎng)液)(泳道3)、培養(yǎng)基上清液中的蛋白質(zhì)結(jié)合后的微晶纖維素(Avicel)組分(泳道4)、上清液與微晶纖維素結(jié)合后的流通組分(泳道5)、用水從微晶纖維素洗脫下的組分(泳道6)和在MonoQ純化后的PBDN1(泳道7和8)。分子量標準(泳道1)如圖示。
圖9表示用親和電泳凝膠來分析PBP(PBDN1和PBDN1N2)。在含有13％丙烯酰胺的非變性凝膠上分析純化牛血清白蛋白(BSA)(泳道1)、PBDN1(泳道2)和PBDN1N2(泳道3)與可溶性寡糖的結(jié)合。在多糖((0.1％W/V)羥基乙基纖維素(HEC)或大麥葡聚糖)存在時(+)凝膠上的阻滯和在多糖不存在時(-)它們的遷移來表示結(jié)合。木聚糖用作一種不結(jié)合的多糖。每個凝膠上每種蛋白質(zhì)的上樣量為5mg。圖9A比較了在有(+)和沒有(-)大麥β-葡聚糖時的結(jié)合情況；圖9B比較了在有(+)和沒有(-)羥基乙基纖維素時的結(jié)合情況，圖9C比較了在有(+)和沒有(-)樺木木聚糖時的結(jié)合情況。
圖10顯示用于構(gòu)建pTZ-JC13(圖10C)的載體。圖10A表示pTZ-JC2，它含有編碼整個CenC的基因片段，用于獲得編碼PBDN1的片段。圖10B顯示載體pUC18-1.6 cenA_PT，它用于獲得CenA編碼片段。
圖11顯示用SDS-PAGE分析CenA和PBDN1-CenA融合蛋白的蛋白水解產(chǎn)物的分析結(jié)果。在pH7.0，50ml磷酸鹽緩沖液(50mM)中8mg多肽與0(泳道5和9)、0.1(泳道4和8)、0.5(泳道3和7)或1.0單位(泳道2和6)的糞肥纖維單孢菌蛋白水解酶在30℃培育3小時。反應(yīng)產(chǎn)物在含有12.5％丙烯酰胺的凝膠上進行分析。分子量標準(泳道1)如圖示。在蛋白水解除去纖維素結(jié)合域后P30與CenA的催化域一致(Gilkes等人，“生物化學雜志”J.Biol.Chem(1988)26310401-10407)。
圖12顯示通過示差吸附至纖維素上然后用SDS-PAGE分析未吸附的多肽來分離CenA和PBDN1-CenA的結(jié)果。在圖12A中，等份的含有25mg(泳道2和3)、100mg(泳道4和5)或250mg(泳道6和7)兩種多肽的緩沖液在有細菌微晶纖維素(BMCC(+))或沒有細菌微晶纖維素(BMCC(-))下培育。在圖12B中，還顯示了含有BMCC培育混合物中的未吸附組分的上清液進一步與磷酸溶脹纖維素(PASC(+))培育的結(jié)果，同時顯示了未加PASC(-)的對照樣品的結(jié)果。
圖13A和13B是固定作用的示意圖和融合蛋白的應(yīng)用。圖13A表示了批量生產(chǎn)、純化和固定融合蛋白。圖13B顯示了融合蛋白質(zhì)在用可重復使用的發(fā)酵罐-固定柱系統(tǒng)來將纖維素性材料水解成葡萄糖的應(yīng)用。
圖14顯示兩種可除去的標記組合物，以及酶法將可除去的標記從纖維素底物上除下的方法箭頭表示化學物質(zhì)，空心的方框表示特異性蛋白水解酶的蛋白水解酶切位點，有陰影的方框表示纖維素結(jié)合域。
圖15顯示羥基乙基纖維素與CBDN1在50mM，pH7的磷酸鹽緩沖液中在35℃結(jié)合的等滴定微量熱數(shù)據(jù)。
圖16顯示羥基乙基纖維素與Pluronic P105的混合物在50mM，pH7的PBS中在35℃的初步相平衡數(shù)據(jù)。
圖17表示以新的CBDN1融合技術(shù)為基礎(chǔ)的親和分配系統(tǒng)的示意圖。在滲濾除去過量的鹽的步驟后，通過在合適的Xa和Xa-CBD融合蛋白表達系統(tǒng)的靶蛋白-1處插入的Xa因子IQGR特異性識別位點的斷裂，靶蛋白可按需從融合構(gòu)建物上回收獲得(參見Assouline等人(1993)Protein Eng.，7787)。通過在親和分配步驟后Xa因子的直接斷裂來直接回收靶蛋白可簡化過程。
圖18表示在水中和100mM檸檬酸鹽緩沖液中UCON 50-HB-5100的實驗性濁點圖。對于10°(w/w)的UCON溶液，在二元混合物中相分離在323K時發(fā)生，在含有緩沖液的系統(tǒng)中則在312K時發(fā)生。
具體實施例詳述本發(fā)明提供了用于純化和/或分離與相形成寡糖聚合物結(jié)合的組合物的水相分離系統(tǒng)。通常，組合物包括與多糖結(jié)合的肽(PBP)，它包含對寡糖聚合物有高度親和力的氨基酸序列，如與多肽或感興趣的化學物質(zhì)共軛的多糖的多糖結(jié)合域(PBD)。然而，多糖結(jié)合肽可包括任何與寡糖聚合物結(jié)合的氨基酸序列。本發(fā)明也提供了制備PBP的方法；其中PBP可從多糖酶的PBD、多糖結(jié)合蛋白或設(shè)計成可與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)的結(jié)合域衍生獲得。PBP可天然產(chǎn)生或人工合成。當PBP是PBD或是從PBD衍生獲得時，氨基酸序列通常基本上沒有多糖酶的水解酶活性，但仍保留了與底物結(jié)合的活性。
相分離系統(tǒng)通常包括兩相，它們是由于相分離系統(tǒng)的組分在混合時的不相容而產(chǎn)生的。系統(tǒng)的一種組分是形成相的寡糖，第二種組分是相誘導試劑，如與寡糖聚合物不相容的第二種聚合物，或是強電解質(zhì)，特別是鹽，如硫酸鹽或檸檬酸鹽，它的高濃度足以誘導相分離。當相形成寡糖是熱分離聚合物時，可通過對含有待純化化合物和相形成聚合物的組合物加熱來誘導相分離直至相分離產(chǎn)生。
采用相分配系統(tǒng)的步驟包括使含有多糖結(jié)合肽的組合物與相分離系統(tǒng)接觸。相分配系統(tǒng)可以預先混合，或組合物的任一組分可以干狀形式(如凍干)加入。例如，寡糖聚合物可加入組合物中從而誘導聚合物重新水合并且相分離。在一些應(yīng)用中，可采用兩種以上的相。在組合物充分分配入寡糖聚合物相后可分離相。通過調(diào)節(jié)系統(tǒng)pH、聚合物濃度和分配電解質(zhì)的加入量可將雜蛋白分配入富含多糖相的量(非親和作用)減少到最低。通過最優(yōu)條件的操作，兩水相的多級接觸可完全或部分(但是充足的)純化目標組合物。
含有感興趣的多肽或化學物質(zhì)的組合物可通過聚合物與能夠?qū)琍BP的組合物洗脫的洗去溶液接觸來從聚合物上除下，或者包含PBP的組合物可通過在化合物和PBP間包含一個蛋白水解酶識別位點或化學斷裂位點用酶法除下。在后一種方法中，PBP仍與寡糖聚合物結(jié)合。識別位點的例子包括那些膠原酶、凝血酶和因子Xa的可被各自相應(yīng)的酶特異性裂解的識別位點。也可用對例如低pH或溴化氰敏感的化學斷裂位點。
為便于除下，特異性裂解酶可以裂解酶復合物的形式提供，其中裂解酶可與有和其它PBP不同的底物結(jié)合特性的PBP結(jié)合，它可與可溶性寡糖聚合物結(jié)合或與其它不是僅有多糖物理結(jié)構(gòu)差異的不同的多糖結(jié)合。第二種PBP最好和與第一種PBP不結(jié)合的不溶性多糖結(jié)合。不溶性多糖可加入含有感興趣的化合物的混合物中以將裂解酶復合物從溶液中除去。在從溶液分離出后，裂解酶復合物可從不溶性多糖中除去并重新使用?；蛘撸呀饷笍秃衔锟深A先與不溶性多糖結(jié)合，例如在采取含有感興趣混合物的化合物流過柱的形式時。
本發(fā)明與現(xiàn)用的水相分離系統(tǒng)相比還提供了幾個優(yōu)點。寡糖聚合物，包括糖類聚合物如纖維素或其它β-葡聚糖類，如從燕麥或大麥獲得的糖類聚合物是很多的、廉價的。而且，各種蛋白質(zhì)可與糖類聚合物和其它寡糖類特異性結(jié)合，可作為本發(fā)明的PBP的來源。例如，融合蛋白可制備成含有與糖類結(jié)合的蛋白質(zhì)的糖類聚合物結(jié)合部位，以便用本發(fā)明的相分離系統(tǒng)分離和/或純化融合蛋白。因此，PBP的應(yīng)用為親和分離和/或純化任何多肽或化學物質(zhì)提供了通用的方法，即將多肽或化學物質(zhì)與可結(jié)合相形成寡糖聚合物的PBP連接。與寡糖聚合物的PBP選擇性結(jié)合特別適用于通過單個寡糖聚合物相分離系統(tǒng)來純化和/或分離各種化合物。因此不需要為每種待分離化合物制備單獨的相分離系統(tǒng)，即為每種化合物制備具體的聚合物配體。同樣寡糖與其它相分離采用的聚合物相比有許多結(jié)合位點，因此大大提高了聚合物與分配配體結(jié)合的容量。
在兩相系統(tǒng)中用一種或多種熱分離聚合物提供的優(yōu)點是在含有與PBP結(jié)合的聚合物的相的高度親和分離后可用簡單的方法來回收和循環(huán)使用聚合物。PBP化合物與聚合物特異性牢固結(jié)合，但用水或在高pH、室溫至生理溫度(通常小于40℃，在20℃)下洗脫很容易除去。對于沒有蛋白質(zhì)的化合物，PBP可用通用的蛋白水解酶如蛋白水解酶K在30℃、pH7.0下從化合物中除去。因此PBP提供了一種使化合物與寡糖聚合物連接的方式，使得化合物在以后可被除去。也可獲得對相形成寡糖有不同親和性的突變型PBP或PBD來滿足具體的系統(tǒng)和/或應(yīng)用的不同親和力。如果需要PBP可包括整個多糖酶，它包括有水解活性的蛋白質(zhì)或當用只含PBP的序列時基本上沒有水解活性的蛋白質(zhì)。后者是所需的，此時底物保持完整性從而可被重復使用。用上述的解吸溶液來處理多糖并不改變多糖的表面結(jié)構(gòu)。另一種方法包括用非特異性蛋白水解酶直接作用在共軛物上來去除PBP共軛物與骨架的結(jié)合而不修飾多糖表面。通過在PBP和感興趣的化合物間引入一個可被特定試劑消除的連接基團，也可單獨獲得感興趣的化合物而使PBP仍與寡糖聚合物結(jié)合。本系統(tǒng)的其它重要優(yōu)點是它從實驗操作到工業(yè)操作可按體積線性放大，而且系統(tǒng)可進行連續(xù)操作。
新的多肽組合物包含有下式的多肽PBP-MR-X(1)其中PBD是指多糖酶的底物結(jié)合域或其它與多糖底物結(jié)合的蛋白質(zhì)的連續(xù)氨基酸序列，它提供了與多糖酶的底物高度親和結(jié)合并且任選地，基本上沒有多糖酶活性。PBP至少與結(jié)合多糖所需的用于相分離系統(tǒng)的氨基酸序列的最小數(shù)目一樣大，還有一個特點是可與相形成寡糖結(jié)合；MR是中等的區(qū)域，可以是一個鍵、有2至30個碳原子或約2至20個氨基酸的短連接基團。該區(qū)域可包括融合蛋白特異性裂解的氨基酸序列，通常是高度特異性的蛋白水解酶如IgA1蛋白水解酶或因子Xa識別的序列；和X可以是任何感興趣的肽或化學物質(zhì)。X的特點是有感興趣的多肽的整個序列，可以是酶、激素、免疫球蛋白、肽等。
新的多肽組合物包括有下式的多肽PBP-Z(2)或PBP-MR-Z(3)其中PBP和MR如上所述；Z是與PBP連接的化學物質(zhì)。Z只表示種類，并不表示種類的化學計量比?；瘜W計量比可以不同。
PBP可通過各種來源獲得，包括本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)有用的寡糖結(jié)合酶。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)兩種寡糖有用，(1)相分離系統(tǒng)中的寡糖和(2)固相系統(tǒng)中所用的寡糖，如用于除去裂解酶的寡糖。相分離系統(tǒng)寡糖通常在水性溶液中是可溶的，對于含有PBP和感興趣的可相分離的化合物的結(jié)合有高的親和性和容量，使得含有多糖結(jié)合肽的化合物在一個相內(nèi)高度富集，通?！菁s70％，最好≥80％。下表1是已知的寡糖與另一種聚合物或強電解質(zhì)形成水性兩相系統(tǒng)的部分表單。
表1相形成寡糖無電荷多糖化合物1有電荷多糖低分子量葡聚糖 葡聚糖羧甲基鈉 從纖維素(纖維三糖、纖維四糖等)衍生獲得的糊精羥丙基葡聚糖 纖維素羧甲基鈉 木糖、木二糖、木三糖等羧甲基葡聚糖葡聚糖硫酸鈉衍生物 麥芽糖糊精和麥芽糖糊精 DEAE葡聚糖阿拉伯半乳聚糖 聚半乳糖醛酸(果膠)羥丙基淀粉支鏈淀粉甲基纖維素羥乙基纖維素乙基羥乙基纖維素羧甲基纖維素羥丙基纖維素菲可(Ficoll)羧甲基淀粉羥乙基淀粉支鏈淀粉1聚合物可以是原料或純化過的。
其它可形成兩相系統(tǒng)的多糖包括低分子量纖維糖的混合物；脫乙酰殼多糖和其它殼多糖衍生物；所有的水溶性葡聚糖(α、β和/或聚合程度大于3的混合連接物)、修飾的葡聚糖和/或衍生的葡聚糖；谷類β-葡聚糖如大麥或燕麥β-葡聚糖；和甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳糖甘露聚糖、木葡聚糖。
另一類形成兩相系統(tǒng)的多糖聚合物包括水溶性的兩性聚合物，它可在水中熱分離。當聚合物的二元水性溶液加熱超過它的濁點溫度(CPT)時，溶液相分離成兩宏觀相。一相，通常是底相，富含聚合物，而另一相典型地只含有少量或不含聚合物。已知的有熱分離性質(zhì)的以多糖為基礎(chǔ)的聚合物包括甲基纖維素、乙基羥乙基纖維素、丙基羥乙基纖維素和羥丙基甲基纖維素。然而，基本上任何水溶性的β-1，4-連接的纖維糖應(yīng)當表現(xiàn)出熱分離性質(zhì)。Johansson等人(1993)，“大分子學”Macromolecules，26，4478；Harris等人，(1991).“生物分離方法”Bioseparations 2，237；Alfred P.A.等人(1992).“生物分離方法”Bioseparations 2，363；和Alfred P.A.等人(1994).“層析學雜志”J.Chromatog.，659，289。其它可熱分離的水溶性聚合物包括聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚丙二醇及環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的線性隨機共聚物(商品名為UCON和Pluronic)。
對于固相回收系統(tǒng)，可用各種多糖底物。它們包括纖維素、由D-吡喃葡糖單元加入β-1，4-葡糖鍵和它的酯如纖維素乙酸酯組成的多糖；木聚糖，其中重復的骨架單元是β-1，4-D-吡喃木糖；殼多糖，它與纖維素相似，由β-1，4-連接的N-乙酰，2-氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡糖單元組成。可與多糖結(jié)合的酶，如上面列出的，是本發(fā)明感興趣的可與這些底物結(jié)合的氨基酸序列的來源。
在下表6中列出了那些與一個或多個可溶/不溶性多糖結(jié)合的結(jié)合域，它們包括對可溶葡聚糖有親和力的所有結(jié)合域(α、β和/或混合鍵)。糞肥纖維單孢菌的內(nèi)切葡聚糖酶CenC的N1纖維素結(jié)合域是唯一與可溶性纖維多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)并且是與任何可溶多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)小類中的一個。同樣，表2至5是含有推斷的β-1，3-葡聚糖結(jié)合域(表2)；含有鏈球菌葡聚糖結(jié)合重復體的蛋白質(zhì)(Cpl超家族)(表3)；有殼多糖結(jié)合域的酶(表4)和淀粉結(jié)合域(表5)。
表2含有假定的β-1，3-葡聚糖結(jié)合域的蛋白質(zhì)的總結(jié)來源(菌株)1蛋白質(zhì) 登記號參考文獻2I型環(huán)狀芽孢桿菌 GLCAl P23903/M34503/JQ0420 1(B.circulans)(WL-12)環(huán)狀芽孢桿菌(IAM 1165) BglHJN0772/D1 7519/S670332II型馬杜拉放線菌種XynII U088943(Actinomadura sp.)(F7C)節(jié)桿菌種(Arthrobacter sp.) GLCI D236689(YCWD3)溶黃色厄斯考維氏菌屬 GLC P22222/M60826/A390944(O.xanthineolytica)R.faecitabidus(YLM-50) RPI Q05308/A45053/D107535a，b
R.communis Ricin A12892 6藍色鏈霉菌 XlnA P26514/M64551/JS07986 7(S.lividans)(1326)T.iridentatus FactorGa D16622 81B.芽孢桿菌屬，O.厄斯考維氏菌屬，R.faecitabidusRarobacterfaecitabidus，R.communisRicinus communis，S鏈霉菌屬，TTachypleus(Horseshoe Crab)2參考文獻1)Yahata等人(1990)“基因”Gene 86，113-117；2)Yamamoto等人(1993)“生物學，生物技術(shù)和生物化學”Biasci.Biotechnol.Biochem.57，1518-1525；3)Harpin等人(1994)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；4)Shen等人(1991)“生物化學雜志”J.Biol.Chem 266，1058-1063 5a)Shimoi等人(1992)“生物化學雜志”J.Biol.Chem.267，25189-25195；5b)Shimoi等人(1992)“生化雜志”J.Biochem 110，608-613；6)Horn等人(1989)專利AI2892；7)Shareck等人(1991)“基因”Gene 107，75-82；8)Saeki等人(1994)“生物化學雜志”J.Biol.Chem.269，1370-1374；9)Watanabe等人(1993)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library表3含有鏈球菌葡聚糖結(jié)合重復體(Cpl超家族)的蛋白質(zhì)的總結(jié)來源 蛋白質(zhì)登記號 參考文獻1唐尼鏈霉菌 GTF-ID13858 1(S.downei(sobrinus))(0MZ176)唐尼鏈霉菌(sobrinus)(MFe28) GTF-I P11001/M17391 2唐尼鏈霉菌(MFe28) GTF-S P29336/M30943/A41483 3唐尼鏈霉菌(6715) GTF-I P27470/D90216/A38175 4唐尼鏈霉菌 DEI L34406 5突變型鏈霉菌GBP M30945/A37184 6(S.mutants)(Ingbritt)突變型鏈霉菌(GS-5) GTF-BA33128 7突變型鏈霉菌(GS-5) GTF-B P08987/M17361/B33135 8突變型鏈霉菌GTF-B3′-ORFP05427/C331358突變型鏈霉菌(GS-5) GTF-C P13470/M17361/M22054 9
突變型鏈霉菌(GS-5) GTF-C 無 10突變型鏈霉菌(GS-5) GTF-D M29296/A4586611唾液鏈霉菌 GTF-J A44811/S22726/S28809 12(S.salivarius) Z11873/M64111唾液鏈霉菌 GTF-K S22737/S22727/Z11872 13唾液鏈霉菌(ATCC25975) GTF-L L3549514唾液鏈霉菌(ATCC25975) GTF-M L3592814肺炎鏈霉菌(S.pneumoniae)R6 LytA P06653/A25634/M13812 15肺炎鏈霉菌 PspA A41971/M7412216噬菌體HB-3 HBLP32762/M3465217噬菌體Cp-1 CPL-1 P15057/J03586/A31086 18噬菌體Cp-9 CPL-9 P19386/M34780/JQ0438 19噬菌體EJ-1 EJL A4293620艱難梭菌 ToxA P16154/A37052/M30307 21(C.difficile)(VPI 10463) X51797/S08638艱難梭菌(BARTS W1) ToxA A60991/X1719422艱難梭菌(VPI 10463)ToxB P18177/X53138/X60984 23，24S10317艱難梭菌(1470) ToxB S44271/Z2327725，26諾維氏梭菌(C.novyl)a-toxinS44272/Z2328027諾維氏梭菌α-毒素Z48636 28醋酪酸梭菌(C.acetobutylicum) CspA S49255/Z37723 29(NCIB8052)醋酪酸梭菌(NCIB8052) CspB Z50008 30醋酪酸梭菌(NCIB8052) CspC Z50033 30醋酪酸梭菌(NCIB8052) CspD Z50009 301參考文獻1)Sato等人(1993)“DNA序列”DNA sequence 4，19-27，2)Ferreti等人(1987)“細菌雜志”J.Bacteriol.169，4271-4278；3)Gilmore等人(1990).“感染免疫雜志”J.Infect.Immun.58，2452-2458.4)Abo等人(1991)“細菌雜志”J.Bacteriol.173，989-996，5)Sun等人(1994)“細菌雜志”J Bacteriol.176，7213-7222.6)Banas等人(1990)“感染免疫雜志”J.Infect.Immun.58.667-673；7)References-cont′d Shiroza等人(1990)“蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)手冊”ProteinSequence Database.8)Shiroza等人(1987)“細菌雜志”J.Bacteriol.169，4263-4270；9)Ueda等人(1988)“基因”Gene 69.101-109；10)Russel(1990)Arch.Oral.Biol.35，53-58；11)Honda等人(1990)“微生物基因雜志”J.Gen.Microbiol.136，2099-2105；12)Giffard等人(1991)“微生物基因雜志”J.Gen.Microbiol 137，2577-2593；13)Jacques(1992)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL DataLibrary14)Simpson等人(1995)“感染免疫雜志”J.Infect Immun 63.609-621，15)Gargia等人(1986)“基因”Gene 43，265-272；16)Yother等人(1992)“細菌雜志”J.Bacteriol.174，601-609；17)Romero等人(1990)“細菌雜志”J.Bacteriol.172.5064-5070；18)Garcia等人(1988)“美國國家學院研究會”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，914-91819)Garcia等人(1990)“基因”Gene 86.81-88.20)Diaz等人(1992)“細菌雜志”J.Bacteriol.174.5516-5525；21)Dove等人(1990)“感染免疫雜志”J.Infect.Immun.58.480-488.22)Wren等人(1990)“FEMS微生物雜志”FEMS Microbiol.lett.70.1-6；23)Barroso等人(1990)“核酸”Nucleic Acid Res 18，4004-4004；24)von Eichel-Streiber er al.(1992)“分子基因?qū)W”Mol.Gen.Genet.233，260-268；25)Sartinger等人(1993)“FMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；26)von Eichel-Streiber er al.(1995)“分子微生物學”Mol.Microbiol.In Press27)Hofmann等人(1993)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library28)Hofmann等人(1995)“分子基因?qū)W”Mol.Gen.Genet.In Press；29)Sanchez等人(1994)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBLData Library，30)Sanchez等人(1995)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL DataLibrary.
表4有殼多糖結(jié)合域的酶的總結(jié)來源(菌株) 蛋白質(zhì) 登記號 參考文獻2細菌酶I型氣單胞菌屬(Aeromonas sp.) Chi D318181(No10S-24)環(huán)狀芽孢桿菌(WL-12) ChiA1 P20533/M57601/A383682環(huán)狀芽孢桿菌(WL-12)ChiD P27050/D10594 3Janthinobacterium lividum Chi69 U07025 4灰色鏈霉菌 蛋白酶A53669 5(Streptomyces griseus)CII型豚鼠氣單胞菌 Chi U09139 6(Aeromonas cavia)(K1)Alteromonas sp(0-7) Chi85A40633/P32823/D13762 7加利福尼亞Autographa(C6) NPH- P41684/L22858 8128粘質(zhì)沙雷氏菌ChiA A25090/X03657/L01455/P07254 9(Serratia marcescens)III型少孔根霉菌(Rhizopus Chi1 P29026/A47022/D10157/S27418 10oligosporus)(IFO8631)少孔根霉菌(IFO8631) Chi2 P29027/A47022/D10158/S27419 10釀酒酵母菌 Chi S50371/U17243 11(Saccharomyces cerevisiae)釀酒酵母菌(DBY939)Chi1 P29028/M74069 12釀酒酵母菌(DBY918)Chi2 P29029/M7407/B41035 12植物酶Hevein超家族大蒜(Allium sativum) Chi M9410513Amaranthus caudatus AMP-1bP27275/A40240 14，15Amaranthus caudatus AMP-2bS37381/A40240 14，15擬南芥(Arabidopsis thaliana) ChiB P19171/M38240/45511 16(CV.colombia)擬南芥 PHPc U0188017勝利油菜(Brassica napus)Chi U2184818勝利油菜 Chi2 Q09023/M95835 19Hevea brasiliensis HevidP02877/M36986/20，21A03770/A38288大麥(Hordeum vulgare) Chi33 L3421122番茄(Lycopersion esculentum)Chi9 Q05538/Z15140/S37344 23紅花煙草(Nicotiana tabacum) CBP20eS72424 24紅花煙草 Chi A21091 25紅花煙草 Chi A29074/M15173/S20981/S19855 26(cv.Havana)紅花煙草(FB7-1) ChiJQ0993/S0828 27紅花煙草(cv.Samsun) Chi A116119 28紅花煙草(cv.Havana) ChiP08252/X16939/S08627 27紅花煙草(cv.BY4) Chi P24091/X51599/X64519//S13322 26，27，29紅花煙草(cv.Havana) Chi P29059/X64518/S20982 26稻(Oryza sativum)(IR36) ChiA L37289 30稻ChiB JC2253/S42829/Z29962 31稻Chi S39979/S40414/X56787 32稻(cv.Jaonicum)ChiX56063 33稻(cv.Jaonicum)Chi1 P24626/X54367/S14948 34稻Chi2 P25765/S15997 35稻(cv.Japonicum)Chi3 D16223 32稻ChiA JC2252/S4282830稻Chi1 D16221 32稻(IR58)ChiU02286 36稻ChiX87109 37豌豆(Pisum sativum) Chi P36907/X63899 38(cv.Birte)豌豆(cv.Alcan) Chi2 L37876 39Populus trichocarpa Chi S18750/S18751/X59995/P29032 40Populus trichocarpa(H11-11)ChiU01660 41菜豆(Phaseolus vulgaris) Chi A24215/S43926/Jq0965/P36361 41(cv.Saxa)菜豆(cv.Saxa) Chi P06215/M13968/M19052/A25898 43，44，45黑接骨木(Sambucus nigra) PR-3fZ4694846黑麥(Secale cereale) Chi JC207147馬鈴薯(Solanum tuberosum) ChiB1 U02605 48馬鈴薯 ChiB2 U02606 48馬鈴薯 ChiB3U02607/S43317 48馬鈴薯 ChiB4 U02608 48馬鈴薯(cv.Maris Piper) WIN-1gP09761/X13497/S04926 49馬鈴薯(cv.Maris Piper) WIN-2gP09762/X13497/S04927 49小麥(Triticum aestivum) Chi S38670/X7604150小麥 WGA-1hP10968/M25536/S09623/S07289 51，52小麥 WGA-2hP02876/M25537/S09624 51，53小麥 WGA-3hP10969/J02961/S10045/A28401 54美洲榆(Ulmus americana) Chi L22032 55(NPS3-487)大蕁麻(Urtica dioica)AGLiM87302 56Vigna unguiculata Chi1X88800 57(cv.Red caloona)NHP細胞核多角體病毒內(nèi)切殼多糖酶樣序列Chi殼多糖酶b抗微生物肽，chevein前體樣肽，dhevein，e殼多糖結(jié)合蛋白，f病理性(patogenesis related)蛋白，g傷口誘導型(wound-induced)蛋白，h麥胚凝集素，凝集素1殼多糖結(jié)合域的參考文獻1)Udea等人(1994)“發(fā)酵生物工程雜志”J，F(xiàn)erment.Bioeng.78，205-211；2)Watanabe等人(1990)“生物化學雜志”J.Biol.Chem.265，15659-16565；3)Watanabe等人(1992)“細菌雜志”J.Bacteriol.174，408-414；4)Gleave等人(1994)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；5)Sidhu等人(1994)“生物化學雜志”J.Biol.Chem.269，20167-20171；6)Jones等人(1986)“EMBO雜志”EMBO J.5，467-473；7)Sitrit等人(1994)“EMB數(shù)據(jù)手冊”EMBData Library；8)Genbank entry only；9)Tsujibo等人(1993)“細菌雜志”J.Bacteriol.175，176-181；10)Yanai等人(1992)“細菌雜志”J.Bacteriol174，7398-7406；11)Pauley(1994)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；12)Kuranda等人(1991)“生物化學雜志”J.Biol.Chem.266，19758-19767；13)van Damme等人(1992)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；14)Broekaert等人(1992)“生物化學”Biochemistry 31，4308-4314；15)de Bolle等人(1993)“植物分子生理學”Plant Mol.Physiol.22，1187-1190；16)Samac等人(1990)“植物生理學”Plant Physiol.93，907-914；17)Potter等人(1993)“植物分子間宏觀反應(yīng)”Mol.Plant Microbe Interact.6，680-685；18)Buchanan-Wollaston(1995)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；19)Hamel等人(1993)“植物生理學”Plant Physiol.101，1403-1403；20)Broekaert等人(1990)“美國國家學院研究會”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，7633-7637；21)Lee等人(1991)“生物化學雜志”J.Biol.Chem.266，15944-15948；22)Leah等人(1994)“植物生理學”Plant Physiol.6，579-589；23)Danhash等人(1993)“植物分子生物學”Plant Mol.Biol.22，1017-1029；24)Ponstein等人(1994)“植物生理學”Plant Physiol.104，109-118；25)Meins等人(1991)專利EP0418695-A1；26)van Buuren等人(1992)“分子基因?qū)W”Mol.Gen.Genet.232，460-469；27)Shinshi等人(1990)“植物分子生物學”Plant Mol.Biol.14，357-368；28)Cornellisen等人(1991)專利EP0440304-A2；29)Fukuda等人(1991)“植物分子生物學”Plant Mol.Biol.16，1-10；30)Yun等人(1994)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；31)Kim等人(1994)“生物學，生物技術(shù)和生物化學”Biosic.Biotechnot.Biochem.58，1164-1166；32)Nishizawa等人(1993)“分子基因?qū)W”Mol.Gen.Genet.241，1-10；33)Nishizawa等人(1991)“植物科學”Plant Sci 76，211-218；34)Huang等人(1991)“植物分子生物學”Plant Mol.Biol.16，479-480；35)Zhu等人(1991)“分子基因?qū)W”Mol.Gen.Genet.226，289-296；36)Muthukrishhnan等人(1993)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；37)Xu(1995)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；38)Vad等人(1993)“植物學”Plant Sci 92，69-79；39)Chang等人(1994)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library，40)Davis等人(1991)“植物分子生物學”plant Mol.Biol.17，631-639；41)Clarke等人(1994)“植物分子生物學”Plant Mol.Biol.25，799-815；42)Broglie等人(1989)“植物細胞”Plant Cell1，599-607；43)Broglie等人(1986)“美國國家研究委員會”Proc.Natl.acad.Sci.USA 83，6820-6824；44)Lucas等人(1985)FEBS Iett.193，208-210；45)Hedrick等人(1988)“植物生理學”Plant Physiol.86，182-186；46)Roberts等人(1994)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；47)Vamagami等人(1994)“生物學，生物技術(shù)和生物化學”Biosci.Biotechnol.Biochem.58，322-329；48)Beerhues等人(1994)“植物分子生物學”Plant Mol.Biol.24，353-367；49)Stanford等人(1989)“分子基因?qū)W”Mol.Gen.Genet.215，200-208；50)Liao等人(1993)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；51)Smith等人(1989)“植物分子生物學”Plant Mol.Biol.13，601-603；52)Wright等人(1989)“分子進化雜志”J.Mol.Evol.28，327-336；53)Wright等人(1984)“生物化學”Biochemistry 23，280-287；54)Raikhel等人(1987)“美國國家學院研究會”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，6745-6749；55)Hajela等人(1993)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；56)Lerner等人(1992)“生物化學雜志”J.Biol.Chem.267，11085-11091；57)Vo等人(1995)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”.EMBL Data Library表 5含有淀粉結(jié)合域的酶的歸納來源(菌株) 酶 登記號 參考文獻5泡盛曲霉(A.awarori) AMYG P23176/D0042/JT0479 1，2(kawachi變種)黑色曲霉(A.niger)(T21) AMYG S733703黑色曲霉-泡盛曲霉 AMYG1/G2 P04064/A90986/A29166/X 4，5，67，8，900712/X00548 K02465米曲霉(A.oryzae) AMYG(GLAA)P36914/JQ1346/D01035/S 10，1175274/D01108A.Shirousamii AMYG(GLA) P22832/JQ0607/D10460 12芽孢桿菌(Bacillus sp.) AMYaP17692/M33302/D90112/S 13(B1018)09196芽孢桿菌(TS-23) a-AMY U22045 14芽孢桿菌(1-1) CGTP31746/S26399 15芽孢桿菌(6.63) CGTP31747/X66106/S21532 16芽孢桿菌(17-1) CGTP30921/M28053/A37208 17芽孢桿菌(38-2) CGT P09121/M19880/D00129/S 18，1924193芽孢桿菌(1011) CGTP05618/A26678/M17366 20芽孢桿菌(DSM5850)CGT A18991 21芽孢桿菌(KC201) CGT D13068 15，22蠟狀芽孢桿菌(SPOII) b-AMY A48961/P36924/S54911 23環(huán)狀芽孢桿菌 CGTP30920/X68326/S23674 24
(B.circulans)(8)環(huán)狀芽孢桿菌(251)CGTX78145 25地衣形芽孢桿菌 CGTAP14014/X15752/S1592026(B.Licheniformis)軟化芽孢桿菌 CGTM(CDG1) P04830/X5904/S31281 27(B.macerans)(IFO 3490)軟化芽孢桿菌 CGT M1277728(IAM 1243)軟化芽孢桿菌 CGT(CDG2) P31835/S26589 29B.ohbensis CGT P27036/D90243 30嗜熱脂肪芽孢桿菌AMYMbP19531/M36539/S2878431(B.stearothermophilus)嗜熱脂肪芽孢桿菌CGTP31797/X59042/S26588/X 32(NO2) 59043/X59404/S31284羅爾氏伏革菌 AMYG2 D49448 33(C.rolfsii)(AHU 9627)D.discoideum ORF S15693/X51947 34灰色腐質(zhì)霉(H.grisea) GLA1M89475 35(var.thermoidea)H.resinae(ATCC20495)GAMP Q03045/X68143/X67708/S 36-3831422/S33908肺炎克雷白氏桿菌 CGT P08704/M15264/A2902339(K.pneumoniae)(M5A1)粗糙鏈孢霉 GLA-1 P14804/X67291/S13711/S1 40，41(N.crassa)(74-OR23-1A) 3710/S36364嗜糖假單胞菌 MTACP22963/X16732/S0566742(P.saccharophila)(LAMI504)假單胞菌 AMF-1dD10769/JS063/D0114343(Pseudomonas sp.)(KO-8940)司徒茨氏假單胞菌 AMYPcP13507/M24516/A3280344
(P.stutzeri)(MO-19)灰色鏈霉菌(S.griseus)AMY P30270/X57568/S1406345(IMRU 3570)淤泥鏈霉菌(S.limosus) AML P09794/M18244/B2839146(微白黃鏈霉菌(S.albidoflavus))紫色鏈霉菌(S.violaceus)AML P22998/M25263/JS010147(委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(S.venezuela))(ATCC15068)彎曲熱單孢(Th.curvata) TAMeP29750/X59159/JH063848(CCM3352)Th.thermosulfurogenes AMYA P26827/X54654/X54982/S 49(DSM3896/EMI)f17298/S37706Th.thermosulfurogenes AMYB P19584/M22471/A3138950(ATCC 33743)a原淀粉消化淀粉酶，b麥芽糖孔蛋白α-淀粉酶，c形成麥芽糖四糖的淀粉酶(1，4-α-四麥芽糖水解酶)，d形成麥芽糖五糖的淀粉酶，e熱穩(wěn)定α-淀粉酶，fClostridium thermosulfurogenes前體。
AMYG、GAM和GLA葡糖淀粉酶，AMY或AMLα-淀粉酶，CGTβ-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶或環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶，ORF開放讀框A.曲霉屬(Aspergillus)，B.芽胞桿菌屬(Bacillus)，C.伏革菌(Corticium)，D.Dictiostelium，H.grisea灰色腐質(zhì)酶(Humicola grisea)，H.resinea.Hormoconisresinae(Amorphotheca resinae)，K.克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)，N.鏈胞霉屬(Neurospora)，S.鏈霉菌屬(Streptomyces)，Th.curvata彎曲熱單胞(Thermomonospora curvata)，Th.熱厭氧菌(Thermoanaerobacter)5淀粉結(jié)合域的參考文獻1)Hayashida等人(1989)“農(nóng)業(yè)生物化學”Agric.Biol.Chem.53，135-141；2)Hayashida等人(1989)“農(nóng)業(yè)生物化學”Agric.Biol.Chem.53，923-929；3)Zhong等人(1994)“微生物學報”Wei Sheng Hseuh Pao 34，184-190；4)Boel等人(1984)“EMBO雜志”EMBO J.3，1097-1102；5)Boel等人(1984)“EMBO雜志”EMBO J.3，1581-1583；6)Svensson等人(1986)“歐洲生物化學雜志”Eur.J.Biochem.154，497-502；7)Svensson等人(1983)Carlsberg Res.Commun..48，529-544；8)Nunberg等人(1984)“分子細胞生物學”Mol.Cell.Biol.4，2306-2315；9)Flwer等人(1990)“現(xiàn)代基因技術(shù)”Curr.Genet.18，537-545；10)Hata等人(1991)“農(nóng)業(yè)生物化學”Agric.Biol.Chem.55，941-949；11)Hata等人(1991)“基因”Gene 108，145-150；12)Shibuya等人(1990)“農(nóng)業(yè)生物化學”Agric.Biol.Chem.，54，1905-1914；13)Itkor等人(1990)“生物化學，生物生理學雜志”Biochem.Biophys.res.Commun.166，630-636；14)Lin等人(1955)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；15)Schimd等人(1988)“第四界國際胞毒素研討會”Proceedings of the fourth International symposiumon cyclodextrins.Huber，O.and Szejtli，J.Eds，pp71-76.Kluwer，AcademicPublishers；16)Akhmetzjanov(1992)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；17)Kaneko等人(1989)“微生物基因雜志”J.Gen.Microbiol 135，3447-3457；18)Kaneko等人(1988)“微生物基因雜志”J.Gen.Microbiol.134，97-105；19)Hamamoto等人(1987)“農(nóng)業(yè)生物化學”Agric.Biol.Chem.51，2019-2022；20)Kimura等人(1987)“細菌雜志”J.Bacteriol.169，4399-4402；21)專利WO9114770-A1；22)Kitamoto等人(1992)“發(fā)酵生物工程雜志”J.Ferment.Bioeng.74，345-351；23)Nanmori等人(1993)“應(yīng)用環(huán)境微生物學”Appl.Environ.Microbiol.59，623-627；24)Nitschke等人(1990)“微生物應(yīng)用生物技術(shù)”Appl.microbial Biotechnol.33，542-546；25)Lawson等人(1994)“分子生物學”J.Mol.Biol.236，590-560；26)Hill等人(1990)“核酸”Nucleids AcidsRes.18，199-199；27)Fujiwara等人(1992)“應(yīng)用環(huán)境微生物學”Appl.Environ.Microbiol.58，4016-4025；28)Takano等人(1986)“細菌雜志”J.Bacteriol.166，1118-1122；29)Sugimoto等人專利號UK2169902；30)Sin等人(1991)“微生物應(yīng)用生物技術(shù)”Appl.Microbiol.Biotechnol.35，600-605；31)Didericksen等人(1988)“FEMS微生物雜志”FEMS Microbiol.Lett.56，53-60；32)Fujiwara等人(1992)“應(yīng)用環(huán)境微生物學”Appl.Environ.Microbiol 58，4016-4025；33)Nagasaka等人(1995)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；34)Maniak等人(1990)“核酸”Nucleic Acids Res.18，3211-3217；35)Berka等人(1992)“EMBL數(shù)據(jù)手冊”EMBL Data Library；36)Joustjoki等人(1992)“FEMS微生物雜志”FEMS Microbiol.Lett.78，237-244；37)Vainio等人(1993)“現(xiàn)代基因技術(shù)”Curr Genet.24，38-44；38)Fagerstrom等人(1990)“微生物基因雜志”J.Gen.Microbiol.136，913-920；39)Binder等人(1986)“基因”Gene47，269-277；40)Stone等人(1989)“現(xiàn)代基因技術(shù)”Curr.Genet.24，205-211；41)Koh-Laur等人(1989)“細菌雜志”J.Bacteriol.171，1333-1339；45)Vigal等人(1991)“分子基因?qū)W”Mol Gen.Genet.225，278-288；46)Long等人(1987)“細菌雜志”J.Bacteriol.169，5745-5754；47)Virolle等人(1988)“基因”Gene 74，321-334；48)Petricek等人(1992)“基因”Gene 112，77-83；49)Bahl等人(1991)“應(yīng)用環(huán)境微生物學”Appl.Environ.Microbiol.57，1554-1559；50)Kitamoto等人(1988)“細菌雜志”J.Bacteriol.170，5848-5854用各種不同的實驗技術(shù)和方法通過各種方式可鑒定并篩選出有所需結(jié)合特征和特異性的新的PBP。它們包括光譜(滴定)方法如NMR光譜法(Zhu等人“生物化學”Biochemistry(1995)34，Gehring等人“生物化學”Biochemistry(1991)305524-5531)、UV示差譜(Belshaw等人“歐洲生物化學雜志”Eur.J.Biochem.(1993)211717-724)、熒光(滴定)光譜(Miller等人J.Bio1.Chem.(1983)25813665-13672)、UV或熒光停流分析(De Boeck等人Eur.J.Biochem.(1985)149141-415)，親和方法如親和電泳(Mimura等人J.Chromatography(1992)597345-350)或在固定的單糖或寡糖上的親和層析，沉淀或凝聚分析包括比濁或濁度分析(Knibbs等人J.Biol.Chem.(1993)14940-14947)、競爭性抑制測定法(有或沒有定量的IC50測定)，和各種物理或物理化學方法如示差掃描或等溫滴定量熱法(Sigurskjold等人J.Biol.Chem.(1992)2678371-8376；Sigurskjold等人Eur.J.Biol.(1994)225133-141)或在寡糖存在或不存在下用熱圓二色性譜或熒光光譜比較蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的測定法。用這些方法可進行定性或定量分析(締合或解離常數(shù)、IC50值、熱力學參數(shù)等)。鑒定對可溶性寡糖聚合物有較高或較低結(jié)合親和力的PBP是所需的；根據(jù)具體的應(yīng)用，有較低而不是較高的結(jié)合親和力的PBP可使例如在分配和/或分離富含包含PBP的化合物的寡糖聚合物相后更易除去寡糖聚合物。
表6多糖結(jié)合域的來源結(jié)合域 發(fā)現(xiàn)有結(jié)合域的蛋白質(zhì)纖維素結(jié)合域 β-葡聚糖酶(微晶纖維素酶、CMC酶、纖維糊精酶)外切葡聚糖酶或纖維生物水解酶纖維素結(jié)合蛋白木聚糖酶混合的木聚糖酶/葡聚糖酶酯酶殼多糖酶β-1，3-殼多糖酶β-1，3-(β-1，4)-葡聚糖酶(β-)甘露糖醇酶β-葡糖苷酶/半乳糖苷酶纖維素合成酶(未確定)淀粉/麥芽糖糊精 α-淀粉酶2，3結(jié)合域 β-淀粉酶4’5支鏈淀粉酶葡糖淀粉酶6，7環(huán)糊精葡糖轉(zhuǎn)移酶8-10(環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶)麥芽糖糊精結(jié)合蛋白質(zhì)11葡聚糖結(jié)合域 (鏈球菌)糖基轉(zhuǎn)移酶12葡聚糖蔗糖酶(未確定)梭狀芽孢桿菌毒素13，14葡糖淀粉酶6葡聚糖結(jié)合蛋白β葡聚糖結(jié)合域β-1，3-葡聚糖酶15，16β-1，3-(β-1，4)-葡聚糖酶(未確定)β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白17殼多糖結(jié)合域 殼多糖酶殼二糖酶殼多糖結(jié)合蛋白(也見纖維素結(jié)合域)Heivein1)Gilkes等人“微生物進展回顧”Adv.Microbiol.Reviews，(1991)303-315；2)Sogaard等人，“生物化學雜志”J.Biol.Chem.(1993)26822480；3)Weselake等人“谷類化學”Cereal Chem.(1983)6098；4)Svensson等人J.(1989)264309；5)Jespersen等人J.(1991)28051；6)Belshaw等人“歐洲生物化學雜志”Eur.J.Biochem.(1993)211717；7)Sigurskjold等人，“歐洲生物化學雜志”Eur.J.Biochem.(1994)225133；8)Villette等人，“生物技術(shù)應(yīng)用及生物化學”Biotechnol.Appl.Biochem.(1992)1657；9)Fukada等人，“生物學，生物技術(shù)和生物化學”Biosci.Biotechnol.Biochem.(1992)56556；10)Lawson等人，“分子生物學”J.Mol.Biol.(1994)236590；11)Sharff等人，“生物化學”Biochemistry(1992)3110657；12)Lis等人，“應(yīng)用環(huán)境微生物學”Appl.Environ.Microbiol.(1995)612040；13)von Eichel-Streiber等人，“細菌雜志”J.Bacteriol.(1992)1746707；14)von Eichel-Streiber等人，“分子基因?qū)W”Mol.Gen Genet.(1992)233260.15)Klebl等人，“細菌雜志”J.Bacteriol.(1989)1716259；16)Watanabe等人，“細菌雜志”J.Bacteriol.(1992)174186；17)Duvic等人，“生物化學雜志”J.Biol.Chem.(1990)2659327PBP在酶分離和純化后可通過將PBP從剩余的酶上切下來獲得。為用于相分離系統(tǒng)，篩選PBP結(jié)合到可溶的相形成寡糖上?？捎萌魏我环N篩選方法，包括單用NMR、NMA/量熱法、單用親和電泳、親和電泳/競爭性測定法、和結(jié)合等溫法。最好用等溫滴定微量熱法(ITC)進行結(jié)合平衡的研究。結(jié)合平衡研究中等溫滴定微量熱法(ITC)的優(yōu)點是由于結(jié)合等溫線是通過反應(yīng)熱實驗來確定的；因此，除了締合常數(shù)外可直接估計出焓值(和熵值)變化。因此，單個微量熱法提供結(jié)合能量與等溫線的全部特征(Haynes等人，“膠體界面雜志”J.Colloid Interface Sci.，(1994)169313；Colloids & Surfaces，(1994)2517)。
通常用于相分離時，PBP與可溶性寡糖結(jié)合的Ka至少在弱抗體-抗原反應(yīng)值的范圍內(nèi)，即3103M、較佳為104M、最佳為106M。如果PBP與寡糖的結(jié)合是放熱的或吸熱的，那么在較低溫度下的結(jié)合將分別增強或減弱，它為分配步驟提供了一種溫度調(diào)節(jié)的方法。
除了要確定寡糖聚合物-PBP配對外，還需要評價相分離系統(tǒng)中和寡糖聚合物合用的第二種組分，即相分離方法。相分離方法可以是另一種聚合物，或足夠量的相誘導試劑(通常是強電解質(zhì)如鹽，鹽通常是硫酸鹽或檸檬酸鹽)或物理上的變化，如當纖維糖聚合物有熱分離性質(zhì)時的溫度變化。可形成有類似經(jīng)典的葡聚糖/PEG系統(tǒng)性質(zhì)，但成本較低的聚合物配對的例子，包括那些如葡聚糖/PEG系統(tǒng)一樣以糖類與聚氧醚間的不相容性為基礎(chǔ)的配對有許多(見Skuse等人，“酶微生物技術(shù)”Enzyme Microb.Technol.(1992)14785)。例子包括羥丙基淀粉(Tjerneld等人，“酶微生物技術(shù)”Enzyme Microb.Technol.(1986)8417)、麥芽糖糊精(Szlag等人，ACS Symposium Series(1990)41938-52)、羥丙基纖維素(Skuse等人，“酶微生物技術(shù)”Enzyme Microb.Technol.(1992)14785)和羧甲基纖維素(Albertsson，“細胞顆粒和大分子的分配”Partition ofCell Particles and Macromolecules，Wiley Interscience(1971))，它們均可與PEG形成分配系統(tǒng)。
為開發(fā)一個系統(tǒng)，需要獲得相平衡數(shù)據(jù)以選擇第一和第二組分的組合和/或用Haynes等人(“液相平衡數(shù)據(jù)”Fluid Phase Equilibria(1989)53463)方法決定總的聚合物濃度、或聚合物和另一種相誘導劑的濃度，根據(jù)它們可形成穩(wěn)定的兩相分配系統(tǒng)。通常，PBP共軛物在中等pH下在中等離子強度的緩沖液(約10mM至1M)中與相形成寡糖結(jié)合。根據(jù)相分離系統(tǒng)內(nèi)的組分，結(jié)合可在4至至少70℃下進行。結(jié)合基本上是瞬時的，且溫度并不重要。一旦PBP共軛物與相形成寡糖結(jié)合，它就分配入那個相中。
一旦確定了相分離系統(tǒng)的組分和最適于具體應(yīng)用的多糖結(jié)合物質(zhì)，PBP可通過將包含編碼合適的多糖結(jié)合物的DNA構(gòu)建物鍵轉(zhuǎn)化入宿主細胞中來制備。術(shù)語“多糖結(jié)合肽”指至少包含多糖酶或多糖結(jié)合蛋白的多糖結(jié)合域的官能部分的氨基酸序列?！肮倌懿糠帧敝缚膳c所需寡糖聚合物結(jié)合的氨基酸序列。較佳地，編碼所需蛋白質(zhì)的DNA與PBP DNA序列連接。式(1)的編碼組合物的融合基因或單獨的PBP DNA序列在宿主細胞如真核細胞或原核細胞中表達。如果要單獨制備PBP，表達并分離得到的多糖結(jié)合肽可與感興趣的化合物即蛋白質(zhì)或化學物質(zhì)進行共軛反應(yīng)。
分離多糖酶基因如纖維素酶基因和多糖結(jié)合蛋白的基因的技術(shù)是該領(lǐng)域已知的，包括從基因組DNA合成、分離、從cDNA制備或它們的組合(見USPN5,137,819，5,202,247和5,340,731)。與可溶性寡糖結(jié)合的一些多肽結(jié)合域的序列是已知的(見圖1)。編碼各種多糖酶和多糖結(jié)合蛋白的DNA也是已知的。各種基因操作技術(shù)是熟知的，包括限制、酶切消化、重新分段、連接、體外誘變、引物修補、用接頭和銜接頭等(見Sambrook等人，“分子克隆實驗手冊”Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York，1989)。
通常，獲得所需DNA的方法包括從表達有所需性質(zhì)的多糖酶或多糖結(jié)合蛋白的生物中制備基因組文庫。用合適的限制性酶如BamHI來分離切割供體微生物的基因組。將獲得的片段插入由相容的限制性酶預先切開的載體分子中。一個合適的載體例子是質(zhì)粒pBR322，它被限制性酶BamHI切開。
多糖酶的氨基酸序列也可設(shè)計成探針以從感興趣的供體細胞中篩選出從mRAN或DNA制備的cDNA或基因組文庫中的多糖酶基因或多糖結(jié)合蛋白基因。通過采用多糖酶cDNA或結(jié)合蛋白cDNA或它們的片段作為雜交探針，可容易地克隆其它微生物中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)相關(guān)基因。特別注意的是用寡核苷酸探針從表達多糖酶活性的微生物中分離基因，該寡核苷酸探針以從具有獨立的多糖酶催化和結(jié)構(gòu)域的生物中獲得的基因核苷酸序列為基礎(chǔ)(參見例如，Shoseyev等人Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)(1992)893483-3487)。
用多糖酶或多糖結(jié)合蛋白的結(jié)合域的共有序列來制備探針是特別有用的。至今從糞肥纖維單孢菌獲得的β-1，4-葡聚糖酶有內(nèi)切葡聚糖酶A、B、C和D(分別為CenA、CenB、CenC、CenD)，外切纖維生物水解酶A和B(分別為CbhA和CbhB)和木聚糖酶A和D(分別為Cex和XylD)(參見Wong等人(1986)“基因”Gene，44315；Meinke等人(1991)“細菌雜志”J.Bacteriol.，173308；Coutinho等人，(1991)“分子微生物學”Mol.Microbiol.51221；Meinke等人，(1993)“細菌”Bacteriol.，1751910；Meinke等人，(1994)“分子微生物學”Mol.Microbiol.，12413；Shen等人，“生物化學雜志”Biochem.J.，in Press；O′Neill等人(1986)“基因”Gene，44325；和Millward-Sadler等人，(1994)“分子微生物學”Mol.Microbiol.，11375)。所有模型蛋白的復雜程度不同(圖1)；但有兩個共同的特征即有獨立功能的催化域(CD)和纖維素結(jié)合域(CBD)(參見Millward-Sadler等人，(1994)“分子微生物學”Mol.Microbiol.，11375；Gilkes等人，(1988)“生物化學雜志”J.Biol.Chem.，26310401；Meinke等人，(1991)“細菌雜志”J.Bacteriol.，1737126；和Coutinho等人，(1992)“分子微生物學”Mol.Microbiol.，61242)。在四種酶CenB、CenD、CbhA和CbhB中，纖連蛋白型III(Fn3)重復體將N端CD和C端CBD分開。酶的CD來自糖苷水解酶家族的其中六個(參見Henrissat(1991)“生物化學雜志”Biochem.J.，280309；和Henrissat等人，(1993)“生物化學雜志”Biochem.J.，293781)；所有的酶均有家族II或CBD的N端或C端CBD(參見Tomme等人，“微生物生理學進展”Adv.Micro.Physiol.，in press)；CenC的N端有家族IV的串聯(lián)CBD；CenB和XylD各有第二個家族III和II的內(nèi)部CBD。Cex和XylD很明顯都是木聚糖酶；然而Cex，而不是XylD，對纖維素的活性較低。因此和其它細菌木聚糖酶一樣(參見Gilbert等人(1993)“基因微生物學雜志”J.Gen.Microbiol.，139187)，它們均有CBD。用相關(guān)細菌可產(chǎn)生類似的系統(tǒng)(參見Wilson(1992)Crit.Rev.Biotechnol.，1245；和Hazlewood等人，(1992)“應(yīng)用細菌雜志”J.Appl.Bacteriol.，72244)。糞肥纖維單孢菌可產(chǎn)生其它β-1，4-葡聚糖酶。不相關(guān)的細菌例如嗜熱纖維梭狀芽孢桿菌(Clostridiumthermocellum)可產(chǎn)生二十或更多種β-1，4-葡聚糖酶(參見Beguin等人，(1992)“FEMS微生物學雜志”FEMS Microbiol.Lett.，100523)。
典型的結(jié)合域共有序列是圖1所示的纖維結(jié)合域的共有序列，其代表性是內(nèi)切葡聚糖酶CN1結(jié)合域。探針可以比整個序列短的多，但核苷酸長度應(yīng)至少是10，較好至少為14。也可用更長的寡核苷酸直至全長基因，其核苷酸長度較佳的應(yīng)不超過500，更佳應(yīng)不超過250?？捎肦NA或DNA探針。通常，這樣確定的核苷酸編碼的結(jié)合部分與結(jié)合域至少有40％是同源的(包括允許適當?shù)谋Ｊ匦匀〈?、更佳排列的空隙?，它與可溶性β-1，4-葡聚糖結(jié)合反應(yīng)的Ka是3103M。氨基酸比較分析可用PC/Gene(IntelliGenetics，Inc)的程序來進行。PCLUSTAL可用于多種序列排列和產(chǎn)生系統(tǒng)樹。
在使用中，探針通常用可被檢測的方式(例如用32P、3H、生物素或親和素)來標記，并與發(fā)現(xiàn)有基因的生物的單鏈DNA或RNA培育。在單鏈和雙鏈(雜交的)DNA(或DNA/RNA)分離(通常用硝化纖維素膜)后用標記來檢測雜交反應(yīng)。適用于寡核苷酸的雜交技術(shù)是該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。盡管通常探針可用可被檢測的標記來使鑒定更容易，但也可用未標記的寡核苷酸，它可作為標記探針的前體，也可用于直接檢測雙鏈DNA(或DNA/RNA)。因此。術(shù)語“寡核苷酸探針”指標記過以及未標記的形式。
為分離多糖酶和多糖結(jié)合蛋白的PBP可用幾種遺傳方法。一種方法是用限制性酶除去部分基因，然后使剩余的基因-框架中的載體片段融合，以獲得編碼截短蛋白質(zhì)的突變基因。另一種方法是用外切核酸酶如Bal31來人為地從DNA的5′端或3′端外切或在基因內(nèi)的限制性缺口內(nèi)切。這些基因缺失方法形成了編碼可評價底物或多糖結(jié)合能力的截短蛋白質(zhì)分子的突變基因。用于評價和結(jié)合活性的合適的底物包括上表2中列出的。
一旦確定了編碼多糖結(jié)合域的核苷酸序列，無論是cDNA還是染色體DNA，就可用各種方法來制備表達有上述式(1)結(jié)構(gòu)的表達產(chǎn)物的組合物。核苷酸序列可與編碼所需多肽的DNA序列融合。很希望能保留組分多肽的三維結(jié)構(gòu)。根據(jù)所需多肽的片段來源和長度，限制性方法可設(shè)計合成的基因來構(gòu)建嵌合的多肽，如果可以，限制性位點可不改變多肽的氨基酸序列。然而，在一些情況下加入新的限制性位點可產(chǎn)生改變的氨基酸序列而不改變蛋白質(zhì)的活性。
在構(gòu)建表達盒(expression cassette)時，通常是將DNA的各種片段克隆入合適的克隆載體中，從而可進行DNA的擴增、DNA的修飾或插入或取出序列、接頭或其它的操作。通常，載體可在細菌內(nèi)至少以相當高的拷貝數(shù)進行復制。有許多載體可用于克隆入革蘭氏陰性細菌特別是大腸桿菌中，它們包括載體如pBR322、pTZ、pUC等?？寺≥d體的特征是在宿主細菌中有有效的復制系統(tǒng)。
克隆載體有至少一個單限制性位點，通?？捎卸鄠€單限制性位點，而且也可包括多限制性位點。此外，克隆載體可含有一個或多個標記以用于選擇轉(zhuǎn)化體。標記通常提供了對細胞毒性試劑如抗生素、重金屬、毒素等的抗性、對營養(yǎng)缺陷型宿主的補充或?qū)κ删w的免疫性。通過載體和盒的適當限制性酶切，通過端的切除或填補修飾末端，加入接頭或加尾適當將末端修飾成平頭，可提供互補末端來將表達盒或其組分連接并插入載體中。
在產(chǎn)生盒的每次DNA操作后，對質(zhì)?？寺?、分離并按需分析特定盒組分的序列以保證獲得合適的序列。根據(jù)操作的特征，所需的序列可從質(zhì)粒中切出并引入不同的載體中，或質(zhì)?？砂葱柽M行限制性酶切并操作表達盒組分。
在一些例子中，當載體可在不同的宿主細胞中復制，并需要不同的復制系統(tǒng)時，可用一種穿梭載體。它需要或不需要其它的在兩種宿主中起作用的標記。當需要這些標記時，載體中可包括它們，其中含有盒、兩套復制系統(tǒng)和標記的質(zhì)?？砂葱鑿囊粋€宿主傳遞至另一個宿主。任何有用的標記可用于選擇。最好選擇對新霉素或四環(huán)素有抗性的標記。然而，盡管很需要選擇標記以便于篩選，但是其它篩選轉(zhuǎn)化細胞的步驟是該領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如轉(zhuǎn)化細胞可根據(jù)它們產(chǎn)生的特異性產(chǎn)物來篩選；所需的產(chǎn)物的合成可用免疫法或酶法來測定。
編碼融合蛋白的DNA可用各種操作來進行表達。描述的細菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)或啟動子包括乳糖啟動子、λ左和右啟動子、色氨酸和乳糖啟動子、Tac啟動子等。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)還可包括調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)序列使融合基因表達時間可以調(diào)節(jié)，生長培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物或表達產(chǎn)物有或沒有、溫度等。例如，融合基因的表達可用溫度通過含有噬菌體λPL啟動子、噬菌體λOL操縱子和溫度敏感的阻抑子的調(diào)節(jié)序列來調(diào)節(jié)。啟動子的調(diào)節(jié)是通過阻抑子和操縱子間的反應(yīng)來實現(xiàn)的。較佳的啟動子是對葡萄糖阻抑不敏感的強Tac啟動子。高水平表達載體的例子在Graham等人(1995)“基因”Gene15851-54中有所描述。
表達盒可與復制系統(tǒng)一起在合適的細胞宿主中但保持獨立或可沒有復制系統(tǒng)而是整合入宿主細胞基因組中。DNA可用已知技術(shù)，如用磷酸鈣沉淀的DNA轉(zhuǎn)化、使細胞和病毒接觸的轉(zhuǎn)染、將DNA微量注射入細胞中等方法來引入宿主中。
一旦融合蛋白的DNA被引入合適的宿主中后，可使宿主生長并表達融合蛋白。可用微生物宿主包括，例如，細菌如大腸桿菌，真核細胞如酵母屬，特別是釀酒酵母菌、鏈霉菌屬、芽孢桿菌、巴斯德畢赤氏酵母，或哺乳動物細胞如BHK和CHO。重組的產(chǎn)物可以是糖基化的或非糖基化的，有野生型或其它糖基化形式。糖基化的量部分取決于特定肽的序列以及產(chǎn)生它的有機體。因此，在大腸桿菌中的表達形成了非糖基化的產(chǎn)物，產(chǎn)物在昆蟲細胞中的表達通常形成比在哺乳動物細胞中產(chǎn)物的表達較少的糖基化。在酵母中的表達可形成超糖基化。
為分離融合蛋白，當產(chǎn)物留在宿主細胞中時，收獲并水解細胞，并用相分離系統(tǒng)分離和/或純化產(chǎn)物。在一些例子中，希望在結(jié)構(gòu)基因的上游和閱讀框架中可提供信號序列(分泌型前導序列)，它可提供融合蛋白的分泌。描述的分泌型前導序列包括青霉素酶、免疫球蛋白、T細胞受體、外膜蛋白等的分泌型前導序列。通過融合入合適的閱讀框架可使融合蛋白分泌入培養(yǎng)基。然而，在細菌表達系統(tǒng)如大腸桿菌中，有明顯的組分進入胞外的培養(yǎng)基中(Ong等人“生物技術(shù)生物工程”Biotech.Bioeng.(1993)42401)。當產(chǎn)物分泌時，可收集營養(yǎng)物培養(yǎng)基并用相分離系統(tǒng)來分離產(chǎn)物。為生成活性的蛋白質(zhì)，需要使蛋白質(zhì)再次折疊。
相分離系統(tǒng)與生物液體、發(fā)酵液、細胞裂解液或其它來源的待純化和誘導相分離的生物化合物合用。為分離和/或純化水性混合物中的組分，在含有PBP的組合物分配入寡糖相后，可以用多種方法中的任一種來分離相和含有從聚合物相解離下的PBP的組合物。它們包括使分離的寡糖相與不同的可提取含有PBP的組合物的相誘導聚合物或鹽接觸；改變化學和/或物理條件，如在分離的寡糖相中加入解離試劑如酸、堿、尿素、乙醇、DMSO等，或當確定了結(jié)合反應(yīng)是放熱或吸熱后，充分改變溫度使結(jié)合親和力降低；從PDP寡糖聚合物中獲得所需的化合物。
當采用切割時，所需的蛋白質(zhì)或化學物質(zhì)很容易用對多糖結(jié)合域和所需蛋白或化學物質(zhì)間的序列有特異性的蛋白水解酶來從多糖結(jié)合域上切下而使PBP結(jié)合在寡糖聚合物上。較佳地，蛋白水解酶是以在所需多肽切下后易從PBP上除去的形式提供的。例如，切割的蛋白水解酶可制成切割酶的復合物，其中蛋白水解酶與第二種多糖結(jié)合物結(jié)合，后者的底物特異性和/或結(jié)合特性與第一種與所需多肽結(jié)合的多糖結(jié)合物不同(Assouline等人(1993)“蛋白質(zhì)工程”Protein Engineering 6787-792；Assouline等人)。因此結(jié)合域從所需重組蛋白上斷裂下來可在溶液中進行，然后切割酶復合物可通過與第一種多糖結(jié)合物不結(jié)合的多糖底物結(jié)合來除去?；蛘?，切割酶復合物可固定在不與第一種多糖結(jié)合物結(jié)合的多糖骨架上。(參見Assouline等人(1993)同上；Assouline等人(＿)同上)所需的蛋白質(zhì)或化學物質(zhì)從寡糖聚合物上解離下來，且不含雜的PBP(仍與聚合物結(jié)合)?；蛘呖捎梅翘禺愋缘鞍姿饷竿耆到釶BP復合物的PBP部分，從而通過例如用蛋白水解酶K在約50mg/ml的濃度下在約37℃處理約20分鐘來使它從寡糖聚合物上釋放下來(Dir等人(1991)“生物/技術(shù)”Bio/Technology，91096-1099)。
在一些情況下，融合蛋白本身是所需的，因此可將融合蛋白從寡糖聚合物上除下而不是將融合蛋白的組分分離下來。為去除融合蛋白和寡糖聚合物的結(jié)合，需要用低離子強度的緩沖液或水或堿性pH或離液鹽的緩沖液。盡管解吸溫度不是關(guān)鍵的，并通常在10℃至40℃內(nèi)，但是通常室溫是較佳的，即在約20℃。在水中重復清洗結(jié)合的融合蛋白或用連續(xù)水流稀釋。通常，pH9.5的碳酸鹽緩沖液或6M的鹽酸胍可用于該解吸步驟。在一些情況下最好用稀的氫氧化鈉(約0.1M)進行處理。對PBP的天然特性進行修飾來改變它的粘附性質(zhì)，以使它可以或如所需的不能被水解吸。對骨架用解吸介質(zhì)可使融合蛋白從寡糖聚合物上解離下來。為在從底物解離后分離PBP-共軛物可采用各種技術(shù)。例如可用上述的解吸液洗去多糖表面的PBP-共軛物。通過改變解吸液的離子強度(pH)使PBP-共軛物重新吸附在離子交換介質(zhì)或第二種多糖骨架上來分離PBP-共軛物。
親和相分離系統(tǒng)有許多應(yīng)用。它們包括濃縮混合物中的一個組分、純化混合物中的組分，其中純化倍數(shù)為2倍，通常大于20倍，并且純度可達80％至90％。純化倍數(shù)可根據(jù)雜質(zhì)的除去、比活的增加和K等來測定。在一些應(yīng)用中，這種方法也可用于細胞分離和/或特定細胞類型的富集。例如干細胞種群可通過使細胞單獨接觸與細胞表面糖類殘基結(jié)合的PBP來富集，或接觸融合入特異性結(jié)合配對體的一種中，例如受體配體如肽激素或其它激素而另一種特異性結(jié)合配對體即受體在細胞表面上。其它可用的配體包括抗體，如抗CD34和細胞因子如IL-2。在親和相分配后，細胞可用例如胰蛋白酶來從分離的寡糖聚合物相中解離下來。親和相分配系統(tǒng)中的剪切力比其它細胞分離方法要小的多，從而對分離細胞的傷害也小的多。
技術(shù)的其它應(yīng)用包括抽提生物轉(zhuǎn)化，即分配反應(yīng)產(chǎn)物的方法，特別是在酶法過程中產(chǎn)物是酶反應(yīng)的反饋抑制劑時。在該系統(tǒng)中，酶與PBP結(jié)合，從而可保持酶活。酶的底物可自然分配入寡糖聚合物相或與PBP結(jié)合，產(chǎn)物則不留在寡糖聚合物相中而是分配入第二組分中，例如當產(chǎn)物的疏水性比底物更強時。然后可取出系統(tǒng)的第二組分并回收產(chǎn)物?？捎贸樘嵘镛D(zhuǎn)化系統(tǒng)的酶反應(yīng)例子包括轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，如用于制備β-1，4-連接的寡糖增甜劑；混合轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，如用于將低碳脂肪酸轉(zhuǎn)化成高碳脂肪酸以及產(chǎn)生甘油；和肽合成。本發(fā)明的含有PBP的組合物可用來在多糖支持物上固定感興趣的化合物。因為PBP可強且特異性吸附其底物。
固定化系統(tǒng)的應(yīng)用有例如，制備固態(tài)的用于診斷測定的試劑，試劑包括酶、抗體片段、肽激素等；當纖維素是可溶的如羧甲基纖維素或固體支持物如微晶纖維素(Avicel)而藥物是多肽如白介素2時，結(jié)合藥物可降低清除速度；藥物輸遞，例如與羧甲基纖維素結(jié)合并與結(jié)合在同一纖維素支持物上的佐劑合用，例如來提高待輸遞藥物的免疫特異性；染料結(jié)合，例如將顏料或染料連接到多糖如纖維素表面上；印刷在如紙和布(棉花)上；提供水解或協(xié)和作用，例如尋靶酶如木質(zhì)素酶以處理木條，尋靶卟啉如用于漂白木漿；在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用如將殺蟲劑如Bt毒素或其它抗微生物劑結(jié)合到植物表面上；用于固氮，如將有機體結(jié)合到根表面上；持續(xù)肥料的釋放；和持續(xù)殺真菌劑的釋放。它們可在高鹽濃度如海洋環(huán)境中使暴露在海水中的表面防污，然后轉(zhuǎn)置到新鮮水中除去融合蛋白。
可用這種方法純化的生物物質(zhì)的例子包括白介素2、因子X、木質(zhì)素酶和TPA或任何其它可融合入PBP的多肽或蛋白質(zhì)。其它例子包括培養(yǎng)液(來自原核細胞或真核細胞或組織培養(yǎng)基)、生物液體、組織提取物、細胞裂解物(包括細菌、真菌、植物、動物、魚、和家畜)的抽提物，特別是純化的蛋白質(zhì)等。通常，混合物在用于親和分配系統(tǒng)前先進行澄清以除去細胞碎片。
下面提供例子來進行描述而無限制意義。
例子縮寫pNPC＝對-硝基苯酚-β-D-纖維素二糖苷；HPA＝皮粉axure；gCenA和gCex＝糞肥纖維單孢菌的CenA和Cex的糖基化形式；
ngCenA和ngCex＝重組大腸桿菌的CenA和Cex的非糖基化形式；RPC＝反相層析；SDS-PAGE＝十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳；α-Pro/Thr＝抗合成Cex Pro/Thr盒的兔型抗血清；PMSF＝苯基甲基磺酰氟化物。
生物培養(yǎng)物保藏下列保藏物由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852保藏。在大腸桿菌C600中質(zhì)粒pcEC-2上的克隆基因CenA的衍生物在1986年4月23日保藏，ATCC登記號為67101。在質(zhì)粒pEC-1上的克隆基因Cex的衍生物于1986年5月27日保藏，ATCC登記號為67120。大腸桿菌JM83，pUC12-1.1cex于1986年4月23日保藏，ATCC登記號為67102。pTugA(登記號為L24193)、pTugAS(登記號為L24367)、糞肥纖維單孢菌CenA(登記號為M15823)和糞肥纖維單孢菌CenC(X57858)的全長核苷酸序列保藏于GenBank中。
材料Klucel或HPC由Aqualon提供。HPC從一種纖維素分子衍生獲得，也稱作纖維素2-羥丙基醚。
Natrosol或HEC由Aqualon提供。HEC是含有羥乙基側(cè)鏈的修飾過的纖維素聚合物，也稱作纖維素2-羥乙基醚。HEC是白色非離子型粉末。HEC也以下列商品名出售Alcoramnosan/Liporamnosan(Vevy)、Tylose H系列(HoechstCelanese/Colorants & Surf)。
Bermocoll E或EHEC由Berol Nobel AB提供。EHEC是乙基纖維素乙二醇醚。EHEC也由Aqualon以Aqualon EHEC的商品名出售。
羥丙基甲基纖維素(HPMC)由Sigma提供。HPMC是甲基纖維素的丙二醇醚，也稱作甲基羥丙基纖維素。HPWC也以下列商品名出售Benecel/Culminal HPMC(Aqualon)；Viscontran MHPC(Henkel)。
葡聚糖由Pharmacia Biotech提供。
Pluronics由BASF提供。Pluronic是乙烯氧化物和丙烯氧化物的嵌段共聚物。Pluronics的固體形態(tài)(F系列)和漿狀形態(tài)(P系列)均可采用。
實施例1CBDN1的分離用大腸桿菌JM101(SupE，thi-1，Δ(tac-ProAB)，[F′traD36，ProAB，tacIqZΔM15](Yanish-Perron等人“基因”Gene(1985)33103-119)作為宿主菌株來保養(yǎng)質(zhì)粒并生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。培養(yǎng)物在30℃下在液體胰化蛋白凍-酵母提取物-磷酸鹽培養(yǎng)基(TYP)或Luria肉湯(LB瓊脂，補充入卡那霉素(100mg/ml))。
將含有pTugKN1(見圖5)的大腸桿菌菌株JM101的過夜培養(yǎng)物用補加100mg卡那霉素的TYP稀釋500倍，并在30℃下生長至最優(yōu)密度2.0-3.0。加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至最終濃度為0.1mM誘導PBDN1的生成，并使細菌在30℃下再培育18小時。培養(yǎng)基上清液用13000Xg離心10分鐘來澄清，并棄去細胞。如下步驟用纖維素親和層析來純化PBDN1。將澄清的培養(yǎng)物上清液在4℃與微晶纖維素(AVciel)(50mg/L)培育，并不時攪拌以使PBDN1結(jié)合。將纖維素懸浮液通過玻璃過濾器(Whatman GF/A)在布氏漏斗上過濾，并用含1MNaCl的pH7.0的50mM磷酸鉀粗洗。用水解吸結(jié)合的PBDN1并用超濾濃縮。然后將部分純化的PBDN1上樣于預先用20mM，pH6.0的磷酸鉀緩沖液平衡的陰離子交換柱(MonoQ)上，操作流速為1ml/min。蛋白質(zhì)牢固地結(jié)合在柱上，并用鹽梯度(0-1N NaCI，pH6.0)除去(見圖7)。PBDN1在300mM鹽中回收(峰1，圖7)。雜蛋白的結(jié)合更牢，可用更高鹽濃度除去(峰2，圖7)。
實施例2用親和電泳分析與CBDN1和CBDN1N2結(jié)合的HEC、大麥β-葡聚糖和木聚糖用親和電泳(Mimura等人(1992)“層析雜志”J.Chromatography597345-350)鑒定和評價CBDN1和CBDN1N2與可溶性多糖如HEC和大麥β-葡聚糖以DP315的結(jié)合。原來連續(xù)碟式電泳用不連續(xù)方法代替。在BioRad電泳系統(tǒng)的同一盤中，制備兩個相鄰的非變性凝膠，一個含有多糖(0.1％ w/v)，另一個不含有配體。這就保證了在有或沒有多糖時的分析基本上是在相同條件下進行的，而且觀察的結(jié)果(在有結(jié)合葡聚糖時的阻滯)不是異常電泳遷移的結(jié)果。在每種凝膠中用BSA作為負對照。凝膠上蛋白質(zhì)的上樣量均為5mg。電泳在4℃、非變性條件pH8.2-8.8下進行2至3小時，CBDN1和CBDN1N2與HEC和大麥β葡聚糖強烈反應(yīng)，因此與在不含β-葡聚糖(-)的凝膠中的遷移相比，它們在含有這些寡糖(+)的凝膠中的遷移受到嚴重阻滯(見圖9A和9B)。CBDN1和CBDN1N2對木聚糖沒有親和力，而且與不含葡聚糖的遷移相比，在含有葡聚糖的凝膠中沒有發(fā)現(xiàn)阻滯(見圖9C)。N1和N1N2分別指CBDN1和CBDN1N2。
實施例3CBDN1和CBDN1-融合蛋白的寡糖結(jié)合常數(shù)的等溫滴度微量熱測定法用微量熱法可測定CBDN1與各種水溶性寡糖的結(jié)合熱力學，從而可確定適于親和分配系統(tǒng)的配體。這些數(shù)據(jù)列在下表7內(nèi)。圖15表示用CalorimetrySciences Corp.的4200ITC型來測定CPDN1與羥乙基纖維素(HEC)在35℃、50mM PBS、pH7下的結(jié)合的可逆結(jié)合等溫數(shù)據(jù)。CPDN1與HEC強結(jié)合，平衡結(jié)合常數(shù)在弱的抗體-抗原反應(yīng)的范圍內(nèi)。在這些條件下，大麥β-葡聚糖與CPDN1的結(jié)合更強(Ka＝85500M-1)。CPDN1對于這兩種寡糖的結(jié)合和現(xiàn)在用于親和分配系統(tǒng)的幾乎所有的以PEG為基礎(chǔ)的親和配體(如Cibacron Blue-PEG，Procion red-PEG，二硝基苯基PEG，二乙酸-PEG)一樣牢固或更佳牢固。這種相當高的結(jié)合親和性，以及單寡糖鏈可結(jié)合多個CPDN1融合蛋白的性質(zhì)表明該親和分配系統(tǒng)的容量和選擇性均很高。下表8提供了N1結(jié)合熱力學歸納。CPDN1和HEC及大麥β-葡聚糖的結(jié)合反應(yīng)是劇烈放熱的，這表示結(jié)合在較低溫度下將增加，因此在分配步驟中可降低溫度，而在洗脫步驟中可升高溫度。
實施例4HEC和Pluronic P105混合物的相平衡分析根據(jù)Haynes等人(“液相平衡”Fluid Phase Equilibria，(1989)53463)的方法獲得HEC和Pluronic P105(聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物)的混合物在50mMPBS、35℃、pH7下相平衡數(shù)據(jù)。如圖16所示，在任何總聚合物濃度高于3％(重量/重量)的Pluronic P105和2％ HEC中可形成穩(wěn)定的兩相分配系統(tǒng)，這使得有很大范圍的兩相組合和平衡連接線長度可用于親和分配。
表7來自糞肥纖維單孢菌的內(nèi)切葡聚糖酶的CBDN1的結(jié)合特異性配體 與CBDN1的結(jié)合α檢測方法可溶性配體葡萄糖 -NMR纖維二糖 -NMR
纖維三糖 +/-NMR/量熱法纖維四糖 ++ NMR/量熱法纖維五糖 +++NMR/量熱法纖維六糖 +++NMR/量熱法甲基纖維素(MC) ++ 親和電泳羧甲基纖維素(CMC) + 親和電泳/競爭性測定乙基羥乙基纖維素++ 親和電泳(EHEC)羥乙基纖維素(HEC) +++親和電泳/競爭性測定羥丙基甲基纖維素+++親和電泳(HPMC)大麥β-葡聚糖 +++量熱法/親和電泳/競爭性測定燕麥β-葡聚糖 +++量熱法/親和電泳脫乙酰殼多糖 +/-親和電泳葡甘露聚糖+ 親和電泳甘露聚糖 - 親和電泳木聚糖- 親和電泳/競爭性測定阿拉伯半乳糖 - 親和電泳淀粉(支鏈淀粉)- 親和電泳葡聚糖T70 - 親和電泳海帶多糖 - 親和電泳不溶性配體磷酸溶脹纖維素(PASC) +++結(jié)合等溫線微晶纖維素+ 結(jié)合等溫線細菌微晶纖維素(BMCC) - 結(jié)合等溫線動物纖維素+/-結(jié)合等溫線殼多糖+/-結(jié)合等溫線直鏈淀粉 - 結(jié)合等溫線交聯(lián)葡聚糖+/-結(jié)合等溫線芙苓聚糖 - 結(jié)合等溫線表

實施例5用等溫滴定微量熱法測定CBDN1從寡糖聚合物上洗脫下的合適條件ITC也可通過測定隨溫度、鹽濃度和類型及助溶劑如乙二醇或尿素濃度(設(shè)計成破壞PBPN1糖類復合物有利的氫鍵結(jié)構(gòu))變化的平衡解離常數(shù)來決定合適的洗脫條件。
實施例6含有cenC CBD基因片段和糞肥纖維單孢菌內(nèi)切葡聚糖酶A(cenA)基因片段的融合體的表達載體的構(gòu)建和融合蛋白的特征載體的構(gòu)建用SmaI和HindIII完全酶切質(zhì)粒pTZ-JC2(見圖10A)。獲得3.9kbp的片段。用HpaI和HindIII完全酶切質(zhì)粒pUC18-1.6 cenA_PT(見圖10B)獲得1.1kbp的片段。連接3.9和1.1kbp的片段連接形成pTZ-JC13(見圖10C)。載體用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM101。
融合蛋白的酶特征與原來的CenA與它分離出的催化域p30相比，由pTZ-JC13編碼的表達產(chǎn)物(融合蛋白)對微晶纖維素(Avicel)、細菌微晶纖維素(BMCC)和磷酸溶脹纖維素(PASC)有催化活性。在固定的測定條件下通過由固定底物量產(chǎn)生的可溶性還原糖的量來測得比活。還原糖的量用比色法及葡萄糖標準來測定。多肽的濃度用與考馬斯亮藍G-250的結(jié)合來測定(Gilkes等人(1988)“生物化學雜志”J.Biol.Chem.26310401-10407)。
評價融合蛋白對蛋白水解降解的靈敏度在用融合蛋白時的主要考慮因素是多肽在各種條件下的穩(wěn)定性，包括對蛋白水解的抗性。用糞肥纖維單孢菌蛋白水解酶在沒有接頭序列時評價融合蛋白對蛋白水解的靈敏度。用糞肥纖維單孢菌蛋白水解酶裂解融合蛋白用SDS-PAGE來檢測(見圖12)。比較融合蛋白和CenA的穩(wěn)定性。改變蛋白水解酶的濃度和蛋白水解條件使結(jié)果最優(yōu)。
評價融合蛋白的結(jié)合特性；示差吸附分析為確定PBD-融合蛋白對不同纖維素同系物的親和性，對結(jié)合部分用SDS-PAGE分析即可評價它與各種纖維素骨架的結(jié)合情況。測定表明PDBN1與非晶型纖維素(PASC)結(jié)合而不與微晶纖維素(BMCC)結(jié)合。然而CBDCenA卻對這兩種纖維素物質(zhì)均有親和性。它們不同的結(jié)合特征就提供了在一種存在時除去另一種的方法的可能性。第一步加入BMCC除去CenA。在第一步后PBD融合蛋白保留在溶液中，然后通過吸附到PASC上來除去(見圖12)。在評價纖維素不飽和、飽和和過飽和的影響的測定中，與纖維素濃度對應(yīng)的各種蛋白質(zhì)組分的濃度可以不同。
這種選擇性除去或結(jié)合不同的組分在處理和純化融合蛋白時很重要。這種方法可包括當融合蛋白結(jié)合在多糖上時用CBD-蛋白水解酶可從融合蛋白中蛋白水解除去PBD生成所需的化合物。然后利用蛋白水解酶與纖維素(如BMCC)的結(jié)合除去蛋白水解酶獲得純凈的化合物。
實施例7用寡糖聚合物相為基礎(chǔ)的親和相分配介導Vero細胞分離的雙功能融合蛋白的制備和性質(zhì)細菌菌株、細胞系和生長條件化學試劑是HPLC分析級的。在37℃、補加入100mg/ml的氨芐青霉素(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，Germany)的LB培養(yǎng)基中使大腸桿菌生長來重組DNA。在37℃、補加入氨芐青霉素(100mg/ml)的TYP培養(yǎng)基(每升有16g胰化蛋白凍、16g酵母提取物、5gNaCl、2.5gK2HPO4)中生長的大腸桿菌R1360內(nèi)進行高水平表達研究和大規(guī)模蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。細菌培養(yǎng)基組分是來自Difco Laboratories(Detroit，MI)。搖瓶培養(yǎng)的搖動速度設(shè)定為250rpm。用0.15mM的異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Sigma Chemical Co.，Louis，Mo)誘導培養(yǎng)。用于吸附研究的Vero(非洲綠猴，腎-ATCC CCL81)細胞維持在37℃、有補加入10％ NCS(Gibco BRL)的DMEM或DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)和5％ CO2的T型搖瓶中。
重組DNA技術(shù)所有的重組DNA工作如前所述進行(Sambrook(1989)同上)。用堿性裂解法制備雙鏈DNA。DNA限制性酶和修飾酶根據(jù)生產(chǎn)商的建議使用。用瓊脂糖凝膠電泳來分離DNA片段。用GeneCleanTM(Biol01，La Jolla，CA)來分離DNA片段。用液氮法來分離小的DNA片段(小于100bp)。冷凍的感受態(tài)大腸桿菌細胞可用于所有的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。用ABI 380A DNA合成儀(Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA)來合成寡脫氧核苷酸并用C18柱層析來純化。在74℃、測序緩沖液(40mM Tris-HCl或pH7.5，20mM MgCl2，50mM NaCl)中使寡脫氧核苷酸退火，然后緩慢冷卻至4℃。用改進型T7DNA聚合物酶通過雙脫氧鏈終止法來對DNA測序(Sanger等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA(1977)745463-5467)。
多肽測定用十二烷基硫酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)來分離多肽。凝膠用考馬斯亮藍R250(BioRad，Richmond，CA)來染色；用裝有ImageQuantTM軟件的掃描密度計(計算密度機，Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)定量分析條帶。每個凝膠中含有純的CBPN1/RGD標準。純的CBPN1/RGD純制品濃度通過在280nm測定純CBD/RGD消光系數(shù)來測定(Scopes，Anal.Biochem.(1974)59277-282)。用兔抗CenA血清作為基本抗體和與辣跟過氧化物(Gibco BRL)共軛的羊抗兔血清作為次級抗體來進行Western印跡法。
寡糖結(jié)合測定這在實施例2中有所描述。
大規(guī)模生產(chǎn)和純化CBPN1/RGD如Wierzba等人(Biotechnol.and Bioeng.(1995)47147-145)描述的方法產(chǎn)生CBDN1，只是在R1360/pTZ18U-CBD/RGD構(gòu)建物中，編碼CBDN1的序列用編碼糞肥纖維單孢菌內(nèi)切葡聚糖酶A(CenA)的纖維素結(jié)合域(CBD)的序列代替。含有構(gòu)建物的大腸桿菌在37℃、有補加入氨芐青霉素(100mg/ml)和IPTG(0.15mM)的TYP培養(yǎng)基的12L發(fā)酵罐(Chemap AG，Volketswil，Switzerland)中生長。在31000g下離心(Sharples-Stokes Division，Pennwalt Corp.，Warminster，PA)分離細胞。培養(yǎng)基和細胞組分中的CBDN1/RGD分別用HEC和plucronic pios的混合物通過如實施例4所述的親和相分配法來純化。培養(yǎng)基通過GF/C玻璃纖維過濾器(Whatman International，Maidstone，UK)來過濾除去細胞碎片。將培養(yǎng)基加入相分離系統(tǒng)中。根據(jù)用于其它水性兩相分配系統(tǒng)的方法(如Joshi等人，“生物分離技術(shù)”Bioseparations，(1990)11311)，重要的區(qū)別是通過CBDN1融合物與HEC的結(jié)合大大加強了分離。圖17是該系統(tǒng)的示意圖，其中培養(yǎng)基上清液或細胞抽提物中的CBDN1-融合蛋白的親和提取物在商業(yè)Graesser型濃縮器(用于許多大規(guī)模分配系統(tǒng))或混合沉降粉碎器(Haynes，博士論文，加利福尼亞大學，Berkeley(1991))中產(chǎn)生。將含有CBDN1-融合蛋白的糖類富集提取相泵入第二個混合沉降粉碎器中反萃取產(chǎn)物，而富含聚(氧醚)的相用不相容的鹽反萃取，然后循環(huán)至親和接觸器中(Haynes等人，AIChE J.，(1991)371401)。將足夠量的鹽，通常是硫酸鹽或檸檬酸鹽加入含有結(jié)合靶蛋白的富含糖類的提取相中，從而形成相分離(見Walter等人，“水性兩相系統(tǒng)的分配”Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems，Academic Press(1985))。相分離所需的2M和更高的鹽濃度通常使得配體-蛋白質(zhì)復合物解離，因此，這是一種簡單的產(chǎn)物回收的方法。CBDN1和HEC的強放熱結(jié)合表明解離也可通過適當升高溫度或加入破壞氫鍵的共溶劑來實現(xiàn)。用滲濾或其它脫鹽方法來除去過多的鹽。懸浮液在4℃下緩慢攪拌過夜。用1-dD截斷膜(Amicon Division，W.R.Grace&Co.，Beverly，MA)通過超濾濃縮和與dH2O交換。對CBDN1/RGD溶液(5至12mg/ml)過濾除菌(0.2mm)并保藏在-20℃。
大腸桿菌細胞用50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)清洗，重新懸浮在150mL相同的補加入3mM EDTA的緩沖液中，在50ml French細胞壓力器(SLMInstruments，Urbana，IL)上破裂。在細胞抽提物中加入苯基甲基磺酰氟化物(1mM)和胃蛋白酶抑制劑A(1mM)以使蛋白水解程度最小。在4℃，17400g下離心30分鐘來除去細胞碎片。在上清液中加入鏈霉素硫酸鹽(Sigma)(1.5％w/v)。在4℃下過夜后，在4℃、17400g下離心30分鐘后收集沉淀。將上清液加入親和分配系統(tǒng)中，并如上所述對培養(yǎng)基肉湯的CBDN1/RGD進行純化。
細胞分離測定從有胰蛋白酶和EDTA的培養(yǎng)基皿中取出細胞，用含有0.01％大豆胰蛋白酶抑制劑的DMEM培養(yǎng)基(Sigma)洗一次，再用沒有抑制劑的DMEM培養(yǎng)基洗兩次。CBDN1放在無血清培養(yǎng)基中至洗過的細胞總數(shù)為4×106。在37℃培育1小時后，將結(jié)合CBDN1/RGD的細胞加入親和相分配系統(tǒng)中。在分離HEC相，加入胰蛋白酶將細胞從HEC上解離下，并離心收集細胞。用臺酚藍排阻來測定細胞活力。
實施例8用固定在微晶纖維素上的β-葡糖苷酶融合蛋白來從纖維糖上產(chǎn)生葡萄糖該過程是使內(nèi)切葡聚糖酶-外切葡聚糖酶與纖維糖共同培育，并將后續(xù)獲得的纖維糖混合物分流入固定有β-葡糖苷酶的微晶纖維素柱中(見圖13B)。方法如下。在一個發(fā)酵容器中，將適當比例的內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶加入含有待降解的纖維素物質(zhì)的培養(yǎng)基中。使酶反應(yīng)在一固定的時間內(nèi)以產(chǎn)生可溶于培養(yǎng)基的纖維二糖。首先將整個消耗的培養(yǎng)基和酶通過固定并濃縮內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的微晶纖維素柱。將含有纖維二糖的洗脫液分流入第二根固定有β-葡糖苷酶PBDCex融合蛋白的微晶纖維素柱上，然后使纖維二糖水解成葡萄糖單元。通過洗脫再生第一根柱上的外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶。兩根柱可重復使用數(shù)次以進行純化和酶轉(zhuǎn)化。
實施例9CBDN1-堿性磷酸酶融合蛋白表達盒的制備TNphoA是含有大腸桿菌堿性磷酸酶基因phoA而無其信號肽序列(′phoA)的Tn5轉(zhuǎn)座子的衍生物。PhoA融合蛋白可通過在正確的閱讀框架處轉(zhuǎn)座插入表達基因來形成。如果靶基因含有蛋白質(zhì)排出信號，那么它們可直接分泌融合蛋白。僅當酶分泌入外周質(zhì)時分泌物才可檢測到有堿性磷酸酶活性。TnphoA可用于在由多個克隆位點的質(zhì)粒上與糞肥纖維單孢菌CBDN1編碼序列形成phoA基因融合。編碼感興趣的蛋白質(zhì)的基因可克隆入多個克隆位點(mcs)并作為融合蛋白表達。基因產(chǎn)物產(chǎn)物可在HEC-Pluronic IOS CBDN1中用親和相分配來純化。
基因融合物的制備和分析TnphoA的轉(zhuǎn)座誘變可用來制得與CBDN1融合的基因。含有CBDN1的質(zhì)粒是pTugKN1(見圖5和6)。
轉(zhuǎn)座通過含有轉(zhuǎn)座子lTnphoA-1的缺陷型λ噬菌體的感染來介導(Gutierrez等人，“分子生物學”J.Mol.Biol.(1987)195289-297)。大腸桿菌CC118的phoA基因中有缺失。CBDN1轉(zhuǎn)座插入框內(nèi)CBDN1編碼序列將生成尋靶胞外介質(zhì)的CBDN1-PhoA融合蛋白。在顯色底物5-溴-4-氯-3吲哚基磷酸鹽(XP)上在選出的有卡那霉素(轉(zhuǎn)座子衍生獲得)和氨芐青霉素抗性的菌落中篩選出有堿性磷酸酶活性的。重新轉(zhuǎn)化來自PhoA+菌落的質(zhì)粒DNA并如上進行選擇和篩選。在用剛果紅染色的羧甲基纖維素(CMC)平板上篩選有內(nèi)切葡聚糖酶活性的PhoA+菌落(Greenwood等人FEBS Letters(1984)2259-263)。希望得到的表型是PhoA+，EngA-和對氨芐青霉素和卡那霉素有抗性。
用限制性酶切從PhoA+，EngA-菌落中分離得到質(zhì)粒DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳對TnphoA插入CBDN1正確取向的菌落進行分析。在觀察融合的蛋白質(zhì)產(chǎn)物時，很明顯這些克隆中的一些有框外插入。測定CBDN1-PhoA融合蛋白與可溶性寡糖如HEC的結(jié)合情況。通過用鏈終止法對DNA測序可測得TnphoA插入的確切位置。
融合蛋白的純化將含有融合蛋白的澄清大腸桿菌細胞抽提物施用于HEC-pluronic 105親和分配系統(tǒng)，系統(tǒng)的緩沖液可促進融合蛋白與HEC聚合物的結(jié)合。在分離HEC相和pluronic105相后，升高溫度解吸融合蛋白并收集融合蛋白。測定收集組分的堿性磷酸酶活性，酶峰進一步用離子交換或凝膠過濾層析純化。純化條件可以不同以回收堿性磷酸酶活性。
根據(jù)雙倒數(shù)形式表示的吸附數(shù)據(jù)計算參數(shù)(±累計標準誤差)。如實施例3，C所述的，用[No]＝101mmol晶格殘基/g纖維素計算Ka和α值。USSN 5,340,731的圖15和16表示了PBPCex以及殼多糖對纖維素(包括微晶纖維素、BMCC和再生纖維素(RC))的吸附和相對親和力。USSN 5,340,731的圖17表示加入的去垢劑對CEBCex與本發(fā)明的組合物(包含雜交蛋白質(zhì)，其中至少多糖的PBP與感興趣的配體如蛋白質(zhì)或化學物質(zhì)如顏料或染料連接)的結(jié)合的影響。酶法去除兩種不同的可去除標記重組合物與纖維素的結(jié)合的例子列在圖14中。
實施例10單熱分離聚合物系統(tǒng)有一類親和濃縮和分離系統(tǒng)采用單種對CBDN1或其它可溶性多糖結(jié)合域有親和性的熱分離多糖。這種多糖族的成員包括甲基纖維素、乙基羥乙基纖維素、丙基羥乙基纖維素和羥丙基甲基纖維素。這些系統(tǒng)可用來結(jié)合分離含有可溶性寡糖結(jié)合域的融合/雜交蛋白質(zhì)(在培養(yǎng)時分泌至培養(yǎng)基上清液中)，或在細胞裂解、滲透壓休克等后結(jié)合和分離含有可溶性寡糖結(jié)合域的胞內(nèi)融合/雜交蛋白質(zhì)。在兩種系統(tǒng)中，方法如下在低于當前溫度的溫度下將熱分離多糖加入含有暴露融合蛋白的培養(yǎng)基上清液或水解液中?；旌蠠岱蛛x多糖和培養(yǎng)基上清液或裂解物，緩慢升高溫度直至高于多糖的當前溫度。當剩余溶液中富含聚合物相形成時，可回收富含聚合物的相，融合蛋白可從多糖上洗脫下來。然后剩余的含有剩余溶解物的溶液可以棄去。
方法分為四步將熱分離多糖加入含有多糖結(jié)合蛋白或任何含有多糖結(jié)合蛋白的融合蛋白的水性溶液中，使聚合物和所述蛋白質(zhì)接觸并結(jié)合；在混合條件下緩緩將溫度升高至超過CPT的溫度；在高于CPT的溫度下消除混合，使得可以分離富含水和富含聚合物的兩相(這可通過重力沉降來實現(xiàn)或通過離心來加強；回收富含聚合物的相(它含有靶蛋白)并洗脫靶寡糖結(jié)合蛋白或含有寡糖結(jié)合蛋白的融合蛋白。
實施例11含有一種或多種熱分離聚合物的親和水性兩相系統(tǒng)這里匯編了含有一種或多種對CBDN1有親和性的熱分離聚合物的水性兩相系統(tǒng)(見下表)。這些系統(tǒng)可進行高度親和分離成含有聚合物的相，然后與區(qū)域結(jié)合的聚合物可用簡單的方法來回收循環(huán)使用。
將以四種不同纖維素為基礎(chǔ)的可與CBDN1和其它寡糖結(jié)合蛋白結(jié)合的聚合物與其它兩種非纖維素類聚合物合用，形成許多新的水性兩相系統(tǒng)。制成的水性兩相系統(tǒng)的性質(zhì)將在下面進行討論。
Pluronic-Klucel系統(tǒng)八種不同級別的Pluronics與三種級別的Klucel合用。所用的Pluronics包括F68、F77、F108、P84、P103、P104、P105和P123。所用的Klucel的級別是Klucel H、1和M。Pluronic F68-Klucel H 兩相系統(tǒng)由含有各種聚合物至少10％(總重量百分數(shù))的溶液形成。Pluronic F68-Klucel L 兩相系統(tǒng)由含有各種聚合物至少13％(總重量百分數(shù))的溶液形成。Pluronic F68-Klucel M 在聚合物濃度大于12％(w/w)時發(fā)現(xiàn)相分離。Pluronic F77-Klucel H 溶液在每種聚合物為9％時發(fā)現(xiàn)相分離。上相是澄清的而下相是混濁的。Pluronic F77-Klucel L 溶液的每種聚合物的濃度為10％(w/w)時發(fā)現(xiàn)相分離。Pluronic F77-Klucel M 兩相系統(tǒng)由含有各種聚合物至少10％(總重量百分數(shù))的溶液形成。Pluronic F108-Klucel H 兩相系統(tǒng)由含有各種聚合物至少10％(總重量百分數(shù))
的溶液形成。Pluronic F108-Klucel L 兩相系統(tǒng)由含有各種聚合物至少10％(總重量百分數(shù))的溶液形成。Pluronic F108-Klucel M 兩相系統(tǒng)由含有各種聚合物至少9％(總重量百分數(shù))的溶液形成。Pluronic F103-Klucel H 在濃度約為6.5％Pluronic和7.1％Klucel時發(fā)現(xiàn)分離。Pluronic F104-Klucel H 在濃度約為4.1％Pluronic和3.8％Klucel時發(fā)現(xiàn)分離。Pluronic F105-Klucel H 溶液在4.5％Pluronic和2.8％Klucel的濃度下發(fā)現(xiàn)相分離。低濃度的兩相系統(tǒng)并不粘稠。Pluronic F105-Klucel L 當濃度為5.0％Pluronic和3.5％Klucel時產(chǎn)生分離。在該范圍內(nèi)的兩相溶液不粘稠。下相在高于40℃的溫度下熱分離。Pluronic F105-Klucel M 在低達3.9％Pluronic和2.5％Klucel的濃度下發(fā)現(xiàn)有相分離。下相在高于38℃的溫度下變得粘稠混濁。Pluronic F123-Klucel H 在濃度為5.6％Pluronic和4.0％Klucel時形成兩相系統(tǒng)。
葡聚糖-Natrosol系統(tǒng)三個級別的葡聚糖與三個級別的Ntrosol形成一系列新的水性兩相系統(tǒng)。葡聚糖的級別包括T40、T70和T500，而Natrosol的級別包括250HR、250LR和250MR。葡聚糖T40-Natrosol250LR溶液每種聚合物濃度為10％時形成水性兩相系統(tǒng)。葡聚糖T70-Natrosol250LR溶液含5.2％葡聚糖和5.0％Natrosol形成水性兩相系統(tǒng)。葡聚糖T500-Natrosol250LR 溶液每種聚合物為5.3％時形成水性兩相系統(tǒng)。
Pluronic-葡聚糖系統(tǒng)四個級別的葡聚糖與四個級別的Pluronic合用形成一系列新的本發(fā)明有用的水性兩相系統(tǒng)。葡聚糖的級別包括T40、T50和T2000。所用的Pluronic包括F68、F77、F108和P105。大多數(shù)聚合物的組合在低聚合物濃度和低粘度下發(fā)現(xiàn)有非常好的相分離性質(zhì)。Pluronic F68-葡聚糖T40 每種聚合物濃度為9.0％時發(fā)現(xiàn)相分離。在這些濃度下兩相系統(tǒng)的澄清的且不粘稠。Pluronic F68-葡聚糖T70Pluronic和葡聚糖的濃度分別為7.％和5.9％時發(fā)現(xiàn)相分離。Pluronic F68-葡聚糖T500 每種聚合物濃度為6.3％時形成水性兩相系統(tǒng)。Pluronic F68-葡聚糖T2000 每種聚合物濃度為9.0％時形成水性兩相系統(tǒng)。Pluronic F77-葡聚糖T40Pluronic和葡聚糖濃度為10.0％和9.2％時形成水性兩相系統(tǒng)。Pluronic F77-葡聚糖T70溶液中各種聚合物濃度為約8.2％時產(chǎn)生相分離。Pluronic F77-葡聚糖T500 各種聚合物濃度為約7.0％時產(chǎn)生相分離。Pluronic F77-葡聚糖T2000 各種聚合物濃度為約10.7％時發(fā)現(xiàn)相分離。Pluronic F108-葡聚糖T40 各聚合物濃度為約7.0％時形成水性兩相系統(tǒng)。Pluronic F108-葡聚糖T70 各聚合物濃度為約7.0％時形成水性兩相系統(tǒng)。Pluronic F108-葡聚糖T500 Pluronic和葡聚糖濃度分別為3.9％和3.4％時產(chǎn)生相分離。Pluronic F108-葡聚糖T2000 Pluronic和葡聚糖濃度分別為3.4％和3.9％時產(chǎn)生相分離。Pluronic P105-葡聚糖T40 各聚合物濃度為約8.0％時形成水性兩相系統(tǒng)。Pluronic P105-葡聚糖T70 Pluronic和葡聚糖濃度為6.3％時形成水性兩相系統(tǒng)。Pluronic P105-葡聚糖T500 各聚合物濃度各自稍低于6.0％時產(chǎn)生分離。Pluronic P105-葡聚糖T2000 各聚合物濃度為6.0％時產(chǎn)生相分離。
Klucel-葡聚糖系統(tǒng)三個級別的Klucel與四個級別的葡聚糖合用形成一系列新的水性兩相系統(tǒng)。所用的Klucel的級別包括Klucel H、L和M。所用的葡聚糖的級別包括葡聚糖T40、T70、T700和T2000。Klucel H-葡聚糖T40Klucel和葡聚糖的濃度分別為6.8％和8.3％時形成水性兩相系統(tǒng)。Klucel H-葡聚糖T70各聚合物的濃度為6.8％時形成水性兩相系統(tǒng)。Klucel H-葡聚糖T500 在稍高于3.0％的濃度下產(chǎn)生相分離。Klucel H-葡聚糖T2000 濃度為3.2％時發(fā)現(xiàn)有相分離。Klucel L-葡聚糖T40溶液濃度大于4.0％時發(fā)現(xiàn)相分離。Klucel L-葡聚糖T70每種聚合物濃度均為3.6％時形成水性兩相系統(tǒng)。Klucel L-葡聚糖T500 濃度為3.9％時發(fā)現(xiàn)分離。Klucel L-葡聚糖T2000 Klucel和葡聚糖濃度分別為3.5％和3.1％時發(fā)現(xiàn)相分離。Klucel M-葡聚糖T40在濃度稍高于3.1％時形成水性兩相系統(tǒng)。Klucel M-葡聚糖T70濃度為約3.5％時發(fā)現(xiàn)相分離。Klucel M-葡聚糖T500 聚合物濃度為3.5％時發(fā)現(xiàn)有相分離。Klucel M-葡聚糖T2000 濃度低于4.0％時形成水性兩相系統(tǒng)。
HPMC-葡聚糖系統(tǒng)用Sigma的HPMC和五個不同級別的葡聚糖形成一系列新的水性兩相系統(tǒng)。所用的葡聚糖的級別包括葡聚糖T40、T70、T500、T2000和葡聚糖硫酸鈉。HPMC-葡聚糖T40各聚合物濃度低于3.0％時發(fā)現(xiàn)相分離。HPMC-葡聚糖T70HPMC和葡聚糖濃度分別為3.8％和4.6％時發(fā)現(xiàn)分離。HPMC-葡聚糖T500 溶液濃度低于3.4％時發(fā)現(xiàn)相分離。HPMC-葡聚糖T2000 濃度接近4.0％時產(chǎn)生分離。HPMC-葡聚糖硫酸鈉 HPMC和葡聚糖硫酸鈉濃度分別為2.9％和4.1％時產(chǎn)生分離。
HPMC-Pluronic系統(tǒng)用Sigma的HPMC和五個級別的Pluronic形成一系列新的水性兩相系統(tǒng)。Pluronic是P系列，包括Pluronic P84、P103、P104、P105和P123。HPMC-Pluronic P84 HPMC和Pluronic濃度為6.3％和7.8％時發(fā)現(xiàn)相分離。在該濃度下，上相是澄清的且很少，這表明該溶液與相界接近。HPMC-Pluronic P103在濃度低于4.0％時形成水性兩相系統(tǒng)。HPMC-Pluronic P104溶液濃度為約3.6％時產(chǎn)生分離。HPMC-Pluronic P105聚合物濃度為約5.5％時發(fā)現(xiàn)相分離。HPMC-Pluronic P123HPMC和Pluronic濃度分別為5.5％和6.4％時產(chǎn)生相分離。
實施例12親和電泳測定纖維素為基礎(chǔ)的聚合物和CBD間的反應(yīng)在四種纖維素為基礎(chǔ)的聚合物上進行親和電泳分析以測定分子和糞肥纖維單孢菌CenC的纖維素結(jié)合域(CBDN1)的N末端間的任何反應(yīng)。在四種纖維素為基礎(chǔ)的聚合物上分別測試CBDN1和CBDN1N2。用不與纖維素分子結(jié)合的牛血清白蛋白(BSA)作對照。結(jié)果歸納在下面。
Klucel(HPC)在pH7時發(fā)現(xiàn)Klucel H和Klucel L與CBDN1和CBDN1N2間有強結(jié)合反應(yīng)從而導致凝膠上的遷移損失。(見圖9)。
Natrosl(HEC)發(fā)現(xiàn)CBDN1和CBDN1N2與Natrosol間有強結(jié)合(見圖9)。
Bermocoll E(EHEC)研究兩個級別的Bermocoll E與CBDN1和CBDN1N2間的結(jié)合反應(yīng)。如電泳測定兩種聚合物均與CBDN1和CBDN1N2強結(jié)合。
羥丙基甲基纖維素(HPMC)電泳測定測得HPMC與CBDN1或CBDN1N2間有強結(jié)合。
當前的親和分配系統(tǒng)由于每個聚合物鏈上只有一個或兩個配體而配體密度很低，從而在容量和分辨能力上有局限性。由于聚合物濃度通常低于15％(重量)，因此配體與聚合物化學計量比為1∶1或2∶1的親和分配系統(tǒng)通常產(chǎn)生的靶蛋白分離系數(shù)(相對于雜質(zhì)的分離系數(shù))在5至50之間。這些分離系數(shù)可滿足足夠的產(chǎn)物濃度，但是總是不能在低成本的一步或兩步提取過程中提供所需的產(chǎn)物濃度。經(jīng)典的親和分配系統(tǒng)也受到生產(chǎn)聚合物配體共軛物的化學花費的局限。如果相形成聚合物的單體單元用作親和配體時，可除去這些成本和容量的局限性。CBDN1和各種水溶性纖維素底物間的靈敏的選擇性的結(jié)合提供了用于連續(xù)純化或重組蛋白質(zhì)的新的、低成本的、高度靈活的親和分配系統(tǒng)。CBDN1和靶蛋白或肽的基因連鎖形成了一種融合體，它可在厘摩爾量的電解質(zhì)存在時與水溶性糖類牢固結(jié)合并保持融合部分的生物活性。
本說明書中提及的所有公開和專利申請表明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水準。盡管每個個人公開或?qū)＠暾埵歉鶕?jù)文獻特別單獨指出的，但是所有的公開和專利申請在這里以相同程度參照引證。
本發(fā)明已完全描述，它對該領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的，他們可在不脫離附加權(quán)利要求的范圍內(nèi)作許多改進和變動。
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述蛋白水解酶識別序列與所述多糖結(jié)合肽異源。
13.一種兩相分配系統(tǒng)包括相形成寡糖聚合物作為第一組分，它與多糖結(jié)合肽以Ka為103M至107M的值結(jié)合，相分離誘導劑作為第二組分，其中所述第一和第二組分均以足夠的量存在以誘導相分離。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的兩相分配系統(tǒng)，其中所述多糖結(jié)合肽從糞肥纖維單孢菌內(nèi)切葡聚糖酶C衍生獲得。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的兩相分配系統(tǒng)，其中所述多糖結(jié)合肽是CBDN1。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的兩相分配系統(tǒng)，其中所述第一組分選自羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基纖維素和甲基纖維素。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的兩相分配系統(tǒng)，其中所述第二組分選自聚乙二醇聚合物、葡聚糖和環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的共聚物。
18.一個與可溶性寡糖結(jié)合但不與微晶纖維素結(jié)合的纖維素結(jié)合域。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的纖維素結(jié)合域，其中所述結(jié)合域是CBDN1。
20.一種分離包含來自混合物的多糖結(jié)合肽的化合物的方法，所述方法包括對所述有可溶于水性溶液的與所述化合物結(jié)合的熱分離β-1，4-連接的纖維糖的混合物加熱至發(fā)生相分離的溫度，并獲得所述化合物分配入的纖維糖聚合物相；收集所述包含從所述混合物其它組分分離獲得的化合物的纖維糖聚合物相。
21.根據(jù)權(quán)利要求13所述的兩相分配系統(tǒng)，包括一種組合物作為第三組分，它包含與所述寡糖聚合物結(jié)合的多糖結(jié)合肽。
22.一種裂解酶復合物，包含與不溶性多糖結(jié)合的多糖結(jié)合肽。
權(quán)利要求
1.一種純化包含來自混合物的其它組分的多糖結(jié)合肽的化合物的方法，所述方法包括誘導包含所述混合物和與所述化合物結(jié)合的相形成寡糖聚合物的溶液的相分離，使所述化合物分配入含有所述寡糖聚合物的相中；收集所述的寡糖聚合物相；和將所述化合物從所述寡糖聚合物上解離下來，從而獲得包含與所述混合物相比純化的所述化合物的溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中相分離是用一種相分離誘導劑來誘導的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述寡糖聚合物是熱分離聚合物，且相分離是通過將所述溶液加熱至發(fā)生相分離的溫度來誘導。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述寡糖聚合物是β-1，4-葡聚糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述β-1，4-葡聚糖是纖維素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述纖維素選自羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、乙基羥乙基纖維素和羥丙基纖維素。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多糖結(jié)合肽從多糖酶或多糖結(jié)合蛋白的多糖結(jié)合域衍生獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述多糖酶是纖維素酶。
9.一種純化來自混合物的其它組分的多肽的方法，所述方法包括使所述混合物與相分離系統(tǒng)在一定條件下接觸，系統(tǒng)有可溶于水性溶液的與所述多肽結(jié)合的相形成寡糖聚合物作為第一組分，以及相分離誘導劑作為第二組分，從而使所述多肽分配入包含所述寡糖聚合物的相中，其中所述多肽包含多糖結(jié)合肽；收集所述寡糖聚合物相；和將所述多肽從所述寡糖聚合物上解離下來，從而獲得包含與所述混合物相比純化的所述多肽的溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述多肽是包含所述多糖結(jié)合肽和大分子的融合多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述融合多肽在所述多糖結(jié)合肽和所述大分子間包含一種蛋白水解酶識別序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述蛋白水解酶識別序列與所述多糖結(jié)合肽異源。
13.一種兩相分配系統(tǒng)包括相形成寡糖聚合物作為第一組分，它與多糖結(jié)合肽以Ka為103M至107M的值結(jié)合，相分離誘導劑作為第二組分，其中所述第一和第二組分均以足夠的量存在以誘導相分離。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的兩相分配系統(tǒng)，其中所述多糖結(jié)合肽從糞肥纖維單孢菌內(nèi)切葡聚糖酶C衍生獲得。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的兩相分配系統(tǒng)，其中所述多糖結(jié)合肽是CBDN1。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的兩相分配系統(tǒng)，其中所述第一組分選自羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羥丙基纖維素和甲基纖維素。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第二組分選自聚乙二醇聚合物、葡聚糖和環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的共聚物。
18.一個與可溶性寡糖結(jié)合但不與微晶纖維素結(jié)合的纖維素結(jié)合域。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的纖維素結(jié)合域，其中所述結(jié)合域是CBDN1。
20.一種分離包含來自混合物的多糖結(jié)合肽的化合物的方法，所述方法包括對所述有可溶于水性溶液的與所述化合物結(jié)合的熱分離β-1，4-連接的纖維糖的混合物加熱至發(fā)生相分離的溫度，并獲得所述化合物分配入的纖維糖聚合物相；收集所述包含從所述混合物的其它組分分離獲得的化合物的纖維糖聚合物相。
全文摘要
本發(fā)明提供分離和/或純化生物組合物的新的方法。生物組合物包含多糖結(jié)合肽,并可完全或部分合成或用重組DNA技術(shù)來制備。在該方法中,將含有生物組合物的溶液與結(jié)合肽的相形成寡糖混合并誘導相分離。然后分離獲得含有生物組合物的相。相分離用相分離誘導劑來誘導,或當寡糖聚合物是熱分離聚合物時,可通過將溫度升高至聚合物濁點溫度以上來誘導。
文檔編號A61K39/39GK1193995SQ96196571
公開日1998年9月23日 申請日期1996年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月24日
發(fā)明者C·A·海恩斯, P·湯米, D·G·基爾伯恩 申請人:不列顛哥倫比亞大學