專利名稱：經(jīng)口遞送基因構(gòu)建物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)口遞送的基因治療載體。更確切地說，它涉及經(jīng)口遞送基因構(gòu)建物至胃腸道內(nèi)靶位點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)粘膜免疫或全身免疫或者表達(dá)局部應(yīng)用或全身應(yīng)用的治療蛋白質(zhì)。
人們建議用基因療法治療多種遺傳病和后天病。體細(xì)胞的基因治療以前集中于轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓干細(xì)胞和來自循環(huán)組織和固體組織的淋巴細(xì)胞。已有描述有關(guān)基因治療的多種遞送方法，包括經(jīng)鼻、經(jīng)肺的和肌內(nèi)的方法。人們注意到GI系統(tǒng)(胃腸系統(tǒng))可作為基因治療的有益的靶，因?yàn)樗子诮邮軆?nèi)窺鏡，在它的腺管中含有永生的祖細(xì)胞，且它可以在活體內(nèi)持續(xù)增殖(F.Ledley，J.Pediatric Gastroen-terology and Nutrition，14328-337(1992))。
基因治療可以兩種基本方式進(jìn)行通過活體內(nèi)和通過在活體外遞送，接著將細(xì)胞返回給病人(M.Morsy et al.JAMA，270102338-2345(November 17，1993)。授予French et al.的US Patent No.5,399,346中描述了將基因處理的抗原特異性淋巴細(xì)胞用于遞送基因產(chǎn)物至靶位點(diǎn)或作為全身治療。遞送淋巴細(xì)胞是通過中心靜脈導(dǎo)管進(jìn)行的。也有提議用脂質(zhì)體和DNA-脂質(zhì)復(fù)合體作替代方式通過病毒載體在活體內(nèi)遞送基因產(chǎn)物。這些復(fù)合體可體外加入細(xì)胞，非腸道注射或?qū)τ诮?jīng)肺遞送的煙霧化以達(dá)到活體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和組織(D.Lasic et al，Science，2671275-1276(March 3，1995))。
經(jīng)腸遞送載體也有描述。H-Soriano-Brücher，AGA Abstracts，Gastroenterology 1005，2(May 1991)認(rèn)為，腸道內(nèi)進(jìn)行體細(xì)胞的基因治療可能因其可達(dá)性而比其它組織更為容易。作者們描述了應(yīng)用非復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將報(bào)導(dǎo)基因遞送至大鼠回腸內(nèi)。PCT/US 92/07029描述了腺病毒介導(dǎo)的將治療基因轉(zhuǎn)移至胃腸道以產(chǎn)生全身用和/或局部用治療蛋白質(zhì)。通過腸衣膠囊的方式經(jīng)口遞送病毒載體。PCT/US 94/04589描述了將DNA結(jié)合蛋白用于傳遞基因至細(xì)胞。乳鐵傳遞蛋白是一種鐵結(jié)合蛋白，它同時(shí)結(jié)合DNA與靶細(xì)胞上特異性受體。乳鐵傳遞蛋白-DNA復(fù)合體在小腸內(nèi)結(jié)合至乳鐵傳遞蛋白受體上，并通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。這種乳鐵傳遞蛋白-DNA復(fù)合體可用于經(jīng)口遞送基因，此處與乳脂微團(tuán)調(diào)制。
已有人研究了基因轉(zhuǎn)移通過腸上皮的難點(diǎn)。Sweeter et al，ProcNatl Acad Sci，USA 859611-9615(December 1988)把腸上皮描述為連續(xù)增殖的細(xì)胞物質(zhì)，并報(bào)導(dǎo)，對(duì)在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)hGH報(bào)道基因的分析表明，在上皮的基因表達(dá)中由細(xì)胞特異性因子和區(qū)域因子(geographic factor)導(dǎo)致區(qū)域差異。Jones et al，J Biol Chem 26524，14684-14690(1990)指出，腸的定向基因治療既可實(shí)現(xiàn)又合乎需要，由于它易被小腸接受，且它對(duì)病毒感染敏感。Sandberg et al.Human Gene Therapy 5323-329(1994)還特別提到將腸上皮作為體細(xì)胞基因治療的位點(diǎn)這一令人感興趣的作法。該文獻(xiàn)啟示，腸腺內(nèi)的腸干細(xì)胞是基因治療的理想靶；而且，使腸膨脹有利于接近這些細(xì)胞，從而減少絨毛、擴(kuò)大絨毛間的間隙并除去活體內(nèi)的保護(hù)性粘液層。
雖然這些文獻(xiàn)都認(rèn)識(shí)到腸是體細(xì)胞基因治療的優(yōu)選位點(diǎn)，但還需要在程序時(shí)間和腸內(nèi)位點(diǎn)遞送載體。
用于遞送治療活性劑的滲透性分配裝置是本技術(shù)中人們熟知的。這種裝置是用膨脹器在數(shù)小時(shí)、數(shù)天或數(shù)月期間遞送藥劑至應(yīng)用環(huán)境。該膨脹器吸收液體、膨脹，然后以受控制的、通常是恒定的方式從裝置內(nèi)部放出有益藥劑調(diào)和物。這種滲透性膨脹器被用于在一段時(shí)間內(nèi)、通常較慢地可控地遞送藥劑。因此，這類裝置通常不用于這種場(chǎng)合即延遲藥劑的初始釋放，接著是迅速釋放，或者大致同時(shí)引入所有藥劑或一次性將含藥劑的所有劑量形式引入應(yīng)用環(huán)境(例如參見US Patent Nos.3,845,770和3,916,899，它們并入本文作參考)。并入本文作參考的US Patent No.5,342,624揭示了由兩部分構(gòu)成的經(jīng)口遞送膠囊，其中的一部分是由水敏材料制作的栓。當(dāng)栓吸收水時(shí)，會(huì)發(fā)生藥劑初始釋放的延遲，致使栓溶脹或膨脹且最后從膠囊體分離而釋放含于其中的藥劑。遺憾的是，栓溶脹和最后釋放引起膠囊內(nèi)的體積膨大而使膠囊內(nèi)形成真空，使流體環(huán)境中的流體進(jìn)入膠囊與活性劑接觸。如果活性劑對(duì)流體如同有益于基因治療的病毒載體和非病毒載體那樣敏感，則這種接觸可引起藥劑的凝聚或失活。此外，被溶脹的水敏栓吸收的流體也可與流體敏感活性劑接觸。
本發(fā)明涉及提供人基因治療的方法。該方法包括口服作為丸劑遞送至胃腸道中靶位點(diǎn)的基因構(gòu)建物或載體。
本發(fā)明還涉及用于為基因治療而遞送基因構(gòu)建物至胃腸道的流體滲透分配裝置。該裝置包括具有兩個(gè)可分離部分的殼，第一個(gè)可分離部分限定含基因構(gòu)建物組合物的水不透性外殼。裝置中的膨脹劑引起外殼兩部分在與應(yīng)用環(huán)境接觸后分離，致使基因構(gòu)建物遞送至胃腸道中的靶位點(diǎn)。
附圖不是按比例繪制，而是用以闡述本發(fā)明的各實(shí)施方案。相同的數(shù)字表示相同的結(jié)構(gòu)。


圖1表示本發(fā)明裝置的一個(gè)實(shí)施方案的剖面圖，該裝置在放入應(yīng)用環(huán)境之前處于密封或預(yù)備形式。
圖2表示圖1的裝置放入應(yīng)用環(huán)境中活化后所處的工作狀態(tài)，示出裝置開啟釋放基因構(gòu)建物至環(huán)境。
圖3表示本發(fā)明裝置的又一個(gè)實(shí)施方案的剖面圖，該裝置在放入應(yīng)用環(huán)境之前處于密封或預(yù)備形式。
圖4表示圖3的裝置放入應(yīng)用環(huán)境中活化后所處的工作狀態(tài)，示出裝置開啟釋放基因構(gòu)建物至環(huán)境。
本發(fā)明涉及遞送基因構(gòu)建物至胃腸(GI)道內(nèi)靶位點(diǎn)的方法和裝置?；驑?gòu)建物調(diào)和物的遞送，一旦開始便迅速完成。遞送裝置是這樣設(shè)計(jì)的，該遞送裝置進(jìn)入胃腸道之后以丸劑形式將所有的基因構(gòu)建調(diào)和物同時(shí)導(dǎo)入胃腸道中的靶位點(diǎn)。
術(shù)語“基因治療”表示遞送基因構(gòu)建物或載體至靶位點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)粘膜免疫或全身免疫或者為局部應(yīng)用或全身應(yīng)用表達(dá)治療蛋白質(zhì)。
術(shù)語“丸劑”表示在一小時(shí)或更短且通常在45分鐘內(nèi)、優(yōu)選在小于約30分鐘的時(shí)間內(nèi)，從裝置中釋放基本上全部基因構(gòu)建調(diào)和物?！盎旧先俊被驑?gòu)建調(diào)和物表示含于裝置中的多于約85％、優(yōu)選約95％以上且通常多于98％的基因構(gòu)建調(diào)和物。
如文中用到的術(shù)語“治療有效量”或“治療有效速率”表示基因的量或施用速率使得表達(dá)水平產(chǎn)生所需的治療結(jié)果、通常為有益的結(jié)果。
“治療蛋白質(zhì)”表示提供一定的藥理效果、通常是有益效果的蛋白質(zhì)或多肽。該效果可能集中于胃腸道或者可能是全身性的。用于系統(tǒng)施用的這類藥劑實(shí)例包括但不局限于抗胰蛋白酶α1，凝血因子VIII，凝血因子IX和其它凝固因子，生長(zhǎng)激素，胰島素和其它肽類激素，促腎上腺皮質(zhì)激素，促甲狀腺激素和其它垂體激素，干擾素α、β和δ，促紅細(xì)胞生成素，生長(zhǎng)因子，組織纖溶酶原激活物，CD4，白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑，腫瘤壞死因子受體，和重組抗體以及抗體片段等等。提供胃腸道局部基因治療的治療蛋白質(zhì)實(shí)例包括但不限于胰酶，乳糖酶，細(xì)胞因子，白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑，腫瘤壞死因子受體，重組抗體和抗體片段，腫瘤抑制蛋白，細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)等等。這些蛋白質(zhì)有益于治療多種疾病，包括但不局限于血友病和其它血液病，生長(zhǎng)障礙，糖尿病，白血病，肝炎，腎衰竭，HIV感染，遺傳病如腦苷脂酶缺陷和腺苷脫氨酶缺陷，高血壓，膿毒性休克，自身免疫病如多發(fā)性硬化癥，格雷夫斯病，全身性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，休克和消瘦病，囊性纖維化，不耐乳糖癥，節(jié)段性回腸炎，炎性腸病，以及胃腸癌和其它癌。進(jìn)一步的有益效果，即誘導(dǎo)對(duì)自身免疫病、過敏反應(yīng)的治療和預(yù)防接觸性超敏反應(yīng)的口服耐性(oral tolerance)，可通過重組肽的基因生產(chǎn)來實(shí)現(xiàn)；而經(jīng)口免疫法(oral immunization)可通過重組病毒的、寄生物的、細(xì)菌的或其它抗原的基因生產(chǎn)來實(shí)現(xiàn)。
參照裝置結(jié)構(gòu)，“不滲透性的”表示裝置的特定部分對(duì)流體和含于裝置和腸環(huán)境中的組分是不透性的?！鞍霛B透的”表示外殼對(duì)流體是滲透性的，但對(duì)含于裝置中或腸環(huán)境中的其它組分是不透性的。
術(shù)語“載體”和“基因構(gòu)建物”用于文中可互換且表示遺傳因子的組合，它用調(diào)節(jié)產(chǎn)物表達(dá)水平的因子編碼治療蛋白質(zhì)。“病毒載體”表示在病毒或病毒相關(guān)的粒子內(nèi)包裝重組基因。于是病毒的作用是感染和將基因整合入靶細(xì)胞，這樣基因就會(huì)表達(dá)治療蛋白質(zhì)。在本發(fā)明裝置中有用的病毒載體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、牛痘和單純瘡疹病毒。反之，“非病毒載體”表示可能或不可能與化合物或生物化合物相關(guān)的重組基因，所述兩類化合物可穩(wěn)定化或促進(jìn)細(xì)胞攝取DNA。在一個(gè)這種實(shí)例中，帶有一個(gè)啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)的重組DNA分子被摻入一DNA骨架中。其它實(shí)例包括應(yīng)用與DNA分子復(fù)合的陽離子脂質(zhì)和中性脂質(zhì)和添加使具有受體介導(dǎo)攝取DNA性能的蛋白質(zhì)或嵌合蛋白(例如參見，MAMorsy et al，JAMA，27019，2338-2345(November 17，1993)和FD Ledley，J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 14328-337(1992)，均并入本文作參考)。
術(shù)語“基因構(gòu)建調(diào)和物”或“載體調(diào)和物”表示任選與藥物上可接受的載體和其它惰性物質(zhì)組合的病毒載體或非病毒載體。應(yīng)懂得，可以將多于一種病毒載體或非病毒載體摻入本發(fā)明裝置中的基因構(gòu)建調(diào)和物，且所用術(shù)語“載體”或“基因構(gòu)建物”決不是排除兩種或多種這類藥劑的應(yīng)用。
應(yīng)用于遞送裝置中病毒載體或非病毒載體的量應(yīng)是導(dǎo)致治療有效量的治療蛋白質(zhì)表達(dá)至達(dá)到預(yù)期結(jié)果所需的量。其實(shí)，它的可變范圍寬，取決于具體藥劑、遞送位點(diǎn)、疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)期的療效。所以，若規(guī)定摻入裝置的基因構(gòu)建物或載體的用量范圍，是不切實(shí)際的。
文中適用的藥物上可接受的載體可包括多于一種成分，例如緩沖劑、粘度調(diào)節(jié)載體、表面活性劑、染料、滲透增強(qiáng)劑、蛋白酶抑制劑、粘液溶解劑或其它調(diào)和物成分和添加劑如本技術(shù)中已知的有助于靶細(xì)胞攝取藥劑的那些或能促使基因構(gòu)建物迅速?gòu)倪f送裝置中釋出的那類添加劑。載體可含有多于一種基因構(gòu)建物。
本發(fā)明包括遞送基因構(gòu)建物至胃腸道的定向區(qū)。胃腸道可被定向的可能區(qū)包括但不限于遠(yuǎn)側(cè)小腸、M細(xì)胞、派伊爾結(jié)和上結(jié)腸。這種定向會(huì)促使在遞送位點(diǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)胃腸上皮細(xì)胞或M細(xì)胞。為達(dá)到定向遞送，下述裝置可以口服。這些裝置將保持基因構(gòu)建調(diào)和物以致遞送入胃并防止遞入上面的腸，而且是在靶位點(diǎn)遞送丸劑。
圖1繪出本發(fā)明遞送基因構(gòu)建物的遞送裝置的一個(gè)實(shí)施方案剖面圖。該裝置在放入應(yīng)用環(huán)境之前呈封閉或預(yù)備形式。分配裝置1包括由第一個(gè)壁段14和第二個(gè)壁段16構(gòu)成的外殼12。第一個(gè)壁段14和第二個(gè)壁段16可相互逆向滑動(dòng)套裝。外殼12圍住并限定內(nèi)腔18。第一個(gè)壁段14圍住內(nèi)腔18中含基因構(gòu)建調(diào)和物20的部分，第二個(gè)壁段16圍住內(nèi)腔18中含膨脹劑22以膨脹和占據(jù)腔18中空間的部分。第二個(gè)壁段16還含活塞24，它位于藥劑調(diào)和物20和膨脹劑22之間?；钊?4可包括基本不能滲入流體通道的組合物，于是它將膨脹器中存在流體的通道限定在腔18的含基因構(gòu)建調(diào)和物的區(qū)域內(nèi)。它工作以大體維持基因構(gòu)建調(diào)和物和膨脹劑的完整性。此外，重要的是活塞24能保證膨脹劑22產(chǎn)生的膨脹驅(qū)動(dòng)力直接施加在第一個(gè)壁段14以分離兩個(gè)壁段。因此，活塞24必須有足夠的強(qiáng)度、厚度和剛度才能轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)力至第一個(gè)壁段14。
第一個(gè)壁段14和第二個(gè)壁段16在其開口端大小幾乎相等從而在此處二者形成摩擦配合。產(chǎn)生的摩擦在激活膨脹器之前足以將兩個(gè)壁段維持在一起，但一旦施加膨脹驅(qū)動(dòng)力時(shí)不能大到阻止兩個(gè)壁段滑離。如果需要另外的摩擦，則在第一個(gè)和第二個(gè)壁段接觸面的一邊或另一邊可引入凸起或采取其它措施。第一個(gè)壁段14和第二個(gè)壁段16可完全套成緊密的、連續(xù)的外圍狀態(tài)。第一個(gè)壁段14的開口端適于裝配在第二個(gè)壁段16中。
工作時(shí)，隨著膨脹劑22吸收和浸滲從應(yīng)用環(huán)境流經(jīng)第二個(gè)壁段16的流體，它就膨脹并推動(dòng)活塞24，使活塞在腔18內(nèi)滑動(dòng)。隨著膨脹劑22繼續(xù)膨脹，活塞24推動(dòng)第一個(gè)壁段14，引起第一個(gè)壁段滑離第二個(gè)壁段16。這樣使兩個(gè)壁段分離，致使基因構(gòu)建調(diào)和物20暴露于應(yīng)用環(huán)境中，如圖2的箭頭28所示。這類裝置被稱為Chron-set裝置(ALZA Corporation，Palo Alto，CA)且在例如US PatentNo.5,223,265中有進(jìn)一步描述，該文獻(xiàn)并入本文作參考。
圖2闡明了圖1的分配裝置1放入應(yīng)用環(huán)境中激活后的工作狀態(tài)。圖2示出裝置1開啟而大體上同時(shí)向環(huán)境釋放所有的基因構(gòu)建調(diào)和物20。膨脹劑22由于從環(huán)境吸收流體而引起容積膨脹，產(chǎn)生膨脹驅(qū)動(dòng)力使第一個(gè)壁段14與第二個(gè)壁段16分離。圖2中的箭頭28指示基因構(gòu)建調(diào)和物20從內(nèi)腔18通過第一個(gè)壁段14的開口端逸出，第一個(gè)壁段14現(xiàn)已與環(huán)境聯(lián)通。
第一個(gè)壁段14可包含半滲透性組合物，即流體能滲透但含于分配裝置1中的基因構(gòu)建物和其它成分不能滲透；或者它可包含對(duì)于流體、藥劑和其它成分之間的交換呈不滲透性的組合物。如果基因構(gòu)建調(diào)和物對(duì)來自應(yīng)用環(huán)境中存在的外部流體的流體敏感，則第一個(gè)壁段14優(yōu)選對(duì)于外界流體的進(jìn)入大體呈不滲透性，于是對(duì)基因構(gòu)建調(diào)和物20大致起保護(hù)作用直至它從外殼12排出而遞送入應(yīng)用環(huán)境。
由于膨脹劑22吸入外界流體后才工作，所以第二個(gè)壁段16中的至少一部分即與膨脹劑22鄰接的部分應(yīng)是半滲透性的；也就是說，它對(duì)流體的通過呈滲透性的，但對(duì)含于分配裝置1中其它成分的通過基本上是不滲透的。
壁段14和16任選包括其它成分例如增韌劑。適用于壁段14或16的不滲透性和半滲透性組合物，以及合適的添加劑，是本技術(shù)中已知的，它們的實(shí)例公開于U.S.Pat.4,874,388中，該文獻(xiàn)并入本文作參考。
包括壁段14和16的外殼12是無毒的、生物惰性的，對(duì)身體組織呈非過敏性和非刺激性，且它能維持其物理和化學(xué)完整性；也就是說，外殼12在分配期間于應(yīng)用環(huán)境中不會(huì)浸蝕或降解。下述情況在本發(fā)明的范圍內(nèi)，即外殼只是在所預(yù)計(jì)的應(yīng)用期間是不溶性的，但隨后能溶于應(yīng)用環(huán)境中。所以，設(shè)想這樣一種分配器，它在應(yīng)用場(chǎng)合不受其環(huán)境、溶解狀態(tài)的影響，或者它在預(yù)計(jì)的應(yīng)用期間只是微溶性的，這樣一旦其內(nèi)含物除去后，它就溶解或浸蝕掉，在應(yīng)用場(chǎng)合未留下不良?xì)堄辔锘蚩諝ぁ?br> 膨脹劑或可膨脹的驅(qū)動(dòng)元件22是無毒的、呈非過敏性和生物惰性，它可操作而分離第一個(gè)和第二個(gè)壁段而從本發(fā)明的分配裝置釋放基因構(gòu)建調(diào)和物20。在一個(gè)實(shí)施方案中，膨脹劑22包括滲透聚合物(osmopolymer)。滲透聚合物與水和含水生物流體作用后溶脹或膨脹至平衡態(tài)。滲透聚合物具有在流體中溶脹的能力，且在聚合物結(jié)構(gòu)中保持相當(dāng)一部分吸入的和吸收的流體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，膨脹劑22包括滲透劑(osmagent)。已知滲透劑還作為有滲透作用的溶質(zhì)和化合物。能用于本發(fā)明目的的滲透劑包括無機(jī)和有機(jī)化合物，它們具有透過半滲透性即流體滲透性壁的滲透壓梯度。在又一個(gè)實(shí)施方案中，膨脹劑22包括分散于滲透聚合物內(nèi)的滲透劑。膨脹劑22可包括一片或一層，或包括很多片或?qū)?，或者可壓成第二個(gè)壁段16。滲透劑或滲透聚合物壓成片層和壓成壁段16時(shí)可以是任何合適的形式如粒子、晶體、丸、小顆粒等等。滲透劑和滲透聚合物都是本技術(shù)中已知的并描述于例如U.S.Pat.Nos.3,865,108；4,002,173；4,207,893；4,327,725和4,612,008中。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中具有的、處于活性劑調(diào)和物與膨脹劑之間的活塞24，將膨脹劑產(chǎn)生的力傳向第一個(gè)壁段14且保持基因構(gòu)建調(diào)和物與膨脹劑各自的特性，并大體上限制基因構(gòu)建調(diào)和物與膨脹劑之間流體的流通。適用作活塞24的代表性原料是本技術(shù)中已知的，例如U.S.Pat.No.4,874,388中報(bào)導(dǎo)的。
圖3闡述了本發(fā)明的遞送基因構(gòu)建物用的分配裝置的另一個(gè)實(shí)施方案。如圖中所示，分配裝置30的外殼32具有開口34和栓36。外殼32包括含膨脹劑40的滲透性或半滲透性部分38和含基因構(gòu)建調(diào)和物20的不滲透性部分44。不滲透性活塞42將膨脹劑40同基因構(gòu)建調(diào)和物20隔離。如圖4所示，膨脹劑40將在流體環(huán)境中開始膨脹，圓柱形栓36就會(huì)與外殼32分離，于是基因構(gòu)建調(diào)和物20就被遞送至胃腸道中的靶位點(diǎn)。這類裝置被稱為PulsincapTM裝置(R.P.Scherer Co.，Swindon，England)且在EPO 0384642中有進(jìn)一步描述，該文獻(xiàn)并入本文作參考。
在分離分配裝置和遞送基因構(gòu)建調(diào)和物之前，總的延遲時(shí)間是在約1～24小時(shí)范圍內(nèi)，優(yōu)選在約2～15小時(shí)之間，而通常在4～8小時(shí)內(nèi)，并且可由一些方法來控制。例如，流體吸入膨脹劑的速率可通過具體選用半滲透性膜來控制。膨脹劑的膨脹速率可通過膨脹劑組成的選擇來控制。第一個(gè)和第二個(gè)壁段的開口端部分的重疊的長(zhǎng)度能決定這兩段分離所需的時(shí)間?？山Y(jié)合運(yùn)用這些方法。這類控制方法在本技術(shù)中是已知的，而且不需過多的實(shí)驗(yàn)就能確定。
雖然描述了遞送基因構(gòu)建物至胃腸道中特定部位的具體裝置，但也可以用本技術(shù)中已知的、能將丸劑遞送至胃腸道中靶位點(diǎn)的其它裝置。這種裝置的一個(gè)實(shí)例是PulsincapTM，它包括不滲透性膠囊和水凝膠栓。將該栓設(shè)計(jì)成在一定的時(shí)間后可溶脹而從裝置中脫出，于是在預(yù)定的延遲之后遞送丸中的內(nèi)含物。例如參見EuropeanPatent No.0384642，它被并入本文作參考。以特定延遲方式遞送丸劑的裝置的另一個(gè)實(shí)例是Time-Clock，描述于U.S.Patent No.5,310,558中，將它并入本文作參考。該裝置中，一個(gè)含活性劑的芯被涂上疏水層；在一定的時(shí)間后，該疏水層如期分解，于是釋放活性劑。已設(shè)計(jì)出釋放丸劑的其它裝置，例如，由射頻信號(hào)激活時(shí)(例如參見U.S.Patent No.3,894,538，并入本文作參考)和由超聲波加熱引起(例如參見U.S.Patent No.4,507,115，并入本文作參考)。本申請(qǐng)書中描述的丸劑可由上述施藥裝置和已知的其它任何裝置或今后研制的具有相同性能的裝置來遞送。
若要恰當(dāng)?shù)剡f送基因構(gòu)建物，則分配裝置必須將基因構(gòu)建調(diào)和物遞送至胃腸道的特定部位。因此，在遞送基因構(gòu)建物之前，需要該裝置通過胃腸道的一定部位至另一部位。在某些情況下，可以在分配裝置外殼的至少某部位敷上腸溶衣，該部位即由半滲透性膜構(gòu)成、與流體激活的膨脹物鄰接的部位。腸溶衣將在胃中保持完整，但一旦到達(dá)小腸就會(huì)迅速溶解，因而允許流體被吸入以激活分配裝置。腸溶衣在本技術(shù)中是熟知的，并且在例如下述文獻(xiàn)中被討論過Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA； 以及Polymers for Controlled Drug Delivery，Chapter 3，CRCPress，1991。
如前所述，基因構(gòu)建物可制備自病毒載體或非病毒載體。如果基因構(gòu)建物制備自病毒載體，則調(diào)和物通過生成含所需基因物質(zhì)的特異性構(gòu)建物制備。病毒基因組的復(fù)制區(qū)缺失而由治療基因替代，然后繁殖復(fù)制缺陷型病毒，當(dāng)細(xì)胞裂解后回收，純化再濃縮。
如果基因構(gòu)建物制備自非病毒載體，則調(diào)和物可以只包括治療基因，或該基因可被摻入例如脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì)復(fù)合體。
可以用標(biāo)準(zhǔn)的制備方法制備圖1和2中所示的裝置。第一節(jié)外殼14(貯器)和第二節(jié)外殼16(帽蓋)可分別塑模或擠出成所需形狀?？捎糜谥苽涞诙?jié)外殼16的半滲透性材料例如包括水軟制增強(qiáng)的(water flux enhanced)Hytrel聚酯彈性體(Du Pont)、纖維素酯、水軟制增強(qiáng)的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、由剛性聚合物與水溶性低分子量化合物摻混制備的半滲透性膜、和本技術(shù)中已知的其它半滲透性材料。可用于制備第一節(jié)外殼14的不滲透性材料例如包括聚乙烯、聚苯乙烯、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、Hytrel聚酯彈性體(DuPont)和其它本技術(shù)中已知的不滲透性材料。
該裝置可依如下方法組裝將基因構(gòu)建調(diào)和物20置于第一個(gè)壁段14中與初始為開口端相反的另一端。制備由活塞24和膨脹劑22構(gòu)成的“雙層滲透性栓”，其形狀應(yīng)使之能套入第二個(gè)壁段16。在旋轉(zhuǎn)式雙層壓片機(jī)上將活塞24和膨脹劑22壓成片。將此雙層滲透性栓置于第二個(gè)壁段16中，所得組件套上填裝好的第一節(jié)外殼端部，于是活塞24與基因構(gòu)建調(diào)和物20相鄰。
如果本發(fā)明的裝置形狀同圖3和4，也可用標(biāo)準(zhǔn)制備方法。外殼32可制成一端封閉的空心圓筒，該圓筒可以是上述的水滲透性材料，在含基因構(gòu)建調(diào)和物20的部分涂上不滲透性涂層。栓36可以是水可溶脹的材料。由膨脹劑40和活塞42制備如前述的滲透栓即可組裝該裝置。將栓放入空心圓筒的封閉端，膨脹劑40與圓筒的封閉端相鄰。然后將基因構(gòu)建調(diào)和物放入與活塞42相鄰的外殼32，再將栓36套入外殼32的開口端34。
給出如上描述僅為易于理解，應(yīng)懂得對(duì)此沒有多余的限制，因?yàn)楸绢I(lǐng)域中的技術(shù)人員很清楚可作更改。
下述實(shí)施例用作本發(fā)明的說明，不能被認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。依照本說明書、文中的附圖和權(quán)利要求，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員會(huì)明了這些實(shí)施例的變體和等效實(shí)例。
實(shí)施例1如下述制備本發(fā)明的遞送基因構(gòu)建調(diào)和物的遞送裝置裝置的滲透啟動(dòng)部分是壓制的雙層片，它包括150mg聚合的滲透調(diào)和物(膨脹劑)和50mg蠟基柔軟材料(活塞)。
聚合的滲透調(diào)和物組成為60wt％聚環(huán)氧乙烷(Polyox303，Union Carbide)，29wt％氯化鈉，5wt％聚丙烯酸(Carbomer934P，B.F.Goodrich)，5wt％羥丙基甲基纖維素E-5，和1wt％氧化鐵。制備時(shí)，上述各組份均通過40目篩過篩，篩分后的組分以合適的比例加入混合器。將干組分充分混合10分鐘；然后在繼續(xù)混合下緩慢加入SDA 3A乙醇直至形成濕物料。再將濕物料通過20目篩過篩，將濕粒子風(fēng)干18小時(shí)。干燥后，又一次使粒子通過20目篩。
蠟柔軟材料由95wt％微晶蠟(MF-2JH Durawax，Astor WaxCorp.)和5wt％明膠(Type A，275-300 bloom)構(gòu)成。制備時(shí)，先將各組分通過40目篩過篩，再以準(zhǔn)確的重量比加入混合器。充分混合干物料達(dá)10分鐘；然后在繼續(xù)攪拌下緩慢地向混合物中加入純化水。形成濕物料后，使混合物通過20目篩，在40℃下烘干粒子達(dá)24小時(shí)。待粒子干燥后，再通過20目篩過篩。
在液壓機(jī)或旋轉(zhuǎn)壓片機(jī)中將滲透調(diào)和物與蠟柔軟材料調(diào)和物壓制成圓筒形雙層片。該片的滲透面是凸面，以符合遞送裝置的形狀，而片的柔軟材料面是平的。進(jìn)行壓片而在雙層間得到勻稱、獨(dú)特的接觸面。
為制備裝置的貯器部分(第一個(gè)壁段)，將70wt％乙酸纖維素320和30wt％聚丙二醇充分混合，然后加入螺桿擠出機(jī)的料斗。當(dāng)聚合物混合物被擠出通過擠出機(jī)的加熱筒時(shí)在127℃下受熱，再進(jìn)入制貯器的模具。注入模具后讓聚合物混合料冷卻，隨后從打開的模具中取出貯器。
同貯器的制法制作裝置的帽蓋部分(第二個(gè)壁段)，帽蓋的組成為70wt％乙酸纖維素320和30wt％聚丙二醇。將熱聚合物混合料注入帽蓋模具后讓其冷卻，再放出完工的帽蓋。
為組裝遞送裝置，應(yīng)采用手工或自動(dòng)裝料機(jī)械將所需基因構(gòu)建調(diào)和物填入制成的貯器，再將滲透啟動(dòng)雙層片放入制作好的帽蓋，使凸面滲透層朝向帽蓋的封閉端，而柔軟材料層露向帽蓋開口端；然后將填好的貯器開口端套入帽蓋的開口端，擠緊這兩節(jié)直至帽蓋、滲透兩層片和貯器緊密地套在一起。
實(shí)施例2如實(shí)施例1那樣制作遞送裝置，然后將組裝好的裝置涂上約20mg甲基丙烯酸共聚物腸溶衣(EudragitL100-55，Rohm Phar-ma)。
實(shí)施例3本發(fā)明含腺病毒載體調(diào)和物的遞送裝置制備如下除去腺病毒基因組的E1區(qū)，并用描述于Crystal，PCT/US 92/07029中的αl-抗胰蛋白酶表達(dá)盒代替，該文獻(xiàn)并入本文作參考。此復(fù)制缺陷型病毒在人腎細(xì)胞系293中繁殖，提供反式E1產(chǎn)物。細(xì)胞裂解后回收病毒，用氯化銫梯度純化后濃縮。然后將該腺病毒基因構(gòu)建物摻入實(shí)施例1中所述的遞送裝置。
實(shí)施例4本發(fā)明含非病毒載體調(diào)和物的遞送裝置制備如下依Gregori-adis和Panagiotidi(Immunol.Lett.1989，20237-240)描述的脫水-再水化技術(shù)制備脂質(zhì)體。將二硬脂酰磷脂酰膽堿、氫化磷脂酰絲氨酸和膽固醇以1∶1∶2的摩爾比溶于氯仿/甲醇(9∶1 v/v)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用描述于并入本文作參考的Eaton et al.，Biochemistry 25，8343-8347中的基因構(gòu)建物凝血因子VIII表達(dá)質(zhì)粒的水溶液對(duì)干燥脂質(zhì)膜進(jìn)行再水化，在50-55℃下旋轉(zhuǎn)10分鐘。將此制劑凍干。用0.9％NaCl再水化該制劑的一部分。該脂質(zhì)體/構(gòu)建調(diào)和物，一種以凍干形式，另一種以再水化形式，分別被裝入實(shí)施例1中所述的遞送裝置。
實(shí)施例5類似于實(shí)施例3的4個(gè)遞送裝置(其中各含500mg腺病毒載體(AV)調(diào)和物)應(yīng)用USP攪拌法(以150rpm)測(cè)試病毒載體調(diào)和物的釋放。將這些裝置放入含0.1％牛白蛋白的500ml pH為7的溶液并攪拌。觀察這些裝置以確定帽蓋和藥物貯器相互分離的時(shí)間，并測(cè)試溶液是否存在AV以確定釋放時(shí)間和釋放期間?？捎迷诿舾械乃拗骷?xì)胞系中標(biāo)準(zhǔn)的蝕斑形成分析確定病毒的存在。每個(gè)裝置將在4～8小時(shí)后、在小于半小時(shí)的期間內(nèi)全部釋放其內(nèi)含物。
實(shí)施例6測(cè)試各含500mg腺病毒載體調(diào)和物、類似于實(shí)施例3中裝置的裝置以確定是否發(fā)生胃腸道上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在第0天口服涂有如實(shí)施例2中所述腸溶衣的裝置。當(dāng)基因構(gòu)建物用于激發(fā)免疫反應(yīng)時(shí)，在開始投藥2周后進(jìn)行加強(qiáng)接種。在加強(qiáng)接種后收集血液和唾液樣品，并運(yùn)用ELISA分析法測(cè)定血清IgG和唾液的IgA水平。血清中IgG和/或IgA的明顯增加表明，投藥基因構(gòu)建物后產(chǎn)生了有效轉(zhuǎn)染和免疫應(yīng)答。血清中已表達(dá)的肽或蛋白質(zhì)水平的顯著增加表示有效轉(zhuǎn)染和表達(dá)。
參照其一些優(yōu)選的實(shí)施方案已對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)描述，但應(yīng)懂得，可在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)作各種修改和變化。
權(quán)利要求
1.提供人基因治療的裝置，該裝置包括可被病人口服形式的基因構(gòu)建物，該裝置可供定向遞送丸劑形式的基因構(gòu)建物至胃腸道以在靶位點(diǎn)誘導(dǎo)局部生成治療蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的裝置，其中的治療蛋白質(zhì)誘導(dǎo)粘膜免疫性。
3.權(quán)利要求1的裝置，其中的治療蛋白質(zhì)誘導(dǎo)全身免疫性。
4.權(quán)利要求1的裝置，其中的治療蛋白質(zhì)在胃腸道中局部適用。
5.權(quán)利要求4的裝置，其中的治療蛋白質(zhì)適用于治療腸病。
6.權(quán)利要求1的裝置，其中的治療蛋白質(zhì)被分泌入體循環(huán)。
7.權(quán)利要求1的裝置，其中的基因構(gòu)建物是病毒載體。
8.權(quán)利要求7的裝置，其中的病毒載體選自逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒和單純皰疹病毒。
9.權(quán)利要求1的裝置，其中的基因構(gòu)建物是非病毒載體。
10.權(quán)利要求9的裝置，其中的非病毒載體選自摻入DNA骨架的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)、與DNA分子復(fù)合的陽離子脂質(zhì)、與DNA分子復(fù)合的中性脂質(zhì)、和使具有受體介導(dǎo)攝取DNA性能的蛋白質(zhì)。
11.用于遞送基因構(gòu)建調(diào)和物至胃腸道的流體吸入性分配裝置，它包括可分離的兩節(jié)，第一個(gè)可分離節(jié)限定含基因構(gòu)建調(diào)和物的水不透性貯器，其中以丸劑形式在胃腸道中的靶位點(diǎn)遞送基因構(gòu)建調(diào)和物。
12.權(quán)利要求11的裝置，第二個(gè)可分離節(jié)限定含水敏材料的水滲透性貯器，當(dāng)水敏材料浸濕時(shí)會(huì)對(duì)第一個(gè)可分離節(jié)施加正壓，導(dǎo)致第一個(gè)和第二個(gè)可分離節(jié)分離。
13.權(quán)利要求12的裝置，其中的水敏材料包括水溶脹材料。
14.權(quán)利要求11的裝置，其中的第一個(gè)可分離節(jié)至少具有一個(gè)開口，此開口被第二個(gè)可分離節(jié)封閉。
15.權(quán)利要求14的裝置，其中的第二個(gè)可分離節(jié)包括一個(gè)水溶脹栓。
全文摘要
本發(fā)明涉及遞送基因構(gòu)建物至胃腸道內(nèi)定向區(qū)的方法。以丸劑遞送基因構(gòu)建物會(huì)引起治療有效果的治療蛋白質(zhì)在靶位點(diǎn)的表達(dá)。本發(fā)明還涉及在靶位點(diǎn)遞送基因構(gòu)建物的裝置。
文檔編號(hào)A61K9/48GK1187118SQ96194471
公開日1998年7月8日 申請(qǐng)日期1996年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月7日
發(fā)明者P·E·達(dá)多納, G·G·狄查達(dá)里維安, J·A·菲克斯, P·I·加德納, H·B·羅森 申請(qǐng)人:阿爾薩公司