專利名稱：：抗肥胖蛋白的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于人類醫(yī)學領域，特別是涉及肥胖以及與肥胖相關的失調的治療。更具體地說，本發(fā)明涉及抗肥胖蛋白，當將其施用于病人時可調節(jié)脂肪組織。肥胖，特別是上身肥胖，在美國以至全世界都是一個常見而又十分嚴重的公共健康問題。根據近期的統(tǒng)計，美國百分之二十五的人口和加拿大百分之二十七的人口體重超重。Kuczmarski，Amer.J.ofClin.Nutr.55495S-502S(1992)；Reederet.al.，Can.Med.AssJ.，23226-233(1992)。已知上身肥胖是二型糖尿病的最主要危險因素，也是心血管疾病和癌癥的一個主要危險因素。近來估計全世界用于治療肥胖的醫(yī)藥費用達1500億美元。這個問題已變得如此嚴重以致使公共衛(wèi)生局醫(yī)務長官開始對美國社會日益增長的肥胖的蔓延趨勢展開斗爭。大多數(shù)肥胖誘發(fā)的病狀可以歸因于其與異常脂血癥、高血壓和胰島素抗性密切相關。許多研究業(yè)已表明通過節(jié)食和體育鍛煉減肥可顯著降低這些危險因素。不盡人意的是這些方法百分之九十五是不成功的。失敗的原因可能由于病癥與遺傳因素密切相關。這些遺傳因素可導致食欲增加、喜食高熱量食物、身體活動力減少和產脂代謝增加。這表明有這些遺傳特征的人不管他們多么努力與自身狀況做斗爭都容易發(fā)胖。因此，能夠糾正這種肥胖性障礙并使醫(yī)生成功治療肥胖病人而無須考慮病人的遺傳因素的藥物就成為人們的需要。數(shù)年來，生理學家們一直推測當哺乳動物飲食過量時會發(fā)出脂肪過量信號，告訴大腦身體正在發(fā)胖，繼而減少進食并消耗更多熱量。G.R.Hervey，Nature227629-631(1969)。這種“反饋”模型得到聯(lián)體實驗的支持，這個實驗表明循環(huán)系統(tǒng)中的激素控制著肥胖。ob/ob小鼠是肥胖和糖尿病的一種動物模型，已知其攜帶與第六染色體上突變相聯(lián)的特征。最近，YiyingZhang與其同事發(fā)表了與此病癥相聯(lián)的定位克隆。YiyingZhangetal.Nature372425-32(1994)。這份報告公開了一個編碼167個氨基酸的蛋白的基因，此蛋白有21個氨基酸的信號肽，在脂肪組織中專一表達。同樣，Murakami等人在BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications209(3)944-52(1995)中報道了大鼠肥胖基因的克隆與表達。目前推測這種顯然由ob基因編碼的蛋白是一種肥胖調節(jié)激素。Zhang等人沒有報告此蛋白的藥物活性。然而，我們發(fā)現(xiàn)Zhang等人所發(fā)現(xiàn)的蛋白由于其化學和物理上的不穩(wěn)定性而不是一個良好的藥物。例如，人類蛋白更傾向于沉淀。含有沉淀的天然蛋白的藥物制劑增加了在病人體內產生免疫應答的危險。因此，仍然需要開發(fā)具有改進的物理和化學穩(wěn)定性的藥物和用于幫助病人調節(jié)其食欲和代謝的藥物。更有意義的是，現(xiàn)已確定，對人肥胖蛋白的77，79到111，118和/或138的氨基酸殘基進行專一性替換，可形成具有更高穩(wěn)定性的優(yōu)良的治療藥物。因此，本發(fā)明提供具有生物活性的肥胖蛋白。本發(fā)明的蛋白更易于配制和儲存。而且，這種化合物具有更好的藥物特點，其治療成分易于進入體內發(fā)揮作用。因此，這種藥物使病人能克服其肥胖性障礙使其二型糖尿病，心血管疾病和癌癥的風險趨于正常而過上正常的生活。發(fā)明概述本發(fā)明涉及式(I)的蛋白或其藥用鹽(SEQIDNO1)ValProIleXaaLysValXaaAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleXaaAspIleSerHisXaaXaaSerValSerSer202530LysXaaLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle354045LeuThrLeuSerLysXaaAspXaaThrLeuAlaValTyrXaaXaaIle505560LeuThrSerXaaProSerArgXaaValIleXaaIleXaaXaaAspLeu65707580GluXaaLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys859095HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly100105110ValLeuGluAlaSerXaaTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuXaaGlySerLeuXaaAspXaaLeuTrpXaaLeuAspLeuSerPro130135140145GlyCys(I)其中位置4的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置7的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置22的Xaa是天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；位置27的Xaa是蘇氨酸或丙氨酸；位置28的Xaa是谷氨酰胺、谷氨酸或缺失；位置34的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置54的Xaa是甲硫氨酸、甲硫氨酸亞砜、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸；位置56的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置62的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置63的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置68的Xaa是甲硫氨酸、甲硫氨酸亞砜、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸；位置72的Xaa是天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；位置75的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置77的Xaa是絲氨酸或丙氨酸；位置78的Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸；位置82的Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸；位置118的Xaa是甘氨酸或亮氨酸；位置130的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置134的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置136的Xaa是甲硫氨酸、甲硫氨酸亞砜、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸；位置139的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；所述蛋白有至少一處發(fā)生替換，該替換選自位置97的組氨酸被谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸或纈氨酸替換；位置102的絲氨酸被精氨酸替換；位置103的甘氨酸被丙氨酸替換；位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替換；位置106的蘇氨酸被賴氨酸或絲氨酸替換；位置107的亮氨酸被脯氨酸替換；位置108的絲氨酸被谷氨酸替換；位置111的甘氨酸被天冬氨酸替換；位置138的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；本發(fā)明還提供一種治療肥胖的方法，包括給需要這種治療的哺乳動物施用式(I)的蛋白。本發(fā)明還提供一種藥物制劑，它包括式(I)的蛋白以及一種或多種藥用稀釋劑、載體或賦形劑。本發(fā)明的另一實施方案是制備式(I)蛋白的方法，其包括(a)用編碼式(I)蛋白的DNA轉化宿主細胞，所述蛋白含有適當?shù)那皩щ模?b)培養(yǎng)宿主細胞并分離步驟(a)中編碼的蛋白；并可任選地，(c)酶促切除前導序列從而產生式(I)蛋白。發(fā)明詳述為本文公開并要求保護的本發(fā)明的目的，下列術語和縮略語定義如下堿基對(bp)--指DNA或RNA。在DNA分子中縮寫A、C、G、T分別代表(脫氧)腺嘌呤、(脫氧)胞嘧啶、(脫氧)鳥嘌呤、(脫氧)胸腺嘧啶核苷酸的5’單磷酸鹽形式?？s寫U、C、G、T對應于RNA分子中的尿嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶核苷的5’單磷酸鹽形式。在雙鏈DNA中，堿基對指A與T或C與G的配對。在DNA/RNA雜交雙鏈中，堿基對可指T與U(T與A)和C與G的配對關系。DNA--脫氧核糖核酸。EDTA--乙二胺四乙酸的縮寫形式。免疫活性蛋白--泛指抗體、二抗體的抗原結合區(qū)以及申請?zhí)枮镻CT/US87/02208，InternationalPublicationNo.WO88/01649中的PCT中描述的單鏈多肽結合分子。mRNA--信使RNA。質粒--染色體外自我復制遺傳元件。PMSG--苯甲基磺酰氟閱讀框架--由tRNA反密碼子、核糖體和相關因子閱讀三聯(lián)體時所翻譯的核酸序列，其中每個三聯(lián)體對應一個特定的氨基酸。由于每個三聯(lián)體是唯一的并具有同等長度，編碼序列一定是3的倍數(shù)。一個堿基對的插入或缺失(稱框架移動突變)可導致同一DNA片段編碼兩種蛋白。為防止這類情況發(fā)生，所所需多肽的三聯(lián)體密碼必須與啟始密碼為起點的3的倍數(shù)相吻合。即必須保持正確的閱讀框架。重組DNA克隆載體--任何自主復制的因子，包括但不限于質粒和噬菌體，既可加入一個以上的DNA片段的DNA分子。重組DNA表達載體--任何已有啟動子插入的重組DNA載體。復制子--控制并容許質粒或其他載體自主復制的DNA序列。RNA--核糖核酸。RP-HPLC--反相高效液相層析的縮寫。轉錄--DNA核苷酸序列中的信息轉移到互補RNA序列中的過程。翻譯--用信使RNA的遺傳信息專一化并指導多肽鏈合成的過程。Tris--三羥甲基氨基甲烷的縮寫。治療--描述為抵抗疾病、病癥或失調而對病人進行安排和護理。包括施用本發(fā)明的化合物預防癥狀及并發(fā)癥的發(fā)生，減輕癥狀或并發(fā)癥，或消除疾病、病癥或失調。因此，治療肥胖包括對需治療的病人限制進食，限制增重并誘導減輕體重。載體--用于基因操作中轉化細胞的復制子。它載有相應于適當?shù)鞍追肿拥亩嗪塑账嵝蛄校斊渑c適當?shù)目刂菩蛄薪Y合時，能夠賦予將要轉化的細胞專一的特性。質粒、病毒和噬菌體都是合適的載體，因為他們都可自主復制。人工載體可通過使用限制性內切酶和連接酶切割和連接不同來源的DNA分子而構建起來。載體包括重組DNA克隆載體和重組DNA表達載體。X-gal--5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷的縮寫。氨基酸縮寫被美國專利與商標局接受，如37C.F.R.§1.822(b)(2)(1933)所示。本專業(yè)技術人員應知道某些氨基酸容易發(fā)生重排。例如天冬酰胺可能重排成天冬氨酸和異天冬氨酸，如I.Schonetal.，Int.J.PeptideProteinRes.14485-94(1979)描述的，在此引入作為參考。這些重排衍生物包括在本發(fā)明的范圍之內。除非另行說明，這些氨基酸具有L構型。如上所示，本發(fā)明提供式(I)蛋白。優(yōu)先的蛋白是式(II)蛋白或其藥用鹽(SEQIDNO2)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(II)其中位置22的天冬酰胺可任選地是谷氨酰胺或天冬氨酸；位置27的蘇氨酸可任選地是丙氨酸；位置28的谷氨酰胺可任選地是谷氨酸或缺失；位置54的甲硫氨酸可任選地是丙氨酸；位置68的甲硫氨酸可任選地是亮氨酸；位置72的天冬酰胺可任選地是谷氨酸或天冬氨酸；位置77的絲氨酸可任選地是丙氨酸；位置118的甘氨酸可任選地是亮氨酸；所述蛋白有至少一處發(fā)生替換，該替換選自位置97的組氨酸被谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、或纈氨酸替換；位置102的絲氨酸被精氨酸替換；位置103的甘氨酸被丙氨酸替換；位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替換；位置106的蘇氨酸被賴氨酸或絲氨酸替換；位置107的亮氨酸被脯氨酸替換；位置108的天冬氨酸被谷氨酸替換；位置111的甘氨酸被天冬氨酸替換；位置138的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換。優(yōu)選的蛋白是這樣的式(II)蛋白，其中位置100的色氨酸是谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或亮氨酸；或位置138的位色氨酸是谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或亮氨酸。式(III)的其它優(yōu)選蛋白或其藥用鹽(SEQIDNO3)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSetAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerpro145GlyCys(III)其中位置97的組氨酸被谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸或纈氨酸替換；位置102的絲氨酸被精氨酸替換；位置103的甘氨酸被丙氨酸替換；位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替換；位置106的蘇氨酸被賴氨酸或絲氨酸替換；位置107的亮氨酸被脯氨酸替換；位置108的天冬氨酸被谷氨酸替換；位置111的甘氨酸被天冬氨酸替換；位置138的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；最優(yōu)選的蛋白是這樣一些式(III)蛋白，其中位置97的組氨酸被谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸或纈氨酸替換；位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替換；位置106的蘇氨酸被賴氨酸或絲氨酸替換；位置107的亮氨酸被脯氨酸替換；位置108的天冬氨酸被谷氨酸替換；位置111的甘氨酸被天冬氨酸替換；或位置138的色氨酸是丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸；進一步優(yōu)選的式(III)蛋白是這樣一些蛋白，其中位置97的組氨酸被絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、異亮氨酸或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被蘇氨酸替換；位置138的色氨酸是丙氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸。另外優(yōu)選的式(III)蛋白是這樣一些蛋白，其中位置97的組氨酸被絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被蘇氨酸替換；或位置138的色氨酸是甘氨酸。本發(fā)明其他優(yōu)選的蛋白包括SEQIDNO3的蛋白，其中位置97、100、101、105、106、107、108、111位的氨基酸殘基按下面表1替換表1氨基酸位置蛋白9710010110510610710811l</tables></tables></tables></tables></tables></tables></tables></tables>最優(yōu)選的式(III)和表1的序列種類包括SEQIDNO4-11的序列種類(SEQIDNO4)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProAlaAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO5)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProGlnAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO6)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuGlnGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO7)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAshAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProGlnAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuGlnGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO8)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisAlaGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProAlaAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO9)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAshAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProAlaAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuGlnGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO10)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110SerLeuProGlnThrSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuGlnGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO11)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110SerLeuProGlnAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuGlnGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys本發(fā)明提供可有效治療肥胖的生物活性蛋白。出人意料的是，由于對人肥胖蛋白作了特異性替換，使申請保護的蛋白的性質得以改進。它們比小鼠和人的肥胖蛋白更穩(wěn)定，因此是優(yōu)良的治療藥物。該申請保護的蛋白一般地由重組技術制備。有關已知序列的DNA定點置換突變技術是眾所周知的，例如M13引物誘變。編碼本文的抗肥胖蛋白的DNA中可能發(fā)生的突變必須不能將序列置于閱讀框架之外，并且優(yōu)選不產生可形成mRNA二級結構的互補區(qū)。見DeBoeretalEP75，444A(1983)。本發(fā)明的化合物可通過重組DNA技術或眾所周知的化學法制備，如溶液或固相肽合成法，或在溶液中進行以蛋白片段起始的半合成法，所述蛋白片段是通過常規(guī)的溶液法偶聯(lián)的。A固相本發(fā)明的蛋白可通過固相肽合成法或重組法制備。多肽固相肽合成法是本領域中熟知的方法。其一般方法可在Dugas，H.andPenney，C.，BioorganicChemistrySpringer-Vetlag，NewYork，pgs.54-92(1981)中找到。例如可用PE-AppliedBiosystems443A肽合成儀固相合成這些肽(購自AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCityCalifornia)并可使用他們提供的循環(huán)合成儀合成。Boc氨基酸和其它試劑也可以從那里以及其他化學試劑商店買到。應用雙偶聯(lián)技術化學合成Boc序列使對甲基二苯甲基胺樹脂初始化以生產C末端甲酰胺。制備C末端氨基酸要用到PAM樹脂。精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸和甲硫氨酸用事先制備好的羥基苯并三唑酯進行偶聯(lián)?？捎孟铝袀孺湵Ｗo。精氨酸，甲苯磺?；於彼?，環(huán)己基或芐基半胱氨酸，4-甲基芐基谷氨酸，環(huán)己基組氨酸，芐氧甲基賴氨酸，2-氯芐氧羰基甲硫氨酸，亞砜絲氨酸，芐基蘇氨酸，芐基色氨酸，甲?；野彼?，4-溴芐酯基可用二氯甲烷中的三氟醋酸(TFA)使Boc脫保護。在4℃下用在二甲基甲酰胺中濃度為20％的哌啶處理肽基樹脂60分鐘，除去色氨酸的甲酰基。甲硫氨酸可用TFA/二甲亞砜/conHCl處理樹脂25℃下60分鐘進行還原(95/5/1)。用含有10％間甲苯酚或間甲苯酚/10％對硫代甲苯酚或間甲苯酚/對硫代甲苯酚/二甲硫醚的混合物的無水氟化氫將肽脫保護并裂解下來。從樹脂上裂解側鏈保護基和肽要在攝氏零度或以下進行，優(yōu)選在-20℃下進行30分鐘，然后在0℃下30分鐘。除去FH后，肽/樹脂用乙醚洗脫，用冰醋酸抽提肽并凍干。純化由C18反相層析柱(Vydac)完成，TFA＝0.1％，乙腈濃度梯度遞增。專業(yè)人員知道固相合成也可用FMOC方法和TFA/清除劑裂解混合物來完成。B重組子合成法本發(fā)明蛋白也可用重組子法制備。若所需得到高產率，推薦使用重組子法。重組子法生產蛋白的基本步驟包括a)構建編碼本發(fā)明蛋白的合成的或半合成的(或從天然來源分離到的)DNA；b)將編碼序列以適合此蛋白單獨表達或以融合蛋白表達的方式整合進表達載體；c)用表達載體轉化適當?shù)恼婧嘶蛟怂拗骷毎?；d)回收和純化重組產生的蛋白。a.基因的構建合成的基因，其體外或體內轉錄和翻譯將產生蛋白，可以用本領域熟知的技術合成。由于遺傳密碼的簡并性，專業(yè)人員知道有相當數(shù)目的DNA序列可合成本發(fā)明的蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選實踐中，合成是用重組DNA技術完成的?；驑嫿w的合成方法是眾所周知的。例如Brown，etal.，(1979)酶學方法，AcademicPress，N.Y.，Vol.68，pgs.109-151中給出的方法。本發(fā)明的蛋白的DNA序列可用常規(guī)DNA合成儀產生，例如AppliedBiosystems380A型或380B型DNA合成儀(購自AppliedBiosystems，Inc.，850LincolnCenterDrive，F(xiàn)osterCity，CA94404)優(yōu)選對編碼本發(fā)明蛋白的編碼序列進行一些修飾，以便將常用的蛋白酶敏感切割部位摻入到序列中信號肽與結構蛋白之間的部位，以便于控制將信號肽從融合蛋白構建體中切除。編碼本發(fā)明蛋白的基因也可由聚合酶鏈式反應(PCR)完成。模板可用從人脂肪組織提取的mRNA或cDNA文庫(購自CLONETECH或STRATAGENE)。這種方法是本領域所熟知的。見Maniatis，etal.，分子克隆實驗指南，冷泉港出版社，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)b.直接表達或融合蛋白本發(fā)明蛋白可直接表達，也可作為包含本發(fā)明蛋白的融合蛋白進行表達，然后用酶促或化學法切割。有各種肽酶(如胰酶)將多肽在特定部位切開或在已知肽鏈的氨基端或羧基端(如二氨基肽酶)消化這些肽。而且，一些特殊化學物質(如溴化氰)可在特定部位切割肽。技術人員常愿意對氨基酸序列做必要的修飾(若是用重組子的話也對合成或半合成編碼序列進行修飾)以便摻入位點特異性的內切位點。見例如CarterP.，融合蛋白的定點水解，《蛋白純化從分子機制到大規(guī)模方法》第13章，美國化學協(xié)會，Washington，D.C.(1990)。c.載體構建利用標準的連接技術構建含所需的編碼序列和調控序列的適當載體。分離的質?；駾NA片段被切開、加尾并連接成所需的形式以構成需要的質粒。用適當?shù)腄NA限制性內切酶將基因工程合成的DNA序列插入到眾多的相應DNA重組表達載體中使所需的蛋白有效表達。合成的編碼序列配制成在轉錄子的兩端有限制性內切酶識別位點以便于從表達和擴增的質粒中分離和結合到這些質粒中。分離到的cDNA編碼序列易于用合成接頭修飾以便用眾所周知的技術將此序列連到需要的克隆載體中。所用的特定內切酶可用親本表達載體的限制性內切酶裂解圖譜指示出來。對限制位點做出選擇以便編碼序列的取向適合于調控序列從而達到本發(fā)明蛋白的框內閱讀和表達。一般說來，質粒含有與其宿主細胞相一致的啟動子和調控序列并應用于此類宿主細胞。這種載體通常載有復制位點和可供表型篩選轉化細胞的標記序列。例如大腸桿菌常用pBR322轉化，后者從大腸桿菌中得到(Bolivaretal.，Gene295(1977))。質粒pBR322含有青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，為鑒別轉化細胞提供了方便。pBR322質?；蚱渌⑸镔|粒必須含有或加上通常重組技術所使用的啟動子和其他調控序列。所需要的編碼序列以啟動子和核糖體結合部位為起點相一致的方向插入到表達載體中而啟動子和核糖體應在表達所需蛋白的宿主細胞中具有功能。這種表達載體的一個例子是Belagajeetal.，美國專利5,304,493號中描述的質粒，在此引入作為參考。美國專利5304493號中描述的A-C-B胰島素原的基因用限制酶NdelI和BamHI從質粒pBR182中除去。本發(fā)明的蛋白基因可插入到這個質粒的NdeI/BamHI限制酶切點。d.在原核細胞中表達一般說來，原核細胞用于克隆DNA序列，構建對本發(fā)明有用的載體。例如大腸桿菌K12菌株294(ATCCNo31446)就特別有用。其他可用的微生物菌株有大腸桿菌B和大腸桿菌X1776(ATCCNo31537)。這些例子用作解釋而不是做限制。原核細胞也用于表達?？衫玫木瓿鲜鼍晖膺€有大腸桿菌W3110(原養(yǎng)菌，ATCCNo.27325)，芽胞桿菌，如枯草芽胞桿菌，其它腸道菌屬如鼠傷寒沙門氏菌，粘質沙雷氏菌和各種假單胞菌。適合于原核宿主細胞的啟動子包括β-內酰胺酶(載體Pgx2907[ATCC39344]含有復制子和β-內酰胺酶基因)和乳糖啟動子系統(tǒng)(Changetal.，Nature，275615(1978)；andGoeddeletal.，Nature281544(1979))，堿性磷酸脂酶，色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(載體pATH1[ATCC37695]配制用于在色氨酸啟動子控制下表達trpE融合蛋白開放閱讀框架)和雜合啟動子如TAC啟動子(從質粒pDR540ATCC-37282分)。然而，其它已知序列的有功能的細菌啟動子可被專業(yè)人員用DNA接頭或連接子將本發(fā)明蛋白基因連接到任何限制酶切點處。細菌系統(tǒng)中的SD序列也可用人工方法連接到編碼這種蛋白的DNA上。e.在真核細胞中表達這種蛋白可用重組法在真核表達系統(tǒng)中生產。優(yōu)先選用的哺乳動物宿主細胞中控制轉錄的啟動子可有各種來源，例如病毒基因組如多瘤病毒，猴病毒(SV40)，腺病毒、逆轉錄病毒、乙肝病毒、優(yōu)選用的是巨細胞病毒，或用異源哺乳動物啟動子，如β-肌動蛋白啟動子。SV40早期或后期啟動子也可通過限制酶解方便地獲得，其中含有SV40病毒的復制起點。Fiers，etal.，Nature，273113(1978)整個SV40基因組可從質粒pBRSV，ATCC45019得到?？拷缙诘娜司藜毎《締幼訌馁|粒pCMBβATCC77177)得到。當然，從這種宿主細胞或相關細胞得到的啟動子也可用于此目的。在載體中插入增強子序列可增加編碼本發(fā)明蛋白的DNA在高等真核生物的轉錄。增強子是DNA順式效應因子，通常在10-300bp之間。它作用于啟動子使其轉錄增加。增強子的取向和位置都是獨立的。在轉錄單位的5’端(Laimins，L.etal.，PNAS78993(1981))和3’端(Lusky，M.L.，atal.，Mol.CellBiol.31108(1983))，在內含子中(Banerji，J.L.etal.，Cell33729(1983))以及在編碼序列中(Osborne，T.F.，etal，Mol.CellBio.41293(1984))都發(fā)現(xiàn)過增強子?，F(xiàn)已知許多增強子序列來自哺乳動物基因(球蛋白，RSV，SV40，EMC，彈性蛋白酶，白蛋白，a-甲胎蛋白和胰島素)。然而，典型應用還是用真核細胞病毒的增強子。例如SV40后期增強子，巨細胞病毒早期增強子，后期復制起點的多瘤病毒增強子和腺病毒增強子。用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或其它多細胞組織的有核細胞)的表達載體也包含轉錄終止所必須的序列，它可能影響mRNA的表達。這些區(qū)段被轉錄成編碼蛋白的mRNA中非翻譯區(qū)的多聚腺苷酸片段。此3’非翻譯區(qū)還包括轉錄終止部位。表達載體可含有篩選基因，亦稱篩選標記。適合做哺乳動物篩選標記的例子有二氫葉酸還原酶(DHFR，可從pJOD-10[ATCC68815]，BglII/HindIII限制性內切片段中獲得)，腺苷激酶(單純皰疹病毒腺苷激酶，位于vP-5克隆[ATCC2028]的BamHI片段中)或新霉素(G418)抗性基因(從pNN414酵母人工染色體載體[ATCC37682]得到)。這類篩選標記成功轉化進入哺乳動物宿主細胞后，被轉化宿主細胞就能在選擇壓力下生存。廣泛采用的有兩套截然不同的篩選體系。一套基于細胞代謝原理并用突變細胞株，這種突變株在沒有補充營養(yǎng)的培養(yǎng)基中不能生長。有兩個例子即CHODHFR缺陷型細胞(ATCCCRL-9096)和小鼠LTK缺陷型細胞(L-M(TK-)ATCCCCL-2。3)。這些細胞在沒有添加營養(yǎng)成分胸腺嘧啶核苷和次黃嘌呤核苷時不能生長。由于這種細胞缺乏完整核苷代謝途徑中的某些基因，它們只能在有這些核苷的補充培養(yǎng)基中存活。另一種代替這種培養(yǎng)基的方法是將完整的DHFR或TK基因引入缺乏相應基因的細胞，由此改變它們的生長需要。沒有受到轉化的細胞則不能在非補充培養(yǎng)基中生長。第二套篩選體系是顯性性狀篩選體系，可用于任何細胞并且不要求使用突變細株。這些細胞有一種特殊的基因，可表達執(zhí)行藥物抗性的蛋白，從而可在篩選中存活。這種顯性性狀篩選的例子有新霉素，SouthernP.andBerg，P.，J.Molec.Appl.Genet.1327(1982)，霉酚酸，Mulligan，R.C.andBerg，P.Science2091422(1980)，或潮霉素，Sugden，B.etal.，MolCell.Biol5410-413(1985)。上述化合物是細菌基因在真核調控下執(zhí)行對相應藥物即G418，新霉素(遺傳霉素)，xgpt(霉酚酸)，或潮霉素的抗性的三個示例。真核表達的優(yōu)選載體是pRc/CMV。pRc/CMV的購自InvitrogenCoroiration，3985SorrentoValleyBlvd.，SanDiego，CA92121。為了肯定構建的質粒中的序列是正確的，將連接混合物轉化大腸桿菌K12菌株DH5a(ATCC31446)并用適當?shù)目咕乜剐院Y選轉化子。制備轉化子質粒并用限制酶法和/或Messing等人的方法進行分析(NucleicAcidsRes.9309(1981)。宿主細胞用本發(fā)明中的表達載體轉化并在適合于誘導啟動子，篩選轉化子或擴增基因的常用營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如溫度，PH等與培養(yǎng)宿主細胞的條件相同并對技術人員來說都是常見的。用上述載體轉化細胞的技術是眾所周知的并且可在一般參考書和一些補充刊物中找到如Maniatis，etal.，分子克隆實驗指南，冷泉港出版社，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)，當代分子生物學方案(1989)。優(yōu)選的適合在真核細胞中表達的本發(fā)明蛋白載體的宿主細胞包括SV40轉化的非洲綠猴腎細胞系(COS-7，ATCCCRL1651)；轉化的人原胚腎細胞系293，(Graham，F(xiàn).L.etal.，J.GenVirol.3659-72(1977)，Virology77319-329，Virology8610-21)；幼齡倉鼠腎細胞(BHK-21(C-13)，ATCCCCL-10，Virology16147(1962))；中國倉鼠卵巢細胞CHO-DHFR-(ATCCCRL-9096)，小鼠Sertoli細胞(TM4，ATCCCRL-1715，BiolReprod23243-250(1980))；非洲綠猴腎細胞(VERO76，ATCCCRL-1587)；人子宮頸上皮癌細胞(Hela，ATCC-2)；狗腎細胞(MDCK，ATCCCCL-34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL3A，ATCCCRL-1442)；人二倍體肺細胞(WI-38，ATCCCCL-75；人肝細胞癌細胞(HepG2，ATCCHB-8065)；小鼠乳腺瘤細胞(MMT060562，ATCCCCL51)。f.在酵母中表達除原核細胞外也可用真核微生物如酵母培養(yǎng)。啤酒酵母是最常用的真核微生物，雖然許多其它菌株也是常用的。在啤酒酵母中表達常用質粒YRp7，(ATCC-40053，Stinchcomb，etal.，Nature28239(1979)；Kingsmanetal.，Gene7141(1979)；Tschemperetal.，Gene10157(1980))此質粒含有色氨酸基因，后者可為不能在色氨酸中生長的酵母突變株例如ATCCno.44076或PEP4-1提供篩選標記(Jones，Genetics8512(1977))。適合用作酵母宿主細胞的啟動序列有下列各種酶的啟動子3-磷酸甘油酸激酶(在質粒pAP12BDATCC53231中發(fā)現(xiàn)，在1990年6月19日美國專利4,935,350號中有描述)或其它糖酵解途徑的酶，如烯醇化酶(在質粒pAC1ATCC39532中發(fā)現(xiàn))，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(從質粒PHcGAPC1ATCC57090，57091衍生而來)，運動發(fā)酵單胞菌(1991年3月19日公開的美國專利5,000,000號)，已糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸異構酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸異構酶，磷酸葡萄糖異構酶，葡萄糖激酶。其他酵母啟動子是下列酶的啟動子區(qū)域乙醇脫氫酶2，異細胞色素C，酸性磷酸酶，與氮代謝有關的降解酶，金屬硫蛋白(得自質粒載體pCL28XhoLHBPVATCC39475，美國專利4,840,896號)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及與麥芽糖和乳糖利用有關的酶(GAL1在質粒pRY121ATCC37658中發(fā)現(xiàn))，所述啟動子是具有由生長條件控制的轉錄這一優(yōu)點的可誘導啟動子。適合在酵母中表達的載體和啟動子在R.Hitzemanetal.，EuropeanPatentPublicationNo.73,657A中有進一步描述。酵母增強子如啤酒酵母的UASGal(與質粒YEpsec-hIlbetaATCC67024中的CYC啟動子相結合)也特別適合與酵母啟動子一起使用。下面以實施例進一步闡明本發(fā)明的蛋白的制備。本發(fā)明范圍不被下述實施例所限制。實施例1載體的構建SEQIDNO12基因由一220bp的片段和一240bp片段裝配而成。這兩個片段由寡核苷酸化學合成得到。(SEQIDNO12)1CATATGAGGGTACCTATCCAAAAAGTACAAGATGACACCAAAACACTGAT51AAAGACAATAGTCACAAGGATAAATGATATCTCACACACACAGTCAGTCT101CATCTAAACAGAAAGTCACAGGCTTGGACTTCATACCTGGGCTGCACCCC151ATACTGACATTGTCTAAAATGGACCAGACACTGGCAGTCTATCAACAGAT201CTTAACAAGTATGCCTTCTAGAAACGTGATACAAATATCTAACGACCTGG251AGAACCTGCGGGATCTGCTGCACGTGCTGGCCTTCTCTAAAAGTTGCCAC301TTGCCATGGGCCAGTGGCCTGGAGACATTGGACAGTCTGGGGGGAGTCCT351GGAAGCCTCAGGCTATTCTACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGG401GGTCTCTGCAAGACATGCTGTGGCAGCTGGACCTGAGCCCCGGGTGCTAA451TAGGATCC220堿基對的片段從NdeI到220的XbaI是由7個相互交疊的長度在34～83個堿基之間的寡聚合苷酸組成。240堿基對的片段從XbaI到BamHI也是由7個長度為57～92個堿基的寡聚合苷酸交疊而成。為裝配這些片段，7個寡聚合苷酸等克分子量混合，通常濃度為每微米1～2個pmol濃度。組合前，幾乎所有的寡聚合苷酸片段的5’端都在標準激酶緩沖液的條件下由T4DNA激酶磷酸化，使用的條件由試劑供貨商給定?；旌衔锛訜岬?5度然后慢慢冷卻到室溫持續(xù)1～2小時以保證寡核苷酸退火。然后用T4DNA連接酶將寡核苷酸相互連接并克隆到適當載體如pUC18和pUC19中。緩沖液和連接條件由酶的供貨商提供。用于連接220堿基對片段的載體事先用NdeI和XbaI酶解，而用于240堿基對片段的載體用XbaI和BanmHI酶解。用連接混合物轉化大腸桿菌DH10B細胞(購自Gibco/BRL)并接種到含100g/ml氨芐青霉素，X-gal和IPTG的蛋白胨-酵母膏(TY)平板中?？寺【渑囵B(yǎng)過夜后再培養(yǎng)在100μg/ml氨芐青霉素的TY液體培養(yǎng)基中用于分離質粒和DNA測序。載有目的序列的質粒包括了組合起來即為完整的基因。組合過程是純化220堿基對片段和240堿基對片段并連接這兩個片段到表達載體中如pRB182其中的A-B-C胰島素原的編碼序列已被除去并在使用前用NdeI和BamHI酶解開。實施例2含有編碼所需蛋白DNA序列的質粒用PmlI和Bsu36I酶解。這些酶的識別序列分別在編碼區(qū)內第275和360核苷酸處?？寺〉妮d體不含這些識別序列。結果只有兩個片段出現(xiàn)在PmlI和Bsu36I酶解物中，一個是載體片段，另一個相當于此蛋白編碼序列中的～85堿基對片段。這段序列可由編碼表1中任何氨基酸替換序列的DNA序列來替換。將這些DNA序列用化學合成法合成為兩個有互補堿基對的寡核苷酸序列并帶有PmlI和Bsu36I的酶解末端?；瘜W合成的寡核苷酸按等分子量混合(1-10pmol/ml)，加熱到95度后緩慢降溫到20-25度使之退火。對退火的寡核苷酸進行標準連接。用連接產物轉化并分析如表1所示。實施例3使用實施例2給出的質粒和方法得到表1中第255號蛋白，它具有甲硫氨酸精氨酸前導序列。此質粒用PmlI和Bsu36I酶解。再將合成DNA片段5’序列SEQIDNO13與5’序列SEQIDNO14退火。連接之后，轉化并分離質粒，通過DNA序列分析鑒定合成的序列。(SEQIDNO13)GTGCTGGCCTTCTCTAAAAGTTGCAGCTTGCCACAGACCAGTGGCCTGCAGAAACCGGAAAGTCTGGACGGAGTCCTGGAAGCC(SEQIDNO14)TGAGGCTTCCAGGACTCCGTCCAGACTTTCCGGTTTCTGCAGGCCACTGGTCTGTGGCAAGCTGCAACTTTTAGAGAAGGCCAGCAC實施例4用實施例2給出的質粒和方法得到具有甲硫氨酸精氨酸前導序列的DNA編碼序列SEQIDNO4。此質粒用PmlI和Bsu36I酶解。合成的DNA片段5’序列SEQIDNO15與5’序列SEQIDNO16退火，然后插入到PmlI和Bsu36I之間。連接后轉化并進行質粒分離。通過DNA序列分析鑒定合成的片段序列。(SEQIDNO15)GTGCTGGCCTTCTCTAAAAGTTGCCACTTGCCAGCTGCCAGTGGCCTGGAGACATTGGACAGTCTGGGGGGAGTCCTGGAAGCC(SEQIDNO16)TGAGGCTTCCAGGACTCCCCCCAGACTGTCCAATGTCTCCAGGCCACTGGCAGCTGGCAAGTGGCAACTTTTAGAGAAGGCCAGCAC前述載體轉化細胞的技術是本領域熟知的并可在一般參考書和一些補充刊物中找到如Maniatis，etal.，分子克隆實驗指南，冷泉港出版社，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)，當代分子生物學方法(1989)。本發(fā)明實施例中推薦的轉化E.coli細胞的技術也是本領域所熟知的，培養(yǎng)轉化的E.coli細胞的確切條件取決于E.coli宿主細胞株的自然性質和所用載體的克隆和表達情況。例如，結合有熱誘導啟動子-操縱子區(qū)的載體，如c1857熱誘導λ噬菌體啟動子-操縱子區(qū)，需要在培養(yǎng)時將溫度從30度升高到40度。以便誘導蛋白合成。本發(fā)明推薦使用的宿主細胞是大腸桿菌K12RV308細胞，但也可使用其他細胞如大腸桿菌K12L201，L687，L693，L507，L640，L641，L695，L814(大腸桿菌B)并不限于這些細胞。然后將轉化的宿主細胞平鋪在與表達質粒中抗性基因相對應的抗菌素選擇壓力培養(yǎng)基上。在與宿主細胞系相適應的溫度下培養(yǎng)一段時間。在高水平的細菌表達系統(tǒng)中表達的蛋白聚積成顆?；蛟诎w中積累，后者含有高水平表達過量的蛋白。Kreugeretal.，蛋白折疊，GieraschandKing編，pgs136-142(1990)，AmericanAssociationfortheAdvancementofSciencePublicationNo.89_18S，Washington，D.C.這種蛋白聚集必須溶解開以便進一步純化和分離所所需的蛋白產品。溶解蛋白可采用各種技術，包括強變性溶液如鹽酸胍和/或弱變性溶液如尿素。然后逐步除去溶液中的變性試劑(常用透析法)使蛋白恢復其天然形式。變性和折疊的條件由特定的蛋白表達系統(tǒng)和/或蛋白本身決定。實施例5實施例3中具有甲硫氨酸精氨酸前導序列的蛋白在E.coli中表達、分離并以折疊形式溶解于PBS或8M尿素中(兩種溶液都含5mM半胱氨酸)并在PBS中徹底透析。在這兩種情況下幾乎沒有蛋白聚集現(xiàn)象。蛋白最后純化用排阻層析法，蛋白被濃縮成3-3.5mg/mlPBS。此蛋白沒有聚集現(xiàn)象發(fā)生而天然人類蛋白在濃縮時可見到大量聚集現(xiàn)象。反相HPLC蛋白分析表明人Ob蛋白用56.6％的乙腈洗脫下來，小鼠的蛋白在55.8％時洗脫下來，而本發(fā)明的帶有甲硫氨酸精氨酸前導肽蛋白在53.7％時洗脫下來。因此，有小鼠蛋白插入的人蛋白表現(xiàn)出比人和小鼠的蛋白有更高的親水性。實施例6有甲硫氨酸精氨酸前導肽的SEQIDNO4蛋白在大腸桿菌中表達。分離蛋白顆粒并溶于有5mM半胱氨酸的8M尿素中。用陰離子交換層析純化蛋白并以折疊形式溶于8M尿素中(含5mM半胱氨酸)，再用PBS徹底透析。蛋白溶液pH降到2.8。每毫克蛋白加入6-10毫單位的dDAP是使甲硫氨酸精氨酸前導序列裂解下來。此轉換反應在室溫進行2-8小時。反應過程在高效反相層析法監(jiān)控下進行。用氫氧化鈉調pH到8終止反應。脫甲硫氨酸精氨酸蛋白進一步由7-8M尿素陽離子交換層析純化經排層析后溶于PBS。最后用排阻層析法純化蛋白，溶于3-3.5mg/mlPBS中。實際上沒有發(fā)現(xiàn)有蛋白聚集。本發(fā)明蛋白的表達優(yōu)選有前導序列。裝配前導序列是一項常規(guī)技術。然而，推薦使用的前導序列是甲硫氨酸-R1，此處R1是除脯氨酸外的任何一中氨基酸。這樣所表達的蛋白易于被組織蛋白酶C轉換成本發(fā)明的蛋白。R1優(yōu)選精氨酸、天冬氨酸或酪氨酸；最優(yōu)選有甲硫氨酸-精氨酸前導序列的蛋白的表達。有趣的是，前導序列并不明顯影響蛋白的穩(wěn)定性和活性。然而，在應用此蛋白前，優(yōu)選將前導序列從此蛋白中除去。因此，具有式甲硫氨酸-R1-SEQIDNO1的蛋白是很有用的生物藥，特別適合作為藥物中間體。純化此蛋白的技術是眾所周知的。其中包括反相層析，親和層析，離子交換和體積排阻層析。本發(fā)明蛋白含有兩個半胱氨酸殘基。因此，可形成二硫鍵穩(wěn)定蛋白。本發(fā)明包括式(I)或(II)，其中96位的半胱氨酸與146位半胱氨酸交聯(lián)還有一些沒有此二硫鍵的蛋白。除本發(fā)明的蛋白外，還有二聚體、三聚體、四聚體、多聚體。這些多聚體亦在本發(fā)明范圍內。本發(fā)明提供治療肥胖的方法。這種方法包括給生物體每公斤體重施用1到1000微克的抗肥胖蛋白藥物。推薦的用藥劑量是每公斤體重10-100微克活性化合物。典型成人日用劑量是0.5-100毫克。在實際用藥時式(I)的蛋白藥物可日服一次或數(shù)次。治療方案可能需要在較長時間內施用。每次服用量或總服用量由醫(yī)生決定并取決于身體狀況和疾病的嚴重程度、年齡、病人一般健康情況和病人對此藥物的耐受能力。本發(fā)明進一步提供了由本發(fā)明蛋白成分構成的藥物制劑。這種蛋白優(yōu)選以藥用鹽的形式存在，也可以在治療和預防肥胖時不經腸胃給藥。例如，式(I)的藥物可與常規(guī)的藥物載體和賦形劑混合使用。其組成含量可從活性蛋白占重量的0.1％到90％，并優(yōu)選是可溶性形式。更常用范圍是10到30％。而且，本發(fā)明蛋白可單獨施用或與其它抗肥胖藥物或有效試劑結合施用。作為靜脈給藥的蛋白通常用靜脈輸液通過輸注方式給藥。這種輸液可以是生理鹽水、Ringer’s液或5％葡萄糖。作肌內注射用時，要用無菌制劑。優(yōu)選用合適的式(I)或(II)的蛋白的可溶性鹽，例如鹽酸鹽，它可溶解于藥用稀釋劑如無熱源水(蒸餾水)、生理鹽水或5％葡萄糖溶液并通過這些溶液給藥。這種藥物的不溶形式，可制成水基或藥用油基(例如長鏈脂肪酸如乙基油酸)懸浮液的形式給藥。本發(fā)明藥物治療肥胖的效果可由下述體內實驗證實。生物檢測聯(lián)體實驗提示周邊脂肪組織釋放蛋白而且被釋放的蛋白能夠控制正常情況的身體增重從而控制肥胖小鼠。而且，最直接的生物實驗是通過幾種途徑給藥(如靜脈注射、皮下、腹膜內，微量泵和插管)然后檢測各時期的食物和水的消耗，身體增重情況，血漿化學或激素情況(葡萄糖、胰島素、ACTH、皮質酮、GH、T4)。適合的實驗動物是正常小鼠(ICR等)和肥胖小鼠(ob/ob，Avy/a，KK-Ay，tubby，fat)。糖尿病和肥胖ob/ob小鼠模型在此研究領域中通常當做肥胖的指標。實驗的對照組用有或無類似成分藥物的載體給同樣的動物并檢測同種參數(shù)或只將藥物本身(不加其它成分)給缺乏受體的動物(db/db小鼠，fa/fa或cp/cp大鼠)。在這些動物中顯示的蛋白活性將證實其在其它動物中的類似活性特別是人。由于認為受試組織應該是調節(jié)進食和生脂代謝的下丘腦。一種類似的實驗模型是直接注射受試藥物給大腦(即給側腦室或第三腦室做頸內注射或直接注射進入特定的下丘腦核(即周邊穹窿核))然后測定上述參數(shù)或監(jiān)測調節(jié)進食或代謝的神經遞質(即NPY，甘丙肽，去甲腎上腺素，多巴胺，β-內啡肽的釋放)。表2例舉的有代表性的蛋白是按照上述實施例的技術制備的。表2和表3描述的蛋白顯示了具有式(I)的SEQINNO3的氨基酸替換。例如，Ala(100)表示蛋白SEQIDNO3的100位色氨酸被丙氨酸替換。MetArg-表示這個蛋白在制備和檢測時帶有甲硫氨酸精氨酸前導序列。表2和表3的蛋白由質譜儀和/或氨基酸分析儀確定。本發(fā)明蛋白對ob/ob小鼠的肥胖治療作用也在表2給出。</tables></tables>類似的體外研究用分離的下丘腦組織在灌注或組織浴系統(tǒng)中完成。在這種情況下，監(jiān)測神經遞質釋放或電生理變化。本發(fā)明的化合物的物理和化學性質如下所示振搖測試起始液含有磷酸緩沖生理鹽水中的Ob蛋白(GibcoBRL，Dulbecco’sPBS無磷酸鈣或磷酸鎂，購自LifeTechnologies，Inc，GrandIsland，NY)。蛋白濃度通常由280nm吸收峰確定。還有一種替代方法是在1-厘米比色杯中測定0.5毫升濃度為1毫克/毫升的Ob蛋白的280nm理論吸收值。整個吸收峰區(qū)的確定是將25微升的樣品上排阻層析(SEC)分析柱(Superdex-75，Pharmacia)，室溫PBS中操作，檢測214nm吸收值。這個吸收峰區(qū)再與第一次測定的280nmOb蛋白完整ESC吸收峰值相比。經分析后，用PBS將各Ob蛋白稀釋到終濃度約為1.6mg/ml。用微量稀醋酸或稀氫氧化鈉分別調這些溶液的到pH5.0，pH6.0，pH7.0和pH8.0。調整pH后的溶液用紫外吸收或SEC技術做定量分析。將Ob蛋白溶液加入到2毫升玻璃自動取樣器小瓶中(VarianInstrumentGroup，Sinnyvale，CA產)，其中每個小瓶有15個直徑為8分之1英寸的Teflon珠(CurtinMathesonScientific，F(xiàn)lorence，KY產)。輕輕振搖除去溶液中的氣泡。小心填滿小瓶后用Teflon封口并旋緊瓶蓋。每次用于評估的振搖實驗小瓶要相互分開。測試小瓶放在精確設置溫度為40℃的溫箱的旋轉裝置上。按每分鐘30轉轉動小瓶使Teflon珠完全在溶液中從上到下輕輕的運動。在一定時間后，除去小瓶的中的珠粒然后在室溫下離心5分鐘(FisherScientificModel345C型離心機)。上清液中的蛋白濃度再用紫外吸收或SEC法測定。溶液中存留的Ob蛋白量通過調整pH后的起始液中Ob蛋白濃度以及振搖測試后的上清液中的Ob蛋白濃度計算出。本發(fā)明蛋白的化學和物理穩(wěn)定性如表3所示。表3描述的蛋白顯示了式(I)的蛋白SEQIDNO3中的氨基酸替換。例如，Ala(100)表示SEQIDNO3的蛋白中100位的色氨酸被丙氨酸替換。人Ob蛋白和小鼠ob蛋白也列出作為參考。表3</tables></tables></tables>此化合物在至少上述一種生物實驗中具有抗肥胖蛋白活性。因此，可用于治療肥胖和由肥胖引起的失調癥。然而，專業(yè)人士知道這種蛋白不僅可用于治療也可用作診斷用抗體和作為動物的飼料添加劑。而且，這種蛋白可用來控制體重以達到哺乳動物美容之目的。通過控制體重達到美容目的是為了改進外觀形象。哺乳動物不是不可避免地發(fā)胖。這種美容用途構成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的原理、具體實施方案和操作方式已在前面說明書中描述。但是，本文中所要保護的發(fā)明不限于所公開的具體形式，因為這些具體形式是解釋性的而不是限制性的。本領域技術人員在不背離本發(fā)明實質的條件下，可作出一些變化和修改。權利要求1.式(I)的蛋白或其藥用鹽(SEQIDNO1)ValProIleXaaLysValXaaAspAspThrLysThrLeuIleLysThr151015IleValThrArgIleXaaAspIleSerHisXaaXaaSerValSerSer202530LysXaaLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle354045LeuThrLeuSerLysXaaAspXaaThrLeuAlaValTyrXaaXaaIle505560LeuThrSerXaaProSerArgXaaValIleXaaIleXaaXaaAspLeu65707580GluXaaLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys859095HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly100105110ValLeuGluAlaSerXaaTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg115120125LeuXaaGlySerLeuXaaAspXaaLeuTrpXaaLeuAspLeuSerPro130135140GlyCys(I)145其中位置4的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置7的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置22的Xaa是天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；位置27的Xaa是蘇氨酸或丙氨酸；位置28的Xaa是谷氨酰胺、谷氨酸或缺失；位置34的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置54的Xaa是甲硫氨酸、甲硫氨酸亞砜、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸；位置56的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置62的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置63的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置68的Xaa是甲硫氨酸、甲硫氨酸亞砜、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸；位置72的Xaa是天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；位置75的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置77的Xaa是絲氨酸或丙氨酸；位置78的Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸；位置82的Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸；位置118的Xaa是甘氨酸或亮氨酸；位置130的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置134的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置136的Xaa是甲硫氨酸、甲硫氨酸亞砜、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸；位置139的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；所述蛋白有至少一處發(fā)生替換，該替換選自位置97的組氨酸被谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸或纈氨酸替換；位置102的絲氨酸被精氨酸替換；位置103的甘氨酸被丙氨酸替換；位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替換；位置106的蘇氨酸被賴氨酸或絲氨酸替換；位置107的亮氨酸被脯氨酸替換；位置108的天冬氨酸被谷氨酸替換；或位置111的甘氨酸被天冬氨酸替換；位置138的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換。2.權利要求1中的蛋白或其藥用鹽，該蛋白有至少一處發(fā)生替換，該替換選自位置97的組氨酸被谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸或纈氨酸替換；位置102的絲氨酸被精氨酸替換；位置103的甘氨酸被丙氨酸替換；位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替換；位置106的蘇氨酸被賴氨酸或絲氨酸替換；位置107的亮氨酸被脯氨酸替換；位置108的天冬氨酸被谷氨酸替換；位置111的甘氨酸被天冬氨酸替換。3.式(II)的蛋白或其藥用鹽(SEQIDNO2)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(II)其中位置22的天冬酰胺可任選地是谷氨酰胺或天冬氨酸；位置27的蘇氨酸可任選地是丙氨酸；位置28的谷氨酰胺可任選地是谷氨酸或缺失；位置54的甲硫氨酸可任選地是丙氨酸；位置68的甲硫氨酸可任選地是亮氨酸；位置72的天冬酰胺可任選地是谷氨酸或天冬氨酸；位置77的絲氨酸可任選地是丙氨酸；位置118的甘氨酸可任選地是亮氨酸；所述蛋白有至少一處發(fā)生替換，該替換選自位置97的組氨酸被谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸或纈氨酸替換；位置102的絲氨酸被精氨酸替換；位置103的甘氨酸被丙氨酸替換；位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替換；位置106的蘇氨酸被賴氨酸或絲氨酸替換；位置107的亮氨酸被脯氨酸替換；位置108的天冬氨酸被谷氨酸替換；位置111的甘氨酸被天冬氨酸替換；位置138的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；4.權利要求3中的蛋白，其中位置100的色氨酸是谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或亮氨酸；位置138的色氨酸是谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或亮氨酸。5.式(III)的蛋白或其藥用鹽(SEQIDNO3)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(III)其中位置97的組氨酸被谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸或纈氨酸替換；位置102的絲氨酸被精氨酸替換；位置103的甘氨酸被丙氨酸替換；位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替換；位置106的蘇氨酸被賴氨酸或絲氨酸替換；位置107的亮氨酸被脯氨酸替換；位置108的天冬氨酸被谷氨酸替換；位置111的甘氨酸被天冬氨酸替換；位置138的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；6.權利要求5中的蛋白，其中位置97的組氨酸被谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸或纈氨酸替換；位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替換；位置106的蘇氨酸被賴氨酸或絲氨酸替換；位置107的亮氨酸被脯氨酸替換；位置108的天冬氨酸被谷氨酸替換；位置111的甘氨酸被天冬氨酸替換；位置138的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換。7.權利要求6中的蛋白，其中位置97的組氨酸被絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、異亮氨酸或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被蘇氨酸替換；或位置138的色氨酸是丙氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸。8.權利要求1至7中任一權項的蛋白，其中位置96的半胱氨酸與位置146的半胱氨酸形成二硫鍵。9.一種具有SEQIDNO4序列的蛋白或其藥用鹽(SEQIDNO4)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProAlaAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys其中位置96的半胱氨酸與位置146的半胱氨酸形成二硫鍵。10.一種具有SEQIDNO5序列的蛋白或其藥用鹽(SEQIDNO5)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProGlnAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145Glycys其中位置96的半胱氨酸與位置146的半胱氨酸形成二硫鍵。11.一種具有SEQIDNO6序列的蛋白或其藥用鹽(SEQIDNO6)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuGlnGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys其中位置96的半胱氨酸與位置146的半胱氨酸形成二硫鍵。12.一種具有SEQIDNO7序列的蛋白或其藥用鹽(SEQIDNO7)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProGlnAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuGlnGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys其中位置96的半胱氨酸與位置146的半胱氨酸形成二硫鍵。13.一種具有SEQIDNO8序列的蛋白或其藥用鹽(SEQIDNO8)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisAlaGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProAlaAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys其中位置96的半胱氨酸與位置146的半胱氨酸形成二硫鍵。14.一種下式蛋白Met-R1-ValProIleXaaLysValXaaAspAspThrLysThrLeuIle1510LysThrIleValThrArgIleXaaAspIleSerHisXaaXaaSerVal15202530SerSerLysXaaLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHis354045ProIleLeuThrLeuSerLysXaaAspXaaThrLeuAlaValTyrXaa505560XaaIleLeuThrSerXaaProSerArgXaaValIleXaaIleXaaXaa657075AspLeuGluXaaLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLys808590SerCysHisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeu95100105110GlyGlyValLeuGluAlaSerXaaTyrSerThrGluValValAlaLeu115120125SerArgLeuXaaGlySerLeuXaaAspXaaLeuTrpXaaLeuAspLeu130135140SerProGlyCys145其中R1是除脯氨酸外的任意氨基酸；位置4的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置7的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置22的Xaa是天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；位置27的Xaa是蘇氨酸或丙氨酸；位置28的Xaa是谷氨酰胺、谷氨酸或缺失；位置34的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置54的Xaa是甲硫氨酸、甲硫氨酸亞砜、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸；位置56的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置62的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置63的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置68的Xaa是甲硫氨酸、甲硫氨酸亞砜、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸；位置72的Xaa是天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；位置75的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置77的Xaa是絲氨酸或丙氨酸；位置78的Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸；位置82的Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸；位置118的Xaa是甘氨酸或亮氨酸；位置130的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置134的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；位置136的Xaa是甲硫氨酸、甲硫氨酸亞砜、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸；位置139的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；所述蛋白有至少一處發(fā)生替換，該替換選自位置97的組氨酸被谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或脯氨酸替換；位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；位置101的丙氨酸被絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸或纈氨酸替換；位置102的絲氨酸被精氨酸替換；位置103的甘氨酸被丙氨酸替換；位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替換；位置106的蘇氨酸被賴氨酸或絲氨酸替換；位置107的亮氨酸被脯氨酸替換；位置108的天冬氨酸被谷氨酸替換；位置111的甘氨酸被天冬氨酸替換；或位置138的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸或亮氨酸替換；15.權利要求14中的蛋白，其中R1是精氨酸。16.權利要求1至13中任一權項的蛋白的制備方法，其包括(a)用編碼權利要求1至13中任一權項的蛋白的DNA轉化宿主細胞，所述蛋白具有任選的前導序列；(b)培養(yǎng)宿主細胞并分離步驟(a)中編碼的蛋白；并任選地，(c)酶促切除前導序列以產生權利要求1至13中任一權項的蛋白。17.權利要求16的方法，其中前導序列是Met-R1-。18.權利要求17的方法，其中前導序列是Met-Arg-。19.一種藥物制劑，它包含權利要求1至13中任一權項的蛋白，以及一種或多種藥用稀釋劑、載體或賦形劑。20.一種治療肥胖的方法，它包括給需要治療的哺乳動物施用權利要求1至13中任一權項的蛋白。21.權利要求1至13中任一權項的蛋白，它被用作藥劑。全文摘要本發(fā)明提供抗肥胖蛋白,給病人施用此蛋白時可調節(jié)脂肪組織。因此,這種藥物可使病人克服其肥胖性障礙,并可極大地減少二型糖尿病、心血管疾病和癌癥的發(fā)病風險而過上正常生活。文檔編號A61K38/00GK1180312SQ96193022公開日1998年4月29日申請日期1996年1月29日優(yōu)先權日1996年1月29日發(fā)明者M·B·巴辛斯基,R·D·迪馬奇埃,D·B·弗洛拉,J·E·黑爾,小·W·F·希思,J·A·霍夫曼,B·E·舍恩厄爾申請人:伊萊利利公司