專利名稱：：交聯(lián)的微粒及其作為治療載體的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及交聯(lián)的微粒及其作為治療載體的用途。發(fā)明的背景使用微粒載體系統(tǒng)經(jīng)胃腸道外輸送治療劑和診斷劑越來越受到人們的重視。已提出多種微粒技術(shù)系統(tǒng)和化學(xué)物質(zhì)作為載體來經(jīng)皮下、靜脈和動脈內(nèi)輸送治療和診斷劑。對于“理想的載體”而言，有幾個關(guān)鍵的方面。包括顆粒的大小、粒度分布、有效的運載量、生物降解速度、易于使用、釋放動力學(xué)和易于重復(fù)生產(chǎn)。其它人已成功地提出“理想的載體”的個別方面，其中著名的有藥物有效運載量、生物降解速度和在某種程度上，顆粒大小及分布。已知的載體通過各種技術(shù)來制備，主要基于溶劑和乳劑形式。這些方法的缺陷是試圖在生產(chǎn)的一個或兩個步驟中控制載體的關(guān)鍵成分。因此，通常通過一個或兩個乳劑系統(tǒng)或溶劑蒸發(fā)技術(shù)，以單一的動態(tài)環(huán)境同時賦予產(chǎn)品顆粒大小、粒度分布、有效運載量和生物降解速度，。一般來說，在制備乳劑時，將藥物、聚合物和表面活性劑的溶液與不溶性的溶劑混合、乳化、加熱或使其穩(wěn)定來固定顆粒，然后凈化除去與不適合胃腸道外使用的油或溶劑。乳劑或溶劑蒸發(fā)系統(tǒng)的反應(yīng)容器是現(xiàn)有技術(shù)的主要特點。該容器中，通過平衡油和水性成分的界面張力、溶質(zhì)在界面的相互作用、攪拌、加熱和殼形成之間的平衡和在聚合物材料中加入活性物質(zhì)來控制微粒的形態(tài)。然而，這種技術(shù)與胃腸道外應(yīng)用藥物所需的大規(guī)模藥物制備極不適應(yīng)。幾乎沒有例外，在生產(chǎn)用于回聲-對比成像和其它胃腸道外使用的微粒時，對已知微粒的大小和粒度分布的控制都大大低于通過噴霧干燥技術(shù)所獲得的對顆粒大小的控制，這在PCT公開WO-A-9112823、WO-A-9218164和WO-A-9408627中有所描述。靜脈內(nèi)微粒的急性毒性主要與肺循環(huán)中的毛細管阻塞、并發(fā)肺靜脈壓降低和順應(yīng)性喪失有關(guān)。顆粒大小和LD毒性之間的關(guān)系已確切記錄在案。我們自己的數(shù)據(jù)顯示顆粒的平均大小超過6um(肺組織中對于不可變形微囊的理論毛細血管大小)，靜脈顆粒的毒性急劇上升。一般來說，膠囊的平均尺寸越大，其大小分布也越寬，并且微粒大小的范圍可跨越兩個數(shù)量級。對于治療使用來說，如化學(xué)栓塞形成，注射含有顆粒大小范圍在5-100um的微粒制劑的希望與高度區(qū)域靶向輸送的概念極不一致。在大顆粒端，有可能阻塞達到和超過100um直徑的大血管，同時伴隨有大面積輸入?yún)^(qū)發(fā)生壞死的危險；在范圍的小顆粒端，使必要量的顆粒分布到系統(tǒng)中成為可能。以前最常用于獲得微粒系統(tǒng)緩釋的機制為控制基質(zhì)材料的侵蝕和將包裹或浸透的活性物質(zhì)釋放到周圍介質(zhì)中。該活性物質(zhì)或者在生產(chǎn)顆粒時被混入或者在固定步驟或穩(wěn)定步驟后吸收入基質(zhì)。將藥物混入已知微囊的基質(zhì)中需要在水和不可避免的氧的存在下加熱。這幾乎一定會導(dǎo)致因氧化損害或無法控制的與載體交聯(lián)而造成的藥物摻雜。在用化學(xué)穩(wěn)定劑時，活性物質(zhì)的喪失甚至是嚴(yán)重的。減慢或修飾藥物從可溶性聚合物載體中釋放速度的另一機制是通過共價鍵將活性物質(zhì)與可溶性聚合物連結(jié)?？傊?，這一機制還沒有用于藥物、配體或抗體與顆粒載體相連結(jié)的微粒體系。連結(jié)活性物質(zhì)與現(xiàn)有技術(shù)微粒的主要障礙是后者的相對疏水性。因為許多完成連結(jié)所需的化學(xué)反應(yīng)是在水性介質(zhì)中進行的，此疏水微粒幾乎不可能進行衍生。以前的工作者們生產(chǎn)親水微囊時，需要在親水聚合物存在下以乳化法進行復(fù)雜的形成。微囊的生物降解速度主要取決于交聯(lián)的程度。在現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)中，改變交聯(lián)對藥物運載和隨后配制微粒的能力具有不利的影響。在操縱該參數(shù)來控制生物降解和藥物釋放的速度方面幾乎尚未作任何努力。現(xiàn)有的微粒要求大量的表面活性劑或聲處理來在水性介質(zhì)中完成單分散懸浮。甚至在重新配制時，微粒具有凝集的傾向性，因此難以通過皮下注射給藥。本發(fā)明概述本發(fā)明基于PCT公開WO-A-9112823、WO-A-9218164和WO-A-9408627中描述的具有好的顆粒特性的顆粒甚至在熱交聯(lián)之后也保留其親水特性和在水中重新配制時獲得單分散懸浮液的能力的發(fā)現(xiàn)。而且保留了原料中的功能基如羧基、胺、羥基或巰基，并能用于衍生。根據(jù)本發(fā)明，一種無菌粉末含有交聯(lián)材料的光滑球狀微粒，直徑0.1-50um，該微粒是親水性的，能夠在水中重新配制而獲得單分散懸浮液，另外還含有通過游離功能基(如胺、羥基、羧基或巰基)與微粒直接或間接連結(jié)的生理性或診斷性活性組分。本發(fā)明詳細描述本發(fā)明優(yōu)選使用PCT公開文獻(同上，其內(nèi)容引入本文供參考)所描述的微粒生產(chǎn)技術(shù)，其中嚴(yán)格控制了顆粒大小、粒度分布、有效運載量、生物降解速度和釋放動力學(xué)，易于使用并可大規(guī)模生產(chǎn)。可以特制本發(fā)明的微粒以便適于使用，同時在所有情況下都保留以高水平的藥物生產(chǎn)方式和相同的控制水平來規(guī)模生產(chǎn)載體的能力。除了控制顆粒大小之外，在各個步驟中可以獨立地控制粒度分布；固定速度或相應(yīng)的生物降解速度；藥物的運載量；和配制及完成。按PCT公開文獻(同上)所述，申請人具有了一種完全調(diào)節(jié)的方法，可產(chǎn)生特定性質(zhì)的微粒。該方法可按藥物常規(guī)過程來操作，不引入外來顆粒，這種外來顆粒必定會象許多現(xiàn)有技術(shù)的方法所生產(chǎn)的微粒那樣妨礙胃腸道外使用。本發(fā)明涉及用于靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)和體外(exvivo)使用的微粒制劑的生產(chǎn)。靜脈顆粒懸浮液，在用稀釋劑重新配制時，優(yōu)選含有低于5％體積的大于6um的顆粒。另外，粒度分布的形狀接近于Gaussian，大約50％的顆粒落在5um的范圍中，優(yōu)選3um，更優(yōu)選2um且最優(yōu)選1.2um。理想的分布是80％的顆粒在3um的范圍中。(所有分布按體積或質(zhì)量計算)。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是95％顆粒小于6um和80％的顆粒在1-6um的粉末，特別是在靜脈使用時。另一個優(yōu)選的實施方案是90％顆粒小于20um且小于6um的體積低于5％的粉末，特別是在動脈內(nèi)使用時。對于較大顆粒體系，使用高度控制的噴霧干燥和隨后的分級步驟，可產(chǎn)生足夠大小的和緊密粒度分布的微粒，這樣在動脈內(nèi)給藥之后，消除了系統(tǒng)釋放，并且栓塞小于20um的血管。在本發(fā)明的一個實施方案中，我們將活性物質(zhì)混合在噴霧干燥的原料中并隨后穩(wěn)定顆粒。我們獲得的顆粒的優(yōu)點主要在于比現(xiàn)有的方法更好地控制形狀和有效運載量。本發(fā)明所使用的方法可包括壁材料和藥物沉積為干粉狀態(tài)，具有可忽略不計的水分，該粉末能夠重新配制成最初的溶解性組成部分。在本發(fā)明中，交聯(lián)可用于控制活性物質(zhì)的釋放速度。例如，在一個實施方案中，交聯(lián)程度及降解速度在與活性物質(zhì)結(jié)合之前被“確定”?；钚耘潴w隨后被連接，并且顯示由基質(zhì)材料交聯(lián)的程度決定的控釋曲線。這具有能觀察到恒定的釋放速度而沒有公知的“突發(fā)”效果。本發(fā)明的再一方面是控制交聯(lián)?？裳苌鶊F的潛在水平和交聯(lián)所需的溫度/時間可通過混入改變這些參數(shù)的添加劑來控制。將賴氨酸或聚賴氨酸、谷氨酸或聚谷氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸混入原料中可具有增加或減少最終微粒制劑生物降解速度的作用。另外，混入這些添加劑可明顯增加可與活性物質(zhì)或配體結(jié)合的基團的數(shù)量。而且，混入這些添加物質(zhì)可減少在噴霧干燥后形成的溶解性微粒加熱期間使微粒穩(wěn)定化所需的時間/溫度。因此，本發(fā)明提供了一種特別適于向指定位置輸送的具有窄的粒度分布的微粒，已發(fā)現(xiàn)許多使該微囊特別有用的有利特征。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用本文所描述的技術(shù)制備的微囊在加工、衍生和配制顆粒的能力方面比現(xiàn)有技術(shù)具有一些更好的特點。因此，例如，本申請人的技術(shù)能夠生產(chǎn)基本保持二級結(jié)構(gòu)并因此保留親水性而不是如現(xiàn)有技術(shù)那樣產(chǎn)生變性和不溶解性、并隱藏功能基的微粒。特別是，該顆粒(i)具有顯著含量的用于衍生的胺、羥基或羧基或其組合，(ii)是高度親水的，易于接近衍生活性基團的水性介質(zhì)，(iii)可以干或濕的狀態(tài)操作來產(chǎn)生干的最終制劑，不需要表面活性劑或聲處理來產(chǎn)生顆粒的單分散懸浮液，(iv)以殼的組分和交聯(lián)所決定的速度生物降解和釋放活性組分，(v)可具有范圍為0.01um-100um的顆粒大小，和(vi)在體內(nèi)循環(huán)保持一定時間(60分鐘或者更長)，顯著長于更疏水的已知微粒，也長于脂質(zhì)體；減少調(diào)理作用(opsonisation)并將產(chǎn)血栓可能性減到最小。顆粒大小對于靜脈給藥來說優(yōu)選低于4um，對于動脈內(nèi)給藥來說在8-30um。特別是對于較大的顆粒來說，分級是一個可有可無的附加步驟。該顆粒大小范圍可按四分位數(shù)間距與平均直徑的比來表示，為0.2-0.5。本發(fā)明的微粒可通過使用制備噴霧干燥的原料的基本囊殼或添加劑的羧基或胺基團將藥物、配體、肽或蛋白質(zhì)直接與載體結(jié)合來衍生。例如，可使用戊二醛、EDCI、對苯二酰氯、溴化氰或還原胺化來完成結(jié)合。另外，可通過生物降解的羥基酸連結(jié)劑將配體、藥物、蛋白質(zhì)或肽連結(jié)，在WO-A-9317713(RijksuniversiteitGroningen)中公開了這種連結(jié)劑，該文獻的內(nèi)容引入本文供參考。本發(fā)明的另一優(yōu)點在于以干的無菌粉末配制和產(chǎn)生產(chǎn)品的能力。本發(fā)明粉狀形式的微囊不絕對需要表面活性劑來保證重新配制時形成單分散懸浮液。重新配制后，它們不凝集，并可通過注射給藥。本發(fā)明一方面是由生物相容的材料制備的與水相容的體系。不能預(yù)計的是，本發(fā)明的微?？赏ㄟ^加熱來使其變得不溶解，但仍然保留足夠的二級結(jié)構(gòu)以保持其高的親水性。通過在pH4.5-5下檢測顆粒的等電點(PI)與天然白蛋白非常類似而獲得保持二級結(jié)構(gòu)的證據(jù)。通常，白蛋白的完全變性導(dǎo)致PI的顯著升高，其值為6.5-7.0。進一步來說，蛋白酶消化蛋白質(zhì)微粒產(chǎn)生肽，通過HPLC分析，與起始溶解性蛋白質(zhì)的消化相比，該肽顯示幾乎相同的曲線。另外，蛋白質(zhì)微粒和蛋白質(zhì)原料的酸水解顯示特別類似的氨基酸成分。這兩個分析支持了微粒中的蛋白質(zhì)主要為天然的的觀察結(jié)果。新的顆粒是親水性的，并且具有循環(huán)超過1小時的能力，第一次提供生物相容的載體系統(tǒng)，它顯示延長的循環(huán)半壽期，并具有與配體高度的特異親和性。在制造和賦予與色譜材料或酶通常相關(guān)的高親和配體結(jié)合能力時，“確定”了微粒的特異性。該顆粒也提供了與生物液體接觸使用的可能，例如體外系統(tǒng)去毒、血清或血液生物測定和在重新進入體內(nèi)之前分離血液成分。下列實施例說明本發(fā)明。實施例1本實施例描述通過殼材料的交聯(lián)來固定溶解性微囊以形成不溶或微溶的微囊。該微囊可通過各種方法來交聯(lián)，包括使用加熱或化學(xué)方法。調(diào)節(jié)固定的程度產(chǎn)生隨后會溶于合適介質(zhì)的微囊。而且，任何結(jié)合或包裹在微囊中的活性化合物會以該溶出點來釋放。另外，微囊的固定程度也反應(yīng)可被酶消化的程度。固定的程度越大，微囊抵抗酶消化的能力也越大。由噴霧干燥含有150ml的25％乙醇的原料來制備HSA微囊，乙醇中含有10.0mg/mlHSA。用于形成微囊的噴霧干燥條件詳述在下表1中。表1</tables>噴霧干燥法產(chǎn)生17.21g的微囊。將由此一批產(chǎn)生的微囊分為相同量的等分試樣并在175℃下分別加熱固定45、55和75分鐘。加熱固定過程通過交聯(lián)白蛋白結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸而使由噴霧干燥制備的溶解性微囊變得不溶。在水性系統(tǒng)中用MultisizerII(CoulterElectronics)測定三種不同加熱的微囊。微囊的平均大小為3.28±0.6um且90％的量在2-5um。微囊與任何活性組分結(jié)合前，以各種方法分析那些加熱固定55分鐘者作為藥物載體的適宜性。游離硫羥基分析存在于白蛋白分子中的游離硫羥基對修飾非常敏感，并因此可用于測量白蛋白的狀態(tài)和狀況。類似地如果在制備期間白蛋白分子不被破壞，它應(yīng)當(dāng)存在于微囊結(jié)構(gòu)中。將白蛋白微囊與DTNB(即，5，5′-二硫代二(2-硝基苯甲酸))反應(yīng)來進行游離硫羥基的分析。如果存在游離硫羥基，它與DTNB反應(yīng)產(chǎn)生在412nm處有吸收的硝基苯甲酸衍生物。測量412nm處12mg/ml微囊懸浮液的吸光度。將50ul20％DTNB的TRIS緩沖液加到所述懸浮液中，在室溫下溫育10分鐘并測量吸光度。計算兩個吸光度的不同并由反應(yīng)產(chǎn)物的分子消光系數(shù)計算微囊中存在的游離硫羥基的濃度。微囊中測量的硫羥基的分子比為0.4785。這與天然白蛋白的值0.5045相似。沒有明顯差異并斷定游離硫羥基在微囊制造期間沒有改變。通過在120℃下用濃HCl氣相水解24小時，將微囊(溶解性的和不溶解性的)和天然白蛋白分解成它們的組成氨基酸。然后通過加入三乙胺的50％乙醇液和隨后加入三乙胺和PITC的乙醇液來使樣品衍生。采用HPLC分析衍生的樣品，并在254nm波長下檢測氨基酸。表4(在說明書的結(jié)尾處)顯示所得氨基酸的組成。出人意料的是，各種樣品之間沒有明顯差異，僅在微囊變得不溶后，含有羧基、羥基和酰胺基團的氨基酸有少量損失。肽分析使用加有20ul1％胃蛋白酶溶液的1ml微囊或白蛋白的酸化溶液來進行微囊和白蛋白的胃蛋白酶消化。消化在37℃下進行24小時，然后第二次加入胃蛋白酶并在37℃下進一步溫育直到樣品被完全消化。使用在0.1％TFA中的乙腈梯度液、在214nm處測量吸光度來對所得溶胞產(chǎn)物進行HPLC分析。如下進行微囊和白蛋白的胰蛋白酶消化首先用鹽酸胍、DTT和碘乙酰胺處理樣品使蛋白結(jié)構(gòu)打開。將0.2％胰蛋白酶加到這些預(yù)處理的樣品之中并在37℃下溫育直到完全消化(如果需要可加入另外的胰蛋白酶)。按上文所述方法進行溶胞產(chǎn)物的HPLC分析。HPLC分析顯示微囊和白蛋白之間的結(jié)構(gòu)沒有明顯差異。這證明在微囊變得不溶后明顯保留了蛋白質(zhì)的二級和三級蛋白結(jié)構(gòu)。與FITC偶合FITC(異硫氰酸熒光素)共價結(jié)合到微囊的氨基上并舉例說明用隨后通過微囊材料本身降解釋放的藥物衍生帶電基團(即賴氨酸殘基)的原則。將FITC共價結(jié)合到三批微囊上。使用15∶1的微囊與FITC。12.5mg的FITC被加到懸浮的微囊中并在30℃下將混合物溫育30分鐘。通過洗滌微囊除去過量的熒光素，直到在洗滌液中沒有熒光素存在，即，沒有觀察到浸出標(biāo)識劑。用蛋白酶K以0.4EU/ml的濃度消化微囊。當(dāng)它們被消化時，從微囊中釋放出熒光素，并在各個時間間隔對微囊懸浮液取樣來進行測量。通過離心分離從微囊中分出釋放的FITC并通過在493nm處測量吸光度來進行定量。所得結(jié)果顯示，微囊加熱固定越少，熒光素開始釋放越快。然而，225分鐘后，所有樣品釋放出大于90％的熒光素。結(jié)合到不同加熱固定的微囊上的FITC的量是相似的，所有三批中大約裝載10±0.5％mole/mole。因此可通過在結(jié)合活性物質(zhì)之前“設(shè)置”微囊的降解速度來調(diào)節(jié)結(jié)合的活性物質(zhì)的釋放速度。用全人血在37℃下將實施例1的微囊溫育30分鐘來確定微囊是不是能夠刺激血小板激活。微囊的濃度等于2000×106顆粒/kg的劑量。溫育30分鐘后，試驗血清對由膠原蛋白ADP和花生四烯酸刺激的血小板凝集的影響。通過測量下列參數(shù)來評價對總止血機制的影響促凝血活性，部分凝血酶原激酶時間；通過片斷1+2和纖維蛋白肽A的出現(xiàn)觀察的凝血酶原時間；和通過檢測優(yōu)球蛋白溶解時間獲得的纖維蛋白溶解活性。在該濃度時，沒有對測定試驗產(chǎn)生任何不利影響。因此，所得結(jié)果提示不象通過乳化過程制備的微粒，該微粒是惰性的并且是親水的。在進一步的試驗中，通過暴露于Co60源并接受25-35Kgray的劑量來用γ射線滅菌按實施例1的方法制備的微粒。以1.5×109微粒/ml的濃度重新配制微囊并在倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)下以25-300×106微粒/kg的劑量范圍施用于健康男性志愿受試者。將微粒挖空并含有能夠使其在血流中通過并保留的空氣，以便隨后用超聲顯像跟蹤。使用Acuson-128，需要右和左室的灰度二維顯象來監(jiān)測IV給藥后循環(huán)保留時間。為了使左和右室產(chǎn)生混濁，在室中必須存在高水平的微粒。在25×106/kg以上劑量時，右和左室的混濁持續(xù)1小時或更長，表明有顯著量的顆粒存在于循環(huán)系統(tǒng)中。該數(shù)據(jù)表明基本微囊載體對血中的凝血機制是惰性的，并且適于運載治療劑。這與通過乳化方法制備的顯示快速RES攝入且循環(huán)半衰期為10分鐘或更短的微粒完全相反。而且，該微粒不要求用嵌段共聚物來衍生以提高循環(huán)半衰期。實施例2本實施例描述添加劑可包含在微囊壁形成材料的噴霧干燥原料中，由此獲得的微囊可在較低的溫度下加熱固定。當(dāng)活性藥物與其共同噴霧干燥并由此與基質(zhì)材料混合時，允許微囊聚合物有較低的交聯(lián)(變得不溶)溫度的添加劑是有使用價值的。通過使用這些添加劑，具有熱敏感活性的微囊可在有利的較低溫度下變得不溶。將5mg/ml的酪氨酸加到噴霧干燥的原料中，并使用實施例1所述的方法形成微囊，不要求改變噴霧干燥的條件來獲得微囊。收集的微囊如前加熱固定完成相同的交聯(lián)，但溫度為100℃，時間為55分鐘，明顯低于正常的175℃，55分鐘。產(chǎn)生的微囊的平均大小為3.28±0.6um，有90％的顆粒在2-5um之內(nèi)。實施例3實施例1描述了3um微囊的制備。本實施例顯示，通過調(diào)節(jié)噴霧干燥條件和使用第二個分類步驟，可生產(chǎn)較大的微囊并極好的控制顆粒的大小和粒度分布。在表2顯示的條件下噴霧干燥20％的HSA。在175℃溫度下，將收集的微囊加熱固定55分鐘，去凝集，然后使用曲管噴射分類器進行分類(見表3)。表2噴霧干燥條件設(shè)置入口溫度220℃出口開始溫度89.1℃出口最終溫度89.2℃噴霧壓2.0bar氣閘設(shè)置0.5進料速度20.1g/min儲備液20％HSA</table>表3分類條件設(shè)置最初的空氣0.6barg后來的空氣2.0barg文丘里空氣8.0barg</table>收集分類的中間流分并按分類方法重新配制以除去多余的賦形劑。如前對所得自由流動的干粉進行測定。微囊的平均大小為12um，且實際上沒有低于6um的微囊，85％的顆粒在9-18um之間。通過除去小于6um的顆粒，預(yù)防了小動脈內(nèi)給藥后因毛細管捕獲而發(fā)生的微囊全身循環(huán)。這有利于局部沉積藥物，因此減少在所需部位產(chǎn)生治療活性所要求的藥物的總量。這是期望的，特別是在細胞毒的情況下，因為全身毒性是有害副作用的主要原因。然后將抗體結(jié)合到微囊壁表面。使用FITCIgG來幫助檢測結(jié)合的抗體。將35mg的高碘酸鈉加到5mg的FITC-Igg中。在室溫下，將混合物溫育1小時，此后加入20mg的微囊。攪拌懸浮液10分鐘，然后通過加入30mg氫硼化鈉，將激活的抗體結(jié)合在微囊上。反應(yīng)在室溫下進行2小時，此后，收集微囊并洗滌。還原微囊樣品，釋放結(jié)合抗體的輕鏈。除去微囊并收集所得濾液。通過使用熒光計測量濾液中存在的FITC標(biāo)記的抗體輕鏈?？贵w與微囊的連結(jié)也可通過三或四肽間隔物的方式來完成。使用上文所述的高碘酸鹽和氫硼化物反應(yīng)，將肽共價結(jié)合到抗體上的激活糖環(huán)上。然后，按實施例6所述方法，使用EDCI，通過肽間隔物將抗體連結(jié)到微囊上。實施例4本實施例說明在噴霧干燥原料中混入添加劑(例如HSA)將改變由實施例1制備的微囊的化學(xué)特性，這樣可極大增加化學(xué)結(jié)合部位的數(shù)量。將聚賴氨酸以5mg/ml的濃度混入噴霧干燥的原料中。按實施例1的方法進行噴霧干燥。由這樣改良的儲備液制備的微囊具有3.5±0.3um的平均大小，并具有與HSA微囊相似的物理特性，如重新懸浮的特性。按實施例1所述方法，將FITC結(jié)合到聚-賴氨酸微囊上。洗滌微囊直到觀察不到進一步釋放FITC。FITC繼續(xù)結(jié)合在HSA微囊上，而不釋放到水性懸浮液中。如實施例1所述，將微囊消化并測量結(jié)合在微囊上的熒光素的總量。消化時熒光素的釋放速度快于標(biāo)準(zhǔn)微囊的速度。然而，測到有20摩爾％熒光素總量結(jié)合在微囊上，比標(biāo)準(zhǔn)微囊組合物增加50％。實施例5本實施例說明可將活性物質(zhì)連結(jié)到殼上，并隨后通過微囊本身的降解控制其釋放速度。將25mg的碳化二亞胺(EDCI)加到10mg/ml的氨甲蝶呤溶液中。攪拌溶液4小時來開始并保證完全激活氨甲蝶呤。將50mg由實施例1制備的HSA微囊加到激活的藥物中并在室溫下攪拌3小時。氨甲蝶呤通過白蛋白上的氨基化學(xué)結(jié)合到微囊上。收集微囊并洗滌以除去任何松散結(jié)合的氨甲蝶呤。對連結(jié)氨甲蝶呤的微囊進行定性，也分析其藥物成分。微囊的平均大小為3.2±0.6um，90％在2-5um之間。藥物成分分析顯示，當(dāng)重新混懸在含水介質(zhì)中時，微囊沒有釋放藥物。而且，此后的三個月穩(wěn)定試驗顯示沒有藥物釋放。白蛋白微囊的蛋白酶K消化釋放結(jié)合的藥物，顯示藥物僅連結(jié)到有限數(shù)量的氨基酸和小肽上。實施例6使用碳化二亞胺將亞德里亞霉素結(jié)合到由實施例1描述的一般方法制備的微囊上。將3mg亞德里亞霉素、6mgEDCI和100mg微囊懸浮在pH6.6的蒸餾水中并在37℃下繼續(xù)攪拌20小時，并且重新懸浮和配制。分析亞德里亞霉素-微囊的藥物成分并進行定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物結(jié)合期間微囊的性質(zhì)沒有變化。通過HPLC分析微囊的酶消化樣品來評價藥物的裝載情況。測量到裝載2％，顯示藥物僅連結(jié)到有限數(shù)量的氨基酸或小肽上。以前已表明，結(jié)合在聚合物載體上的亞德里亞霉素的活性證明它對某些顯示多種藥物耐受表型的腫瘤是有益的。實施例7將利用實施例1方法制備的微囊衍生來運載2-氟-5-脫氧尿苷(FUdR)。用琥珀酐激活藥物。將40mgFUdR加到0.2MpH8.3的磷酸鹽緩沖液中。在該溶液中加入200mg琥珀酐并將反應(yīng)混合物在30℃下攪拌2小時，同時使用IMNaOH保持PH為8.3。調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的PH為6.5并加入0.5g的微囊。攪拌懸浮液10分鐘后，以15∶1的比例加入EDCI和N-羥基琥珀酰亞胺，并且在室溫下進行偶合反應(yīng)。24小時后，收集微囊并洗滌，通過HPLC分析確定微囊上存在的FUdR。在ASTED系統(tǒng)中使用1％TFA進行連結(jié)藥物微囊的酸水解，并且在269nm處檢測隨后的FUdR的釋放。發(fā)現(xiàn)15％w/wFUdR通過酸可水解的鍵結(jié)合到微囊上。細胞毒活性在體外測量實施例5-7的藥物微囊共軛物的細胞毒活性。使用HSN細胞系。這是一種化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸肉瘤，它在動物模型中產(chǎn)生肝癌，具有血管型式，類似于在人中見到的結(jié)腸直腸肝轉(zhuǎn)移瘤。使用MTT間接測量殺細胞情況。它在激活的線粒體中被還原為甲(一種有顏色的代謝物)。將HSN細胞在加有對照劑量的藥物或藥物-微囊溶胞產(chǎn)物的多孔板中培養(yǎng)。暴露一定范圍時間之后，將MTT加到孔中并測量甲濃度作為細胞死亡的指標(biāo)。對一定范圍的已知的細胞數(shù)目標(biāo)定該細胞系的測定。所有三種藥物(氨甲蝶呤、5-FUdR和亞德里亞霉素)具有天然藥物與藥物-微囊溶胞產(chǎn)物類似的劑量反應(yīng)曲線，表明細胞毒活性是相似的。所有三種藥物和溶胞產(chǎn)物的細胞活性的最大減少大約為80％。對于5～FUdR和氨甲蝶呤來說，劑量反應(yīng)曲線最陡的部分是從1ug/ml降到0.01ug/ml，而亞德里亞霉素是從0.1ug/ml開始，正好在體內(nèi)所見的血清范圍內(nèi)。未衍生微囊的對照溶胞產(chǎn)物不顯示細胞毒活性。實施例8本實施例說明活性化合物不是直接與微囊殼壁相連，而是通過可降解的間隔物或連結(jié)劑來連結(jié)。這能夠極大地控制活性化合物的連結(jié)和釋放。使用WO-A-9317713描述的將藥物與溶解性載體連結(jié)的技術(shù)，用乳酸間隔物將甲氧萘丙酸與微囊連結(jié)。在10mmol的L-乳酸的二甲基甲酰胺懸浮液中，加入20mmol三乙胺和10mmol五甲基芐基(PMB)氯。加熱混合物直到形成溶液，然后在室溫下放置。溶液培養(yǎng)過夜后加入過量的碳酸鈉，并收集洗滌和干燥沉淀的酯(L-乳酸-PMB)。在含有10nmol甲氧萘丙酸、L-乳酸-PMB和4-二甲基氨基吡啶的溶液中，加入11mmol的二環(huán)己基碳化二亞胺溶液。在25℃下攪拌反應(yīng)混合物并檢測甲氧萘丙酸連結(jié)物的形成。完成反應(yīng)之后，收集、洗滌并干燥甲氧萘丙酸-L-乳酸連結(jié)物。通過甲氧萘丙酸連結(jié)物與茴香醚和三氟乙酸在室溫下反應(yīng)2分鐘來除去PMB保護基。真空除去過量的試劑并收集和洗滌殘渣。酸化洗滌的殘渣產(chǎn)生甲氧萘丙酸-L-乳酸，提取、洗滌并在50℃的真空下干燥。通過與碳化二亞胺按1∶1進行反應(yīng)，然后加入1mmolN-羥基琥珀酰亞胺來激活甲氧萘丙酸-L-乳酸。將活化的甲氧萘丙酸-L-乳酸-NHS以5∶1的比例加到硼酸鹽緩沖的HSA微囊中。收集并干燥所得產(chǎn)物。配制干燥的甲氧萘丙酸微囊，產(chǎn)生自由流動的粉末，微囊平均大小為3.5±0.6um。有90％的微囊在2-5um。用毛細管區(qū)帶電泳(CapillaryZonalElectrophoresis)(Beckman，UK)對產(chǎn)物進行分析。結(jié)果表明在微囊上含有藥物。用酯酶釋放藥物并隨后用連接有GilsonHPLC(AnachemUK)的ASTED系統(tǒng)來分析釋放的甲氧萘丙酸。結(jié)果表明藥物是沒有受損的并為天然形式。實施例9微囊的噴霧干燥生長使人們能對該工藝的許多方面和微囊的最終特性進行控制。可以改變最終微囊的表面特性，以便將酶或受體的配體引入微囊殼中。在該實施例中，精氨酸殘基的數(shù)量增加，該增加的殘基數(shù)可用于結(jié)合TPA。用實施例1和5的方法，將聚-精氨酸加到噴霧干燥的原料中。利用實施例1中所描述的相同條件來生產(chǎn)微囊。微囊的平均大小為3.31±0.6um并且90％的微囊在2-5um。將含250ugTAP的溶液加到100mg微囊中。將該懸浮液攪拌2小時，然后除掉微囊并簡單地洗滌。通過在8M脲存在下，在20mMDTT中于37℃溫育30分鐘減少肽，用RP-HPLC測量在反應(yīng)溶液中剩余的TPA的濃度。使用10-40％乙腈-水的梯度液和0.1％TFA在60分鐘中分析片斷。使用血塊溶解測定來分析TPA-微囊中TPA的存在。通過合并纖維蛋白原、凝血酶和TPA微囊來產(chǎn)生纖維蛋白血塊。然后將纖維蛋白溶酶原加到血塊中并將玻璃珠加到表面以決定測定結(jié)束點，即血塊溶解。通過溶解血塊玻璃珠下降表明TPA與微囊結(jié)合并且TPA仍然是活性的。另外，使用改良的纖維測定來確定TPA與微囊結(jié)合的量。在微量滴定板的孔中，加入含有纖維蛋白原和凝血酶的稀瓊脂糖凝膠。在該凝膠中，加入20ul的TPA-微囊和纖維蛋白溶酶原懸浮液。30分鐘后，將板洗滌并使用微滴定板讀數(shù)計在340nm測定凝膠混濁度的減少。使用合適的TPA標(biāo)準(zhǔn)測定存在于微囊上的TPA濃度。結(jié)果顯示有15-20％的TPA與微囊結(jié)合。對于在血管造影時給藥，TPA微囊可用作儲存血栓溶解劑，類似于WO-A-9408627建議的作為儲存回聲對比劑，具有在心肌保持局部儲存TPA的優(yōu)點。表4天然白蛋白和微囊的氨基酸組成權(quán)利要求1.一種滅菌粉末，它含有交聯(lián)材料制成的光滑、球狀微粒，其直徑為0.1-50um，該微粒是親水性的并且能夠在水中重新配制而獲得單分散的懸浮液，并且它另外含有生理或診斷活性的、通過其上的游離功能基與微粒直接或間接相連的組分。2.權(quán)利要求1的粉末，其中該材料是氨基酸，聚氨基酸或其它多肽。3.權(quán)利要求1或2的粉末，它與促進酶生物降解的另一個水溶性材料混合。4.上述任一權(quán)利要求的粉末，其中活性組分為藥物、化學(xué)間隔物、酶或受體的配體、或抗體。5.上述任一權(quán)利要求的粉末，可通過下面方法，由水溶性的并且具有所述基團的所述材料獲得(i)噴霧干燥并交聯(lián)，使得所述基團以游離形式保留，和(ii)通過所述基團將活性成分與交聯(lián)材料相連接。6.權(quán)利要求5的粉末，其中步驟(i)包括噴霧干燥水溶性材料的溶液并且在低于4％的濕度下加熱干燥的材料來進行交聯(lián)。7.上述任一權(quán)利要求的粉末，其中功能基為氨基、羥基、羧基或巰基。8.權(quán)利要求7的粉末，其中功能基為氨基，羥基或羧基。9.上述任一權(quán)利要求的粉末，其中顆粒的四分位數(shù)間距與平均直徑的比為0.2-0.5。10.權(quán)利要求9的粉末，其中95％的顆粒小于6um，80％的顆粒在1-6um之內(nèi)。11.權(quán)利要求9的粉末，其中90％的顆粒小于20um，低于5％體積的顆粒小于6um。12.上述權(quán)利要求所定義的微粒懸浮液，適于胃腸道外給藥。13.權(quán)利要求12的懸浮液，其中權(quán)利要求10的顆粒用于靜脈給藥。14.權(quán)利要求12的懸浮液，其中權(quán)利要求11的顆粒用于動脈給藥。全文摘要一種滅菌粉末,它含有直徑為0.1—50um的微粒,可通過噴霧干燥和交聯(lián)具有游離功能基的水溶性材料來獲得,其特征在于微粒是水溶性的,可在水中重新配制而獲得單分散的懸浮液并保留所述可用于衍生的基團。將該顆粒與藥物或其它功能分子連接,并用作治療載體。文檔編號A61K9/16GK1175208SQ9519759公開日1998年3月4日申請日期1995年12月14日優(yōu)先權(quán)日1994年12月16日發(fā)明者A·D·蘇頓,R·A·約翰森申請人:安達里斯有限公司