專利名稱：純化的乳頭狀瘤病毒蛋白的制作方法
相關(guān)申請本申請是1994年11月14日申請的，現(xiàn)在未決的，美國系列編號(hào)為No.08/339 668的專利申請的部分延續(xù)申請。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及純化的重組乳頭狀瘤病毒(PV)蛋白，以及其制備，測定和制劑方法。
附圖簡要說明

圖1是用來表達(dá)乳頭狀瘤病毒L1和/或L2病毒衣殼蛋白的雙向酵母表達(dá)載體。
圖2是在酵母中表達(dá)的HPV 6aL1 VLPs的電子顯微圖。
圖3是在酵母中表達(dá)的HPV 6aL1/L2 VLPs的電子顯微圖。
圖4是啤酒糖酵母菌株1558構(gòu)建圖示。
圖5是啤酒糖酵母菌株1569構(gòu)建圖示。
圖6是純化過程的概要步驟。
圖7是菌株表。
圖8是從酵母中純化的HPV 16 L1+L2的一系列SDS-PAGE分析。除最終純化的VLP外還包括純化過程中間步驟的保留物。表提供了各泳道中樣品的鑒定。包括用膠體考馬斯藍(lán)的凝膠染色以及用L1和L2蛋白的抗血清的Western印跡。
圖9是另一種美洲產(chǎn)白尾棕色兔乳頭狀瘤病毒L1純化過程示意圖。
背景技術(shù)：
乳頭狀瘤病毒(PV)感染發(fā)生于多種動(dòng)物，包括人、綿羊、狗、貓、兔、猴、蛇和牛。乳頭狀瘤病毒感染上皮細(xì)胞，一般在感染部位引起良性上皮或纖維上皮腫瘤。PV是特異感染劑物種；人乳頭狀瘤病毒不能感染非人動(dòng)物。
乳頭狀瘤病毒可以以它們所感染的宿主為基礎(chǔ)分類為性質(zhì)不同的組。人乳頭狀瘤病毒(HPV)以DNA序列同源性為基礎(chǔ)進(jìn)一步分類為70多種類型。PV類型顯示為特異型免疫原，因?yàn)閷τ谟梢环N類型乳頭狀瘤病毒引起的感染的中和免疫性不使其具有抗另一種類型乳頭狀瘤病毒的免疫性。
在人體內(nèi)，不同HPV類型引起不同疾病HPV1、2、3、4、7、10和26-29型在正常的和免疫妥協(xié)個(gè)體體內(nèi)引起良性瘤(wart)。HPV5、8、9、12、14、15、17、19-25、36和46-50型在免疫妥協(xié)個(gè)體體內(nèi)引起淺度損害(flat lesion)。HPV6、11、34、39、41-44和51-55型引起生殖器或呼吸道粘膜非惡性濕疣。HPV16、18、31、33、35、45和58型引起生殖器粘膜上皮發(fā)育不良，并且與子宮頸、陰道、陰門和肛門管的多數(shù)原位及侵襲性癌相關(guān)。
乳頭狀瘤病毒是小的(50-60nm)，無被膜的，二十面體DNA病毒，其編碼至多8個(gè)早期基因和兩個(gè)晚期基因。病毒基因組的開放讀框(ORFs)以E1至E7和L1和L2表示，其中“E”表示早期和“L”表示晚期。L1和L2編碼病毒衣殼蛋白。早期(E)基因與例如病毒復(fù)制和細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能相關(guān)。
L1蛋白是主要的衣殼蛋白，分子量是55-60kDa。L2蛋白是少量衣殼蛋白，預(yù)計(jì)其分子量是55-60kDa，且根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳測定，其表觀分子量是75-100kDa。免疫學(xué)數(shù)據(jù)表明大多數(shù)L2蛋白對于L1蛋白是內(nèi)化的。L1 ORF在不同乳頭狀瘤病毒之間是高度保守的。L2蛋白在不同乳頭狀瘤病毒之間較少保守性。
L1和L2已被鑒定為用于免疫預(yù)防的良好靶物。一些早期基因也已被證明是開發(fā)疫苗的潛在的靶物。有關(guān)美洲產(chǎn)白尾棕色兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)和牛乳頭狀瘤病毒(BPV)系統(tǒng)的研究表明用細(xì)菌中表達(dá)的這些蛋白質(zhì)免疫或通過使用痘苗載體保護(hù)動(dòng)物免受病毒感染。乳頭狀瘤病毒L1基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)或使用痘苗載體集合產(chǎn)生病毒樣顆粒(VLP)，其已被用來誘導(dǎo)與保護(hù)而免受病毒攻擊相關(guān)的高滴定度病毒中和抗體應(yīng)答。而且L1和L2基因已被用來產(chǎn)生用于預(yù)防和治療動(dòng)物乳頭狀瘤病毒感染的疫苗。HPV 16型L1和L2基因已被克隆到痘苗載體中；所得載體用來感染CV-1哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以產(chǎn)生病毒樣顆粒(VLP)。
用于PV感染和疾病，包含L1蛋白，L1+L2蛋白，或修飾的L1或L1+L2蛋白的預(yù)防和治療疫苗的開發(fā)和商業(yè)化由于缺乏大量純化的病毒和純化的蛋白質(zhì)而受到阻礙。因?yàn)镻V不易體外培養(yǎng)，因此通過體外PV增殖難以生產(chǎn)所需量的L1和L2蛋白。引起的供應(yīng)問題使之難以表征PV和PV蛋白。因此開發(fā)一種粗PV蛋白，尤其是PVL1和L2蛋白或修飾的L1和L2蛋白的易再生源是有用的。開發(fā)將粗乳頭狀瘤病毒蛋白大量純化到適于免疫學(xué)研究和疫苗開發(fā)的純度水平的方法也是有用的。大量生產(chǎn)具有天然蛋白免疫給予(immunity-conferring)性質(zhì)，如天然蛋白構(gòu)象的乳頭狀瘤病毒蛋白也將是有用的。另外開發(fā)分析PV蛋白的方法和測定蛋白質(zhì)的相對純度以及含蛋白組合物的方法也將是有用的。如此高度純化的蛋白在制備各種用于PV感染研究的試劑中也是有用的；這些試劑包括但不限于多克隆抗體，單克隆抗體，和分析標(biāo)準(zhǔn)物。
本發(fā)明涉及高度純化的PV的L1和L2蛋白。本發(fā)明也涉及用于生產(chǎn)和純化具有天然乳頭狀瘤病毒蛋白的免疫給予(immunity-conferring)性質(zhì)的重組乳頭狀瘤病毒蛋白的方法。本發(fā)明涉及用于乳頭狀瘤病毒感染預(yù)防和治療疫苗的生產(chǎn)。本發(fā)明重組蛋白能生成病毒樣顆粒。這些VLP是免疫原性的，并且防止動(dòng)物模型中形成瘤。本發(fā)明以美洲產(chǎn)白尾棕色兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)，HPV 6型(6a亞型)和HPV 16型的重組的酵母產(chǎn)生的L1和L1+L2蛋白為模型系統(tǒng)進(jìn)行了例示。本發(fā)明純化和分析方法適用于其它HPV型，其它HPV蛋白和其它重組體表達(dá)系統(tǒng)。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及純化的乳頭狀瘤病毒(PV)重組蛋白以及其制備、測定、應(yīng)用和制劑方法。發(fā)明的詳述本發(fā)明涉及純化的乳頭狀瘤病毒(PV)重組蛋白以及其制備、測定、應(yīng)用和制劑方法。本發(fā)明以CRPV、HPV 6a和HPV 16重組的酵母衍生的蛋白質(zhì)進(jìn)行例示，但本發(fā)明不限于此。本發(fā)明各種實(shí)施方案包括但不限于重組HPV DNA分子，與重組HPV DNA分子互補(bǔ)的RNA，重組DNA分子編碼的蛋白質(zhì)，重組DNA分子和相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體，包含DNA，RNA，蛋白質(zhì)或抗體的組合物，使用DNA，RNA，蛋白質(zhì)或抗體以及其衍生物的方法。這些衍生物包括但不限于DNA編碼的肽和蛋白質(zhì)，DNA的抗體，或DNA編碼的蛋白質(zhì)的抗體，包含DNA的疫苗或者包含DNA編碼的蛋白質(zhì)的疫苗，包含DNA或DNA編碼蛋白的免疫學(xué)組合物，包含DNA或DNA衍生的RNA或DNA編碼蛋白的藥盒。
已產(chǎn)生出細(xì)菌衍生的重組牛乳頭狀瘤病毒L1和L2。重組細(xì)菌蛋白的中和血清與天然病毒以低水平交叉反應(yīng)，假設(shè)是由于天然和細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白之間的構(gòu)象不同。
表達(dá)HPV 16 L1或HPV 16 L2 ORFs的重組桿狀病毒已被用來感染昆蟲SF9細(xì)胞并產(chǎn)生L1和L2蛋白。Western印跡分析表明桿狀病毒衍生的L1和L2蛋白與抗HPV 16的抗體反應(yīng)。桿狀病毒衍生的L1形成VLPs。
已經(jīng)報(bào)道過用啤酒酵母的重組菌株生產(chǎn)粗HPV 16 L1和HPV 16 L2蛋白。重組蛋白作為細(xì)胞內(nèi)和分泌的產(chǎn)物生產(chǎn)。當(dāng)胞內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)主要蛋白質(zhì)當(dāng)細(xì)胞在不存在變性劑情況下裂解時(shí)是不可溶的。這些蛋白質(zhì)的純度未加報(bào)道。
酵母分泌的重組蛋白顯示含有酵母衍生的碳水化合物。這些N-鍵連的寡糖的存在可以掩蔽天然表位。另外，分泌的蛋白可以包含其它修飾，如分泌性前導(dǎo)序列的保留，分泌過程也可能是低效率的。
用于PV感染和疾病，包含L1蛋白，L1+L2蛋白，或修飾的L1或L1+L2蛋白的預(yù)防和治療疫苗的開發(fā)和商業(yè)化由于缺少大量純化的病毒和純化的蛋白而受到阻礙。因?yàn)镻V不容易體外培養(yǎng)，所以通過PV體外增殖難以生產(chǎn)所需量的L1和L2。與體外培養(yǎng)PV相關(guān)的困難導(dǎo)致了PV和PV蛋白化學(xué)，生物學(xué)和生理學(xué)表征方面的困難。因此開發(fā)一種粗PV蛋白，尤其是PVL1和L2蛋白或修飾的L1和L2蛋白的容易再生源是有用的。開發(fā)將粗乳頭狀瘤病毒蛋白大量純化到適于免疫學(xué)研究和疫苗開發(fā)的純度水平的方法也是有用的。大量生產(chǎn)具有天然蛋白免疫給予性質(zhì)，如天然蛋白構(gòu)象的乳頭狀瘤病毒蛋白也將是有用的。另外開發(fā)分析PV蛋白的方法和測定蛋白質(zhì)的相對純度以及含蛋白組合物的方法也將是有用的。如此高度純化的蛋白在制備各種用于PV感染研究的試劑中也是有用的；這些試劑包括但不限于多克隆抗體，單克隆抗體，和分析標(biāo)準(zhǔn)物。
包含DNA或DNA編碼蛋白的藥用組合物可以根據(jù)已知技術(shù)如通過與藥學(xué)可接受載體混合而配制。載體和配制方法的例子可以參見《Remington藥物科學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Science)。為制成適于有效給藥的藥學(xué)可接受組合物，這些組合物要含有有效量的所述蛋白或VLP。這些組合物可以含有從多于一種類型的HPV衍生出來的蛋白質(zhì)或VLP。
本發(fā)明治療或診斷組合物以足以治療或診斷PV感染的量給與個(gè)體。有效量根據(jù)多種因素而不同，如個(gè)體的癥狀、體重、性別和年齡。其它因素包括給藥方式，一般情況下，以大約1mcg至大約1mg劑量范圍給與本發(fā)明組合物。
本發(fā)明藥物組合物可以通過多種途徑提供給個(gè)體，如皮下，局部，口服，粘膜，靜脈內(nèi)和肌內(nèi)給藥。
本發(fā)明疫苗包含DNA，RNA或DNA編碼蛋白，其含有在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)中和抗體生成所必需的抗原決定簇。這些疫苗有足夠的安全性，給與時(shí)不會(huì)有臨床感染的危險(xiǎn)；沒有毒付作用；可以通過有效途徑給與；穩(wěn)定；并且與疫苗載體相容。
可以通過多種途徑給與疫苗，如口服，腸胃外，皮下，粘膜，靜脈內(nèi)或肌內(nèi)。給與劑量根據(jù)個(gè)體癥狀，性別，體重和年齡，給藥途徑；和疫苗的PV類型而不同。疫苗可以以如膠囊，懸浮劑，酏劑或液體溶液的劑量形式使用。本發(fā)明疫苗可以與免疫學(xué)可接受載體一起配制。
以治療有效量，即足以產(chǎn)生免疫保護(hù)應(yīng)答的量給與疫苗。治療有效量可以根據(jù)PV類型不同而不同?？梢砸詥蝿┗蚨鄤┙o與疫苗。
本發(fā)明純化的蛋白質(zhì)可以用于免疫原性組合物制劑。當(dāng)引入到合適的宿主時(shí)這些組合物能在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
本發(fā)明純化的蛋白質(zhì)或其衍生物可以用來產(chǎn)生抗體。這里使用的術(shù)語“抗體”包括多克隆和單克隆抗體兩者，以及其能結(jié)合抗原或半抗原的片段，如Fv，F(xiàn)ab和F(ab)2本發(fā)明蛋白和蛋白衍生物可以用于血清型HPV感染和HPV篩選。純化的蛋白質(zhì)，VLP和抗體使其自身配制成HPV檢測和血清型鑒定的藥盒。這樣一種藥盒包含一種適于在至少一個(gè)容器中密封保持的隔室化載體。該載體可以進(jìn)一步包含適于檢測各種HPV類型的試劑，如重組HPV 6a L1或L2蛋白或VLP或抗HPV 6a抗體或重組HPV 16 L1或L2蛋白或VLP或HPV 16抗體。該載體也可以包含檢測方法如標(biāo)記的抗原或酶底物等等。
純化的蛋白質(zhì)也用作免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物，分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物。
因?yàn)榛蛎艽a是簡并的，可以用多于一種的密碼子來編碼特定的氨基酸，因此氨基酸序列可以被任何一套相似DNA寡核苷酸編碼。只有一套將是與HPV 6a或HPV 16序列相同的，但即使存在在合適的條件下失配的DNA寡核苷酸的情況下也能與HPV 6a或HPV 16 DNA雜交。在改變的條件下，失配的DNA寡核苷酸仍可以與HPV 6a或HPV 16 DNA雜交，以允許鑒定和分離HPV 6a或HPV 16編碼DNA。
本發(fā)明純化的HPV 6a或HPV 16 DNA或其片段可以用來分離和純化其它來源的同系物和HPV 6a片段。為此，在合適的雜交條件下將第一種HPV 6a DNA與含有編碼HPV 6a同系物的DNA的樣品混合?？梢苑蛛x雜交的DNA復(fù)合體，并且可以從中純化編碼同源DNA的DNA。
已知在各種編碼特異氨基酸的密碼子中存在大量冗余。因此本發(fā)明也涉及那些包含改變的編碼相同氨基酸最后的翻譯的密碼子的DNA序列。為此說明書的目的，具有一個(gè)或幾個(gè)取代密碼子的序列定義為簡并變異。本發(fā)明范圍也包括DNA序列或翻譯的蛋白質(zhì)基本上不改變被表達(dá)蛋白的最終物理性質(zhì)的突變。例如，用纈氨酸取代亮氨酸，精氨酸取代賴氨酸，或者天冬酰胺取代谷氨酰胺可以不引起多肽的功能變化。
已知編碼一種肽的DNA序列可以改變，以編碼與那些天然存在的肽不同性質(zhì)的肽。改變DNA序列的方法包括但不限于定點(diǎn)誘變。
這里所使用的HPV 6a的“功能衍生物”是具有基本上與HPV 6a生物活性相似的生物活性(功能上的或是結(jié)構(gòu)上的)的化合物。術(shù)語“功能衍生物”試圖包括HPV 6a的“片段”，“變體”，“簡并變體”，“類似物”，“同系物”或“化學(xué)衍生物”。術(shù)語“片段”指HPV 6a的任何多肽亞組。術(shù)語“變體”指結(jié)構(gòu)和功能與整個(gè)HPV 6a分子或與其片段基本上相同的分子。如果兩個(gè)分子具有基本上相同的結(jié)構(gòu)，或者兩個(gè)分子具有相同的生物活性，則是一個(gè)分子與HPV 6a“基本上相同”。因此，如果兩個(gè)分子具有基本上相同的活性，則即使其中一個(gè)分子的結(jié)構(gòu)并沒有在另一個(gè)分子中發(fā)現(xiàn)，或者即使兩個(gè)氨基酸序列是不相同的，這兩個(gè)分子也被認(rèn)為是變體。術(shù)語“功能衍生物”不包括HPV 6b。
術(shù)語“類似物”指一個(gè)分子其功能與整個(gè)HPV 6a分子或與其片段基本上相同。
可以用本領(lǐng)域已知的多種方法來分子克隆HPV 6a DNA。這些方法包括但不限于在構(gòu)建包含HPV 6a的cDNA或基因組DNA庫之后在合適的表達(dá)載體系統(tǒng)中直接功能化表達(dá)HPV 6a基因。另一種方法是篩選用自HPV 6a氨基酸序列設(shè)計(jì)的標(biāo)記的寡核苷酸探針在噬菌體或質(zhì)粒穿梭載體中構(gòu)建的包含HPV 6a的cDNA或基因組DNA庫。另外一個(gè)方法包括用編碼HPV 6a的部分DNA篩選在噬菌體或質(zhì)粒穿梭載體中構(gòu)建的包含HPV 6a的cDNA或基因組DNA庫。所述部分DNA是通過由純化的HPV6a的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡并的寡核苷酸引物而進(jìn)行HPV 6a DNA片段的特異聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增而獲得的。另一種方法是從生產(chǎn)HPV 6a的細(xì)胞中分離RNA，并通過體外或體內(nèi)翻譯系統(tǒng)將RNA翻譯成蛋白質(zhì)，將RNA翻譯成肽或蛋白質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)至少一部分HPV 6a蛋白質(zhì)，其可以用例如HPV 6a蛋白活性或用抗HPV 6a抗體免疫學(xué)活性而鑒定。在該方法中，由生產(chǎn)HPV 6a的細(xì)胞中分離的RNA樣品可被分析編碼至少一部分HPV 6a的RNA的存在。可以對RNA樣品的進(jìn)一步級(jí)分以從非HPV6a RNA中純化HPV 6a RNA?？梢苑治鲇迷摲椒ㄉa(chǎn)的肽或蛋白以提供氨基酸序列，這些氨基酸序列接著用來提供生產(chǎn)HPV 6a cDNA的引物，或者可以分析用于翻譯的RNA以提供編碼HPV 6a的核苷酸序列，并產(chǎn)生用于篩選HPV 6a cDNA文庫的探針。這些方法是本領(lǐng)域公知的，并且公開于例如，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，CddSpring Harbor Laboratory Press，Cold Sping Harbor，NY.1989。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，其它類型文庫，以及從其它細(xì)胞或細(xì)胞型構(gòu)建的文庫可以用來分離HPV 6a編碼DNA這一點(diǎn)是顯而易見的。其它類型文庫包括但不限于從其它包含HPV 6a型的細(xì)胞和細(xì)胞系中衍生的cDNA文庫和基因組DNA文庫。
制備cDNA文庫可以通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)而進(jìn)行。cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)可以參見例如Sambrook，J.，等，上文。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說也可以從合適的基因組DNA文庫中分離編碼HPV 6a的DNA這一點(diǎn)是顯而易見的。構(gòu)建基因組DNA文庫可以用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。基因組DNA文庫構(gòu)建技術(shù)可以參見上文Sambrook，J.，等人的文獻(xiàn)。
通過本說明書描述的方法獲得的克隆HPV 6a DNA或其片段可以通過將分子克隆到包含合適的啟動(dòng)子和其它合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體中而重組表達(dá)，并轉(zhuǎn)移到原核或真核宿主細(xì)胞中生產(chǎn)重組HPV 6a。這些操作技術(shù)全部公開于上文Sambrook，J.，等的文獻(xiàn)中，是本領(lǐng)域公知的。
表達(dá)載體在本說明書中定義為在合適的宿主中轉(zhuǎn)錄基因的克隆拷貝和翻譯它們的mRNA所需要的DNA序列。這些載體可用來在各種宿主中，如細(xì)菌、藍(lán)綠藻、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞，表達(dá)真核生物基因。具體設(shè)計(jì)的載體使DNA穿梭于宿主之間，如細(xì)菌-酵母或細(xì)菌-動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌-真菌細(xì)胞或細(xì)菌-無脊椎動(dòng)物細(xì)胞。合適地構(gòu)建的表達(dá)載體包含宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)，選擇性標(biāo)記，一定數(shù)目的有用的限制性酶切位點(diǎn)，高拷貝數(shù)的能力，和活性啟動(dòng)子。一個(gè)啟動(dòng)子定義為引導(dǎo)DNA聚合酶結(jié)合DNA并引發(fā)RNA合成的一個(gè)DNA序列。強(qiáng)的啟動(dòng)子是以高頻率引發(fā)mRNA的啟動(dòng)子。表達(dá)載體可以包括但不限于克隆載體，修飾的克隆載體，具體設(shè)計(jì)的質(zhì)?；虿《?。
各種哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以用來在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)HPV 6a DNA或其片段。適于重組HPV 6a表達(dá)的商售哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括但不限于pcDNA3(Invitrogen)，pMClneo(Stratagene)，pXT1(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC 37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC37224)，pRSVgpt(ATCC 37199)，pRSVneo(ATCC 37198)，pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)，和λZD35(ATCC 37565)。
各種細(xì)菌表達(dá)載體可以用來在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)HPV 6a DNA或其片段。適于重組HPV 6a表達(dá)的商售細(xì)菌表達(dá)載體包括但不限于pET 11a(Novagen)，λgt11(InVitrogen)，pcDNAII(InVitrogen)，pKK223-3(Pharmacia)。
各種真菌細(xì)胞表達(dá)載體可以用來在真菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)HPV 6a或其片段。適于重組HPV 6a表達(dá)的商售真菌細(xì)胞表達(dá)載體包括但不限于pYES2(Invitrogen)，畢赤酵母表達(dá)載體(Invitrogen)。
各種昆蟲表達(dá)載體可以用來在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)HPV 6a DNA或其片段。適于重組HPV 6a表達(dá)的商售昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體包括但不限于pBlue BacIII(InVitrogen)。
包含編碼HPV 6a或其片段的DNA的表達(dá)載體可以用來在細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)HPV 6a蛋白或HPV 6a蛋白片段。這里使用的動(dòng)物包括人。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括但不限于細(xì)菌，如大腸桿菌，真菌細(xì)胞如酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括但不限于人、牛、豬、猴和嚙齒動(dòng)物源的細(xì)胞系，和昆蟲細(xì)胞系，包括但不限于果蠅和蠶衍生的細(xì)胞系。合適的并可商購的由哺乳動(dòng)物物種衍生的細(xì)胞系包括但不限于L細(xì)胞L-M(TK-)(ATCC 1.3)，L細(xì)胞L-M(ATCCCCL 1.2)，293(ATCC CRL 1573)，Raji(ATCC CCL 86)，CV1(ATCC CCL 70)，COS-1(ATCC CRL 1650)，COS-7(ATCC CRL 1651)，CHO-K1(ATCC CCL 61)，3T3(ATCC CCL 92)，NIH/3T3(ATCC CRL 1658)，Hela(ATCC CCL 2)，C1271(ATCC CRL 1616)，BS-C-1(ATCC CCL 26)和MRC-5(ATCC CCL 171)。
表達(dá)載體可以通過任何一項(xiàng)技術(shù)引入到宿主細(xì)胞中，包括但不限于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(lipofection)，原生質(zhì)體融合，和電穿孔。這些包含表達(dá)載體的細(xì)胞被克隆繁殖并各個(gè)分析以測定它們是否產(chǎn)生HPV 6a蛋白。HPV 6a表達(dá)宿主細(xì)胞的克隆的鑒定可以通過幾種方法進(jìn)行，包括但不限于與抗-HPV 6a抗體的免疫學(xué)反應(yīng)，和宿主細(xì)胞相關(guān)的HPV 6a活性的存在，如HPV 6a特異配體結(jié)合，或定義為HPV 6a特異配體在HPV 6a的相互作用介導(dǎo)的應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
HPV DNA片段的表達(dá)也可以用體外合成制備的mRNA或天然mRNA來進(jìn)行。合成的mRNA或從產(chǎn)生HPV 6a的細(xì)胞中分離的mRNA可以在多種無細(xì)胞體系內(nèi)有效翻譯，所述系統(tǒng)包括但不限于麥胚提取物和網(wǎng)織細(xì)胞提取物，以及在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的系統(tǒng)中有效翻譯，包括但不限于微注射到蛙卵母細(xì)胞中，優(yōu)選微注射到蛙卵母細(xì)胞中。
HPV 6a蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)以后，可以回收HPV 6a蛋白以提供純化形式的HPV 6a?？梢垣@得幾種HPV 6a的純化方法并適于應(yīng)用。正如本說明書所描述的，重組HPV 6a蛋白可以從細(xì)胞裂解物中純化，并通過鹽分級(jí)分離，離子交換層析，大小排阻層析，羥基磷灰石吸附層析和疏水作用層析單獨(dú)應(yīng)用或各種組合來提取。
另外，重組HPV 6a可以從其它細(xì)胞蛋白中通過使用用特異于全長新生HPV 6a或HPV 6a多肽片段的單克隆或多克隆抗體制備的免疫親和柱來分離。
多克隆和單克隆抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域多種方法來制備。這里所使用的單克隆或單特異性抗體定義為單一抗體種類或具有HPV 6a同源結(jié)合特征的多抗體種類。這里所說的同源結(jié)合指抗體種類結(jié)合一個(gè)特異抗原或表位的能力。
可以使用生產(chǎn)單特異性抗體的方法來制備對HPV多肽片段或全長新生HPV多肽有特異性的抗體，這一點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。具體地說，可以產(chǎn)生對全部功能HPV蛋白或其片段有特異性的單特異性抗體這一點(diǎn)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明也涉及篩選體內(nèi)調(diào)控DNA表達(dá)或RNA編碼HPV以及HPV 6a蛋白功能的化合物的方法。調(diào)控這些活性的化合物可以是DNA，RNA，肽，蛋白質(zhì)或非蛋白類有機(jī)分子?；衔锟梢酝ㄟ^增強(qiáng)或減弱DNA，或編碼HPV 6a RNA的表達(dá)，或HPV 6a蛋白的功能而進(jìn)行調(diào)控。調(diào)控DNA表達(dá)，或RNA編碼HPV 6a或HPV 6a蛋白功能的化合物可以通過各種檢驗(yàn)而測定。檢驗(yàn)可以簡單的“是/不是”檢測來測定表達(dá)或功能是否有變化。檢測可以通過將試驗(yàn)樣品的表達(dá)或功能與標(biāo)準(zhǔn)樣品的表達(dá)或功能的水平相比較而定量進(jìn)行。
可以制備包含HPV 6a DNA，HPV 6a DNA片段，抗HPV 6a DNA或HPV 6a蛋白的抗體，HPV 6a RNA或HPV 6a蛋白的藥盒。這種藥盒可用來檢測與HPV 6a DNA雜交的DNA，或檢測樣品中HPV 6a蛋白或肽片段的存在。這一特征對于多種目的是有用的，包括但不限于法醫(yī)分析和流行病學(xué)研究。
可以合成與HPV 6a編碼DNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列以用于反義治療。這些反義分子可以是DNA，DNA穩(wěn)定的衍生物，如硫代磷酸酯或甲基膦酸酯，RNA，RNA的穩(wěn)定衍生物，如2′-O-烷基RNA，或其它HPV 6a反義寡核苷酸擬態(tài)物。HPV 6a反義分子可以通過微注射，脂質(zhì)體包被作用，或通過從載有反義序列的載體中表達(dá)而引入細(xì)胞中。HPV 6a反義療法可能特別適用于治療其中降低HPV 6a活性是有益的那些疾病。
術(shù)語“化學(xué)衍生物”指包含另外的通常不是基礎(chǔ)分子的一部分的化學(xué)部分的分子。這些部分可以改善基礎(chǔ)分子的溶解性，半壽期，吸收性等?；蛘哌@些部分可以減弱基礎(chǔ)分子的副作用或者降低基礎(chǔ)分子的毒性。這些部分的例子在多種文獻(xiàn)中有所描述，例如《Remington’s藥物科學(xué)》。
可以以合適的劑量單獨(dú)使用根據(jù)本文所公開的方法鑒定的化合物，所述合適的劑量通過常規(guī)試驗(yàn)確定以獲得HPV 6a或其活性的最佳抑制使用，同時(shí)減少任何潛在的毒性。另外與其它藥劑一起給藥或順序給藥也是所希望的。
有利的是，本發(fā)明化合物可以以每日單劑給藥，或者每日總劑量可以分成幾次劑量給藥。而且，本發(fā)明化合物可以通過多種途徑給藥，包括但不限于鼻內(nèi)，經(jīng)皮，通過栓劑，口服等給藥。
對于使用多于一種的活性試劑的結(jié)合治療，其中活性試劑以不同制劑形式存在，活性試劑可以同期給藥，或者每種藥劑可以以不同交錯(cuò)時(shí)間給藥。
使用本發(fā)明化合物的劑量用法根據(jù)多種因素選擇，包括患者的類型，種類，年齡，體重，性別和醫(yī)療條件；所要治療的疾病的嚴(yán)重程度；給藥途徑；患者的肝腎功能；所使用的其具體化合物。普通醫(yī)生容易確定和對防止，阻擾或停止病狀進(jìn)展所需藥物的有效量開處方。在獲得藥效力而又沒有毒性的范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)藥物濃度的最佳精確度需要以藥物適于靶位點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)的給藥法，包括考慮藥物的分布，平衡和減少。
本發(fā)明方法中，詳細(xì)描述的化合物可以形成活性成分，而且一般情況下以與根據(jù)所要給藥的形式而適當(dāng)選取的合適的藥物稀釋劑、賦形劑或載體(本說明書中稱為“載體”物質(zhì))的混合物的形式給藥，并且結(jié)合常規(guī)制藥實(shí)踐。所述給藥形式是口服片劑、膠囊、酏劑、糖漿、栓劑、凝膠體等。
例如，對于以片劑或膠囊形式口服給藥，活性藥物成分可以與口服非毒性藥物可接受惰性載體如乙醇、甘油、水等相混合。而且，如果期望或需要，也可以向混合物中摻入合適的結(jié)合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑。合適的結(jié)合劑包括但不限于淀粉、明膠、天然的糖如蔗糖、或β-乳糖、玉米甜劑，天然或合成的膠如金合歡、西黃蓍膠或藻酸鈉、羧甲基素、聚乙二醇、蠟或類似物。這些劑量形式中使用的潤滑劑包括但不限于油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等等。崩解劑包括但不限于淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等等。
對于液體形式，活性藥物成分可以適當(dāng)?shù)鼗旌嫌谡{(diào)味懸浮劑或分散劑中，如合成的或天然膠，例如西黃蓍膠、金合歡、甲基纖維素等。其它可以使用的分散劑包括甘油等。對于腸胃外給藥，需要滅菌的懸浮液如溶液。當(dāng)需要靜脈內(nèi)給藥時(shí)要使用一般含有合適防腐劑的等張制劑。
含有活性藥物成分的局部制劑可以與多種本領(lǐng)域公知的載體材料混合，例如醇、蘆薈凝膠、尿囊素、甘油、維生素A和E油、礦物油、PPG2丙酸肉豆蔻酯等，生成例如醇溶液、局部清潔劑、清潔霜、皮膚凝膠、皮膚洗劑，和乳膏或凝膠制劑中的洗發(fā)劑。
本發(fā)明化合物也可以以脂質(zhì)體運(yùn)送系統(tǒng)的形式給藥，例如小單層囊泡，大單層囊泡和多層囊泡。脂質(zhì)體可以由各種磷脂，如膽甾醇、硬脂基胺或卵磷脂生成。
本發(fā)明化合物也可以通過使用單克隆抗體作為化合物分子與之偶聯(lián)的各載體來運(yùn)送。本發(fā)明化合物也可以與作為靶向性藥物載體的可溶聚合物偶聯(lián)，這樣的聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥基丙基異丁烯?；?酰胺苯酚、聚羥乙基天冬酰胺苯酚、或被十六烷酰殘基取代的聚環(huán)氧乙烷聚賴氨酸。而且，本發(fā)明化合物可以與一類用于實(shí)現(xiàn)藥物緩釋中的生物可降解聚合物偶聯(lián)，所述聚合物是例如聚乳酸、聚ε己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯，和水凝膠交聯(lián)或兩親性共聚物。
下面實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1制備酵母菌株U9從Leland Hartwell博士(華盛頓大學(xué)，Seattle，WA)處得到啤酒酵母菌株2150-2-3(MA Talpha，Leu 2-04，adel，cri°)。菌株2150-2-3細(xì)胞在30℃在5mL YEHD培養(yǎng)基(Carty等，J.IndMicro 2(1987)117-121)中繁殖過夜。細(xì)胞用無菌蒸餾水沖洗3次，再懸浮于2mL無菌蒸餾水中，0.1mL細(xì)胞懸液鋪到六個(gè)5-氟-乳清酸(FOA)板的每一板上，以挑選ura3突變株(Cold Spring HarborLaboratory Manual for Yeast Genetics)。平板在30℃孵育。每250mL蒸餾水所含的培養(yǎng)基3.5g，沒有氨基酸和硫酸銨鹽的DifcoYeast Nitrogen Base；0.5g，5-氟-乳清酸；25mg尿嘧啶；和10.0g葡萄糖。
通過0.2μm膜過濾將培養(yǎng)基滅菌，然后與保持50℃的250mL 5％Bacto-Agar(Difco)，10mL 1.2mg/mL腺嘌呤溶液，和5mL L-亮氨酸溶液(180mg/50mL)混合。所得培養(yǎng)基以每個(gè)培養(yǎng)皿20mL分配。
培養(yǎng)5天后，出現(xiàn)多個(gè)菌落，通過將菌落再劃線而將單一菌落從最初的FOA板分離到新鮮的FOA板，然后在30℃培養(yǎng)。來自第二批FOA板的幾個(gè)菌落通過復(fù)制平板置于YEHD平板和減少尿嘧啶的平板兩個(gè)平板上而測定ura 3突變株的存在。所期結(jié)果是在YEHD板上生長良好，而在無尿嘧啶的培養(yǎng)基中不生長。得到了一個(gè)分離物(U9)，其顯示了這些性質(zhì)。其以冷凍的甘油貯備液在-70℃下貯存(菌株#325)備用。實(shí)施例2制備用于斷裂酵母MNN9基因的載體為了制備用于斷裂酵母MNN9基因的載體，需要首先從啤酒酵母基因組DNA中克隆MNN9基因。這通過標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行。以公開的酵母MNN9基因的序列(Zymogenetica歐洲專利申請No.88117834.7，公開號(hào)No.0-314-096-A2)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)用于全長MNN9編碼序列PCR的5′正義引物和3′反義引物。使用了下面的含有旁側(cè)Hind III位點(diǎn)(下劃線)的寡脫氧核苷酸引物正義引物5′-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3′反義引物5′-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3′MNN9基因的初始蛋白酶密碼子是粗印體中的強(qiáng)調(diào)部分。使用來自啤酒酵母菌株JRY 188(Rine等)的基因組DNA為模板，使用TaqDNA聚合醚(Perkin Elmer)，并進(jìn)行25個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(94℃1分鐘，37℃2分鐘，72℃3分鐘)，來進(jìn)行PCR。所得的1.2kbp PCR片段用Hind III消化，凝膠純化，并與Hind III消化的堿性磷酸酶處理的pUC13(Pharmacia)連接。所得質(zhì)粒以p1183表示。
為了用酵母URA3基因斷裂MNN9基因，質(zhì)粒pBR322-URA3(其包含亞克隆到pBR322 Hind III位點(diǎn)的1.1kbp Hind III片段編碼S.cerevisiae URA3基因)用Hind III消化，并且具有功能URA3基因的1.1kbp DNA片段被凝膠純化，用T4 DNA聚合酶平整末端，然后與PmII消化的質(zhì)粒p1183(在MNN9編碼序列內(nèi)PmII切割)連接。所得質(zhì)粒中p1199包含被功能URA3基因分裂的MNN9基因。實(shí)施例3構(gòu)建包含MNN9基因斷裂的U9-衍生的菌株1372為斷裂菌株U9(#325)中的MNN9基因，用Hind III消化30μg質(zhì)粒p1199，產(chǎn)生線性mnn9∷URA3斷裂盒(cassette)。菌株325細(xì)胞用原生質(zhì)球方法(Hinnen等，1978，《美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，751929-1933)用Hind III消化過的p1199DNA轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在沒有尿嘧啶但含有1.0M山梨糖醇的合成瓊脂培養(yǎng)基上挑選。合成培養(yǎng)基每升蒸餾水含有瓊脂，20g；酵母氮堿(Yeastnitrogen base)和/或氨基酸，6.7g；腺嘌呤，0.04g；L-酪氨酸，0.05g；山梨糖醇，182g；葡萄糖，20g；和減少亮氨酸的溶液#2，10ml。減少亮氨酸的溶液#2每升蒸餾水含有L-精氨酸，2g；L-組氨酸，1g；L-亮氨酸，6g；L-異亮氨酸，6g；L-賴氨酸，4g；L-蛋白酶，1g；L-苯丙氨酸，6g；L-蘇氨酸，6g；L-色氨酸，4g。
平板在30℃孵育5天，此時(shí)出現(xiàn)一些菌落。從10個(gè)菌落中制得染色體DNA制劑，然后用EcoRI加Hind III消化。然后用具有MNN9基因(自質(zhì)粒p1199分離的)的1.2kbp Hind III片段為探針，通過Southern印跡(J.Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbro Labroatory出版社，1989)評價(jià)DNA消化產(chǎn)物。鑒定了一個(gè)分離物(菌株#1372)，其顯示了Southern印跡上所期望的DNA帶位移以及mnn9突變體典型顯示的極端聚集。實(shí)施例4構(gòu)建用于酵母HIS3基因斷裂的載體為了構(gòu)建其中啤酒酵母HIS3基因被URA3基因斷裂的斷裂盒，質(zhì)粒YEP6(K.Strubl等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761035)用BamHI消化，具有HIS3基因的1.7kbp BamHI片段被凝膠純化，用T4DNA聚合酶平整末端，并與事先已用BamHI消化并用T4 DNA聚合酶處理的pUC 18連接。所得質(zhì)粒(以p1501或pUC 18-HIS3表示)用NheI(其在HIS3編碼序列中切割)消化，載體片段被凝膠純化，用T4DNA聚合酶平整末端，然后用牛腸堿性磷酸酶處理。通過用Hind III消化從質(zhì)粒pBR322-URA3中分離URA3基因，具有URA3基因的1.1kbp片段被凝膠純化，并用T4 DNA聚合酶平整末端，并與上述pUC 18-HIS3 NheI片段連接。所得質(zhì)粒(指定為pUC 18-his3∷URA3或p1505)包含其中酵母HIS3基因被功能URA3基因斷裂的斷裂盒。實(shí)施例5構(gòu)建用于通過HIS3基因斷裂酵母PRB1基因的載體具有啤酒酵母PRB1基因的質(zhì)粒FP8ΔH由Carneyie-Mellon大學(xué)的E.Jones博士提供(C.M.Moehle等，1987，《遺傳學(xué)》(Genetics)115∶255-263)。其用Hind III加XhoI消化，具有PRB1基因的3.2kbpDNA片段被凝膠純化，并通過用T4 DNA聚合酶處理平整末端。質(zhì)粒pUC 18用BamHI消化，凝膠純化，并通過用T4 DNA聚合酶處理平整末端。所得載體片段與上述PRB1基因片段連接，得到質(zhì)粒pUC 18-PRB1。包含HIS3基因的質(zhì)粒YEp6用BamHI消化。所得具有功能HIS3基因的1.7kbp BamHI片段被凝膠純化，然后通過用T4 DNA聚合酶處理平整末端。質(zhì)粒pUC18-PRB1用EcoRV加在PRB1編碼序列中切割的NcoI消化，并去除蛋白酶B活性位點(diǎn)的旁側(cè)序列。具有pUC 18中PRB1編碼序列的殘基5′和3′一部分的5.7kbp EcoRV-NcoI片段被凝膠純化，通過用T4 DNA聚合酶處理平整末端，用牛腸堿性磷酸酶脫磷酸化，并與上述末端整平的HIS3連接。所得質(zhì)粒(指定為pUC 18-prb1 ::HIS3，原種#1245)在已被如上缺失的PRB1基因部位的位置包含功能HIS3基因。實(shí)施例6構(gòu)建包含MNN9和PRB1基因兩者斷裂的U9相關(guān)的酵母菌株包含MNN9基因斷裂的U9相關(guān)菌株1372在實(shí)施例3中已描述過。菌株1372的克隆分離物在FOA板(如實(shí)施例1所述)上傳代，以選擇ura3突變體。得到了幾種菌株1372的ura3分離物，并且一特別分離(菌株12930-190-S1-1)被挑選用于下面的HIS3基因斷裂。pUC 18-his3∷URA3基因斷裂載體(p1505)用XbaI加EcoRI消化，產(chǎn)生線性his3∷URA3斷裂盒，并用于通過乙酸鋰方法(《酶學(xué)方法)》Meehodsin Enzymology，194290(1991))的菌株12930-190-S1-1的轉(zhuǎn)化。在沒有尿嘧啶的合成瓊脂培養(yǎng)基上挑選Ura+轉(zhuǎn)化物，在相同培養(yǎng)基上對克隆分離物再劃線，然后復(fù)制平板置于沒有尿嘧啶或者沒有組氨酸的培養(yǎng)基上以篩選哪些既是Ura+又是His-的分離物。挑選一個(gè)分離物(菌株12930-230-1)用于下面的PRB1基因的斷裂。PRB1基因斷裂載體(pUC 18-prb1∷HIS3，原種#1245)用SacI加XbaI消化，產(chǎn)生線性prb1∷HIS3斷裂盒，并用于通過乙酸鋰方法轉(zhuǎn)化菌株12930-230-1。在沒有組氨酸的瓊脂培養(yǎng)基上挑選His+轉(zhuǎn)化物，在相同培養(yǎng)基上對克隆分離物重新劃線。從幾種所得His+分離物制備基因組DNA，用EcoRI消化，然后在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳。然后用通過PCR使用下面寡脫氧核苷酸引物已經(jīng)制備的PRB1基因的放射標(biāo)記617bp探針進(jìn)行Southern印跡分析
5′TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3′5′CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3′獲得11種分離物，其顯示所期望的探針與2.44kbp prb1∷HIS3DNA片段的雜交作用。這與該探針與野生型PRB1基因1.59kbp片段的雜交作用相矛盾。挑選這些包含所述prb1∷HIS3分裂的分離物中的一個(gè)用于進(jìn)一步的應(yīng)用并指定為菌株#1558。實(shí)施例7構(gòu)建用于酵母PEP4基因斷裂的載體用下面的方法從酵母基因組庫中克隆啤酒酵母PEP4基因。包含酵母基因組庫pLS 101(Schultz和Friesen，1983，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)1558-14)的大腸桿菌細(xì)胞在5mL含有100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中繁殖過夜。從該培養(yǎng)物中10-4和10-5稀釋物被鋪于LB加氨芐青霉素的平板上。使用硝基纖維素濾紙制備菌落平板lift。通過PCR技術(shù)，使用Taq DNA聚合酶，制備對于酵母PEP4基因的探針，來自pLS 101酵母庫的全部質(zhì)粒DNA，接著以公開的PEP4的DNA序列(C.A.，Woolford等，《分子細(xì)胞生物學(xué)》(Mol.Cell.Biol.)62500(1986))為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)寡脫氧核苷酸引物。有義引物5′-GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC-3′反義引物5′-GGC GAG TGG GCC AAC AGG TTC-3′用25次循環(huán)擴(kuò)增(94℃1分鐘，37℃2分鐘，72℃3分鐘)進(jìn)行PCR。PCR探針被凝膠純化，放射標(biāo)記，并與上述菌落濾紙雜交。幾個(gè)菌落對與PEP4探針的雜交呈陽性，對于單一菌落在LB加氨芐青霉素平板上劃線。質(zhì)粒DNA通過堿性-SDS裂解(Sambrook等，上文)人幾種分離物中制備，并用BamHI消化。發(fā)現(xiàn)所期望的14kbp載體帶和6.9kbp PEP4插入帶。用EcoRI加XhoI進(jìn)行兩次消化，發(fā)現(xiàn)所期望的PEP4的1.5kbp帶。挑選顯示出所期望結(jié)果的一個(gè)分離物(大腸桿菌菌株#860)用于進(jìn)一步的應(yīng)用。來自菌株#860的質(zhì)粒DNA用BamHI消化，攜帶染色體PEP4基因的6.9kbp BamHI DNA片段克亞隆到pUC 13的BamHI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒p890。然后質(zhì)粒p890用NcoI(在PEP4編碼序列中切割)消化，凝膠純化，通過用T4 DNA聚合酶處理平整末端，與具有功能URA3基因的1.1kbp末端已平整的片段(如實(shí)施例2所制備)連接，所得的包含被URA3基因分裂的PEP4基因的質(zhì)粒指定為pUC 13-pep4∷URA3(菌株#906)。實(shí)施例8構(gòu)建酵母菌株#1569，#1538和#1592，它們是包含prb1和pep4突變型兩者的菌株U9的衍生物為了斷裂菌株U9中的HIS3基因，用EcoHI加XbaI消化斷裂載體pUC 18-his3∷URA3，然后用來通過乙酸鋰方法轉(zhuǎn)化菌株U9。在沒有尿嘧啶的瓊脂培養(yǎng)基上挑選Ura+轉(zhuǎn)化物，并對于克隆分離物在相同培養(yǎng)上劃線。然后幾種所得Ura+分離物復(fù)制平板置于沒有尿嘧啶或組氨酸的瓊脂培養(yǎng)基上，并篩選即Ura+又His-的那些。挑選一個(gè)分離物(菌株#1524)用于下面的PRB1斷裂。PRB1斷裂載體pUC 18-prb1∷HIS3用SacI加XbaI消化后用于通過乙酸鋰方法對菌株#1524的轉(zhuǎn)化。在沒有組氨酸的瓊脂培養(yǎng)上挑選His+轉(zhuǎn)化物，并對于克隆分離物在相同培養(yǎng)基上劃線。由一些His+分離物制備基因組DNA，通過與放射標(biāo)記的PRB1探針的Southern印跡雜交進(jìn)行評價(jià)。挑選顯示出所期望的PRB1基因被HIS3斷裂(即prb1∷HIS3)的一種分離物用于下面的PEP4基因的斷裂。為了獲得ura3分離物而在FOA板上將菌株#1537傳代，并且挑選一個(gè)分離物(菌株#1541)用于進(jìn)一步的應(yīng)用。
為了斷裂菌株#1541中的PEP4基因，PEP4基因斷裂載體pUC13-pep4∷URA3用XhoI消化，產(chǎn)生線性pep4∷URA3斷裂盒，并用于通過乙酸鋰方法的菌株#1541的轉(zhuǎn)化。在尿嘧啶缺少的瓊脂培養(yǎng)基上挑選Ura+轉(zhuǎn)化物，并對于克隆分離物在相同培養(yǎng)基上劃線。由幾個(gè)Ura+轉(zhuǎn)化物制備基因組DNA，并用放射標(biāo)記的PEP4基因探針進(jìn)行Southern印跡評價(jià)。挑選顯示出所期望的PEP4基因被URA3基因斷裂的一個(gè)分離物(菌株#1569)用于進(jìn)一步的應(yīng)用。根據(jù)實(shí)質(zhì)上相同的步驟順序，在一獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了菌株#1538。菌株#1538是菌株U9的一個(gè)衍生物。菌株#1538包含prb1和pep4突變型兩者。另外，菌株#1569的ura3衍生物通過在FOA板上傳代而獲得。所得的菌株#1569的ura3衍生物指定為菌株#1592。實(shí)施例9從活檢組織中提取核酸從25歲分娩后女性患者獲得大的外陰濕疣尖銳損害。在液氮中冷凍損害碎片，然后用Braun mikrodismembrator II(B.BraunInstruments，Melsungen，德國)處理。所得物質(zhì)用0.6％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解，用蛋白酶K(50mcg/ml)處理，并用苯酚/氯仿/異戊醇提取。DNA是乙醇沉淀的，并用UV分光光度測定定量。通過瓊脂糖凝膠電泳，接著用溴化乙錠染色來證明存在高分子量的DNA。實(shí)施例10HPV DNA分型HPV DNA分型使用標(biāo)記為Vira Type Plus(DigeneDiagnostics，Beltsville，MD)的雜交捕獲分析來測定。使用的HPV探針被分成兩個(gè)庫，其組成以每一類型與生殖惡性腫瘤的相關(guān)性為基礎(chǔ)。探針組A含有“低危險(xiǎn)性”類型HPV 6，11，42，43和44，而探針B含有“高危險(xiǎn)性”類型16，18，31，33，35，45，51，52和56。全部DNA用PstI，BamHI和Hind III消化，并且在高度嚴(yán)格的條件下(Tm-15℃)進(jìn)行Southern印跡以測定HPV亞型。實(shí)施例11克隆HPV 6a基因組從HPV 6a陽性生物活組織樣品中提取的全部DNA用Hind III核酸內(nèi)切酶消化。通過0.8％低熔點(diǎn)溫度瓊脂糖制備凝膠大小分級(jí)后，從凝膠上切下相當(dāng)于～8kbp的DNA的區(qū)，并用GelaseTM酶消化瓊脂糖(GelaseTM酶購自Epicentre Technologyies，Inc.，Madison，WI)。樣品與已用HindIII消化并脫磷酸化的pUC 18(Pharmacia，Inc.，Piscataway，NJ)連接?；钚源竽c桿菌DH5細(xì)胞(Gibco，BRL，Gaithersburg，MD)轉(zhuǎn)化后，通過菌落雜交，用與HPV 6b L1基因(5′-GAG AGA TCT TAC CTT TTAGTT TTG GCG CGC TTA C-3′)的3′端互補(bǔ)的反義32P-標(biāo)記的寡脫氧核苷酸從質(zhì)粒庫中篩選HPV 6a陽性克隆。分離包含8.1kbp HPV 6a基因組的pUC 18質(zhì)粒并用限制性酶表征并進(jìn)行Southern印跡分析。該質(zhì)粒用pUC 18-HPV 6a消化。用QiagenTMPlasmid Maxi藥盒(QiagenInc.，Chatsworth，CA)制備質(zhì)粒DNA。實(shí)施例12pUC 18-HPV 6a的序列分析為了測定完全的HPV 6a序列，以公開的HPV 6b序列為基礎(chǔ)合成序列測定引物。完全的8.1-kbp HPV 6a基因組的兩股鏈通過雙脫氧鏈終止法用PRISMTM藥盒和Applied Biosystems(ABI)自動(dòng)測序儀(#373A)根據(jù)廠商說明(ABI，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)進(jìn)行序列測定。有義和反義序列不匹配的情況下，合成另外的HPV 6a特異性引物以從兩個(gè)方向?qū)τ袉栴}的區(qū)再進(jìn)行序列測定以得到共有序列。
HPV 6a和HPV 6b的DNA序列具有超過97％的相同性，在8010bp之中，總共有229bp被鑒定有變化。與HPV 6b序列相比最明顯的區(qū)別發(fā)現(xiàn)于長調(diào)控區(qū)(LCR；nt7205-nt106)。除了在HPV 6a LCR中幾個(gè)單個(gè)核苷酸(nt)變化外，發(fā)現(xiàn)在nt7350處一個(gè)94-bp插入和另一個(gè)在nt7804處19-bp插入。在nt7615處，六個(gè)堿基對從HPV 6a基因組中缺失。實(shí)施例13構(gòu)建HPV 6a L1酵母表達(dá)載體HPV型6a DNA用作PCR模板。通過PCR使HPV 6a L1基因擴(kuò)增，使用Vent聚合酶(New England Biolabs，Inc.)35次擴(kuò)增循環(huán)(94℃，1分鐘；48℃，1分鐘；72℃，1分鐘45秒)，使用包含旁側(cè)BglII位點(diǎn)(下劃線)的下面的寡脫氧核苷酸引物有義引物5′-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGCCTA GCG ACA GCA CAG-3′反義引物5′-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTAC-3′有義引物引入酵母非翻譯前導(dǎo)序列緊接著的HPV 6a L1起始蛋白酶密碼子(粗印體強(qiáng)調(diào)部分)上游。1.5-kbp L1 PCR產(chǎn)物用BglII消化并凝膠純化。通過從包含來自質(zhì)粒pBM272(由華盛頓大學(xué)，St.Louis的Mark Johnston提供)的通過酵母ADH1轉(zhuǎn)錄終止子(Bennetzen，J.L.和Hall，B.D.(1982)《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)2573018-3025)而位于每一面旁側(cè)的趨異進(jìn)化GAL1/GAL 10啟動(dòng)子的雙向GAL啟動(dòng)子載體pUC 18-GAL 1p-GAL 10p中分離1.4kbp Sph I片段，克隆位于GAL 1啟動(dòng)子和ADH 1轉(zhuǎn)錄終止子第一拷貝之間的BamHI位點(diǎn)，而構(gòu)建pGAL 10表達(dá)載體，Sma I克隆位點(diǎn)位于趨異性化GAL 10啟動(dòng)子和ASH 1轉(zhuǎn)錄終止子的第二個(gè)拷貝之間。由pBR322，酵母LEU2-d基因和酵母2μm組成的酵母穿梭載體與Sph I成環(huán)并與1.4-kbpSphI GAL啟動(dòng)子片段連接。所得啟動(dòng)子pGAL 10用在GAL 1啟動(dòng)子和ADH 1轉(zhuǎn)錄終止子之間切割的BamHI線性化。BamHI消化過的pGAL 10載體和BglII消化過的HPV 6a L1 PCR片段連接，并用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5細(xì)胞(BRL)。分離包含HPV 6a L1基因的pC 1/1-GAL質(zhì)粒并指定為p13173-357-6。對p13173-357-6中的L1基因進(jìn)行序列測定(ABI Sequencer #373A)并顯出與pUC 18-HPV 6a克隆中的L1基因相同。實(shí)施例14構(gòu)建HPV 6a L1和L2酵母表達(dá)載體質(zhì)粒p13173-357-6(pGAL 10+HPV 6a L1)用SamHI消化，Sam I在GAL 10啟動(dòng)子和ADH 1轉(zhuǎn)錄終止子之間切割。1.4-kbp HPV6a L2基因通過PCR擴(kuò)增，使用pUC 18-HPV 6a DNA為模板，使用Vent聚合酶(New England Biolads，Inc.)，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增(94℃，1分鐘；48℃，1分鐘；72℃，1分鐘45秒)，并使用下面的含旁側(cè)Sma I位點(diǎn)(下劃線)的寡脫氧核苷酸引物有義引物5′-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGG CAC ATAGTA GGG CCC GAC GAC-3′反義引物5′-TCC CCC GGG CTA GGC CGC CAC ATC TGA AAAAAA TAA GG-3′有義引物引入酵母非翻譯前導(dǎo)序列緊接著的HPV 6a L2起始蛋氨酸密碼子(粗印體強(qiáng)調(diào)部分)上游。PCR片段用Bma I消化，，凝膠純化，并與Sma I消化過的p13173-357-6質(zhì)粒連接。分離既包含HPV 6a L1又包含L2基因的pGAL 10質(zhì)粒并指定為p14049-7-2。對L2基因測序(ABI Sequencer #373A)，發(fā)現(xiàn)與pUC 18-HPV 6a克隆中的L2基因相同。實(shí)施例15在酵母中表達(dá)HPV 6a L1并共表達(dá)HPV 6a L1和L2質(zhì)粒p13173-357-6(pGAL 10+HPV 6a L1)和p14049-7-2(pGAL 10+HPV 6a L1和L2)用來轉(zhuǎn)化啤酒酵母菌株#1569(MATa，Leu 2-04，prb 1，ade 1，pep 4，cir°)和#1558(MATa，Leu 2-04，prb 1，mnn 9，ade 1，cir°)。用宿主菌株#1558獲得的結(jié)果重組菌株是菌株#1644(HPV 6a L1)和#1670(HPV 6a L1+L2)，如表中所示?？寺》蛛x物在30℃在含有2％半乳糖的YEHD培養(yǎng)基中生長68-78小時(shí)。收獲細(xì)胞后，用玻璃珠破碎細(xì)胞沉淀物。通過免疫印跡分析分析細(xì)胞溶質(zhì)中HPV 6a L1或HPV 6a L2蛋白的表達(dá)。含有40μg總細(xì)胞蛋白的樣品在還原和變性條件下在10％Tris-甘氨酸凝膠上進(jìn)行電泳，并電印跡到硝基纖維素濾紙上。使用用來抗trp E-HPV 11融合蛋白的兔抗血清(Brown，D.R等，Virology20146-54)為第一抗體，猴抗兔IgG辣根過氧化物酶連接的(HRP)整個(gè)抗體(Amersham，Inc.)作為第二抗體對L1蛋白進(jìn)行免疫測定。用化學(xué)發(fā)光ECLTM檢測藥盒(Amersham，Inc.)處理濾紙。在除陰性對照物(沒有L1或L2基因的載體對照物)外的所有樣品中檢測到了50-55kDaL1蛋白帶。
使用來自小鼠的1∶250稀釋的血清通過Western分析測定L2蛋白是70kDa蛋白帶，其中所述小鼠已用基本上根據(jù)Carter等的方法制備的trpE-HPV 6a L2融合蛋白為第一抗體，HRP連接的，綿羊抗小鼠IgG(Amersham，Inc.)為第二抗體(1∶1000稀釋)進(jìn)行了三次免疫。
對于EM分析(Structure Probe，West Chester，PA)，每一樣品一份置于200目碳包被的銅載網(wǎng)上。一滴2％磷鎢酸(PTA)，pH7.0置于載網(wǎng)20秒。在TEM檢驗(yàn)之前使載網(wǎng)空氣風(fēng)干。所有電微學(xué)技術(shù)用JEOL 100 CX透射電子顯微鏡(JEOL USA，Inc.)以加速電壓100KV進(jìn)行。產(chǎn)生的顯微圖最終放大倍數(shù)為100000X。
在具有HPV 6a L1或HPV 6a L1和L2共表達(dá)質(zhì)粒的所有酵母樣品中在50-55nm直徑大小范圍發(fā)現(xiàn)VLP。在酵母對照樣品中沒有發(fā)現(xiàn)VLP。實(shí)施例16HPV 6a L1+L2(菌株#1670)的發(fā)酵將平板培養(yǎng)的菌株的1670的表面生長無菌轉(zhuǎn)移到無亮氨酸的液體培養(yǎng)基中，所述的液體培養(yǎng)基含有(每升)8.5g沒有氨基酸和硫酸銨的Difco酵母氮堿；0.2g尿嘧啶；10g琥珀酸；5g硫酸銨；和0.25g L-酪氨酸，在滅菌前用NaOH將該培養(yǎng)基調(diào)至pH 5.0-53。在28℃在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以250rpm生長25小時(shí)后，在-70℃貯存之前通過將無菌甘油加入至終濃度17％(w/v)(每冷凍管1mL)而制備冷凍培養(yǎng)物小管。用于菌株1670發(fā)酵的接種物在相同培養(yǎng)基(每2L燒瓶中500mL)中培養(yǎng)，并將兩個(gè)冷凍培養(yǎng)物小管的解凍的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至2-L燒瓶中而開始，并在28℃，在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以250rpm培養(yǎng)25小時(shí)。酵菌株1670使用New Brunswidk SF-116發(fā)酵罐，接種后工作體積為10L。使用的生產(chǎn)培養(yǎng)基含有(每L)20g Difco酵母提取液；10gSheffield HySoy胨；20g葡萄糖；20g半乳糖；在滅菌前將培養(yǎng)基調(diào)至pH 5.3。將2L種菌燒瓶中的全部內(nèi)容物(500mL)轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中，在28℃。每分鐘通5L空氣，400rpm，3.5psi壓力條件下培養(yǎng)。根據(jù)需要增強(qiáng)攪拌以保持溶解的氧的水平高于40％飽和。發(fā)酵過程用脫機(jī)葡萄糖測量器(Beckman Gluvose 2 Analyzer)和聯(lián)機(jī)質(zhì)譜(Perkin-Elmer 1200)監(jiān)測。孵育69個(gè)小時(shí)后，達(dá)到每升9.9g干細(xì)胞重量的細(xì)胞密度。培養(yǎng)物用中空纖維過濾(Amicon DC-10過濾系統(tǒng)中的Amicon H5MPO1-43柱體)濃縮至大約2L，用2升磷酸緩沖鹽水滲濾，在分散于500mL離心管之前進(jìn)一步濃縮(至大約1升)。以8000rpm(Sorval GS3回轉(zhuǎn)器)在4℃離心20分鐘收集細(xì)胞沉淀。傾析出上清液后，將沉淀物(共225g濕細(xì)胞)在-70℃貯存?zhèn)溆?。?shí)施例17純化重組HPV 6a L1+L2衣殼蛋白除有注明外所有步驟都在4℃下進(jìn)行菌株#1670細(xì)胞在-70℃下冷凍貯存。冷凍細(xì)胞(濕重＝3.80g)在20-23℃下解凍，并再懸浮于50mL“L1緩沖液”(20mM磷酸鈉，pH 7.2，100mM NaCl，1.7mM EDTA)中。加入蛋白酶抑制劑PMSF和胃酶抑制劑A，分別達(dá)到終濃度2mM和1.7mcM。通過M 110微液化器(Microfluidics Corp.，Newton，MA)的三個(gè)通道以大約8000psi的壓力將細(xì)胞漿液破碎。破碎的細(xì)胞漿液以5000×g離心10分鐘去除細(xì)胞殘?jiān)槠??；厥蘸蠰1+L2抗原的上清液。
加入緩沖液A(20mM MOPS，pH 7.0)以1∶5稀釋上清液，加到用緩沖液A平衡過的FractogelEMD TMAE-650(S)樹脂(EMSeparatiohs，Gibbstown，NJ)陰離子捕獲柱(5.0cmID×4.0cm)上。用緩沖液A沖洗后，以緩沖液A中0～1.0M NaCl的梯度洗脫抗原。進(jìn)行免疫打點(diǎn)印跡檢測哪一柱級(jí)分中含有L1蛋白。
通過Bradford方法，接著是使用銀染的SDS-PAGE和Western印跡對免疫打點(diǎn)印跡檢測含有L1蛋白的級(jí)分的所有蛋白質(zhì)。
集中那些顯示相差不大純度旦富含L1蛋白的TMAE級(jí)分。通過硫酸銨分級(jí)濃縮抗原。加入固體試劑同時(shí)溫和攪拌30分鐘將溶液調(diào)至63％飽和的硫酸銨。樣品置于冰上，讓沉淀進(jìn)行30分鐘，以12000×g離心樣品，沉淀重新懸浮于20.0mL PBS(6.25mM磷酸鈉，pH7.2，150mM NaCl)。
重新懸浮的沉淀在Sephacryl 500HR樹脂(Pharmacia，Piscataway，NJ)大小排阻柱(2.6cm ID×89cm)上層析，洗脫緩沖液是PBS。層析在20-23℃下進(jìn)行。通過銀染SDS-PAGE和Western印跡檢測分析級(jí)分。收集最純的級(jí)分，濃縮所得的集中樣品。
用膠體考馬斯染色SDS-PAGE分析最終樣品。L1和L2蛋白估計(jì)是85％同源性。使用合適的抗血清通過western印跡證明L1和L2蛋白的特征。最終樣品分成小份在-70℃貯存。這一過程得到共3.0mg蛋白質(zhì)。
通過結(jié)構(gòu)探針(Structure Probe)(West Chester，PA)進(jìn)行電子顯微分析。一小份樣品置于200目碳包被銅載網(wǎng)上。一滴2％磷鎢酸，pH 7.0置于載網(wǎng)20秒鐘。在TEM檢驗(yàn)前使載網(wǎng)空氣風(fēng)干。所有顯微技術(shù)用JEOL 100 CX透射電子顯微鏡(JEOL USA，Inc.)以100kV的加速電壓進(jìn)行。產(chǎn)生的顯微圖最終放大倍數(shù)100000X。證明存在50-55nm大小范圍的病毒樣顆粒。實(shí)施例18構(gòu)建CRPVL1表達(dá)載體通過PCR技術(shù)，從包含完全的CRPV病毒基因組(Peter Howley博士，NCI)的質(zhì)粒pLA II中擴(kuò)增CRPV L1基因，使用Vent聚合酶(NewEngland Biolabs，Inc.)；35次循環(huán)擴(kuò)增(94℃，1分鐘；50℃，1分鐘；72℃，2分鐘)，并且使用下面的包含旁側(cè)BglII位點(diǎn)(下劃線)的寡核苷酸引物有義引物5′-GAA GAT CTT CAA AAC AAA ATG GCA GTG TGGCTG TCT AC-3′反義引物5′-GAA GAT CTT TAT TAA GTA CGT CTC TTG CGT TTAG-3′有義引物將酵母非翻譯前導(dǎo)序列緊接著的CRPV L1起始蛋白酸密碼子(粗印體強(qiáng)調(diào))上游引入。1.6kb L1 PCR產(chǎn)物用Bgl II消化，凝膠純化并亞克隆克載體pSP72(Promega)的BglII位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pBP72-CRPV-L1(p12930-314-4-1)。
對一個(gè)亞克隆進(jìn)行完全的序列測定，發(fā)現(xiàn)與公開的CRPV L1序列有4個(gè)核苷酸不同。這一變化不導(dǎo)致氨基酸的變化。從pSP72-CRPV-L1中切割L1基因作為Bgl II片段并亞克隆到位于酵母表達(dá)載體中酵母GAL 10啟動(dòng)子和ADH 1轉(zhuǎn)錄終止子之間的獨(dú)特的BamHI位點(diǎn)，所述酵母表達(dá)載體包含來自YEp52(Broach等，Exp.Manipulation ofGene Expression(基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)操作)，1983，8381-116)的GAL 10啟動(dòng)子和相同載體骨架中的轉(zhuǎn)錄終止子。所得質(zhì)粒指定為p12930-323-6-1。實(shí)施例19構(gòu)建CRPV L2表達(dá)載體質(zhì)粒pLA II用Sal I消化，凝膠純化7.9kb片段并與其自身連接后，通過PCR技術(shù)，使用Vent聚合酶(New England Biolabs，Inc.)從質(zhì)粒pLA II擴(kuò)增CRPV L2基因。進(jìn)行35次循環(huán)擴(kuò)增(90℃，1分鐘；50℃，1分鐘；72℃，2分鐘)，并使用包含旁側(cè)EcoRI位點(diǎn)(下劃線)的寡核苷酸引物有義引物5′-GGA ATT CAC AAA ACA AAA TGG TTG CAC GGTCAC GAA AAC-3′反義引物5′-GGA ATT CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA CAC TG-3′有義引物引入酵母非翻譯前導(dǎo)序列緊接著的CRPV L2起始蛋氨酸密碼子(粗印體強(qiáng)調(diào))的上游。1.5kb PCR產(chǎn)物用EcoRI消化，凝膠純化，并亞克隆到包含趨異進(jìn)化酵母GAL 1/GAL 10啟動(dòng)子的雙向啟動(dòng)子載體pUC 18-GAL 1p-GAL 10p的EcoRI位點(diǎn)。該載體包含位于GAL 1啟動(dòng)子和ADH 1轉(zhuǎn)錄終止子第一拷貝之間的獨(dú)特的BamHI位點(diǎn)，獨(dú)特的EcoRI和Sma I位點(diǎn)位于GAL 10啟動(dòng)子和ADH 1轉(zhuǎn)錄終止子的第二拷貝之間。所得表達(dá)彈夾載于1.4kb Sph I片段上。包含緊鄰GAL 10啟動(dòng)子的所期望的L1插入物的一個(gè)克隆(p12930-295-2-2)進(jìn)行完全序列測定，并顯示出包含與公開的序列不同的6個(gè)核苷酸變化，其中4個(gè)導(dǎo)致氨基酸變化。起點(diǎn)模板DNA的序列分析證明這些變化也存在于pLA II，且不是由PCR引入的。用Sph I切割包含L2基因的pUC 18-GAL 1p-GAL 10p載體，具有ADH 1t-GAL 1p-GAL 10p-L2-ADH 1t表達(dá)彈夾的2.9kb片段與酵母穿梭載體的大Sph I片段連接。所得質(zhì)粒指定為p12930-323-2-3。實(shí)施例20在酵母中表達(dá)CRPV L1和L2衣殼蛋白質(zhì)粒p12930-323-6-1和p12930-323-2-3用來轉(zhuǎn)化啤酒酵母菌株#1569、#1538、BJ5462〔EW.Jones，《(酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology 194(1991)428-453〕和BJ 1995〔Jones，出處同上〕?？寺》蛛x物在30℃在含有2％半乳糖的YEHD培養(yǎng)基中生長48-72小時(shí)。收獲細(xì)胞后，用玻璃珠破碎細(xì)胞沉淀，加入Triton X-100至0.5％終濃度，通過免疫印跡分析對所得細(xì)胞溶質(zhì)評估CRPV L1和L2表達(dá)。含有40μg總細(xì)胞蛋白的樣品在還原和變性的條件下在12％Tris-Glycin凝膠(Novex)上進(jìn)行電泳，并在PVDF膜(Novex)上電印跡。用多克隆兔抗-L1或抗-L2抗血清(由Hershey醫(yī)藥中心的John Kreider博士饋贈(zèng))作為第一抗體，與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的蛋白質(zhì)A(Amersham，Inc.)作為第二抗體，檢測CRPV L1和L2蛋白。用化學(xué)發(fā)光ECLTM檢測藥盒(Amersham，Inc.)處理膜。在所有具有L1表達(dá)質(zhì)粒的樣品中檢測到了一條55-61kDa L1蛋白帶，而在所有來自具有L2表達(dá)質(zhì)粒的酵母克隆的樣品中檢測到了一條～90kDaL2蛋白帶。
用抗L2抗血清在來自具有L1表達(dá)質(zhì)粒的酵母克隆的樣品中檢測不到信號(hào)，反之亦然(圖6)。
以這些表達(dá)結(jié)果為基礎(chǔ)，挑選下面的重組酵母菌株進(jìn)一步研究菌株#1582，其是包含質(zhì)粒p12930-323-6-1的宿主菌株#1569；和菌株#1583，其是包含p12930-323-2-3質(zhì)粒的宿主菌株#1538。實(shí)施例21A.純化重組CRPV L1衣殼蛋白將在-70℃下貯存的菌株#1582細(xì)胞解凍，懸浮于等體積的Breaking緩沖液(20mM磷酸鈉，pH 7.2，100mM NaCl，1.7mMEDTA)。向漿液中加入蛋白酶抑制劑PMSF和胃酶抑制劑A，分別達(dá)到2mM和1.7μM終濃度。通過微液化器中的10個(gè)通道裂解細(xì)胞。通過以5000×g離心10分鐘澄清裂解液。上清液加到L1緩沖液45％蔗糖(w/v)的5cm墊層的頂端，以100000×g離心4小時(shí)沉淀L1。沉淀小丸再懸浮于1/10th體積的L1緩沖液中。再懸浮的沉淀通過以5000×g離心10分鐘而澄清。向上清液中加入Tween-80至0.01％終濃度。室溫下通過大小排阻層析在Sephacryl S-1000樹脂(Pharmacia)的1700ml柱(5cm ID)上將上清分級(jí)。用于該柱的洗脫緩沖液是10mM磷酸鈉，pH 7.2，150mM NaCl，0.01％Tween-80。集中經(jīng)免疫打點(diǎn)印跡分析含有免疫反應(yīng)性物質(zhì)的級(jí)分，用帶有76mm直徑的YM-100平片膜(100000MW CO)的Amicon攪拌池通過超濾將集中樣品濃縮1/6th體積。產(chǎn)物通過Millex-GV 0.22μm膜(Millipore)無菌過濾。B.重組CRPV L1衣殼蛋白的表征通過Westem印跡并通過N-末端序列分析證明終產(chǎn)物的特征。通過考馬斯和銀染SDS/PAGE，并通過溶液篩分毛細(xì)管電泳(SSCE)，在215nm處光學(xué)檢測測定純度。L1經(jīng)SSCE測定純度是75％。電子顯微分析表明存在50-55nm直徑大小范圍的VLP。C.進(jìn)行分子排阻HPLC分析為測定VLP’s，樣品根據(jù)大小通過分子排阻層析分級(jí)。用帶有裝備有200微升注射針頭的ISS 100自動(dòng)注射器的Perkin-Elmer Series410 Biopump HPLC進(jìn)行層析。柱子是TSK-凝膠G 5000 PW，7.5×600mm(TOSOHAA S，Montyonmeryville，PA)。為了監(jiān)測蛋白質(zhì)自柱上洗脫，用Perkin-Elmer LC-235二極陣列檢測器在280nm進(jìn)行光學(xué)檢測。流動(dòng)相是10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)中的0.5MNaCl。流速是0.5mL/分鐘，收集1毫升級(jí)分。用來自Sigma的蛋白標(biāo)準(zhǔn)物以及重組乙肝表達(dá)抗原(RecombivaxTM，Merck & Co.，WestPoint，PA)進(jìn)行柱校正。通過免疫打點(diǎn)印跡分析進(jìn)行對洗脫過程中收集的級(jí)分中的抗原的檢測。D.免疫打點(diǎn)印跡分析將每一級(jí)分中的10微升樣品應(yīng)用到PCDF膜(Immobilon-P，Millipore Corp.，Bedford，MA)的橫帶上，所述膜被預(yù)先潤濕并置于弄濕的印跡紙上。使樣品吸收到膜中，將該膜置于溶解于阻斷溶液(0.15MNaCl，0.02％(w/v)疊氮化鈉，和0.01M磷酸鈉，pH7.2的5％(w/v)脫脂奶粉溶液)，室溫下柔和攪拌孵育至少3小時(shí)。傾析出阻斷溶液并代之以第一抗體溶液。
所使用的第一抗體根據(jù)要檢測的抗原而不同用兔抗-CRPV血清“晚期應(yīng)答”(Biodesign International，Kennebunk，ME)探測CRPV L1。用兔抗-CRPV L2血清探測CRPVL2。用單克隆抗體MAB 837(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)探測HPV 6a L1。用小鼠抗-HPV 6a L2-trp E融合血清探測HPV6a L2。
通過標(biāo)準(zhǔn)方法使用與堿性磷酸酶綴合的第二抗體和顯色底物NBT/BCIP使免疫配合物顯色。E.自重組CRPV L1衣殼蛋白制備疫苗以100μg/ml的濃度將純化的CRPV L1衣殼蛋白吸附到Al(OH)3。實(shí)施例22純化重組CRPV L1衣殼蛋白-方案2除特別說明外，所有步驟在4℃下進(jìn)行。
將在-70℃下貯存的菌株#1582細(xì)胞解凍懸浮于等體積的破碎緩沖液(20mM磷酸鈉，pH7.2，100mM NaCl，1.7mM EDTA)。向漿液中加入蛋白酶抑制劑PMSF和胃酶抑制劑A，分別達(dá)2mM和1.7μM終濃度。用BioNeb細(xì)胞破裂系統(tǒng)(Glas-Col Apparatus Co.，Terra Haute，IN)裂解細(xì)胞。裂解液以5000×g離心10分鐘以澄清。
上清液加到L1緩沖液中45％蔗糖(w/v)的5cm墊層上端，L1以100000×g離心4小時(shí)而沉淀。沉淀物再懸浮于1/10th體積的L1緩沖液中。重懸浮的沉淀以5000×g離心10分鐘澄清。
上清液用PBS稀釋1∶5。通過在Sorvall SA-600轉(zhuǎn)子上以6500rpm在4℃離心10分鐘而再澄清。上清通過0.22微米針筒式濾器過濾，并通過陰離子交換層析分級(jí)。
用帶有ml注射針頭的Perkin-Elmer系列410 Biopump HPLC進(jìn)行陰離子交換層析。層析基質(zhì)是150mm×10mm ID玻璃柱中的Fractoeel EMF TMAE-650(S)25-40微米樹脂(EMSeparations，Gibbstown，NJ)。為監(jiān)測蛋白質(zhì)自柱洗脫，用Perkin-ElmerLC-235二極陣列檢測器在280nm進(jìn)行光學(xué)檢測。柱子用0.15M、0.01M磷酸鈉緩沖液(pH7.2)(緩沖液A)中的NaCl預(yù)平衡。柱子流速0.75ml/分鐘。將樣品裝上柱，柱子用緩沖液A沖洗以去除未結(jié)合物質(zhì)。結(jié)合物質(zhì)用氯化鈉線性濃度梯度自0.15M至0.65M洗脫5分鐘，接著用0.65M至1.15M線性梯度洗脫30分鐘。通過免疫打點(diǎn)印跡分析進(jìn)行對洗脫過程中收集的級(jí)分中的抗原的檢測。集中含有免疫反應(yīng)性物質(zhì)的級(jí)分(即在0.81M和1.05M NaCl之間洗脫的級(jí)分)。
在Macrosep離心濃縮裝置(Filtron Technology Corp.，Northborugh，MA)中將集中的級(jí)分濃縮至1/5th體積。
通過分子排阻層析用87cm×27cm ID柱中的Sephacryl S-1000SF樹脂(Pharmacia，Piscataeay，NJ)將濃縮物分級(jí)。以2.5ml/分鐘流速洗脫柱子。用280nm監(jiān)測蛋白質(zhì)的洗脫。用免疫印跡檢測抗原。
集中含有免疫反應(yīng)性物質(zhì)的級(jí)分，并用帶有43mm直徑Y(jié)M-100平片膜(Amicon，Inc.，Beverly，MA)的攪拌池(Amicon，Inc.，Beverly，MA)在10psi壓力氮?dú)庀鲁瑸V濃縮。
通過用考馬斯染色的SDS/PAGE，并通過溶液篩分毛細(xì)管電泳(SSCE)表征終產(chǎn)物。通過SSCE分析由方案2得到的終產(chǎn)物純度88％。實(shí)施例23A.純化重組CRPV L1衣殼蛋白-方案3(圖17)除具體說明外所有步驟在4℃下進(jìn)行。
將于-70℃下貯存的菌株#1582細(xì)胞解凍，并懸浮于等體積的破碎緩沖液(20mM磷酸鈉，pH7.2，100mM NaCl，1.7mM EDTA)中。向漿液中加入蛋白酶抑制劑PMSF和胃酶抑制劑A，分別達(dá)到2mM和1.7mM終濃度。用BioNeb細(xì)胞破碎系統(tǒng)(Glas-Col Apparatus Co.，Terra Haute，IN)裂解細(xì)胞。裂解液以5000×g離心10分鐘澄清。
上清液加到L1緩沖液中45％蔗糖(w/v)的5cm墊層之上，以100000×g離心4小時(shí)使L1沉淀。沉淀小丸再懸浮于1/10th體積的L1緩沖液中。再懸浮的沉淀以5000×g離心10分鐘而澄清。
上清用1/2體積氯仿提取，取出含水層并以12000rpm在Beckman微管中在室溫下離心5分鐘而澄清。
用PBS將上清稀釋至1∶5。在Sorvall SA-600轉(zhuǎn)子中以6500rpm在4℃離心10分鐘而再澄清。上清通過0.22微米針筒式濾器過濾，并通過陰離子交換層析分離。
用帶有5ml注射針頭的Perkin-Elmer系列410 Biopump HPLC進(jìn)行陰離子交換層析。層析基質(zhì)是150mm×10mm ID玻璃柱中的Fractogel EMF TMAE-650(S)25-40微米樹脂(EMSeparations，Gibbstown，NJ)。為了監(jiān)測蛋白質(zhì)自柱上洗脫，用Perkin-Elmer LC-235二極陣列檢測器在280nm進(jìn)行光學(xué)檢測。柱子用0.01M磷酸鈉緩沖液，pH 7.2(緩沖液A)中的0.15M NaCl預(yù)平衡。柱子以0.75ml/分鐘的流速洗脫。將樣品裝載上柱，用緩沖液A沖洗柱子以去除未結(jié)合的物質(zhì)。結(jié)合的物質(zhì)用NaCl線性濃度梯度自0.15M至0.65M洗脫5分鐘，接著以0.65M至1.15M線性梯度洗脫30分鐘。通過免疫打點(diǎn)印跡分析進(jìn)行對洗脫過程中收集的級(jí)分中抗原的檢測，集中包含免疫反應(yīng)性物質(zhì)(即在0.01和1.05M NaCl之間洗脫的級(jí)分)的級(jí)分。
集中的級(jí)分在Macrosep離心濃縮裝置中(Filtron TechnologyCorp.，Northborough，MA)濃縮至1/5th體積。
通過離子排阻層析用87cm×27mm ID柱中的Sephacryl S-1000SF樹脂(Pharmacia，Pisvataway，NJ)將濃縮物分級(jí)。柱子以2.5ml/分鐘的流速洗脫。用A280nm監(jiān)測蛋白質(zhì)的洗脫。免疫印跡檢測抗原。
集中含有免疫反應(yīng)性的物質(zhì)的級(jí)分，并用帶有43mm直徑Y(jié)M-100平片膜(Amicon，Inc.，Beverly，MA)的攪拌池(Amicon，Inc.，Beverly，MA)在10psi壓力氮?dú)庀鲁瑸V濃縮。
通過考馬斯染色SDS/PAGE，并通過溶液篩分毛細(xì)管電泳(SSCE)表征終產(chǎn)物。SSCE測定方案3的終產(chǎn)物純度為95％。溶液篩分毛細(xì)管電泳(SSCE)在100℃在1％2-巰基乙醇和1％(w/v)SDS中將樣品CRPVVLP(～0.2mg/ml)加熱15分鐘。樣品與參照標(biāo)記，苯六甲酸一起電動(dòng)加入到用10腔體積0.1N NaOH，水和Prosort篩分試劑(ApplideBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)預(yù)平衡的硅石融合毛細(xì)管，42cm(22cm至監(jiān)測器)×0.05mm I.D.中。使用Applied Biosystems Model 270A-HT CE儀器施加300伏/cm分離電壓。以在215nm的吸收值監(jiān)測洗脫樣品，用Nelson Turbochrom3軟件采集數(shù)據(jù)。實(shí)施例24通過用酵母衍生物CRPV L1 VLPS接種引起的保護(hù)免受乳頭狀瘤發(fā)展的作用5只新西蘭白兔用吸附于礬的135μg L1 VLPs(75％純)的肌內(nèi)免疫，或者用吸附于氫氧化鋁的100μg重組乙肝表面抗原(99％純)肌內(nèi)免疫作為陰性對照。在最后一次加強(qiáng)免疫后十天用CRPV攻擊之前，動(dòng)物在8周內(nèi)得到了兩次以上的加強(qiáng)免疫。在免疫前，每一次加強(qiáng)時(shí)，和在攻擊之前采取血清用L1特異性ELISA分析。用酵母衍生的CRPV-L1或CRPV-L2的裂解粗產(chǎn)物5μg包被96孔平板。去除蛋白質(zhì)，平板在4℃在10％干乳(Carnation)+TTBS(20mM Tris-HCl pH7.4，50mM NaCl，0.1％Tween)中阻斷2小時(shí)。用TTBS沖洗平板后，在1％乳+TTBS中加入稀釋的兔血清并在4℃孵育2小時(shí)。平板用TTBS沖洗并和以1％乳+TTBS中1∶1000稀釋的抗兔IgG-堿性磷酸酶(Kirbegaard和Perry Lads，Inc，)一起在4℃孵育2小時(shí)。平板用TTBS沖洗并通過加入磷酸對硝基苯酯(Krikegaard和Perry Lads.，Inc.)發(fā)展。通過加入5％EDTA使反應(yīng)停止，在405nm測定吸收值。如果L1/L2吸收值之比是2∶1的話則效價(jià)被認(rèn)為是陽性的。
第一次注射后-L搞抗體滴度存在4星期，每次附加的加強(qiáng)免疫其滴度都增加。對照動(dòng)物是陰性的。CRPV攻擊后六周接種動(dòng)物15處都沒有疣(1∶2稀釋的或1∶12稀釋的病毒原種)，而對照動(dòng)物顯示15處中的12處(1∶2稀釋的病毒)或15處的9處(1∶12稀釋的病毒)生成疣。15星期后，接種的動(dòng)物仍未長疣。
基本上根據(jù)Christensen等，1991年《病毒學(xué)》(Virology)181572-579的方法，通過將兔血清與CRPV混合，并接著用處理的CRPV攻擊兔而進(jìn)行病毒中和測定。測定中和抗體的標(biāo)準(zhǔn)是完全的病毒中和作用(處于疣生成來說3/3處顯陰性)。分析了來自5個(gè)接種動(dòng)物和5個(gè)對照動(dòng)物的血清。1劑量CRPV L1 VLPs后采集的血清在80％的兔子中(4/5)含有其完全中和了未稀釋病毒的抗體。2或3劑量CRPV L1VLPs后，100％的兔子(5/5)具有病毒中和抗體。對照血清不顯示任何病毒中和活性。根據(jù)滴度，所選擇接種動(dòng)物的血清應(yīng)稀釋10-1000倍之間，且仍100％中和。實(shí)施例25構(gòu)建用于來自單一質(zhì)粒的CRPV L1/L2共表達(dá)的載體質(zhì)粒pSP72-CRPV-L1(p12930-314-4-1)用Bgl II消化，具有帶酵母5′-非翻譯前導(dǎo)序列的CRPV L1 ORF的1.5kbp BglII片段被凝膠純化。質(zhì)粒p12930-323-2-3用在GAL 1啟動(dòng)子與ADH 1轉(zhuǎn)錄終止子之間切割的BamHI消化。線性載體片段被凝膠純化，然后與上面提到的CRPV-L1 BglII片段連接，得到質(zhì)粒p12930-366-1-2。所得質(zhì)粒包含GAL 1啟動(dòng)子調(diào)控下的CRPV-L1 ORF和GAL 10啟動(dòng)子調(diào)控下的CRPV-L2 ORF。實(shí)施例26構(gòu)建用于來自兩個(gè)質(zhì)粒的CRPV L1/L2共表達(dá)的載體包含L2基因的pUC 18-GAL 1p-GAL 10p載體用Sph I切割，具有ADH 1t-GAL 1p-GAL 10p-L2-ADH 1t表達(dá)盒的2.9kb片段被凝膠純化并用T4 DNA聚合酶處理平整末端。酵母穿梭載體YEp24〕Botstein等，《基因》(Gene)8∶17(1979)〕用BamHI消化，用T4 DNA聚合酶處理平整末端，用牛腸堿性磷酸酶去磷酸化后與上述末端平整過的L2表達(dá)盒連接，得到質(zhì)粒p1594。實(shí)施例27CRPV L1和L2在酵母中共表達(dá)質(zhì)粒p12930-366-1-2(pC1/1-GAL 1/10p-CRPV/L1+L2)用來轉(zhuǎn)化啤酒酵母菌株#1569和BJ5462(一個(gè)質(zhì)粒體系)。在亮氨酸減少合成瓊脂培養(yǎng)基上挑選所得的轉(zhuǎn)化物。在一平行實(shí)驗(yàn)中，菌株#1 592用CRPV-L1表達(dá)載體p12930-323-6-1；加YEp24-GAL 10p-L2表達(dá)載體p1594(兩個(gè)質(zhì)粒體系)共轉(zhuǎn)化，在沒有亮氨酸和尿嘧啶的合成瓊脂培養(yǎng)基上挑選包含兩個(gè)載體的所得轉(zhuǎn)化物。一個(gè)質(zhì)粒體系和兩個(gè)質(zhì)粒體系的克隆分離物在30℃在含有2％半乳糖的YEHD復(fù)合培養(yǎng)基中生成48-72小時(shí)。收獲細(xì)胞后，用玻璃珠破碎細(xì)胞沉淀。加入Triton X-100達(dá)0.5％終濃度，并通過免疫印跡分析分析細(xì)胞裂解物的CRPV L1和L2的表達(dá)。含有50μg總細(xì)胞蛋白質(zhì)的樣品在還原和變性條件下在8-16％Tris-Glycin梯度凝膠(Novex)上電泳，并電印跡到PVDF膜(Novex)上。用多克隆兔抗-L1或抗-L2抗血清(由Hershey Medical Center的John Kreider博士惠贈(zèng))作為第一抗體，與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的蛋白質(zhì)A(Amersham，Inc.)作為第二抗體來檢測CRPV L1和L2蛋白。膜用化學(xué)發(fā)光ECLTM檢測藥盒(Amersham，Inc.)處理。在所有來自擁有L1+L2表達(dá)質(zhì)粒的酵母克隆的所有樣品中檢測到了一條55-61kDa L1蛋白質(zhì)帶和一條～90kDaL2蛋白質(zhì)帶。在自擁有L1表達(dá)質(zhì)粒的酵母克隆衍生的樣品中沒有到L2信號(hào)(圖6)在來自只包含L2表達(dá)載體的細(xì)胞的樣品中沒有檢測到L1信號(hào)。實(shí)施例28純化CRPV L1和CRPV L1+L2 VLPs用于EM研究酵母表達(dá)的CRPV L1和CRPV L1和L2蛋白被部分純化并濃縮用于電子顯微鏡研究(EM)。用被L1+L2共表達(dá)載體p12930-366-1-2轉(zhuǎn)化的S.cerevisiae菌株#1569或BJ5462接種含有2％半乳糖的1至1.5升YEHD培養(yǎng)基，并在30℃生長48-72小時(shí)。在一平行實(shí)驗(yàn)中，和CRPV-L1表達(dá)載體p12930-323-6-1加YEp24-GAL10p-L2質(zhì)粒p1594共轉(zhuǎn)化的菌株#1569細(xì)胞在相同方式下生長。收獲細(xì)胞，且細(xì)胞沉淀物在-70℃下冷凍。所有下面的步驟在4℃下進(jìn)行。將細(xì)胞沉淀物解凍，并懸浮于等體積的“L1緩沖液”(20mM磷酸鈉，pH7.2，100mM NaCl，1.7mM EDTA)。向漿液中加入蛋白抑制劑PMSF和胃酶抑制劑A，分別達(dá)到2μM和1.7μM終濃度。細(xì)胞通過微液化器中3-5道裂解。裂解液以5000×g離心10分鐘而澄清。將上清液加到L1緩沖液中45％(v/v)蔗糖的5cm墊層的上部，L1，L2或L1和L2蛋白以100000×g離心4小時(shí)沉淀。將沉淀物重懸浮于1/10th體積的L1緩沖液中。重懸浮的沉淀以5000×g離心10分鐘澄清。
對于EM分析(Structure Probe，West Chester，PA)，每一樣品的一小份被置于200目碳包被的銅載網(wǎng)上。一滴2％磷鎢酸(PTA)，pH 7.0加到載網(wǎng)上20秒鐘。在TEM檢驗(yàn)之前使載網(wǎng)空氣風(fēng)干。所有顯微鏡檢查法用JEOL 100CX透射電子顯微鏡(JEOL USA，Inc.)以100KV加速電壓進(jìn)行。產(chǎn)生的顯微圖最終放大倍數(shù)是100000X。
在包含CRPV L1表達(dá)質(zhì)粒或用于CRPV L1和L2共表達(dá)質(zhì)粒的所有酵母樣品中，發(fā)現(xiàn)VLPs≤25nm直徑大小范圍。在酵母對照樣品中或在只擁有L2表達(dá)質(zhì)粒的酵母樣品中沒有發(fā)現(xiàn)VLP。實(shí)施例29在滋養(yǎng)復(fù)合且化學(xué)確定的培養(yǎng)基中表達(dá)CRPV L1(菌株1582)和HPV型6a L1(菌株1644)這些菌株的種苗在如上所述的無亮氨酸的合成培養(yǎng)基上生長，以轉(zhuǎn)移到搖蕩燒瓶培養(yǎng)物中。所用搖蕩燒瓶有隔板以獲得高通氣容量(每300ml燒瓶有70mL液體，Tunair Labware)，且培養(yǎng)基補(bǔ)加有大約0.5mL/L的消泡劑(UCON LB-625，Union Carbide)。滋養(yǎng)復(fù)合培養(yǎng)基含有(每升)40g Difco酵母提取液；20g Sheffield HySoy胨；30g葡萄糖；50g半乳糖；滅菌前將培養(yǎng)基調(diào)至pH 5.3。所用的化學(xué)確定的培養(yǎng)基與Oura(《生物技術(shù)與生物工程》(BiotechnolBioenyineer)161197-1212，1974)所描述的相同，但補(bǔ)加有(每升)0.1g膽堿Cl；0.4g腺嘌呤；30g谷氨酸-鈉鹽為氮源；0.2g尿嘧啶；20g葡萄糖；40g半乳糖。用3mL種菌接種燒瓶，并以250rpm在旋轉(zhuǎn)搖蕩器上在28℃孵育66小時(shí)。在不同時(shí)間間隔從燒瓶中取樣通過免疫印跡用抗-CRPV L1和抗HPV 6a L1抗血清來證實(shí)表達(dá)作用。實(shí)施例30克隆HPV6 L1和L2基因通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook等，上文)從Caski細(xì)胞(ATCC #CRL1550)中提取總基因組DNA。DNA用Bstl 107I和SphI核酸內(nèi)切酶消化，并通過0.8％低熔點(diǎn)溫度瓊脂糖制備凝膠電泳。從凝膠上切下對應(yīng)于～3.5kbp DNA的區(qū)，瓊脂糖用GelaseTM酶(Epicentre Technologies，Inc.)消化。凝膠純化的DNA用T4 DNA聚合酶平整末端，并包含包埋的Hind III位點(diǎn)的末端平整的，磷酸化的寡脫氧核苷酸接頭連接。連接的混合物用Hind III消化至完全，～3.5kbp DNA通過如上所述的瓊脂糖凝膠進(jìn)行大小分級(jí)。凝膠純化的DNA與已被被Hind III消化并去磷酸化的pUC 18質(zhì)粒DNA連接?；钚源竽c桿菌DH5細(xì)胞(BRL)轉(zhuǎn)化后，通過菌落雜交用與HPV-16 L1基因(5′-GAG AGA TCT TAC AGCTTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3′)的3′終端互補(bǔ)的反義32P標(biāo)記的寡脫氧核苷酸從質(zhì)粒庫中篩選HPV 16-陽性克隆。分離包含3.3-kbpHPV 16基因組片段的pUC 18質(zhì)粒并通過限制酶和Southern印跡分析表征。該質(zhì)粒指定為pUC 18-HPV 16 L1/L2，且包含所有L1和L2編碼DNA序列，用QiagenTMPlasmid Maxi藥盒(Qiagen，Inc.)制備質(zhì)粒DNA。實(shí)施例31構(gòu)建HPV 16 L1酵母表達(dá)載體用克隆pUC18-HPV 16 L1/L2作為PCR模板。通過PCR擴(kuò)增HPV16 L1基因，使用Vent聚合酶(New England Biolads，Inc.)，10次循環(huán)擴(kuò)增(94℃，1分鐘；48℃，1分鐘；72℃，1分鐘45秒)，且使用包含旁側(cè)BglII位點(diǎn)(下劃線)的如下的寡脫氧核苷酸引物有義引物5′-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TTTGGC TGC CTA TGT AGG CC-3′反義引物5′-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTAGC-3′有義引物引入酵母非翻譯前導(dǎo)序列緊接著的HPV 16 L1起始蛋氨酸密碼子(粗印體強(qiáng)調(diào)部分)的上游。1.5kbp L1 PCR產(chǎn)物用Bgl II消化，凝膠純化，并與BamHI消化的pGAL 10載體連接。分離包含HPV 16L1基因的pGAL 10并指定為p14049-37-1。用PRISMTM藥盒(ABI，Inc.)和ABI序列測定儀#373A型，根據(jù)廠商說明，對p14049-37-1中的L1基因測序。分離物中的L1基因顯示包含3個(gè)相對于正確的公開的原型序列(Kirbbauer，R.等(1 993)J.Virol.676929-6936)的核苷酸變化，導(dǎo)致兩個(gè)氨基酸變化His-202變?yōu)锳sp；Thr-266變?yōu)锳la。原始模板DNA的序列分析證明這些變化也存在于基因組克隆pUC 18-HPV 16 L1/L2，且不是由PCR引入的。實(shí)施例32構(gòu)建HPV 16 L1和L2酵母表達(dá)載體質(zhì)粒p14049-37-1用Sma I消化，Sma I在GAL 10啟動(dòng)子和ADH1轉(zhuǎn)錄終止子之間切割。通過PCR擴(kuò)增1.4-kbp HPV 16 L2基因，使用pUC 18-HPV 16 L1/L2 DNA為模板，使用Vent聚合酶(NewEngland Biolads，Inc.)，進(jìn)行10次循環(huán)擴(kuò)增(94℃，1分鐘；48℃，1分鐘；72℃，1分鐘45秒)，并使用下面的包含旁側(cè)SmaI位點(diǎn)(下劃線)的寡脫氧核苷酸引物有義引物5′-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC GAC ACAAAC GTT CTG CAA AAC-3′反義引物5′-TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATCTGA-3′有義引物引入酵母非翻譯前導(dǎo)序列緊接著的HPV 16 L2起始蛋氨酸密碼子(粗印體強(qiáng)調(diào)部分)的上游。1.4-kbp L2 PCR產(chǎn)物用Sma I消化，凝膠純化，并與Sma I消化的p14049-37～1載體連接。分離包含HPV 16 L1和L2基因兩者的pLS 110質(zhì)粒并指定為p14049-42-2。p1 4049-42-2中的L2基因用PRISMTM藥盒(ABI，Inc)和ABI測序儀#373A型，根據(jù)廠商說明進(jìn)行序列測定。分離物中L2基因顯示包含5個(gè)相對于正確的，公開的原型序列(Kirnbauer，R.等(1993)上文)的核苷酸變化，導(dǎo)致一個(gè)氨基酸變化Ser-269變?yōu)镻ro?；蚪M克隆pUC 18-HPV 16 L1/L2序列分析證明該變化也存在于原始模板DNA中，且不是由PCR引入的。實(shí)施例33A.酵母中HPV 16 L1的表達(dá)和HPV 16 L1和L2的共表達(dá)質(zhì)粒p14049-37-1和p14049-42-2用來轉(zhuǎn)化啤酒酵母菌株#1558。所得重組菌株是表中所示的#1678(HPV 16-L1)和#1679(HPV 16 L1+L2)?？寺》蛛x物在30℃在含有2％牛乳糖的YEHD培養(yǎng)基中生長68-78小時(shí)。收獲細(xì)胞后，用玻璃珠破碎細(xì)胞沉淀物，且通過免疫印跡分析分析細(xì)胞裂解物的HPV 16 L1或HPV 16 L2蛋白的表達(dá)。含有40mcg總細(xì)胞蛋白的樣品在還原和變性條件下在10％Tris-Glycine凝膠上電泳，并電印跡到硝基纖維素濾膜上。用抗trp E-HPV11 L1融合蛋白的兔多克隆抗血清(D.Brown等，Virology 20146-54)作為第一抗體，HRP連接的猴抗兔IgG抗體(Amersham，Inc.)為第二抗體免疫檢測HPV 16 L1蛋白。濾膜用化學(xué)發(fā)光ECLTM檢測藥盒(Amersham，Inc.)處理。除陰性對照外(沒有L1或L2基因的載體對照物)在所有樣品中檢測到了一條50-55kDa L1蛋白質(zhì)帶。通過免疫印跡用抗在大腸桿菌中表達(dá)的trp E-L2融合蛋白的小鼠抗HPV 16 L2血清作為第一抗體檢測到L2蛋白質(zhì)是一條70kDa蛋白質(zhì)帶。山羊抗小鼠HRP連接的IgG(Amersham，Inc.)用作第二抗體，濾膜如上進(jìn)行處理。B.純化重組HPV 16型L1+L2衣殼蛋白除指明的外所有步驟在4℃下進(jìn)行。
細(xì)胞在-70℃下冷凍貯存。冷凍細(xì)胞(濕重＝27.6g)在20-23℃下解凍，并重新懸浮于40mL“L1緩沖液”(20mM磷酸鈉，pH7.2，100mM NaCl，1.7mM EDTA)。加入蛋白酶抑制劑PMSF和胃酶抑制劑A，分別達(dá)2mM和1.7mcM終濃度。所有細(xì)胞漿液在M110微液化器(Microfluidics Corp.，Newton，MA)通過三個(gè)通道以大約8000psi的壓力破碎。破碎的細(xì)胞漿液以5000×g離心10分鐘去除細(xì)胞渣片?；厥蘸琇1+L2抗原的上清液。
加入緩沖液A(20mM MOPS，pH7.0)，以1∶5稀釋上清，并施加到在緩沖液A中平衡的FractogelEMD TMAE-650(S)樹脂的陰離子交換捕獲柱(5.0cm ID×4.8cm)上。用緩沖液A沖洗后，用緩沖液A中0-1.0M NaCl的梯度洗脫抗原。進(jìn)行免疫打點(diǎn)印跡測定自柱中流出的哪個(gè)級(jí)分含有L1蛋白。
經(jīng)免疫打點(diǎn)印跡測定的含有L1蛋白質(zhì)的級(jí)分通過Bradford方法接著是用銀染的SDS-PAGE和Westem印跡測定全部的蛋白質(zhì)。
集中哪些顯示出類似純度且富含L1蛋白的TMAE級(jí)分。通過硫酸銨分級(jí)濃縮抗原。通過加入固體試劑同時(shí)柔和攪拌30分鐘將樣品調(diào)節(jié)至48％飽和硫酸銨。將樣品置于冰上，沉淀過夜。樣品以12000×g離心。沉淀重新懸浮于20.0mL PBS(6.25mM磷酸鈉，pH 7.2，150mMNaCl)。
重懸浮的沉淀物在20-23℃下在Sephacryl 500HR樹脂的大小排阻柱(2.6cm ID×89cm)上分別進(jìn)行層析。洗脫液是PBS。用銀染SDS-PAGE和Nestern印跡檢測分析級(jí)分，集中最純的級(jí)分。所得集中液在50mL攪拌池中用43mm YM-100平片膜(Amicon Beverly，MA)以N2壓力為4-6psi的壓力濃縮。
終產(chǎn)物通過用膠體考馬斯染色的SDS-PAGE分析。通過使用合適抗血清的Western印跡分析證明了L1和L2蛋白的同一性。終產(chǎn)物分成小份并在-70℃下貯存。該過程產(chǎn)生總量0.53mg蛋白質(zhì)。
用Structure Probe(West Chester，PA)進(jìn)行電子顯微鏡分析。一小份樣品置于200目碳包被銅載網(wǎng)。一滴2％磷鎢酸，pH7.0置于載網(wǎng)上20秒。TEM檢驗(yàn)之前使載網(wǎng)空氣風(fēng)干。所有顯微技術(shù)用JEOL 100CX透射電子顯微鏡(JEOL USA，Inc.)以100kV加速電壓進(jìn)行。產(chǎn)生的顯微圖具有100000X最終放大倍數(shù)。證明存在≤25大小范圍內(nèi)的病毒樣顆粒。C.純化重組HPV 16型L1+L2衣殼蛋白除標(biāo)明的外所有步驟在4℃下進(jìn)行。
細(xì)胞在-70℃下冷凍貯存。在20-23℃解凍冷凍的細(xì)胞(濕重＝92.8g)，并再懸浮于105mL“L1緩沖液”(20mM磷酸鈉，pH7.2，100mM NaCl，1.7mM EDTA)中。加入蛋白酶抑制劑PMSF和胃酶抑制劑A，分別達(dá)2mM和1.7mcM終濃度。通過在M110-Y微液化器(Microfluidics Corp.，Newton，MA)中的三個(gè)通道以大約16000psi壓力破碎細(xì)胞漿液。破碎的細(xì)胞漿液以6100×g離心15分鐘以去除細(xì)胞殘?jiān)??；厥蘸蠰1+L2抗原的上清液。
加入緩沖液A(20mM MOPS，pH7.0)，以1∶5稀釋上清液，并加入到在緩沖液A中平衡的FractogelEMD TMAE-650(S)樹脂(EM Separations，Gibbstown，NJ)的陰離子交換捕獲柱(5.0cm ID×4.2cm)。用緩沖液A沖洗后，用緩沖液A中0-1.0M NaCl的梯度洗脫抗原。進(jìn)行免疫打點(diǎn)印跡檢測自柱中流出的哪一級(jí)分含有L1蛋白。
通過Bradford方法，接著是用銀染SDS-PAGE和western印跡對免疫打點(diǎn)印跡確定的含有L1蛋白的級(jí)分測定其全部蛋白質(zhì)。
集中那些顯示類似純度且富含L1蛋白的TMAE級(jí)分。通過硫酸銨分級(jí)濃縮抗原。通過加入固體試劑并同時(shí)柔和攪拌10分鐘將樣品調(diào)至35％飽和硫酸銨。將樣品置于冰上，讓其沉淀進(jìn)行4小時(shí)。樣品以12000×g離心。沉淀再懸浮于20.0mL PBS(6.25mM磷酸鈉，pH 7.2，150mMNaCl)中，所述PBS中含有1mM EDTA。
重新懸浮的沉淀物分開地在Sephacryl 500HR樹脂(Pharmacia，Piscatanay，NJ)的大小排阻柱(2.6cm ID×89cm)上層析。洗脫液是PBS+1mM EDTA。通過用銀染SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡檢測分析級(jí)分，集中最純的級(jí)分。所得集中液用43mm YM-100平片膜(Amicon Beverly，MA)以4-6psi N2壓力在50mL攪拌的小池中濃縮。
終產(chǎn)物用膠體考馬斯染色SDS-PAGE進(jìn)行分析。估計(jì)L1和L2蛋白質(zhì)有70％同源性。通過使用合適的抗血清證明了L1和L2蛋白質(zhì)的同一性。將終產(chǎn)物分成小份并在-70℃下貯存。該過程產(chǎn)生了總量38mg蛋白質(zhì)。實(shí)施例34A.發(fā)酵菌株1679(HPV 16型L1+L2)基本上如上所述進(jìn)行用于制備冷凍原種培養(yǎng)基，接種，發(fā)酵，和菌株1679的細(xì)胞回收的過程。培養(yǎng)67小時(shí)后，達(dá)到每升4.2g干細(xì)胞重的細(xì)胞密度，回收后得到總量93g濕細(xì)胞沉淀物。B.發(fā)酵菌株1678(HPV 16型L1)基本上根據(jù)如上所述進(jìn)行用于制備冷凍原種培養(yǎng)基，接種，發(fā)酵，和菌株1678的細(xì)胞回收過程。培養(yǎng)70.5小時(shí)后，集中兩個(gè)10升發(fā)酵的內(nèi)容物(每升8.7g干細(xì)胞重的細(xì)胞密度)，其回收后得到總共258g濕細(xì)胞沉淀物。C.純化重組HPV 16型L1衣殼蛋白除標(biāo)明的外所有步驟在4℃下進(jìn)行。
菌株#1678細(xì)胞在-70℃下冷凍貯存。冷凍細(xì)胞(濕重＝128g)在20-23℃解凍，并再懸浮于140mL“改良的L1緩沖液”(20mM磷酸鈉，pH7.2，100mM NaCl)中。加入蛋白酶抑制劑和胃酶抑制劑，分別達(dá)2mM和1.7mcM終濃度。通過在M110-Y微液化器(Microfluidics Corp.，Newton，MA)中的3個(gè)通道以大約16000psi壓力將細(xì)胞漿液破碎。破碎的漿液以11000×g離心40分鐘以去除細(xì)胞殘?jiān)；厥蘸蠰1抗原的上清液。
加入緩沖液A(20mM MOPS，pH7.0)，以1∶5稀釋上清液，并加到在緩沖液A中平衡的FractogelEMD TMAE-650(S)樹脂的陰離子捕獲柱(5.0cm ID×6.4cm)上。用緩沖液A沖洗后，用緩沖液A中0-1.0M NaCl的梯度洗脫抗原。進(jìn)行免疫打點(diǎn)印跡檢測自柱中流出的哪一級(jí)分含有L1蛋白。
通過Bradford方法，接著是用銀染SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析免疫打點(diǎn)印跡所確定的含L1蛋白的級(jí)的總蛋白。
集中那些顯示類似純度且富含L1蛋白的TMAE級(jí)分。通過硫酸銨分級(jí)來濃縮抗原。通過加入固體試劑同時(shí)柔和攪拌10分鐘，將樣品調(diào)至35％飽和硫酸銨。樣品置于冰上使沉淀進(jìn)行5小時(shí)。樣品以12000×g離心。沉淀重懸浮于20.0mL PBS(6.25mM磷酸鈉，pH7.2，150mMNaCl)中。
重懸浮的沉淀物分開地在Sephacryl 500HR樹脂(Pharmacia，Piscatanay，NJ)的大小排阻柱(2.6cm ID×89cm)上層析。洗脫液是PBS。通過用銀染SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡檢測分析級(jí)分，收集最純的級(jí)分。所得集中液用43mm YM-100平片膜(Amicon Beverly，MA)以4-6psi N2壓力在50mL攪拌的小池中濃縮。
終產(chǎn)物通過使用膠體考馬斯染色的SDS-PAGE分析。估計(jì)L1蛋白質(zhì)有70％同源性。通過使用合適的抗血清蛋白質(zhì)印跡證明了L1的同一性。將終產(chǎn)物分成小份并在-70℃下貯存。該過程產(chǎn)生總共7.4mg蛋白。D.分析方法免疫打點(diǎn)印跡方法樣品以1∶10稀釋(如果需要)于Milli-Q-H2O中，并將10mcL樣品點(diǎn)滴到Poly ScreenTMPVDF膜(NEN Research Products，Boston，MA)上。斑點(diǎn)干燥后，膜在水中沖洗并使其干燥。第一抗體溶液通過將合適的抗血清稀釋于印跡緩沖液(6.25mM磷酸鈉，pH7.2，5％脫脂乳，150mM NaCl，0.02％NaN3)中而制備。在20-23℃孵育至少1小時(shí)。印跡在三個(gè)變化的PBS(6.25mM磷酸鈉，pH 7.2，150mMNaCl)中各沖洗1分鐘。第二抗體溶液通過將合適的堿性磷酸酶連接的綴合物抗血清于印跡緩沖液中而制備。相同條件下孵育進(jìn)行至少1小時(shí)。象前面一樣沖洗印跡，并用1步NBT/BCIP底物(Pierce，Rockford，IL)檢測。
抗體如下用于檢測通過MAB 837(Chemicon Intemational，Inc.，Temecula，CA)測定HPV 6a L1。HPV 6a L2通過小鼠抗-HPVA L2-trp E融合血清集中液#641和647(由M.Rosolowski室內(nèi)制備)檢測。HPV 16 L1通過MAB885(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)檢測。HPV 16 L2通過小鼠抗-HPV 16 L2-trp E融合血清集中液#611(由K.Jansen室內(nèi)制備)檢測。用于總蛋白的Bradford測定由商購Coomassie Plus藥盒(Pierce，Rockford，IL)測定總蛋白。樣品在Milli-Q-H2O中稀釋至合適的水平。標(biāo)準(zhǔn)和微測定方法所需體積分別為0.1mL和1.0mL。對于兩種方法，使用BSA(Pierce，Rockford，IL)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)廠商說明進(jìn)行測定。用Cricket Graph軟件在Macintosh IIci計(jì)算機(jī)上描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析所有凝膠，緩沖液，和電泳儀器由Novex(San Diego，CA)獲得，并根據(jù)廠商說明進(jìn)行。簡要地說，樣品在Milli-Q-H2O中稀釋至相等蛋白濃度并以1∶1與含有200mM DTT的樣品孵育緩沖液混合。樣品在100℃孵育15分鐘，并加到預(yù)制凝膠12％Tris-甘氨酸凝膠上。樣品以125V電泳1小時(shí)45分鐘。通過各種Heukeshoven和Dernick〔《電泳》(Electrophoresis)，6(1985)103-112〕或使用商購藥盒(Integrated Separation System S，Natick，MA)的膠體考馬斯染色的方法的銀染法使凝膠展開。對于蛋白質(zhì)印跡，蛋白質(zhì)以25V45分鐘轉(zhuǎn)移到LVDF膜上。將膜干燥并如免疫打點(diǎn)印跡一樣和抗體溶液一起孵育。實(shí)施例35制備免疫原組合物根據(jù)已知方法，如通過與藥物可接受載體，穩(wěn)定劑，或疫苗助劑混合而將純化的VLP’s配制成制劑，本發(fā)明免疫原性VLP’s可以通過與生理可接受組合物如，例如PBS，鹽水或蒸餾水混合而制備，用于疫苗應(yīng)用。為了獲得所期望的免疫原性效果，免疫原性VLP’s以大約0.1至100mcg，優(yōu)選大約1至大約20mcg的劑量范圍給予。每制劑中的VLP量可以根據(jù)多種因素而不同，包括但不限于個(gè)體癥狀，體重，年齡和性別。VLP制劑可以通過各種途徑給藥，包括但不限于口服，皮下，局部，粘膜和肌內(nèi)。這種VLP制劑可以由單一類型VLP(即來自HPV 6a的VLP)或VLP的混合物(即來自HPV 6a，HPV 11，HPV 16和HPV 18的VLP)組成。
任意選擇地可以含有抗微生物保鮮劑，例如鄰乙汞硫基苯酸鈉。如果需要，本發(fā)明免疫原性抗原可以結(jié)合疫苗穩(wěn)定劑和疫苗助劑使用。典型的穩(wěn)定劑是特別的化合物，例如聚陰離子如肝素，肌醇六硫酸酯，硫酸化的β-環(huán)糊精，少的特別的賦形劑，例如氨基酸，山梨糖醇，甘露糖醇，木糖醇，甘油，蔗糖，葡萄糖，海藻糖，和改變?nèi)芤簵l件，例如中性pH，高離子強(qiáng)度(大約0.5～2.0M的鹽)，二價(jià)陽離子(Ca2+，Mg2+)。助劑的例子是Al(OH)3和Al(PO4)。本發(fā)明疫苗可以以冷凍或凍干形式下貯存。實(shí)施例36制備VLP的抗體純化的VLP被用來產(chǎn)生抗體。這里所用的術(shù)語“抗體”包括單克隆和多克隆抗體兩者以及其片段，如Fv，F(xiàn)ab和F(ab)2片段，這些片段能結(jié)合抗原或半抗原?？贵w以多種方式被使用，包括但不限于重組VLP的純化，天然L1或L2蛋白的純化，和藥盒。藥盒應(yīng)該包含適于至少在一個(gè)容器中保持密封的間隔化的載體。該載體應(yīng)該進(jìn)一步包括適于檢測HPV或HPV片段或HPV抗體的試劑如抗VLP抗體或VLP。載體也可以含有檢測的手段如標(biāo)記的抗原和酶底物等等?？贵w，或VLP或藥盒用于各種目的，包括但不限于熒光分析和流行病學(xué)研究。實(shí)施例37純化重組HPV 11型L1衣殼蛋白除標(biāo)明的外所有步驟在4℃下進(jìn)行。
細(xì)胞在-70℃冷凍貯存。冷凍細(xì)胞(濕重＝180g)在20-23℃解凍，并再懸浮于900mL“破碎緩沖液”(50mM MOPS，pH7.2，500mM NaCl，1mM CaCl2)中。加入蛋白酶抑制劑AEBSF和胃酶抑制劑A，分別達(dá)1mM和1.7μM終濃度。細(xì)胞漿液通過在M110-Y微液化器(Microfluidics Corp.，Newton，MA)中的4個(gè)通道以大約16000psi壓力破碎。向破碎的細(xì)胞漿液中加入足夠體積的10％TritonX100去污劑(Pierce，Rockford，IL)使TX 100濃度達(dá)0.5％。將漿液攪拌20小時(shí)。用Triton X100處理過的裂解液以12000×g離心40分鐘以去除細(xì)胞殘?jiān)??；厥蘸蠰1蛋白質(zhì)的上清液。
用300K弦切流動(dòng)膜盒(Filtron，Northborough，MA)將上清液用5體積20mM磷酸鈉，pH7.2，0.5M NaCl透析。由膜截留的物質(zhì)經(jīng)放射免疫測定和蛋白質(zhì)印跡分析表明含有L1蛋白。
將保留物加到在20mM磷酸鈉，pH7.2，0.5M NaCl中平衡的SPSpherodex(M)樹脂(IBF，Villeneuve-la-Garenne，法國)的高分辨親和柱(11.0cm ID×5.3cm)上。用平衡緩沖液沖洗后，用20mM磷酸鈉，pH7.2，1.0M NaCl沖洗，用20mM磷酸鈉，pH7.2，2.5MNaCl沖洗步驟洗脫出L1蛋白。在沖洗和洗脫過程中收集級(jí)分。用Bradford法測定柱級(jí)分的總蛋白。然后用蛋白質(zhì)印跡和用膠體考馬斯檢測SDS-PAGE分析級(jí)分，也用放射免疫分析分析級(jí)分。
集中顯示類似純度且富含L1蛋白的SP Spherodex級(jí)分。
終產(chǎn)物用蛋白質(zhì)印跡和用膠體考馬斯檢測的SDS-PAGE分析。估計(jì)L1蛋白質(zhì)有≥90％同源性。蛋白質(zhì)印跡證明了L1蛋白的同一性。終產(chǎn)物通過0.22μm膜滅菌過濾，并4℃下貯存。該過程得到總共100mg蛋白。
用結(jié)構(gòu)探針(Structure Probe)(West Chester，PA)進(jìn)行電子顯微分析。一小份樣品置于200目碳包被銅載網(wǎng)上，一滴20％磷鎢酸， pH7.0置于載網(wǎng)上20秒。在TEM檢測前空氣風(fēng)干載網(wǎng)。所有顯微技術(shù)用JEOL 100Q透射電子顯微鏡(JEOL USA，Inc.)以加速電壓100kV進(jìn)行。得到的顯微圖最終放大倍數(shù)是100 000X。用于總蛋白的Bradford測定用商購Coomassie Plus藥盒(Pierce，Rockford，IL)檢測總蛋白。樣品在Milli-Q-H2O中稀釋到適當(dāng)水平。標(biāo)準(zhǔn)和微測定方法分別需要0.1mL和1.0mL體積。在兩種方案中，用BSA(Pierce，Rockford，IL)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)廠商說明進(jìn)行測定。用CricketGraph軟件在Macintosh IIci計(jì)算機(jī)上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析所有凝膠，緩沖液，和電泳儀器由Novex(San Diego，CA)獲得，并根據(jù)廠商說明進(jìn)行。簡要地說，樣品在Milli-Q-H2O中稀釋至相等蛋白濃度并以1∶1與含有200mM DTT的樣品孵育緩沖液混合。樣品在100℃孵育15分鐘，并加到預(yù)制凝膠12％Tris-甘氨酸凝膠上。樣品以125V電泳1小時(shí)45分鐘。通過使用商購藥盒(IntegratedSepcaration Systems，Natock，MA)的膠體考馬斯染色顯色凝膠。
對于蛋白質(zhì)印跡，以25V40分鐘將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜用Milli-Q-H2O沖洗并空氣風(fēng)干。第一抗體是抗Trp E HPV 11 L1融合蛋白的多克隆兔抗血清(由D.Brown博士惠贈(zèng))。抗體溶液通過將抗血清稀釋于印跡緩沖液(6.25mM磷酸鈉，pH 7.2中的5％脫脂乳，150mM NaCl，0.02％NaN3)而制備。孵育在20-23℃至少進(jìn)行1小時(shí)。印跡在三個(gè)變化的PBS(6.25mM磷酸鈉，pH7.2，150mMNaCl)中各沖洗1分鐘。第二抗體溶液通過將山羊抗-兔IgG堿性磷酸酶連接的綴合物抗血清(Pierce，Rockford，IL)稀釋在印跡緩沖液中而制備。在相同條件下孵育至少1小時(shí)。如前所述沖洗印跡并用一步NBT/BCIP底物(Pierce，Rockford，IL)檢測。實(shí)施例38純化重組HPV 6a型L1衣殼蛋白除標(biāo)明的外所有步驟在4℃下進(jìn)行。
細(xì)胞在-70℃冷凍貯存。冷凍細(xì)胞(濕重＝60g)在45℃水浴中解凍，并再懸浮于300mL“破碎”緩沖液(50mM MOPS，pH 7.2，500mM NaCl，1mM CaCl2)中。加入蛋白酶抑制劑AEBSF和胃酶抑制劑A，分別至1mM和1.7μM終濃度。細(xì)胞漿液通過在M110-Y微液化器(Microfluidics Corp.，Newton，MA)中的5個(gè)通道以大約16000psi壓力破碎。向破碎的細(xì)胞漿液中加入足夠體積的10％TritonX100去污劑(Pierce，Rockford，IL)使TX 100濃度達(dá)0.5％。將漿液攪拌20小時(shí)。用Triton X100處理過的裂解液以12000×g離心40分鐘以去除細(xì)胞殘?jiān)；厥蘸蠰1蛋白質(zhì)的上清液。
用300K切向流膜盒(Filtron，Northborough，MA)將上清液用5體積20mM磷酸鈉，pH7.2，0.5M NaCl透析。由膜截留的物質(zhì)經(jīng)放射免疫測定和蛋白質(zhì)印跡分析表明含有≥90％L1蛋白原量。
將保留物加到在20mM磷酸鈉，pH7.2，0.5M NaCl中平衡的POROS5OHS樹脂(PerseptiVe Biosystems，Cambridge，MA)的高分辨親和柱(5.0cm ID×10.0cm)上。用平衡緩沖液沖洗后，用20mM磷酸鈉，pH7.2，中的0.5-1.5M NaCl線性梯度沖洗L1蛋白，在沖洗和洗脫過程中收集級(jí)分。用Bradford法測定柱級(jí)分的總蛋白。然后用蛋白質(zhì)印跡和用膠體考馬斯檢測SDS-PAGE分析級(jí)分，也用放射免疫分析分析級(jí)分。
集中顯示類似純度且富含L1蛋白的柱級(jí)分。集中的級(jí)分通過0.22μm膜滅菌過濾。產(chǎn)物用43mm YM-100平片膜(Amicon Beverly，MA)以4-6psi N2壓力在50mL攪拌池中濃縮。產(chǎn)物在4℃下貯存。該過程產(chǎn)生總共2.7mg蛋白。
終產(chǎn)物樣品通過TCA沉淀進(jìn)一步濃縮，通過蛋白質(zhì)印跡和用膠體考馬斯檢測SDS-PAGE分析，通過膠體考馬斯染色凝膠的光密度顯示L1蛋白質(zhì)為≥90％同源性。通過蛋白質(zhì)印跡證明L1蛋白的同一性。
用結(jié)構(gòu)探針(Structure Probe)(West Chester，PA)進(jìn)行電子顯微分析。一小份樣品置于200目碳包被銅載網(wǎng)上，一滴20％磷鎢酸，pH7.0置于載網(wǎng)上20秒。在TEM檢測前空氣風(fēng)干載網(wǎng)。所有顯微技術(shù)用JEOL 100CX透射電子顯微鏡(JEOL USA，Inc.)以加速電壓100kV進(jìn)行。得到的顯微圖最終放大倍數(shù)是100000X。用于總蛋白的Bradford測定用商購Coomassie Plus藥盒(Pierce，Rockford，IL)檢測總蛋白。樣品在Milli-Q-H2O中稀釋到適當(dāng)水平。標(biāo)準(zhǔn)和微測定方法分別需要0.1mL和1.0mL體積。在兩種方案中，用BSA(Pierce，Rockford，IL)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)廠商說明進(jìn)行測定。用CricketGraph軟件在Macintosh IIci計(jì)算機(jī)上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析所有凝膠，緩沖液，和電泳儀器由Novex(San Diego，CA)獲得，并根據(jù)廠商說明進(jìn)行。簡要地說，樣品在Milli-Q-H2O中稀釋至相等蛋白濃度并以1∶1與含有200mM DTT的樣品孵育緩沖液混合。樣品在100℃孵育15分鐘，并加到預(yù)制凝膠12％Tris-甘氨酸凝膠上。樣品以125V電泳1小時(shí)45分鐘。通過使用商購藥盒(IntegratedSepcaration Systems，Natock，MA)的膠體考馬斯染色展開凝膠。
對于蛋白質(zhì)印跡，以25V40分鐘將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜用Milli-Q-H2O沖洗并空氣風(fēng)干。第一抗體是抗MAB 837(ChemiconInternational，Inc.，Temecula，CA)其已與堿性磷酸酶(J.Cook，MRL)共價(jià)連接?？贵w溶液通過將抗血清稀釋于印跡緩沖液(6.25mM磷酸鈉，pH7.2中的5％脫脂乳，150mM NaCl，0.02％NaN3)而制備。孵育在20-23℃至少進(jìn)行1小時(shí)。印跡在三個(gè)變化的PBS(6.25mM磷酸鈉，pH7.2，150mM NaCl)中各沖洗1分鐘。洗印跡用一步NBT/BCIP底物(Pierce，Rockford，IL)檢測。
序列表(1)一般信息(i)申請人Lehman，Ernest D.
Cook，III James C.
George，Hugh A.
Hofmann，Kathryn J.
Jansen，Kathrin U.
Joyce，Joseph G.
Markus，Henry Z.
Schultz，Loren D.
(ii)發(fā)明題目純化的乳頭狀瘤病毒蛋白(iii)序列數(shù)目20(iv)聯(lián)系地址(A)住址Christine E.Carty(B)街道126 E.Lincoln Avenue，P.O.Box 2000(C)市Rahway(D)州New Jersey(E)國家USA(F)郵編07065-0907(v)計(jì)算機(jī)可讀方式(A)媒介類型Floppy盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.25(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/339，368(B)申請日14-NOV-1994(C)分類(viii)代理人/事務(wù)所情報(bào)(A)名稱Carty，Christine E.
(B)登記號(hào)36,099(C)參考/檔案號(hào)19341Y
(ix)電訊情報(bào)(A)電話(908)594-6734(B)電傳(908)594-4720(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1CTTAAAGCTT ATGTCACTTT CTCTTGTATC 30(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2TGATAAGCTT GCTCAATGGT TCTCTTCCTC 30(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3TGGTCATCCC AAATCTTGAA A 21(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征
(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4
CACCGTAGTG TTTGGAAGCG A 21(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GAGGCTACCA GCGAGCCGGG C 21(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO6GGCCAGTGGG CCAACAGGTT C 21(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度34堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID NO7GAGAGATCTT ACCTTTTAGT TTTGGCGCGC TTAC 34(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度45堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8CTCAGATCTC ACAAAACAAA ATGTGGCGGC CTAGCGACAG CACAG 45(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度34堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9GAGAGATCTT ACCTTTTAGT TTTGGCGCGC TTAC 34(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度45堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10TCCCCCGGGC ACAAAACAAA ATGGCACATA GTAGGGCCCG ACGAC 45(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度38堿基對
(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11TCCCCCGGGC TAGGCCGCCA CATCTGAAAA AAATAAGG 38(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型 cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12GAAGATCTTC AAAACAAAAT GGCAGTGTGG CTGTCTAC 38(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度34堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO13GAAGATCTTT ATTAAGTACG TCTCTTGCGT TTAG 34(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度39堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14
GGAATTCACAAAACAAAATGGTTGCACGGT CACGAAAC 39(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度32堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO15GGAATTCTTA TTCTGCGTAG ACAGCCACAC TG 32(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO16GAGAGATCTT ACAGCTTACG TTTTTTGCGT TTAGC35(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度47堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO17CTCAGATCTC ACAAAACAAA ATGTCTCTTT GGCTGGCCTAT GTAGGCC 47(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核酸
(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO18GAGAGATCTT ACAGCTTACG TTTTTTGCGTTTAGC 35(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度45堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO19TCCCCCGGGC ACAAACAAAA ATGCGACACA AACGTTCTGC AAAAC 45(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO20TCCCCCGGGC TAGGCAGCCA AAGAGACATC TGA 3權(quán)利要求
1.分離和純化的乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白，所述衣殼蛋白選自L1蛋白、L2蛋白、L1+L2蛋白，和其官能衍生物，所述蛋白至少70％純度。
2.權(quán)利要求1的純化的蛋白，其中乳頭狀瘤病毒選自人乳頭狀瘤病毒和美洲產(chǎn)白尾棕色兔乳頭狀瘤病毒。
3.權(quán)利要求2純化的蛋白，其中人乳頭狀瘤病毒選自HPV 6a，HPV6b，HPV 11，HPV 16，HPV 18，HPV 31，HPV 33，HPV 35，HPV 41，HPV 45，和HPV 58。
4.權(quán)利要求1純化的蛋白，其中蛋白質(zhì)由一合成系統(tǒng)產(chǎn)生，該合成系統(tǒng)包括重組宿主。
5.由權(quán)利要求1蛋白組成的病毒衣殼。
6.由權(quán)利要求1蛋白組成的病毒樣(virus-like)顆粒。
7.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1純化的蛋白質(zhì)的方法，包括(a)用重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主，重組DNA分子編碼選自乳頭狀瘤病毒L1蛋白，乳頭狀瘤病毒L2蛋白，乳頭狀瘤病毒L1+L2蛋白，和其官能衍生物的蛋白；(b)在允許重組DNA表達(dá)，產(chǎn)生粗產(chǎn)物重組乳頭狀瘤病毒蛋白的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主；和(c)純化粗產(chǎn)物重組乳頭狀瘤病毒蛋白以產(chǎn)生純化的蛋白質(zhì)。
8.用權(quán)利要求7的方法產(chǎn)生的重組乳頭狀瘤病毒蛋白。
9.由權(quán)利要求7蛋白質(zhì)組成的病毒衣殼。
10.由權(quán)利要求7蛋白質(zhì)組成的病毒樣顆粒。
11.一種包含權(quán)利要求1蛋白質(zhì)的疫苗。
12.含有權(quán)利要求1蛋白質(zhì)的藥物組合物。
13.一種治療或預(yù)防乳頭狀瘤病毒感染的方法，包括給宿主施用權(quán)利要求11的疫苗。
14.一種檢測乳頭狀瘤病毒或抗乳頭狀瘤病毒抗體的藥盒，包括一種選自下面的試劑編碼乳頭狀瘤病毒蛋白的重組DNA分子，純化的乳頭狀瘤病毒蛋白，由純化的乳頭狀瘤病毒蛋白組成的病毒樣顆粒，抗乳頭狀瘤病毒蛋白的抗體，和抗病毒樣顆?？贵w。
15.一種產(chǎn)生裝配到病毒衣殼中的重組乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白的方法，包括(a)將編碼至少一種乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白的乳頭狀瘤病毒基因克隆到載體中；(b)將載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞；(c)在允許產(chǎn)生乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞；和(d)在允許形成病毒衣殼的條件下純化乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白。
16.用權(quán)利要求15的方法產(chǎn)生的病毒衣殼。
17.由權(quán)利要求16的衣殼組成的病毒樣顆粒。
18.一種誘導(dǎo)脊椎動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包括給動(dòng)物施用權(quán)利要求16的衣殼。
19.一種誘導(dǎo)動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包括給動(dòng)物施用權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)。
20.含有權(quán)利要求6病毒樣顆粒的藥物組合物。
21.含有權(quán)利要求5的衣殼的藥物組合物。
22.權(quán)利要求4的合成系統(tǒng)，其中系統(tǒng)選自轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞。
23.一種制備純化的由至少一種純化的乳頭狀瘤病毒蛋白組成的病毒樣顆粒的方法，該方法包括(a)用陰離子交換層析處理含有至少一種粗乳頭狀瘤病毒蛋白的溶液，產(chǎn)生部分純化的乳頭狀瘤病毒蛋白；(b)將處理過的部分純化的乳頭狀瘤病毒蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀；和(c)用大小排阻層析進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)。
24.乳頭狀瘤病毒的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒包括重組乳頭狀瘤病毒蛋白，且病毒樣顆粒為至少70％純度。
25.一種制備純化的由至少一種純化的乳頭狀瘤病毒蛋白組成的衣殼的方法，該方法包括(a)用陰離子交換處理含有至少一種粗乳頭狀瘤病毒蛋白的溶液，產(chǎn)生部分純化的乳頭狀瘤病毒蛋白；(b)將處理過的部分純化的乳頭狀瘤病毒蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀；和(c)用大小排阻層析進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)。
26.乳頭狀瘤病毒衣殼，該病毒樣顆粒包括重組乳頭狀瘤病毒蛋白，且該衣殼至少70％純度。
全文摘要
本發(fā)明涉及純化的重組乳頭狀瘤病毒(PV)蛋白和其制備,測定,使用及配制成制劑的方法。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1173203SQ95197322
公開日1998年2月11日 申請日期1995年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月14日
發(fā)明者E·D·拉曼, J·C·庫克三世, H·A·喬治, K·J·霍夫曼, K·U·詹森, J·G·喬伊斯, H·Z·馬庫斯, L·D·舒爾茨 申請人:麥克公司