專利名稱：白細胞介素-10的哺乳動物受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明普遍涉及哺乳動物白細胞介素-10受體特有的核酸和多肽，以及特別是它們在制備用于診斷或治療各種受體相關(guān)醫(yī)學(xué)狀態(tài)的試劑中的應(yīng)用。
活化的造血細胞分泌大量蛋白質(zhì)，其中一些被稱作細胞因子。細胞因子通過控制增生作用、分化作用以及免疫細胞的效應(yīng)物功能而在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起著多種重要作用。
細胞因子的作用典型地是由在靶細胞上發(fā)現(xiàn)的特定受體分子所介導(dǎo)的。靶細胞上的這些受體的結(jié)構(gòu)和作用機理不十分清楚，雖然已知其大多由至少兩個分離的多肽鏈構(gòu)成。
其中一條鏈通常以α鏈表示，能夠與它的細胞因子配體以低親合力結(jié)合。這種相互作用可以或不可以導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞中。另一條鏈以β鏈表示，當(dāng)與α鏈聯(lián)合時，它賦予異種二聚體受體與細胞因子結(jié)合的高親和力。β鏈本身通常沒有明顯的配體結(jié)合親和力。受體的二聚體形式與配體(如細胞因子)結(jié)合的結(jié)果是能將信號傳導(dǎo)至細胞中。
抑制其它多種細胞因子合成的一種細胞因子被稱為白細胞介素-10(IL-10)。參見Fiorentino等，J.Exptl.Med.1702081(1989);和Mosmann等，Immunol.Today 12A49-A53(1991)。小鼠和人的對應(yīng)物已被分離。見Moore等，Science 2481230(1990);以及Vieira，等，Proc Nat′l Acad.Sci.USA 881172(1991)。
已描述過被稱為vIL-10或BCRF1的人病毒類似物，它具有許多天然人形式的特征性活性。見Hsu等，Science 250830(1990)。已經(jīng)由馬皰疹病毒中發(fā)現(xiàn)另外的病毒類似物。見Rode等，Viral Genes 7111(1993)。
由于IL-10的生物重要性，并且由于IL-10首先與細胞受體結(jié)合而起作用，因此需要這種受體的分離成分，以及需要制備和使用這些成分的材料和方法。
本發(fā)明通過提供IL-10受體成分的核酸和蛋白質(zhì)序列滿足了這一需要。以人IL-10受體成分和小鼠對應(yīng)物兩者作為例子，雖然用相似方法或以其其它性質(zhì)為基礎(chǔ)將會發(fā)現(xiàn)其它哺乳動物種類的相應(yīng)成分。
更確切地說，本發(fā)明提供了由具有與編碼哺乳動物IL-10受體、其片段或其特定部分序列同源的序列構(gòu)成的重組或分離的核酸。在優(yōu)選的實施方案中，核酸將包括被分離的脫氧核糖核酸，進一步包括來自與編碼IL-10受體基因毗連的5′或3′序列的調(diào)節(jié)序列，或者核酸與遺傳控制單元操作連結(jié)。在另一種實施方案中，受體、片段或其一部分具有生物活性，例如具有IL-10受體的一個特征，或者是來自哺乳動物，包括鼠和人。
在特定實施方案中，核酸能以高嚴謹度與序列SEQ ID NO1或3雜交，或者用探針分離，此探針以高嚴謹度與人IL-10受體基因雜交。本發(fā)明還包括能與例如含有選自下組包括的核苷酸取代、核苷酸缺失、核苷酸插入和核苷酸段轉(zhuǎn)換的突變體的這些序列雜交的核酸。另一種實施方案包括與遺傳控制單元，例如，原核啟動子元件或真核表達控制單元，包括病毒啟動子操作連接的重組核酸。
不同實施方案包括表達編碼IL-10受體或其片段的DNA的表達載體，或包括這些序列和一個選擇標記的載體。本發(fā)明還包括含有能表達這些受體的表達載體的宿主細胞。優(yōu)選的宿主細胞實例包括原核生物，包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌，包括大腸桿菌;低級真核細胞包括酵母;高級真核細胞包括動物細胞如哺乳動物和靈長目動物細胞，包括人。最好受體選自人IL-10受體，或鼠IL-10受體。另外的實施方案包括進一步編碼第二種蛋白質(zhì)或多肽的核酸，例如，第二種多肽與所述受體或其一個片段融合。本發(fā)明還包括含有這些核酸的亞細胞結(jié)構(gòu)、細胞，或含有這些核酸的生物。
本發(fā)明還包括由這些DNA序列編碼的蛋白質(zhì)或多肽，最好基本上不含不是由重組宿主中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或細胞污染物。受體蛋白質(zhì)或多肽通常由哺乳動物體得到，包括鼠或人，具有所示SEQ ID NO2或4的氨基酸序列，或其等位序列或其變種，或其一個特定部分。受體蛋白質(zhì)或多肽能與一個固體支持物相連，可以基本上是純的或藥學(xué)上可接受的形式，有或沒有另外的載體或賦形劑。本發(fā)明也涉及融合蛋白質(zhì)或多肽，包括那些進一步含有來自第二種受體蛋白質(zhì)的一段序列的融合蛋白或多肽。其它實施方案包括亞細胞結(jié)構(gòu)、細胞或含有這種受體蛋白質(zhì)或多肽的生物。
本發(fā)明還提供了在營養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)含有所述核酸的細胞以制備受體蛋白質(zhì)或多肽的方法，以及在細胞中表達該受體蛋白質(zhì)或多肽的方法。各種可選擇的實施方案還包括純化受體蛋白質(zhì)或多肽的步驟，其中把受體蛋白質(zhì)或多肽分泌到培養(yǎng)基中并從那里純化，且其中由哺乳動物，包括鼠和人體內(nèi)得到受體。本發(fā)明還提供了由這些方法制備的受體，并且顯示了不同于正常天然受體的轉(zhuǎn)譯后修飾模式，例如，糖基化;烷基化;和羧基化。受體可在表達顯示非天然受體糖基化模式的受體的細胞系中制得。本發(fā)明還提供了診斷以宿主中不適當(dāng)IL-10應(yīng)答為特征的醫(yī)學(xué)狀態(tài)的方法，包括使得自具有特異性結(jié)合劑的宿主的樣品與(ⅰ)編碼IL-10受體或其片段的核酸接觸;或與(ⅱ)IL-10受體或其片段相接觸，并測定試劑與樣品結(jié)合的程度。在各種可選擇的情況中，結(jié)合劑是編碼受體或其片段的一種基因的核酸探針，識別IL-10受體或其片段的一種抗體;或IL-10受體的一個配體，拮抗劑，或抗拮抗劑。最好受體由哺乳動物，包括鼠和人體中得到。
本發(fā)明還提供了篩選對于IL-10受體有結(jié)合親和力的化合物的方法，包括用所述方法制備分離的或重組的受體;并檢測化合物與該受體的結(jié)合，因而鑒定具有確定結(jié)合親和力的化合物。最好該化合物是這些受體的一種配體，拮抗劑，或抗拮抗劑。
本發(fā)明也提供了蛋白質(zhì)和多肽，例如自然配對的具有與IL-10受體片段同源性氨基酸序列的游離蛋白質(zhì)。典型的情況是，受體由哺乳動物獲得，包括鼠或人，而且特定實施例具有SEQ ID NO2或4序列。
本發(fā)明涉及重組體或基本上純的蛋白質(zhì)，包括與IL-10受體氨基酸序列顯示出實質(zhì)同一性的區(qū)域。特別實施例包括具有選自SEQ ID NO2或4序列的多肽，或連接到固體支持物上的多肽。
本發(fā)明提供了對于IL-10的重組受體或其片段來說具有結(jié)合親和力的多種抗體。優(yōu)選實施例例舉了抗IL-10受體，可以是中和或非中和抗體，與有毒部分融合，或者與包括放射性核素的標識部分接合。同時也提供了象Fab和FV的結(jié)合片段?？贵w或片段最好是結(jié)合到包括鼠或人哺乳動物的受體上。
另外，本發(fā)明提供了治療具有以不適當(dāng)IL-10應(yīng)答或呈現(xiàn)IL-10受體異常表達為特征的醫(yī)學(xué)狀態(tài)的患者的方法，包括給患者施用治療有效量的組合物，該組合物包括(a)與IL-10的受體或其片段結(jié)合的抗體;(b)IL-10受體的配體、興奮劑或拮抗劑;或(c)結(jié)合IL-10受體或其片段的配體。在一實施例中，所述抗體是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。在另外一些實施例中，使靶化合物與(a)IL-10的分離的或重組的受體，或(b)結(jié)合該受體片段的配體接觸，并用分離的或重組IL-10受體，或結(jié)合該受體片段的配體鑒定靶化合物，并鑒定靶化合物的接觸效果，用這種方法來選擇興奮劑或拮抗劑。
本發(fā)明也提供了估評試驗化合物與IL-10受體的結(jié)合親和力的方法，該方法包括接觸(a)含有受體或其片段的樣品;與具有已知該受體親和力的標記化合物，和(b)試驗化合物;并測定被結(jié)合的標記化合物的含量，此量與被結(jié)合到受體上的試驗化合物的量成反比。最好，該受體由哺乳動物，包括鼠或人中得到。另一可選擇實施例是調(diào)控IL-10受體的生物活性的方法，包括使受體與選自與該受體結(jié)合的抗體;IL-10受體的配體，興奮劑或拮抗劑;結(jié)合有IL-10受體片段的配體的組合物接觸。
本發(fā)明也提供了藥盒形式的應(yīng)用試劑。例如，提供了用于(a)確定IL-10受體的數(shù)量;或(b)測定試驗化合物對IL-10受體的結(jié)合親和力的藥盒，該藥盒包括具有該受體結(jié)合親和力的標記化合物，和測量被結(jié)合標記的化合物的工具。
各種實施例包括的藥盒進一步還含有重組體受體，其中所標記的化合物是受體的配體，包括IL-10;其中該化合物是抗體;其中測量工具是固定該受體的固相;或其中該固相含有捕獲分子。本發(fā)明也提供了檢定樣品中抗IL-10受體的抗體的藥盒，包括該受體和抗體測定工具。在一實施例中，該受體與固體支持物相接觸。本發(fā)明還提供了含有用在檢定中的DNA探針例如人IL-10mRNA的藥盒。
本發(fā)明還提供了已知調(diào)控IL-10受體活性的化合物，用下面的方法選擇用IL-10的分離的或重組體受體或其片段接觸該化合物;由這種接觸評估對生物活性的影響。
本發(fā)明還提供了調(diào)控IL-10生物作用的方法，包括干擾生物機制的步驟例如對二類細胞因子受體(例如干擾素受體)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進行干擾。也提供了調(diào)控二類受體例如干擾素的生物作用的方法，包括干擾IL-10受體的生物機制這一步驟。
本文所引用的全部參考文獻特此被完全并入本文作參考。
本發(fā)明涉及哺乳動物IL-10受體亞單位的氨基酸和DNA序列，例如人和鼠IL-10受體亞單位。這些序列由含有特異性結(jié)合IL-10的cDNA表達庫產(chǎn)物的細胞篩選庫得到。這樣得到的受體-配體復(fù)合物被化學(xué)交聯(lián)，多種方法被用來分離編碼結(jié)合蛋白質(zhì)的核酸。
該重組核酸和被分離或被純化的核酸是與編碼IL-10受體亞單位的序列或其片段基本上同源的。本發(fā)明還涉及編碼融合多肽的核酸，以及含有這種核酸的載體、轉(zhuǎn)化的宿主細胞，和生物體。由該核酸衍生的重組體和分離的或純化的IL-10受體亞單位或其片段也是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明也提供了與位于受體亞單位表面的抗原決定簇具有特異性的抗體，包括特異性結(jié)合普遍存在于表面上的抗原決定簇，或結(jié)合一種受體所特有的抗原決定簇的抗體。
本發(fā)明包括含有這些材料的藥盒。藥盒中的各種核酸、多肽和抗體能用于多種診斷中治療目的。
這些材料能用于治療哺乳動物的方法中，特別是那些具有不期望的受體功能的哺乳動物，這些疾病例如自身免疫疾病、二類細胞T輔助的不適當(dāng)免疫應(yīng)答、Ⅱ類MHC的不適當(dāng)功能、被抑制的單核細胞或巨噬細胞相關(guān)的免疫功能、膿毒性或毒性休克反應(yīng)和細胞內(nèi)病原體介導(dǎo)的疾病。這些方法包括施用有效量的這些物質(zhì)，或用這些物質(zhì)接觸生物樣品。
本發(fā)明物質(zhì)還能用來選擇和篩選對受體有特異性的拮抗劑和興奮劑。例如能制備缺少細胞質(zhì)和/或跨膜區(qū)域的可溶解形式的受體亞單位，并用標準方法固定在固體支持物上，用于特異性結(jié)合受體。因此能鑒定特異性結(jié)合至細胞外結(jié)合點或IL-10受體細胞內(nèi)區(qū)域的配體。其中特別的應(yīng)用是影響IL-10受體所歸屬的類的多受體類型，即二類受體類型的配體。在下文中更全面地描述二類受體。
可以制備特異性結(jié)合至配體識別部分或受體其它部分的抗體。受體亞單位或其片段或具有所述亞單元序列的相應(yīng)序列的合成多肽可用作制備這種抗體的一般方法中的抗原。
下面的描述主要涉及鼠或者人IL-10受體，但包括結(jié)構(gòu)或生物活性的很多性質(zhì)將適于這兩者以及其它哺乳動物的對應(yīng)物例如兔、豬、綿羊和山羊等。因此由其它種得到的類似用途和材料能按這里所描述的方法獲得。這樣，其它種可以包括其它溫血種象鳥類或靈長目動物。
這里所使用的標準方法，例如描述在Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor PressWu et al.，(eds)，1989，“Recombinant DNA Methodology”from Methods in Enzymology，Academic Press，NY;Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，(2D ed.)，vols 1-3，CSH Press，NY;Ausubel et al.，Biology，Greene Publishing Associated，Brooklyn，NY;或Ausubel et al.，1987 and Supplements.Current Protocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，New York。
為得到編碼IL-10受體亞單位的核酸，用由應(yīng)答IL-10的細胞分離出的信使RNA(mRNA)構(gòu)建互補DNA(cDNA)庫。用命名為BJAB的AB細胞系制備源于人的cDNA庫，分別以MC/9和J774表示的肥大細胞和巨噬細胞細胞系用于制備源鼠的cDNA。
用幾種改變和獨特技術(shù)通過表達克隆克服與分離cDNA克隆相關(guān)的問題。特別是需要鑒定適宜的細胞系，其中編碼所需IL-10結(jié)合活性的cDNA庫能被制備。確定IL-10是否能與克隆分離的表達產(chǎn)物結(jié)合，以及選擇具有低背景IL-10結(jié)合活性的細胞系用于表達是重要的。
通過加入提供測定配體-受體交聯(lián)復(fù)合物手段的N-末端延伸部分來修飾用作配體的IL-10(下文中“IL-10”和“配體”一詞可以互換使用)。所用延伸部分是被一種抗體特異性識別的FLAG肽，雖然也可以用其它延伸部分來代替。見Hopp et al.，Bio/Technology 61204(1988)。不知道所述延伸部分是否與配體-受體互相作用干擾，或所觀察到的任何IL-10結(jié)合蛋白質(zhì)相互作用是否在生理上恰當(dāng)?shù)摹?br> 通過使用這種延伸部分，能測定表達受體成分的細胞，以及在其表面具有交聯(lián)復(fù)合體的親和性固定細胞。這兩種方法被用于豐富和驗證IL-10受體亞單位的特性。
制備鼠和人細胞受體亞單位cDNAs后，將其測序。
本發(fā)明涉及實際上被測序的非糖基化受體亞單位，該蛋白質(zhì)的等位變異體和各種代謝變異體，例如同不同細胞類型產(chǎn)生的轉(zhuǎn)譯后修飾作用，包括用在重組體表達系統(tǒng)中的天然細胞和宿主細胞。通過選擇適當(dāng)?shù)募毎茨軌蛑苽涓鞣N糖基化變異體和轉(zhuǎn)譯后修飾變異體。
分別用SEQ ID NOs1和2來定義完全的人IL-10受體亞單位(IL-10R)核苷酸序列和被推測的氨基酸序列。鼠核苷酸序列和從中所推測的氨基酸序列分別用SEQ ID NOs3和4來定義。SEQ ID NO3中的起始密碼子由堿基61開始。
由以SW8.1表示的克隆中得到人序列，SW8.1在一質(zhì)粒中于1992年12月4日保藏于American Type Culture Collection，Rockville，MD(ATCC)，且登記保藏號為ATCC69146。疏水膜距片段顯示與人受體成分的氨基酸217～243相對應(yīng)。因此，可溶性結(jié)合片段對應(yīng)于來自大約殘基1～216或更短的一個延伸部分。
由以pMR29命名的克隆得到鼠序列，pMR29在一質(zhì)粒中，于1992年12月4日保藏于ATCC，且登記保藏號為ATCC69147。
這里所使用的術(shù)語“IL-10受體亞單位”意指包括用SEQ ID NO2或4定義的或用以SEQ ID NO1或3定義的核酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或肽。這個術(shù)語也指特異性結(jié)合IL-10的這類蛋白質(zhì)或多肽的片段。這類片段可通過蛋白水解裂解、化學(xué)合成或重組方法來制備。
本發(fā)明的一些IL-10受體亞單位以高親和力結(jié)合到IL-10上，象人或鼠的IL-10，高親和力例如至少大約10nM，通常高于3nM，優(yōu)選高于1nM，更優(yōu)選的高于0.5nM。當(dāng)額外的蛋白質(zhì)成分與這里所公開的成分例如類α鏈相聯(lián)系時，期望多蛋白復(fù)合體與其配體的結(jié)合親和力將增大。
本發(fā)明還包括具有與本文所定義的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或肽，但除外顯示與確知的G-CSF、GM-CSF、EPO、TNF、IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6或IL-7受體亞單位序列同源性相同或較少的氨基酸序列同源性的任何蛋白質(zhì)或肽。
一些肽不結(jié)合IL-10，但可以結(jié)合涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或其它與受體相互作用的迄今未鑒定的細胞內(nèi)分子。這些肽具有相應(yīng)于受體細胞內(nèi)或跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了未知結(jié)合能力的其它肽。由于它們具有相應(yīng)于部分受體分子的氨基酸序列，因此這些肽可用作例如制備抗體的抗原。
通過優(yōu)化殘基匹配，如果需要，通過引入需要的空隙來測定氨基酸序列同源性，或序列同一性。考慮到匹配時取代基的轉(zhuǎn)化，上述情況可以有不同變化。轉(zhuǎn)化的取代基有代表性地包括下組范圍內(nèi)的取代基[甘氨酸，丙氨酸];[纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸];[天冬氨酸，谷氨酸];[天冬酰胺，谷氨酰胺];[絲氨酸，蘇氨酸];[賴氨酸，精氨酸]和[苯丙氨酸，酪氨酸]。同源的氨基酸序列趨于包括每個受體序列的天然等位變異體和種間變異體。
典型的同源性蛋白質(zhì)或多肽與本文所定義的氨基酸序列相比具有25～100%同源性(如果引入空隙)，至50～100%同源性(如果轉(zhuǎn)化取代基被包括在內(nèi))。同源性檢測為至少大約50%，一般至少56%，較一般至少62%，經(jīng)常至少67%，較經(jīng)常至少72%，典型地至少77%，較典型地至少82%，通常至少86%，較通常至少90%，最好至少93%，更優(yōu)選至少96%，在特別優(yōu)選實施方案中，至少98%或更多。一些同源的蛋白質(zhì)或多肽，象各種受體亞型，與IL-10受體成分共有多種生物活性;例如用于陳述本發(fā)明的有關(guān)實施例。
這里所使用的術(shù)語“生物活性”沒有限定地定義為包括結(jié)合配體(例如類IL-10蛋白質(zhì))、與抗每個受體組分的抗體的交叉反應(yīng)性和配體依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。“配體相關(guān)活性”是指或者配體自身結(jié)合，或者以配體結(jié)合所介導(dǎo)的生物活性，包括例如第二信使調(diào)制，Ca++吸收，磷酸化作用，蛋白質(zhì)結(jié)合等。
術(shù)語“配體”是指通常是類細胞因子肽家族成員的分子，其通過涉及肽配體結(jié)合的片段與受體結(jié)合。配體也是作為或者所述受體結(jié)合的天然配體，或是其類似物的分子，或者是天然配體的功能類似物的分子。該功能類似物可以是結(jié)構(gòu)改變的配體或者可以是完全不相關(guān)的分子，該分子具有與適宜配體結(jié)合決定域相互作用的分子形狀。這些配體可以作為興奮劑或拮抗劑，參見例如Goodman等，(eds)，Goodman and Gilman′sThe Pharmacological Bases of Therapeutics(8th ed)，1990，Pergamon Press。
特別有用的溶解性受體亞單位片段可結(jié)合IL-10配體。因為完整的受體顯示含有配體與之結(jié)合的細胞外區(qū)域，由殘基217～243跨膜螺旋片段的氨基近端細胞外碎片構(gòu)成的蛋白質(zhì)將顯示如此的結(jié)合活性。很容易檢測細胞外區(qū)與其它蛋白質(zhì)和較短片段融合的配體結(jié)合活性。由細胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成的片段也可以應(yīng)用。
人和鼠IL-10受體亞單位在DNA和蛋白質(zhì)序列水平上顯示出70～75%同源性。在明顯結(jié)構(gòu)基序的基礎(chǔ)上，IL-10受體亞單位屬于細胞因子受體超家族的二類組中的一員。參見例如Bazan，Immunology Today 11350(1990);和Bazan，Proc.Nat′l Acad.Sci USA876934(1990)。
一類受體的特征基序包括四個保守的胱氨酸和一個色氨酸殘基的氨基末端，和間位芳族殘基的羧基末端(膜近端的)。二類受體的基序特征是一個在氨基末端這一半中的保守的色氨酸和第二半胱氨酸對，在羧基末端這一半中的WS×WS盒類似物，和第二個保守的半胱氨酸對。
二類中的其它受體是α-干擾素(IFN-α)受體、γ-干擾素(IFN-γ)、組織因子受體，以及一種第二溶解的病毒IFN受體同源物的受體。這里所描述的IL-10受體成份特別與γ-干擾素受體密切相關(guān)。這些結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的相似性提示IL-10作用其受體上的機理可能與IFN-γ和其受體的相互作用相似，盡管它是否確切不是本發(fā)明的內(nèi)容。參見例如Levy，et al.，New Biologist 2923(1990);Sen et al.，J.Biol.Chem.2675017(1992);和Uze，et.，al.，Proc.Nat′l Acad.Sci，USA 894774(1992)。
例如，IL-10對由IFN-γ引起的巨噬細胞激活的拮抗作用可直接介入IFN應(yīng)答的信號聯(lián)級。這可通過IFN信號途徑中的一種成分與IL-10途徑中的一種成分相互作用來實現(xiàn)。在兩種途徑中共有一些成分實際上是可能的，包括活性受體復(fù)合物中一種或幾種成分的直接結(jié)構(gòu)重疊，例如共有的類β亞單位。
另外，IFN和IL-10受體成分的結(jié)構(gòu)相似性將預(yù)示在一種途徑中很關(guān)鍵和在另一種途徑中保守的受體結(jié)構(gòu)區(qū)將具有相同的重要性。這種可預(yù)示性延伸至配體分子表面形狀和可能與下游信號途徑成分相互作用的分子內(nèi)特性。由此提出調(diào)控IL-10生物作用的方法，包括干擾干擾素受體(包括例如IFN的興奮劑或拮抗體，或與IFN受體突變體同源的IL-10受體變異體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟。因此期望保守區(qū)的中和抗體對該家族中的其它受體具有相似效果。
本發(fā)明涉及分離的核酸，例如DNA或編碼IL-10受體亞單位的片段的應(yīng)用。并且，本發(fā)明涉及分離的或重組體DNA，或其片段的應(yīng)用，它們編碼的蛋白質(zhì)同源于每一相關(guān)種的變異體或受體，或用編碼IL-10受體的cDNA作探針所分離的。被分離的DNA具有5′和3′側(cè)面的相應(yīng)調(diào)控序列，例如啟動子，增強子，多聚腺苷酸增加信號，和其它本領(lǐng)域公知序列。這樣的核酸一般用作例如編碼IL-10受體或其片段的mRNA基因的探針。
本文所定義的一種“分離”的核酸是一種例如RNA、DNA，或混合的聚合物的核酸，它實質(zhì)上與其它成分分離，所述其它成分是本來伴有的天然序列，例如核糖體、聚合酶和起源種中的側(cè)翼基因組序列。該術(shù)語包括已經(jīng)從其天然存在環(huán)境中分離出的核酸序列，和包括重組的或克隆的DNA分離物以及化學(xué)合成的類似物或用異源體系合成的生物類似物。一種基本上純化的分子包括該分子的被分離的形式。
一種被分離的核酸通常是一均勻的分子的組合物，但在一些實例中含有少量不均勻性。這種不均勻性典型地在見于聚合物的兩端或?qū)λ枭锕δ芑蚧钚圆恢匾牟糠帧?br> “重組的”核酸或者用其制備方法或者根據(jù)其結(jié)構(gòu)來定義。參照其制備方法，例如用一種方法制備一種產(chǎn)品，該方法是重組核酸技術(shù)的應(yīng)用，例如包括在核苷酸序列中人為地插入。或者它是一種通過產(chǎn)生一種包括兩個片段融合的序列制備的核酸，這兩個片段不是天然就相互接鄰的，但意指不考慮天然存在的產(chǎn)物，例如天然存在的突變體。
因此，例如本發(fā)明包括通過用任何非天然存在的載體轉(zhuǎn)化的細胞制備的產(chǎn)物，也包括用任何合成的寡核苷酸方法得到的序列的核酸。通常用編碼相同或保守的氨基酸的豐富的密碼子取代一個密碼子來達到這一目的，同時典型地引入或移去一個序列識別位點。或者通過連接所需功能的核酸片段得到單個遺傳實體來實現(xiàn)，該遺傳實體包括所需功能的聯(lián)合，但這些功能在一般可得的天然形式中未被發(fā)現(xiàn)。
本文所定義的核酸“片段”是至少大約17個核苷酸的接鄰片段，一般至少21個核苷酸，更一般至少25個核苷酸，普通地至少30個核苷酸，更普通地至少35個核苷酸，經(jīng)常至少42個核苷酸，更經(jīng)常至少49個核苷酸，典型地至少58個核苷酸，更典型地至少75個核苷酸，通常至少100個核苷酸，更通常至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選的是至少500個核苷酸，在特別優(yōu)選的實例中將至少800或更多核苷酸。
編碼IL-10受體亞單位或其片段的DNA能用于鑒定編碼相關(guān)或同源受體的基因、mRNA和cDNA種類，以及編碼這些受體成分種的變異體的核酸。如此應(yīng)用的優(yōu)選探針編碼于不同種變異體之間保守的受體的區(qū)。用序列比較可以鑒定保守區(qū)。
本發(fā)明還涉及具有相同于或高度同源于本文所提及的被分離DNA的DNA序列的重組DNA分子和片段。特別是，該序列經(jīng)常與控制轉(zhuǎn)錄、翻譯和DNA復(fù)制的DNA片段操作連接。也可以得到含有內(nèi)含子的基因組序列，以及分離它們的方法。
當(dāng)進行比較時，同源核酸序列顯示明顯的相似性。核酸同源性標準是或者用通常用于本領(lǐng)域的序列比較來測定同源性，或者是以雜交條件為基礎(chǔ)。在下文中更詳細地描述了雜交條件，雜交條件被與其它已知細胞因子受體的同源性進一步地限定，該受體例如上文描述的受體成分。除任何所述參數(shù)外，同源性程度將被限制到超過與這些受體的任何此類相似性，這些受體例如GM-CSF、IL-3、IL-4和IL-5受體成分。
基本的核酸序列同源性是指當(dāng)用適當(dāng)核苷酸插入或缺失進行適當(dāng)排列時其片段或其互補鏈，至少大約50%核苷酸是相同的，一般至少是56%，更一般至少59%，普通地至少62%，更普通地是65%，經(jīng)常至少68%，更經(jīng)常至少71%，典型地至少74%，更典型地至少77%，通常至少80%，更通常至少大約85%，最好至少大約90%，更好地至少大約95至98%，在特別實例中高至大約99%或更多的核苷酸。
當(dāng)在選擇的(嚴格地)雜交條件下使所述片段與一股鏈或其補體(典型地使用本文定義的序列)雜交時也存在基本的同源性。
所述同源性對比的長度可以覆蓋較長范圍，且在某些方案中將覆蓋至少大約17個核苷酸的范圍，通常至少大約20個核苷酸，更通常至少大約24個核苷酸，典型地至少大約28個核苷酸，更典型地至少大約40個核苷酸，最好至少大約50個核苷酸，更好至少大約75至100或更多個核苷酸。
在指雜交作用中的同源性時，嚴格的條件是指典型控制在雜交反應(yīng)中的鹽、溫度、有機溶劑和其它參數(shù)的嚴格結(jié)合條件。嚴格的溫度條件通常包括超過大約30℃，更通常超過大約37℃，典型地超過大約45℃，更典型地超過大約55℃，最好超過大約65℃，更好超過大約70℃的溫度。嚴格的鹽條件普遍地少于大約1000mM，經(jīng)常少于大約700mM，通常少于大約500mM，更通常至少少于大約400mM，典型地少于大約300mM，最好少于大約200mM，更好少于大約150mM。然而參數(shù)的結(jié)合作用比任何單個參數(shù)的檢測重要的多[Wetmur et al.，J.Mol.Biol.31349(1968)]。
本文所描述的被分離和被鑒定的核酸能用來制備變異體和突變體。它們也能用來制備有用的載體構(gòu)建體，例如用于制備轉(zhuǎn)基因細胞，包括同源重組作用，例如基因“破壞”(“Knock-out”)動物，以及用于基因治療。參見Goodnow，“Transgenic Animals”in Roitt(ed.)，Encyclopedia of Immunology，1992，Academic Press，San Diego，pp.1502-1504;Travis，Science 2561392(1992);Kuhn，et al.，Science 254707(1991);Capecchi，Science2441288(1989);Robertson，(ed.)，Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells∶A Practical Approach，1987，IRL Press，Oxford;Rosenberg，J.Clinical Oncology 10∶180(1992)。
用核苷酸取代、缺失、插入和顛換能容易地修飾分離的受體DNA。最好在表達產(chǎn)物中保持IL-10結(jié)合能力。這樣得到的突變體受體能容易地進行如本文所描述的與IL-10的特異性結(jié)合試驗。用已知方法象位點-特異性突變能制備這些被修飾的序列。例如用修飾的引物、本文所描述的序列和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)也能制備修飾的序列。
本發(fā)明還提供了重組蛋白質(zhì)，例如用受體亞單位片段構(gòu)成的異源融合蛋白質(zhì)。異源融合蛋白是通常在同樣方式存在下不是自然融合的蛋白質(zhì)或片段的融合物。因此具有受體多肽的免疫球蛋白的融合產(chǎn)物是具有以典型多肽鏈融合的序列的連續(xù)的蛋白質(zhì)分子，例如典型地制成單個翻譯產(chǎn)物并展現(xiàn)由每一肽源帶來的性質(zhì)。相似概念適用于異源核酸序列。
另外，結(jié)合其它蛋白質(zhì)的相似功能區(qū)能制備新的構(gòu)成體。例如，在不同的新的融合多肽或片段之間可以“交換”配體結(jié)合或其它片段。參見例如Canningham et al.，Science 243∶1330(1989);和O′Dowd，et al.，J.Biol.Chem.263∶15985(1988)。因此由配體結(jié)合特性和細胞內(nèi)區(qū)的功能化結(jié)合導(dǎo)致呈現(xiàn)新的特性結(jié)合的新的嵌合多肽。例如，對于這些受體的其它結(jié)合區(qū)來說，其它相關(guān)受體的配體結(jié)合區(qū)可以被加入或被取代。所得蛋白質(zhì)將總具有雜合功能和性質(zhì)。
通過Beaucage et al.，Tetra.Letts.221859(1981)所描述的磷酰胺(phosphoramidite)方法能制備適當(dāng)?shù)暮铣蒁NA片段?；蛘吆铣善浠パa鏈并在適宜條件下一并將所合成鏈退火，或者利用有適當(dāng)引物序列的DNA聚合酶加入其互補鏈，經(jīng)常通過這兩種方法得到雙鏈片段。
本發(fā)明提供了制備融合蛋白質(zhì)的方法。盡管具有顯著的結(jié)構(gòu)相似性，但各種受體變異體具有稍微不同的功能或生物活性。用現(xiàn)代分子生物學(xué)標準技術(shù)分析影響受體不同生理功能或生物活性的結(jié)構(gòu)元件是可能的，特別是在細胞因子受體的相關(guān)家族范圍中比較變異體。參見描述在Cunningham et al.，(同上) 中的同源掃描誘變技術(shù)，以及用在O′Dowd et al.(同上)和Lechleiter et al.，EMBO J.94381(1990)中的方法。
配體結(jié)合碎片段能在受體間被取代以測定哪種結(jié)構(gòu)性質(zhì)對于配體結(jié)合親和力和特異性兩者來說是重要的。易受細胞外配體影響的受體片段是這種分析的基本靶物。大量不同受體變異體例如等位變異體將被用來篩選顯示有與它們相互作用的結(jié)合性質(zhì)的配體。細胞內(nèi)功能可能包括通常易受胞液影響的受體片段。然而在某些環(huán)境中可以發(fā)生受體內(nèi)在化，也可以發(fā)生細胞內(nèi)成分和稱為“細胞外”片段兩者間的相互作用。這些細胞內(nèi)功能通常包括來自結(jié)合配體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過誘變或直接的生化方法，例如交聯(lián)或親和力方法可以鑒定受體與其它蛋白質(zhì)相互作用的特異性片段。也可以應(yīng)用結(jié)晶的或其它物理方法進行結(jié)構(gòu)分析。鑒定具有不同功能的受體變異體間的相似性和不同點將產(chǎn)生新的診斷和治療試劑和處理方法。
能在pMR29和pSW8.1克隆中得到編碼IL-10受體亞單位或其片段的核酸，或者能通過化學(xué)合成或篩選cDNA或基因組庫的方法獲得，所述基因組庫由細胞系或組織樣品制備。
這樣的核酸能在許多宿主細胞中表達出完全長度的受體亞單位或受體的片段的合成，然后，例如被用于產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體;用來進行結(jié)合研究;來進行被修飾受體分子的構(gòu)成和表達;并用來研究結(jié)構(gòu)/功能。每個受體或其片段能在宿主細胞中被表達，所述宿主細胞是用適當(dāng)表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染過的。這些分子實際上是不含蛋白質(zhì)或細胞污染物，而不是從重組宿主產(chǎn)生的，因此特別用于當(dāng)與藥學(xué)上可接受載體和/或稀釋劑結(jié)合時的藥物組合物。該受體或其一部分可以作為與其它蛋白質(zhì)的融合物被表達。
表達載體是典型地自我復(fù)制DNA或RNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有例如所需受體基因或其片段，通常與在適當(dāng)宿主細胞里被識別的適當(dāng)遺傳控制元件操作連接。這些控制元件能影響在適當(dāng)宿主中的表達。促進表達需要的控制元件的特殊類型取決于實際應(yīng)用的宿主細胞。一般遺傳控制元件包括原核生物的啟動子系統(tǒng)或真核生物的啟動子表達控制系統(tǒng)，且典型地包括一個轉(zhuǎn)錄啟動子，可任意選擇的操縱基因以控制轉(zhuǎn)錄的起始、提高mRNA表達水平的轉(zhuǎn)錄增強子、編碼適當(dāng)核糖體結(jié)合位點的序列，以及終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。表達載體通常也包括使得該載體在宿主細胞獨立復(fù)制的復(fù)制起點。
本發(fā)明載體含有編碼類IL-10肽受體，或其編碼一生物活性受體多肽的片段的DNA。該DNA能在病毒啟動子的控制下，并能編碼選擇標志。本發(fā)明進一步涉及應(yīng)用這種能在原核或真核宿主內(nèi)表達編碼受體的真核生物的cDNA的表達載體，其中所述載體與宿主相容，且編碼該受體的真核cDNA被插入到載體中使得含有這種載體的宿主的生長表達被討論的cDNA。通常，表達載體被設(shè)計為在其宿主細胞中穩(wěn)定的復(fù)制或為大大增加每個細胞中所需基因拷貝總數(shù)目的擴增。并非總需要在宿主細胞復(fù)制表達載體，例如有可能影響用載體在各種宿主中能產(chǎn)生IL-10受體或其片段的瞬時表達，所述載體不含有被該宿主細胞識別的復(fù)制起源。通過重組作用也可能應(yīng)用引起IL-10受體或其片段進入宿主DNA的整合作用。
本文所使用的載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、可整合DNA片段和其它能進行使DNA片段進入宿主基因組的整合作用的載體。表達載體是含有影響實現(xiàn)操作連接基因表達的遺傳控制元件的特定載體。質(zhì)粒是最常用的載體形式，但其它具有相當(dāng)功能和是或變?yōu)楸绢I(lǐng)域公知的載體形式也適用于本發(fā)明。參見例如Pouwels et al.，Cloning VectorsA Laboratory Manual，1985，和Supplements，Elsevier，N.Y.;和Rodriquez et al.，(eds)，VectorsA Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，1988，Buttersworth，Boston.
轉(zhuǎn)化細胞最好是用由重組體DNA技術(shù)構(gòu)建的受體載體轉(zhuǎn)化過或轉(zhuǎn)染過的哺乳動物細胞。轉(zhuǎn)化的宿主細胞通常表達受體或其片段，但是為克隆、擴增和操縱其DNA的目的，則不需要表達受體。本發(fā)明進一步涉及在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞，因此使得受體或片段例如可溶性蛋白質(zhì)在培養(yǎng)物中積累。受體蛋白質(zhì)能從細胞或從培養(yǎng)基中被回收。
為了本發(fā)明的目的，當(dāng)其功能彼此相關(guān)時，操作連接DNA序列。例如如果被表達為前蛋白質(zhì)或其參與引導(dǎo)多肽到細胞膜或參與多肽分泌，前序列或分泌引導(dǎo)序列被操作連接于多肽上。如果其控制多肽的轉(zhuǎn)錄，則啟動子與編碼序列操作連接;如果其定位進行翻譯，則核糖體結(jié)合位點與編碼序列操作結(jié)合。通常，操作連接是指接鄰的和在碼內(nèi)，然而一些遺傳元件象阻遏子基因不是接鄰鍵合的，而是與操縱基因序列結(jié)合，然后控制表達。
適當(dāng)?shù)乃拗骷毎ㄔ思毎?、低級真核細胞和高級真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性微生物，例如大腸桿菌和枯草芽胞桿菌。低級真核生物包括酵母，例如啤酒酵母和畢赤氏酵母，以及網(wǎng)柄粘菌屬中的種。高級真核生物包括由動物細胞獲得的組織培養(yǎng)細胞系，包括非哺乳動物源，例如昆蟲細胞和鳥類，以及哺乳動物源，例如人、靈長目動物和嚙齒動物。
原核生物宿主-載體體系包括適合許多不同種的寬范圍載體。如本文所應(yīng)用的，大腸桿菌和其載體一般被用于包括其它原核生物應(yīng)用的相當(dāng)?shù)妮d體。擴增DNA的代表性載體是pBR322或很多其衍生物。能用來表達受體或其片段的載體包括但不限制于這樣的載體，即那些含有l(wèi)ac啟動子(pUC-系列);trp啟動子(pBR322-trp);Ipp啟動子(pIN-系列);λ-pP或pR啟動子(pOTS);或者雜交啟動子象ptac(pDR540)。參見Brosius等.，“Expression Vectors Employing Lambda-，trp-，lac-，and Ipp-derived Promoters”，in VectorsA Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，(eds.Rodriguez and Denhardt)，1988，Buttersworth，Boston，Chapter 10，pp.205～236。
可以用含有載體的IL-10受體序列轉(zhuǎn)化低級真核生物，例如酵母和網(wǎng)柄粘菌屬。為了本發(fā)明的目的，最普通的低級真核生物宿主是面包酵母，啤酒酵母。盡管也能應(yīng)用許多其它的株和種，但上述酵母通常用來代表低級真核生物。酵母載體典型地包括復(fù)制起源(整合型除外)、選擇基因、啟動子、編碼受體或其片段的DNA、翻譯終止及多聚腺苷酸化作用和轉(zhuǎn)錄終止序列。適當(dāng)?shù)慕湍副磉_載體包括象構(gòu)成啟動子如3-磷酸甘油酯激酶和各種其它糖酵解酶基因啟動子或可誘導(dǎo)(inducible)啟動子象乙醇脫氫酶2啟動子或金屬硫堇啟動子。適當(dāng)?shù)妮d體包括下面類型的衍生物自我復(fù)制的低拷貝數(shù)(象YRp-系列)，自復(fù)制高復(fù)本數(shù)(象YEp-系列);整合類型(象YIp-系列)，或者小染色體(象YCp系列)。
生長在組織培養(yǎng)物中的高級真核細胞通常是用于表達功能活性IL-10受體蛋白質(zhì)的優(yōu)選宿主細胞。原則上，任何高級真核組織培養(yǎng)細胞系都是可用的，例如昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，無論源于無脊椎動物或者源于脊椎動物。然而，通常優(yōu)選哺乳動物細胞。細胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染以及繁殖已成為常用的方法。有用的細胞系的例子包括HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系、幼鼠腎(BRK)細胞系、昆蟲細胞系、鳥類細胞系以及猴(COS)細胞系。
這樣的細胞系表達載體包括復(fù)制起源、啟動子、翻譯起始位點、RNA拼接位點(如果使用基因組DNA)、多聚腺苷酸化(polyadenylation)位點以及轉(zhuǎn)錄終止位點。這些載體通常也含有選擇基因或擴增基因。適合的表達載體可以是質(zhì)粒、病毒、或者載有例如由象腺病毒、SV40、牛痘病毒或巨細胞病毒這些來源中得到的啟動子的逆轉(zhuǎn)錄病毒。適當(dāng)?shù)谋磉_載體的代表性例子包括pCDNA1(Invitrogen，San Diego，CA);pCD[Okayama et al.，Mol.Cell Biol.51136(1985)];pMClneo Poly-A[Thomas et al.，Cell 51503(1978)];以及桿狀病毒載體象pAC 373 or pAC 610[O′Reilly et al.，Baculovirus Expression VectorsA Laboratory Manual，1992，F(xiàn)reeman & Co.，N.Y.
通常希望在提供特定的或確定的糖基化方式的系統(tǒng)中表達受體多肽。這種情況下，通用方式由表達體系自然提供。然而，通過向被引入異源表達體系的適當(dāng)?shù)奶腔鞍踪|(zhì)暴露該多肽，例如一種非糖基化形式，將修飾這種方式。例如用一種或幾種編碼哺乳動物或其它糖基化酶的基因可以與該受體基因共同轉(zhuǎn)化。用這種方法，在原核生物或其它細胞中能實現(xiàn)某些哺乳動物糖基化作用方式。
本發(fā)明的核酸將提供具有高受體蛋白質(zhì)含量的有用材料來源。表達這些蛋白質(zhì)的細胞是純化蛋白質(zhì)的天然受體形式或其變異體的來源。另外，純化片段能與受體的適當(dāng)部分融合以幫助分離和制備。例如FLAG序列，或功能等同物，能通過一種可除去蛋白酶序列與蛋白質(zhì)融合，使得FLAG序列被一種親和試劑識別，且純化的蛋白質(zhì)易受蛋白酶消化而移去延伸部分。
存在許多其它等價片段，例如對重金屬柱試劑具有親和特性的多聚組氨酸片段。參見例如Hochuli，Chemische Industrie 12∶69(1989);Hochuli，“Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Adsorbent”in Setlow(ed)，Genetic Engineering，Principle and Methods 12∶87，1990，Plenum Press，N.Y.;和Crowe et al.，QIAexpress∶The High Level Expression & Protein Purification System，1992，QUIAGEN，Inc.Chatsworth，CA.
而且，適當(dāng)?shù)乃拗骷毎梢员挥糜诟咚降夭⒃谠试S進行所需翻譯后加工的條件下表達受體蛋白質(zhì)，例如糖基化作用變異體。
制備出高水平表達物后，應(yīng)用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)將IL-10受體成分純化至接近均一。這些方法包括硫酸銨沉淀法、柱色譜、電泳、離心、結(jié)晶和其它。參見例如Ausubel et al.，1987和定期增刊，Current Protocols in Molecular Biology;Deutscher，“Guide to Protein Purification”in Methods in Enzymology Vol 182，1990，以及此系列中的其它內(nèi)容;以及蛋白質(zhì)純化產(chǎn)物的應(yīng)用方面的合成文獻，例如Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，CA。
本發(fā)明還提供了IL-10受體亞單位鹽和被標記的衍生物。這樣的衍生物可以包括與化學(xué)基團的共價或集聚化合。這些衍生物通常分為三類(1)鹽，(2)側(cè)鏈和末端殘基共價修飾，和(3)吸附復(fù)合物，例如與細胞膜吸附。這樣的共價或聚集衍生物用作免疫原、免疫分析中的試劑，或被用于純化方法中，象IL-10或其它結(jié)合配體的親和純化中。
例如用本領(lǐng)域公知的方法通過共價鍵使IL-10受體或其可溶解形式固定在固相載體上例如溴化氰活化的瓊脂糖上，或吸附到聚烯表面，有或沒有戊二醛交聯(lián)，用于抗IL-10受體抗體或IL-10的分析或純化。也能用可檢測基因標記IL-10受體，例如用氯胺T放射性碘標記的方法，與稀土螯合物的共價鍵合，或與另外一個用于診斷分析中的熒光基團共軛。
本發(fā)明的可溶性IL-10受體能被用作制備特異于該受體或其片段的抗血清或抗體的免疫原。被純化的受體能被用來篩選單克隆抗體或由用含有IL-10受體的不純產(chǎn)物的不同形式進行免疫制備的抗原結(jié)合片段。
術(shù)語“抗體”也包括天然抗體的抗原結(jié)合片段。該被純化的受體也能被用作測定應(yīng)答存在提高水平的IL-10受體或含有IL-10受體細胞片段而生成的抗體的試劑。另外，IL-10受體片段也可以作為免疫原來產(chǎn)生本發(fā)明的抗體，如下文就要描述的。例如，本發(fā)明涉及具有結(jié)合親和力或抗本文所定義的氨基酸序列或其片段的抗體。
特別是，本發(fā)明涉及具有結(jié)合親和力或抗特定片段的抗體，所述片段被預(yù)測在脂質(zhì)雙層外側(cè)。這些片段容易地變成人或鼠受體序列外觀上的構(gòu)成。另外，本發(fā)明涉及被預(yù)示將存在于膜的細胞外側(cè)上的IL-10受體片段。分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以鑒定膜相關(guān)區(qū)被描述在例如來自Heijne，J.Mol.Biol.225∶487(1992);和Fasman et al.，Trends in Bioc Hemical Sciences 1589(1990)。
能產(chǎn)生針對受體亞單位或其片段各種變異體的抗體(以其天然存在形式和其重組體形式)。另外能產(chǎn)生對IL-10受體的活性形式或其失活形式的抗體，不同點在于活性受體更易于識別只存在于活性受體中的抗原決定簇。能用標準方法制備抗獨特基因型抗體。
通過用所說片段與產(chǎn)生免疫性的蛋白結(jié)合物免疫動物能產(chǎn)生抗IL-10受體預(yù)先測定片段的抗體，包括結(jié)合片段和單鏈譯本。從分泌所需抗體的細胞中制備單克隆抗體。通過結(jié)合正常的或缺損的IL-10受體篩選這些抗體，或篩選拮抗或興奮IL-10受體活性。
正常地，這些單克隆抗體將與至少大約1mM的1Kd結(jié)合，更正常地至少300μM，一般至少100μM，更一般至少30μM，平常至少10μM，更平常至少3μM，經(jīng)常至少1μM，更經(jīng)常至少300nM，典型地至少100nM，更典型地至少30nM，通常至少10nM，更通常至少3nM，最好至少1nM，更好至少300pM，在特別優(yōu)選的實施例中至少100至10pM或更少。
本發(fā)明的抗體，包括抗原結(jié)合片段具有極高的診斷或治療價值。它們是與IL-10受體結(jié)合和抑制配體與受體結(jié)合或抑制類IL-10肽引起生物應(yīng)答的能力的有效拮抗劑。也能將它們用作非中和抗體并能與毒素或放射性核素偶聯(lián)，使得當(dāng)抗體與受體結(jié)合時，細胞自身被殺死。并且這些抗體能與藥劑或其它治療試劑結(jié)合(直接或間接地通過鍵合)。
本發(fā)明抗體也能用于診斷應(yīng)用中。作為捕獲或非中和抗體，它們能與IL-10受體結(jié)合而不抑制配體結(jié)合。作為中和抗體，它們能用于競爭結(jié)合分析中。它們也用于測定或定量IL-10或IL-10受體。
受體片段可以與其它材料連接，特別是多肽，如被用作免疫原的融合的或共價連接的多肽。IL-10受體和其片段可以與許多免疫原融合或共價聯(lián)接，象鎖眼
血藍蛋白、牛血清白蛋白、破傷風(fēng)類毒素等等。參見制備多克隆抗血清方法的文獻Microbiology，Hoeber Medical Division，Harper and Row，1969;Landsteiner，Specificity of Serological Reactions，1962，Dover Publications，New York;and Williams et al.，Methods in Immunology and Immunochemistry，Vol.1，1967，Academic Press，New York.
在一些情況下，希望從不同哺乳動物宿主制備單克隆抗體，象小鼠、嚙齒動物、牛、羊、驢、靈長目類動物、人等。在下面文獻中可以發(fā)現(xiàn)用于制備這樣單克隆抗體的技術(shù)的描述，例如Stites et al.(eds)，Basic and Clinical Immunology，4th ed.，Lange Medical Publications，Los Altos，CA;Harlow and Lane，Antibodies∶ALaboratory Manual，1988，CSH Press;Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(2d ed)，1986，Academic Press，New York;以及特別是在Kohler和Milstein，Nature 256495(1975).
簡言之，本方法包括給動物注入免疫原。然后處死該動物，從其脾中取出細胞，然后與骨髓瘤細胞融合。其結(jié)果是得到能在體外再繁殖的雜交細胞或“雜交瘤”。然后篩選雜交瘤群來分離各個克隆，每個克隆分泌針對免疫原的單個抗體種類。在這種方法中，所得到的各處抗體種類是永久性的和是來自免疫動物的克隆單個B細胞在應(yīng)答被識別的致免疫物質(zhì)上的特異性位點所產(chǎn)生的產(chǎn)物。
其它適合的技術(shù)包括在體外使抗原多肽接觸淋巴細胞或涉及篩選噬菌體或類似載體中的抗體庫。參見Huse et al.，“Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda，”Science 246∶1275(1989);以及Ward et al.，Nature 341∶544(1989).
本發(fā)明的多肽和抗體可以在有或沒有改變的情況下都可以被使用，包括嵌合的或人化的抗體。常常通過與一提供可測信號物質(zhì)相連(共價或非共價)來標記多肽和抗體。許多標記和結(jié)合的技術(shù)是公知的，在科技和專利文獻中都有大量報導(dǎo)。適當(dāng)?shù)臉擞洶ǚ派湫院怂?、酶、底物、輔助因子、抑制物、熒光基團、化學(xué)發(fā)光基團、磁粉等等。公開這樣標記的使用的文獻包括美國專利3817837;3850752;3939350;3996345;4277437;4275149;及4366241。也可以制備重組免疫球蛋白，參見Cabilly，美國專利4816567;和Moore等人，美國專利4642334。
本發(fā)明的抗體能被用于分離該受體的親和色譜法。制備色譜柱，其中抗體與固相載體連接，例如顆粒，象瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖等等，將細胞溶解物通過柱子，洗柱，然后增加溫和變性劑濃度，最后釋出被純化的受體蛋白質(zhì)。
該抗體也可以被用來篩選特別表達產(chǎn)物的表達庫。通常用一基團標記用在這種方法中的抗體，使得容易通過抗體結(jié)合測定抗原的存在。這種抗獨特基因型抗體被用作檢測或診斷各種與各個受體表達相關(guān)的免疫狀態(tài)。
可溶性受體片段也能被用作IL-10的載體，例如，保護細胞因子不受各種降解的或其它的活性的影響。在某些條件下，復(fù)合物被用作緩釋組合物，使細胞因子或拮抗劑緩慢地功能釋放。而且，作用IL-10的一種拮抗劑，可溶形式的受體，例如含有沒有膜相關(guān)片段的細胞因子結(jié)合部分的片段，將是有用的診斷或治療的組合物。作為一診斷試劑，這種片段能被用作抗IL-10抗體的替代物，但可能相當(dāng)于一中和抗體。
另外，本文所描述的被分離的成分可能是其它細胞因子受體α亞單位的類似物。這意謂著可以存在IL-10受體的獨特的β成分，并且與這些成份締合，由IL-10結(jié)合調(diào)制活性。這將提供方便的分離這種被稱這β亞單位的方法。參見例如，Hayashida et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 87∶9655(1990)。或者，種或組織特異性附屬分子，例如蛋白質(zhì)，可以提供改變受體蛋白質(zhì)性質(zhì)或活性的源由。
本發(fā)明的天然存在和重組體形式的IL-10受體亞單位應(yīng)用于能篩選與受體有結(jié)合活性的化合物的藥盒和分析方法中。近幾年已開發(fā)了幾種自動分析方法，能每年篩選成千上萬種化合物。參見例如，F(xiàn)odor et al.，Science 251∶767(1991)，其中描述了用許多在固相底物上合成的確定的多聚物試驗結(jié)合親和力的方法。各種任意的多肽序列的噬菌體或其它文庫也是有用的。能得到大量的象本發(fā)明所提供的被純化的可溶性受體，能大大促進適當(dāng)?shù)姆治龇椒ǖ陌l(fā)展。
例如，一旦受體被定性，一般就能發(fā)現(xiàn)其拮抗劑。隨著應(yīng)用純化的受體的高度自動化分析方法的發(fā)展，現(xiàn)在能試驗可能的受體拮抗劑。特別是，用本文所提供試劑實現(xiàn)的篩選技術(shù)將發(fā)現(xiàn)新的興奮劑或拮抗劑。
本發(fā)明特別用于通過使用重組體受體(在任何范圍藥劑篩選技術(shù)中)篩選化合物。用重組體受體篩選受體反應(yīng)藥物的優(yōu)點包括(a)改善的由特定來源得到的受體的可恢復(fù)的源;
(b)每個細胞中潛在的在分析中產(chǎn)生更好的信噪比較大數(shù)目的受體;以及(c)種的變異體的特異性(理論上產(chǎn)生較大的生物和疾病特異性)。
一種藥物篩選的方法是使用用表達該受體的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細胞。從任何其它細胞中能分離在分離作用中表達受體的細胞。這種能存活的或固定形式的細胞能被用于標準的受體/配體結(jié)合分析。參見Parce et al.，Science 246∶243(1989);和Owicki et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 874007(1990)。
競爭性測定是特別有用的，其中用已知對該受體有結(jié)合親和力的標記配體(象125I-IL-10)和試驗化合物及細胞(IL-10受體的來源)一起接觸和保溫，該試驗化合物對IL-10受體的結(jié)合親和力是已被測定的。然后分離結(jié)合的配體和游離的配體以確定配體結(jié)合的程度。試驗化合物被結(jié)合的數(shù)量與被測定的標記配體被結(jié)合的數(shù)量成反比。可使用任何技術(shù)從游離的配體中分離結(jié)合的配體從而確定配體結(jié)合的程度。這種分離步驟典型地包括例如與濾器粘附然后洗脫、與塑料粘附然后洗脫或細胞膜的離心。
能存活的細胞也能被用來篩選對以IL-10受體介導(dǎo)的功能有效的藥物，例如第二信使含量，即Ca++;細胞增殖;磷酸肌醇池變化;磷酸化作用水平;一氧化二氮的含量和其它。一些測定方法省去了一個分離步驟，例如近似靈敏測定系統(tǒng)。鈣靈敏染色將用于測定Ca++含量，用氟量計或一種熒光細胞分類儀。參見Lowenstein et al.，Cell 70705(1992)。
另一種方法是用來自被轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細胞的膜作為IL-10受體的來源。這些細胞被指導(dǎo)IL-10受體表達的DNA載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化?；旧线@些膜能由細胞制備并被用于適當(dāng)?shù)氖荏w/配體結(jié)合分析，例如上文所提到的競爭性分析。
還存在另外一個方法是使用由被轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細胞得到的可溶性未純化或可溶性被純化的受體。這用來做“分子”結(jié)合分析，其優(yōu)點是增加了特異性、自動化能力和高的藥物試驗生產(chǎn)量。
另外一種藥物篩選技術(shù)包括一種方法，它提供了篩選具有適當(dāng)?shù)腎L-10受體結(jié)合能力的化合物的高生產(chǎn)量，并詳細描述在Geysen，歐洲專利申請84/03564中。首先在固相載體底物例如塑料栓或某些其它適宜表面上合成大量不同的短肽試驗化合物。然后所有的栓與可溶的未被純化的或可溶的被純化的IL-10受體反應(yīng)，并洗滌，下一步包括測定結(jié)合的IL-10受體。
常規(guī)的藥物設(shè)計也取決于對受體和其它效應(yīng)物或配體的分子形狀的結(jié)構(gòu)研究。效應(yīng)物可以是在應(yīng)答配體結(jié)合中介導(dǎo)其它功能的其它蛋白質(zhì)，或通常與受體相互作用的其它蛋白質(zhì)。測定與特定的其它蛋白質(zhì)相互作用位點的一種途徑是物理結(jié)構(gòu)測定，例如，X-射線結(jié)晶法或NMR技術(shù)(二維或三維)。這些將提供氨基酸殘基形成分子接觸區(qū)的目標。
被純化的受體可直接包括在平盤上用于上文所提到的藥物篩選技術(shù)。然而，這些受體的非中和抗體能被用作捕獲抗體將各個受體固定在固相上。
恰當(dāng)?shù)赝ㄟ^競爭抑制作用，由配體與受體結(jié)合的抑制作用可以阻礙對類IL-10多肽的生理反應(yīng)，因此，本發(fā)明的體外分析經(jīng)常使用由表達重組受體的細胞分離的膜、含有這些受體的配體結(jié)合片段的可溶性片段或者是附著于固相底上的片段。這些分析也用來進行結(jié)合片段突變和改變或配體突變和改變(例如配體類似物)的效果的診斷上的測定。
本發(fā)明也涉及競爭性藥物篩選分析法的應(yīng)用，例如其中受體或受體片段的中和抗體與和受體結(jié)合的試驗化合物競爭。在這種方法中，抗體能被用于測定占據(jù)受體一個或多個結(jié)合位點的任何多肽的存在，且也可被用于占據(jù)可能被IL-10占據(jù)的受體上的結(jié)合位點。
另外，抗受體和含有配體結(jié)合位點的受體的可溶性片段的中和抗體能被用來抑制例如噬菌體、B細胞、T細胞或相關(guān)細胞類型中的IL-10受體功能。
本發(fā)明還涉及許多診斷藥盒中的IL-10受體、其片段、多肽和其融合產(chǎn)物的應(yīng)用以及測定IL-10受體存在的方法。典型情況下，該藥盒含有或者被確定的受體肽或者基因片段，或者識別一者或另外一者的試劑。
測定試驗化合物與IL-10受體結(jié)合親和力的藥盒典型地包括試驗化合物;標記化合物，例如具有已知與IL-10受體結(jié)合親和力的配體或抗體;IL-10受體的來源(天然存在的或重組體)，從游離的標記化合物中分離結(jié)合化合物的手段，例如固定IL-10受體的固相。一旦篩選了化合物，這些與IL-10受體具有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親和力的化合物能用于本領(lǐng)域公知的適當(dāng)生物分析法中來測定它們是否是興奮劑或拮抗劑。這些重組體受體多肽的獲得也很好地確定了校準此種分析法的標準。
測定例如樣品中IL-10受體濃度的優(yōu)選的藥盒典型地包括具有已知與該受體結(jié)合親和力的配體或抗體，IL-10受體的來源(天然存在的或重組體)以及從游離的標記化合物中分離結(jié)合的標記化合物的手段，例如一個固定IL-10受體的固相。正常地將提供含有試劑的小室和說明書。
特異于受體或受體片段的抗體，包括抗原結(jié)合片段能用于測定存在升高含量的受體和/或其片段的診斷應(yīng)用中。這種診斷分析能應(yīng)用溶胞產(chǎn)物、活細胞、固定細胞、免疫熒光、細胞培養(yǎng)物、體液，并能進一步包括與血清中IL-10受體相關(guān)的抗原的測定等等。診斷分析可以是均相的(沒有游離試劑與受體-配體復(fù)合物之間的分離步驟)或非均相的(有一分離步驟)。存在各種各樣的化學(xué)分析方法，象放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、酶免疫分析(EIA)、復(fù)酶免疫分析技術(shù)(EMIT)、底物標記的熒光免疫分析(SLFIA)等等。例如，通過使用一個被標記的且識別IL-10受體或其特異片段抗體的第二抗體能應(yīng)用未被標記的抗體。這些分析法在文獻中有大量的討論，參見例如Harlow et al.，AntibodiesA Laboratory Manual，1988，CSH。
抗獨特基因型抗體具有診斷抗受體抗體存在的相似用途。例如可以是各種異常狀態(tài)的診斷。例如IL-10受體的過量或不適合產(chǎn)物可以導(dǎo)致各種免疫反應(yīng)，這些免疫反應(yīng)可以診斷異常受體表達，特別是在增生細胞情況下例如癌。
通常，診斷分析試劑被裝入藥盒以優(yōu)化分析的靈敏性。對于本發(fā)明，依據(jù)分析方法的性質(zhì)、草案和標記物的不同，提供或者被標記的或者未被標記的抗體，或者被標記的受體。通常與其它附加成分相結(jié)合，象緩沖液、穩(wěn)定劑、信號產(chǎn)生所必須的原料(象酶的底物)，等等。最好，該藥盒也含有適當(dāng)使用的說明書以及使用后的處理。典型地，該藥盒具有每個有用試劑的各室。希望該試劑能以干燥的凍干粉提供，該試劑能在水介質(zhì)中重建，具有適當(dāng)濃度來進行分析。
任何藥物成分的篩選和診斷分析可以在沒有改變的情況下或也可以在通過各種途徑修飾后進行。例如可按上文的描述進行標記。
也有很多方法從游離配體中分離出結(jié)合配體或者從游離試驗化合物分離結(jié)合化合物。這些受體能被固定在不同固體上然后洗脫。適當(dāng)?shù)墓腆w包括塑料象ELISA平板、濾膜和珠子。將受體固定到基質(zhì)上的方法包括，不限制于，直接附著于塑料上、應(yīng)用捕獲抗體化學(xué)偶聯(lián)和生物素-抗生物素蛋白。這種技術(shù)的最后一步包括用幾種方法中的任何一種沉淀受體/配體復(fù)合物，包括使用例如一種有機溶劑象聚乙二醇或一種鹽象硫酸銨。其它適當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)包括而不限制于熒光素抗體磁粒方法，該方法描述在Rattle et al.[Clin.Chem.301457(1984)]，和描述在U.S.Patent No.4659678中的雙抗體磁粒分離方法中。
本發(fā)明的另一診斷方面包括由IL-10受體序列得到的寡核苷酸或多核苷酸序列的應(yīng)用。這些序列能被用作測定病人的限定細胞中受體異常水平的探針，這些病人疑為具有例如自身免疫疾病，不能正常應(yīng)答炎癥的感染，或增殖細胞疾病象癌。文獻中充分描述和討論了RNA和DNA兩種核苷酸序列的制備、序列的標記和序列優(yōu)選的大小。
正常情況下寡核苷酸探針應(yīng)具有至少大約14個核苷酸，通常至少大約18個核苷酸，多聚核苷酸探針可以有多至幾千堿基對，可以使用多種標記，最常用的是放射核素，特別是32P。然而也可以使用其它技術(shù)，象引入多核苷酸的光或生物素修飾的核苷酸。然后生物素作為結(jié)合抗生物素或抗體的位點，這個位點可用很多標記物標引，象用放射性核素、熒光、酶等等。
或者，可以應(yīng)用識別特異性雙螺旋的抗體，包括DNA雙螺旋，RNA雙螺旋、DNA-RNA雜交雙螺旋，或DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后，抗體可以被標記，并進行分析，其中雙螺旋與一個表面結(jié)合，因此由雙螺旋在表面上的形成可測定與雙螺旋結(jié)合的抗體的存在。用經(jīng)典技術(shù)可實施新的反義RNA探針的應(yīng)用，象核酸雜交，加減篩選、重組探針，雜交釋放翻譯(HRT)，以及雜交阻止翻譯hybrid arrested translation(HART)。也包括擴增技術(shù)象聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
本發(fā)明還涉及定性或定時地測定其它標志存在的診斷藥盒。診斷或預(yù)后決定于用作標記物的多種指示物。因此，藥盒可以驗定標志物的結(jié)合。參見例如Viallet et al.，Progress in Growth Facter Res.189(1989)。
本發(fā)明提供了具有顯著治療價值的試劑。IL-10受體(天然存在的或重組體)，其片段與抗體，以及被鑒定為對IL-10受體具有結(jié)合親和力的化合物，在治療多種疾病中是有用的，例如自身免疫疾病，膿毒性和毒性休克和傳染病。參見例如Hsu et al.，Int′l Immunol.4563(1992);de Waal Malefyt et al.，J.Expt′l Med.1741209(1991);Fiorentino et al.，J.Immunol.1473815(1991);和Ishida et al.，J.Expt′l Med.1751213(1992)。另外，本發(fā)明對與IL-10受體的異常表達或異常觸發(fā)相關(guān)的任何疾病和失調(diào)具有治療意義。例如，確信IL-10受體在免疫作用的許多基本調(diào)控過程中起著作用。應(yīng)用本發(fā)明將發(fā)展細胞因子的興奮劑和拮抗劑。也參見例如Harada et al.，J.Biol.Chem.26722752(1992)，該文中鑒定了在拮抗受體功能中有用的受體片段。
重組IL-10受體，包括其可溶性片段，或IL-10受體的抗體能被純化，然后施予患者。為了治療應(yīng)用，這些試劑能與附加的活性成分混合，例如，經(jīng)典的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，以及生理上無害的穩(wěn)定劑和賦形劑。這些混合物經(jīng)無菌過濾并制成劑形如通過真空冷凍干燥法放入劑量瓶中或穩(wěn)定的水合制劑中。本發(fā)明也涉及抗體或其結(jié)合片段的應(yīng)用，例如，所說抗體或其結(jié)合片段是可溶的，不是互補結(jié)合的。
用IL-10受體或其片段能實現(xiàn)藥物篩選，以鑒定與IL-10受體具有結(jié)合親和力的化合物。然后應(yīng)用下一步的生物分析來測定化合物是否具有固有的促進活性且因此是其阻滯IL-10活性的阻滯劑或拮抗劑。同樣地，具有內(nèi)在促進活性的化合物能活化受體，因此是在促進IL-10活性中的興奮劑。本發(fā)明還涉及IL-10受體的抗體作為拮抗劑的醫(yī)療應(yīng)用。
進行有效治療需要的試劑的量決定于許多不同的因素，包括施用方式、靶位點、患者生理狀態(tài)，以及其它施用藥物。因此應(yīng)該滴定治療劑量以達到理想的安全性和效力。典型地，體外使用的劑量能對用于這些試劑原位施用的量提供指南。處理特定疾病的有效劑量的動物試驗將進一步提供人劑量的預(yù)定的指征。已公開了多種情報，例如in Gilman et al.(eds)，Goodman and Gilman′s∶The Pharmacological Bases of Therapeutics，8th Ed.，1990，Pergamon Press，和Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，1990，Mack Publishing Co.，Easton，Penn。
本申請討論了施用方法，例如口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)，或肌內(nèi)施用，透皮擴散以及其它。藥學(xué)上可接受的載體包括水、鹽水、緩沖液和其它化合物，描述在例如Merck Index，Merck and Co.，Rahnay，New Jersey.由于IL-10和其受體間的高親和力結(jié)合，這些試劑的低劑量最初是被希望是有效的。因此，劑量范圍通常希望是低于1mM濃度的量，典型地少于大約10μM濃度，通常少于大約100nM，最好少于大約10pM(微微摩爾)，最好少于大約100fM(毫微微摩爾)，以及適當(dāng)載體。緩釋劑或緩釋裝置經(jīng)常被用于連續(xù)施用。在下面詳細的描述中將發(fā)現(xiàn)受體細胞內(nèi)片段，包括IL-10受體和相近受體兩者的另外用途。
可以直接向被處理宿主施用IL-10受體、其片段、該受體或其片段的抗體、拮抗劑以及興奮劑，這取決于該化合物的大小，希望在施用前將其與載體蛋白質(zhì)象卵白蛋白或血清卵白蛋白結(jié)合。可以以任何常用的劑量配方施用治療制劑。盡管可能單獨服用活性成分，但最好是以藥物組合物施用。
這樣的組合物包括至少一種活性成份，如上所定義的，以及一種或幾種其可接受的載體。每種載體必須是藥學(xué)上和生理上兩者可接受的，易于與其它成分互容的且對患者無害。制劑包括那些適于口、直腸、鼻或腸胃外(包括皮下，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)和真皮內(nèi)的)施用。
制劑常常以單位劑量形式存在，并可用藥學(xué)領(lǐng)域公知的方法制備。參見例如Avis et al.(eds)，Pharmaceutical Dosage FormsParenteral Medications，1993，Dekker，New York，Lieberman et al.(eds)，Pharmaceutical Dosage FormsTablets，1990，Dekker，New York，和Lieberman et al.(eds)，Pharmaceutical Dosage FormdDisperse Systems，1990，Dekker，New York。本發(fā)明治療方法可以與其它化學(xué)治療或化學(xué)預(yù)防試劑結(jié)合或用于與其它化療或化學(xué)預(yù)防試劑的締合作用。
通過標準的基因治療技術(shù)也能傳遞本發(fā)明的物質(zhì)，所述基因治療技術(shù)包括例如直接將DNA注入組織、重組病毒載體的使用和被轉(zhuǎn)染細胞的移植。參見例如Rosenberg，J.Clin.Oncol.10180-199(1992)。
很可能存在另外的IL-10受體亞單位。在不同生物分析方法中IL-10顯示不同特定的活性(每mg蛋白質(zhì)的單位)。例如在細胞合成抑制因子分析中其中IL-10作用于巨噬菌細胞上IL-10的比活性比在鼠胸腺細胞或鼠肥大細胞增生作用的共同刺激作用中發(fā)現(xiàn)的IL-10比活性要高。
盡管還沒有證實每個成分自身結(jié)合vIL-10的能力，本申請?zhí)峁┑娜撕褪驣L-10受體結(jié)合IL-10。重組受體(100～400pM)的表觀Kd比巨噬細胞和單核細胞(5～20pM)上IL-10的EC50高得多。由于與相關(guān)的2類細胞因子受體的類似性，例如IFN-α，IFN-β，或IFN-γ，它們的結(jié)構(gòu)特點相似，可能需要一輔助分子進行IL-10結(jié)合上的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
能用多種途徑篩選這樣的輔助成分。這些途徑包括物理親和方法和活性篩選。這里用于人IL-10的相似親和方法能用于vIL-10。因為vIL-10是有生物活性的，但沒有發(fā)現(xiàn)與亞單位的結(jié)合，因此可以存在幾種該受體的修飾形式。FLAG-vIL-10融合構(gòu)建物在含有這樣一種受體形式的細胞的選擇性純化中應(yīng)該是有用的。
一種途徑是轉(zhuǎn)染由適當(dāng)細胞，例如能應(yīng)答vIL-10的細胞得到的文庫，來篩選轉(zhuǎn)染的不應(yīng)答vIL-10的細胞;或者不能與vIL-10(或FLAG-vIL-10融合作用)結(jié)合。在濃度太低以致只能有效地與本發(fā)明受體亞單位結(jié)合的濃度下用FLAG-vIL-10標記篩選這樣一個被轉(zhuǎn)化的細胞庫。參見例如Kitamura et al.，Cell 661165(1991)。
或者，F(xiàn)LAG-vIL-10融合構(gòu)建物能被用于描述或FACS分離，例如如下面所描述的。這些技術(shù)可以和與已分離的IL-10成分的共轉(zhuǎn)染作用相結(jié)合，例如來分離改變了結(jié)合性質(zhì)的輔助成分。特別希望在締和時增加配體結(jié)合親和性的成分。用這種方法分離的cDNA克隆例如通過測序來描述特征，并與其它在其它受體中鑒定的亞單位或輔助蛋白質(zhì)進行結(jié)構(gòu)比較。
實施例可通過下面非限制性實施例詳細陳述本發(fā)明。除非特別指出，下面給出的固體混合物中的固體、液體中的液體和液體中的固體的百分數(shù)分別以wt/wt，vol/vol和wt/vol來表示。
下面實施例表明在幾種鼠和人細胞系中具有高比活的碘化人IL-10(hIL-10)能以特異的和飽和的方式與IL-10受體結(jié)合。MC/9增生作用分析證明該標記蛋白質(zhì)保留了大于50%的生物活性。被純化的碘化蛋白質(zhì)的分子量大小表明蛋白質(zhì)大多以二聚體形式存在，且在這種形式下能與其受體特異性結(jié)合。當(dāng)在還原條件下用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法[SDS-PAGE;Laemmli，Nature 227680(1970)]實驗時，37kDa人IL-10二聚物可以被洗滌劑離解為單個的18kDa IL-10。這些代表存在共價連接的細胞因子二聚物的37kDa物質(zhì)一致。而且證明活性hIL-10是非共價連接的二聚物。
用幾種源于鼠和人的細胞系進行的特異性結(jié)合篩選表明，鼠科肥大細胞系MC/9和人B淋巴瘤系JY在每個細胞中具有極高數(shù)目能結(jié)合的，例如未被占據(jù)的受體。相對于MC/9和JY來說，人B細胞系Ramos和BH5以及紅血白病細胞系TF-1以降低的水平結(jié)合，下面緊跟著是人T細胞和巨噬細胞系。在已報導(dǎo)的觀察基礎(chǔ)上即肥大細胞，巨噬細胞/單核細胞、B細胞和T細胞應(yīng)答IL-10來選擇這些細胞系。通常由紅血白病患者處得到的TF-1細胞系依賴于IL-3、紅細胞生成素或GM-CSF作長期生長。在增生分析中這些細胞系也應(yīng)答IL-4、IL-5和IL-6。盡管TF-1細胞系應(yīng)答各種細胞因子，但沒有測得細胞因子單獨或與其它細胞因子結(jié)合對TF-1細胞應(yīng)答hIL-10的增生效果。
由Scatchard分析獲得的Kd數(shù)值表明hIL-10以相對高的親和力與其鼠和人細胞上的受體結(jié)合，每個細胞中有100至300未被占據(jù)的受體。用鼠肥大細胞系MC/9和人細胞系JY上的人和鼠科IL-10的競爭結(jié)合分析證明，當(dāng)鼠配體能與鼠細胞系競爭結(jié)合碘化的hIL-10時，它不能與人細胞系相競爭。一種解釋是在所用的結(jié)合條件下，hIL-10能識別并與鼠和人受體兩者結(jié)合，而鼠IL-10只能識別鼠受體。支持鼠配體的結(jié)合識別位點有種特異性這種觀點的是人細胞上不存在鼠科IL-10的任何顯著的生物交叉反應(yīng)活性。
實施例1一般方法細胞系和組織培養(yǎng)MC/9細胞ATCC＃CRL 1649在帶有10%胎牛血清的Dulbecco′s改良基本培養(yǎng)基(DMEM)中正常生長，所述10%胎牛血清(FBS)中含有3～5%促細胞分裂劑刺激的脾調(diào)理介質(zhì)，100U/ml mIL-4，10U/ml青霉素/鏈霉素，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，1×MEM必需和非必需氨基酸，1×MEM維生素，50μMβ-巰基乙醇，6mg/升葉酸，116mg/升L-精氨酸，和36mg/升L-天冬酰胺。TF-1細胞[Kitamura et al.，J.Cell.Physiol.140323(1989)]在帶有10%FBS和1μg/升鼠GM-CSF的RPMI1640中培養(yǎng)。JY細胞(由J.de Vries，DNAX，Palo Alto，CA獲得)在帶有10%FBS，6mM谷氨酰胺，和抗生素的DMEM中生長。其它細胞系[Ramos(ATCC＃CRL1596)，WEHI 265.1(TIB 204)，U937(CRL 1593)，HL-60(CCL 240)，JD(CRL 8163)，Jijoye(CCL 87)，THP-1(TIB 202)，B-JAB(由J.Banchereau，Schering-Plough France獲得)和BH-5(由W.Tadmori，Schering-Plough Research Institute，SPRI處獲得)]在帶有10%FBS，6mM谷氨酰胺和抗生素的RPMI中培養(yǎng)。另外，用50μMβ-巰基乙醇補足BH-5和THP-1細胞的培養(yǎng)基。所有組織培養(yǎng)試劑由GIBCO(Gaithersburg，MD)購得。熒光活化的細胞分類(FACS)用標準方法在Becton-Dickinson FACStar PLUS上完成FACS。參見例如Shapiro，Practical Flow Cytometry(2d ed.)，1988，Alan Liss，New York。
細胞因子和抗體由Schering-Plough Research Institute(SPRI)，New Jersey提供重組CHO-衍生的人IL-10和IL-5，以及大腸桿菌衍生的人GM-CSF，IFN-γ和鼠IL-10。通過MC/9增生作用分析(見下文)測得這些產(chǎn)物的比生物活性是2.3×107單位/mg(對于hIL-10來說)，且對mIL-10是1.6×107單位/mg。重組hIL-6由Genzyme(Cambridge，MA)購得。IL-10和IL-5的單克隆抗體由J.Abrams[DNAX，Palo Alto，CA;參見Abrams et al.，Immunol.Rev.1275(1992)]提供，但也可以用標準方法制得。
人IL-10的碘化作用用酶球(Enzymobead)放射性碘化試劑(Bio-Rad，Richmond，CA)標記純化的hIL-10蛋白質(zhì)，按照制造商的議定書，這是一種乳過氧化物酶和葡氧酶的被固定的制劑。將純化蛋白質(zhì)通過PD-10柱(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，NJ)以除去游離標記物。用乳過氧化物酶方法(NEN Research Products，Boston，MA)也碘化加入的樣品。所得到的比放射活性范圍在100～180μCi/μg hIL-10。然后將碘化的原料通過120ml交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75柱(Pharmacia LKB)，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中收集1.1ml餾分。通過在4℃下在10%三氯乙酸中將收集的餾分的等份培養(yǎng)1小時實現(xiàn)TCA沉淀作用。離心后生成小球狀沉淀物，然后在Clinigamma計數(shù)器上計數(shù)(Pharmacia LKB)。MC/9增生作用分析應(yīng)用比色MTT染色-還原作用分析測定hIL-10的生物活性，參見例如Tada，et al.，J.Immun.Meth.93157(1986);和Mosmann，J.Immun.Meth.6555(1983)。簡言之，用不同量的人IL-10處理在96孔微量滴定板中含有100U mIL-4/ml的培養(yǎng)基(100μl)的每井5×103MC/9細胞48小時。應(yīng)用的hIL-10標準物的最大值是200單位/100μl并連續(xù)稀釋兩倍。加入25微升5mg/ml MTT并溫育3至5小時。然后在10%SDS中用10mM HCl去污劑解離細胞，且讀取平板在570nm的吸光度。
結(jié)合實驗和Scatchard分析在200×g離心10分鐘，將用于試驗的每種細胞系大約5×106個細胞球狀沉淀化，在PBS中洗滌，再懸浮于200μl含有100-500pM碘化的hIL-10的結(jié)合緩沖液中(PBS，10%胎牛血清，0.1%NaN3)。在4℃下于旋轉(zhuǎn)混合器中溫育2小時后，將細胞在200×g離心10分鐘，再懸浮于100μl無標記hIL-10的結(jié)合緩沖液中，在伸長的微離心試管中覆蓋一層200μl 1∶1鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二辛酯油狀物的混合物，在4℃下在400×g離心5分鐘，在液氮中速凍。然后將細胞小球破碎并在Clinigamma 1272計數(shù)器(Pharmacia LKB)上計數(shù)。通過在500至1000倍摩爾過量未標記hIL-10的存在下進行結(jié)合，未測得特異性的結(jié)合。
在飽和結(jié)合實驗中使用了大約600pM碘化hIL-10溶液的兩倍連續(xù)稀釋物，同時做一平行系列以測定非特異性結(jié)合。在用EBDA Program(Elsevier-Biosoft，Cambridge，U.K.)獲得的數(shù)據(jù)點上進行Scatchard分析。在上述結(jié)合條件下并加入100倍摩爾過量的每種單克隆抗體進行抗體抑制作用。在相似條件下再加入500倍摩爾過量指定的細胞因子測定細胞因子的特異性。
化學(xué)交聯(lián)在2ml由PBS，0.1%NaN3，10%牛血清白蛋白和有或沒有200nM未標記hIL-10的200pM125I-hIL-10構(gòu)成的結(jié)合介質(zhì)中于4℃下將大約2×108個細胞溫育4小時。細胞用PBS洗兩次，然后再懸浮于1ml PBS中。向細胞懸浮物中加入10微升15M1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC;Pierce Chemical Co.)貯存液，用恒定搖蕩在室溫下將細胞溫育1小時。
用冷PBS兩次洗滌細胞，然后加入150mM甘氨酸(pH7.2)終止反應(yīng)，用Tris-HCl緩沖。離心收集細胞，通過加入1ml含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，140mM NaCl，2mM EDTA，1mg/ml亮肽素(Sigma)，2mM Prefabloc SC(Boehringer Mannheim)，2mM碘代乙酰胺(Sigma)，2mM鄰二氮雜菲(Sigma)和1%三硝基甲苯X-100(Sigma)的裂解緩沖液裂解，裂解物于4℃在10000×g離心20分鐘。
收集上清液，與用標準方法制備的兔抗hIL-10多克隆抗血清在4℃下溫育過夜，并預(yù)吸附在蛋白質(zhì)G樹脂(Pierce Chemical Co.)上。每個樣品含有20μl樹脂。溫育后，樹脂用PBS洗滌三次，且再懸浮于20μl沒有還原劑的SDS-PAGE緩沖液中。然后在非還原條件下取每種樣品20μl在4-15%梯度凝膠(Daiichi Chemical Co.，Tokyo)中進行SDS-PAGE。平行進行一組預(yù)先染色分子量標記(Life Technologies，Inc.)來測定交聯(lián)復(fù)合物的大小。電泳后干燥凝膠，在-80℃下用兩個增感屏使凝膠與Kodak XAR膠片曝光48小時。
COS7轉(zhuǎn)染在一電穿孔小池(Bio-Rad，Richmond，CA)中使5微克質(zhì)粒DNA與250μl帶有10%FBS和抗菌素的DMEM中的5×106個COS7細胞混合。用0.20kV的Bio-Rad Gene Pulser將細胞電穿孔，電容量為960μF，電阻為200歐姆。室溫下10分鐘后，將細胞轉(zhuǎn)移到10cm具有10ml完全培養(yǎng)基的平皿中使其附著。
在37℃下過夜溫育后，用只是沒有血清的同樣培養(yǎng)基代替上述培養(yǎng)基。兩天以后，通過在帶有4mM EDTA和0.03%NaN3的PBS中溫育，從平皿上分離出細胞，收集細胞，用于結(jié)合實驗。每個結(jié)合測定大約使用1×106個細胞。
實施例2具有FLAG序列的人和鼠IL-10融合蛋白質(zhì)的制備用標準分子生物學(xué)技術(shù)制備編碼融合蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建物。如在IL-10活性的生物測定中所測得的，F(xiàn)LAG序列被商業(yè)上可得到的抗體(IBI-Kodak，Rochester，NY)識別，并不明顯干擾IL-10融合蛋白質(zhì)與結(jié)合蛋白質(zhì)的締合作用。
實施例3cDNA文庫的制備應(yīng)用標準技術(shù)從對IL-10敏感的細胞系構(gòu)建cDNA庫。參見Super Script Plasmid System for cDNA Systems and Plasmid Cloning，Life Technologies，BRL，Gaithersburg，MD。使用BJABB人細胞系，正如應(yīng)用鼠MC/9肥大細胞和J774巨噬細胞系。
實施例4表達增大數(shù)目的IL-10結(jié)合蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化過的細胞的富集用生物素化的熒光FLAG抗體為標記，對cDNA庫轉(zhuǎn)染的細胞進行FACS分類。使轉(zhuǎn)化的細胞與抗體接觸后，加入藻紅蛋白-鏈霉抗生物素蛋白(PE-streptavidin)。然后用FACS分析標記過的細胞，收集表達最大量IL-10結(jié)合的細胞的3～5%。被選擇的細胞用于構(gòu)成cDNA文庫，細胞的富集重復(fù)3次。因此發(fā)現(xiàn)IL-10能競爭與FLAG-IL-10結(jié)合。
用親和力純化，即淘洗(panning)，在用抗-FLAG抗體包被的平皿上選擇表達IL-10結(jié)合蛋白質(zhì)的細胞。這樣被鑒定的細胞被進行多次循環(huán)的淘洗過程，其外源載體插入物被分離并鑒定。
實施例5編碼IL-10結(jié)合蛋白質(zhì)的核酸的鑒定用標準方法通過測序進一步鑒定源于人和鼠cDNA的被分離的插入物。
選擇作用后大部分細胞具有較高的熒光密度，且通過與50倍過量的IL-10的競爭作用大大減弱了結(jié)合信號。
實施例6乳過氧化物酶標記的人IL-10的生物活性用乳過氧化物酶方法將純化的CHO-衍生的hIL-10碘化至高比活性(100至200μCi/μg蛋白質(zhì))。
最初試圖用IODO-GEN試劑(Pierce，Rockford，IL)標記CHO-衍生的hIL-10使得產(chǎn)生足夠比活性的蛋白質(zhì)被用于受體鑒定中。用乳過氧化物酶方法得到的碘化hIL-10與用IODO-GEN得到的相比具有大約高五倍的比活性。
為了測定該高比活性標記的hIL-10是否具有生物活性，用Thompson-Snipes等人(J.Exp.Med.173507(1991))的方法檢測樣品誘導(dǎo)MC/9細胞增生的能力。用50ng/ml濃度的每個樣品，發(fā)現(xiàn)標記和未標記IL-10的估計活性分別是7.48×102和1.16×103單位/毫升。因此標記的IL-10保留了64%的生物活性。碘化的hIL-10的其它樣品測定表明通常保留大于50%生物活性。
實施例7放射標記的hIL-10活性形式的二聚特性當(dāng)通過葡聚糖G-75凝膠過濾柱時，標記的蛋白質(zhì)混合物被分成三個不同的種類。發(fā)現(xiàn)這個分離過程對于減少結(jié)合靶細胞的本底是需要的。最大的一類是隨洗脫體積洗出的高分子量形式。最小的一類是在最低分子量標準(13.7kDa)和染色標記溴酚蘭之間洗脫。
與分子量標準進行比較表明第二洗脫組分大小大約為37kDa，與預(yù)定的hIL-10二聚體的分子量相符。第二組分的SDS-PAGE表明高分子量形式是作為分子量在43kDa和200kDa之間的聚集體跑帶。在這些條件下遷移的第二組分大約是18kDa，而根本沒有發(fā)現(xiàn)第三組分。與最大和第二組分相關(guān)的放射活性是可沉淀的TCA而與小組分相關(guān)的則不是。
實施例8放射性碘化的人IL-10與細胞受體的結(jié)合在發(fā)現(xiàn)放射性碘化的hIL-10具有生物活性的基礎(chǔ)上，測定餾分樣品與患者細胞系特異性結(jié)合的能力。MC/9細胞通過增生作用應(yīng)答hIL-10，因此它們首先被用來測定hIL-10的結(jié)合特異性。當(dāng)由G-75柱得到的三個餾分被用來做與MC/9結(jié)合實驗時，只37kDa餾分而不是其它兩個能與之高度結(jié)合;而且500倍摩爾過量的未標記IL-10蛋白質(zhì)能阻礙大于90%的標記IL-10的結(jié)合。
為了確定hIL-10結(jié)合其受體的特異性，其它細胞因子以及抗hIL-10單克隆抗體被用來測驗它們抑制碘化hIL-10與其細胞表面受體結(jié)合的能力。發(fā)現(xiàn)過量的hIL-10在與TF-1結(jié)合中能與標記的hIL-10競爭。相反，hIL-5、hIL-4、IFN-γ、GM-CSF和hIL-6在競爭中無效。
為進一步證實hIL-10與TF-1細胞的結(jié)合是特異性的，檢驗hIL-10和hIL-5的單克隆抗體阻礙碘化hIL-10與其受體結(jié)合的能力。產(chǎn)生的抗hIL-10的中和單克隆抗體抑制標記的hIL-10與TF-1細胞的結(jié)合，但抗人IL-5單克隆抗體卻不抑制。
用多種不同細胞系結(jié)合實驗表明，hIL-10能在不同程度上與大多數(shù)這些細胞系相結(jié)合。發(fā)現(xiàn)結(jié)合程度最高的是用鼠肥大細胞系MC/9和人B-淋巴瘤系JY。相對于JY和MC/9而言，TF-1(人紅白血病細胞系)以及Ramos和BH5(人B-淋巴瘤系)顯示了降低的結(jié)合水平。實驗的人IL-10以相對低的水平結(jié)合其它被檢測的細胞。與WEHI265.1(一種鼠單核細胞系)的結(jié)合實驗也表明相對低的結(jié)合水平。
實施例9人IL-10結(jié)合細胞受體的親和力為了測定結(jié)合親和力和估計每個細胞中結(jié)合位點/受體的數(shù)目，用JY和M/9細胞繪制出了典型的飽和結(jié)合曲線。對于兩種細胞系，最大的結(jié)合是在大約300至400pM標記的hIL-10。有代表性的結(jié)合數(shù)據(jù)的Scatchard分析給出斜率是1Kd的直線標圖，對JY細胞系大約為150pM，對MC/9系為49pM。得到的B最大值代表配體結(jié)合細胞的最大濃度，于MC/9和JY細胞系分別為4.0pM和7.5pM。假設(shè)一個hIL-10二聚物配體分子結(jié)合一個受體，估計對于MC/9每個細胞大約有100個未被占據(jù)的受體，對于JY每個細胞有180個未被占據(jù)的受體。由幾個獨立的實驗得出，人IL-10對于JY和MC/9細胞的結(jié)合親和力是大約50至170pM，每個細胞中有100至300個未被占據(jù)的受體。
實施例10人和鼠IL-10受體結(jié)合的種特異性為了測定受體結(jié)合的種特異性，檢測了鼠和人IL-10與標記的人IL-10競爭結(jié)合鼠和人細胞系的能力。因為大腸桿菌衍生的鼠科IL-10的比生物活性是人IL-10的60～70%，如用MC/9生物實驗所測定的，因此校準了在競爭實驗中人和鼠科IL-10的濃度。鼠和人IL-10兩者都能阻礙標記的hIl-10與鼠MC/9系的結(jié)合。相反，人IL-10，而不是鼠IL-10能成功地與標記的hIL-10競爭和人B-淋巴瘤系JY的結(jié)合。
實施例11人IL-10與細胞受體化學(xué)交聯(lián)后產(chǎn)生的多復(fù)合物為了估算hIL-10受體結(jié)合復(fù)合物的大小，使125I-hIL-10與JY和MC/9(ATCC CRL 1649)細胞相結(jié)合，并按如上所述用EDC處理細胞。由于兩種細胞系中hIL-10受體的數(shù)目低，交聯(lián)后用抗hIL-10多克隆抗血清免疫沉淀細胞裂解物來富集結(jié)合復(fù)合物。
按上文所述進行SDS-PAGE和放射自顯影后，發(fā)現(xiàn)JY和MC/9細胞系兩者都得到hIL-10-特異性結(jié)合復(fù)合物。由兩種細胞系產(chǎn)生的結(jié)合復(fù)合物的主要形式具有大約97kDa的估算分子量。JY細胞，而不是MC/9細胞得到兩個另外的帶，其具有大約190和210kDa的估計分子量。
也發(fā)現(xiàn)一些小的帶，其分子量在68和43kDa之間變化。他們可以是較大復(fù)合物的降解產(chǎn)物。交聯(lián)的125I-hIL-10顯示為在43和29kDa標記物之間遷移的帶。在1000倍摩爾過量的未標記的hIL-10的存在下完全抑制交聯(lián)復(fù)合物的生成。
實施例12結(jié)合人IL-10的特異性用人或鼠cDNA克隆轉(zhuǎn)染COS7細胞，使其表達載體達72小時，并測驗與放射性碘化的人IL-10的結(jié)合。與只有載體不同，被克隆的受體cDNA能授與COS細胞上的人IL-10以特異性結(jié)合能力。人和鼠克隆兩者都能結(jié)合人IL-10。
實施例13人IL-10受體亞單位的可溶的和融合衍生物的制備在下面的實施例中公開了定義各種用作PCR的寡核苷酸引物的SEQ ID序號。因此根據(jù)序列表能發(fā)現(xiàn)這些引物的核苷酸序列。
下面用來描述本發(fā)明的融合衍生物是含有人IL-10受體細胞外功能區(qū)、人IL-4細胞內(nèi)功能區(qū)和或者人IL-10或者人IL-4跨膜區(qū)的一種蛋白質(zhì)。這樣的構(gòu)建物是有用的，例如，解釋由相應(yīng)細胞因子進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機理。
為了有利于重組質(zhì)?？寺〉酱竽c桿菌中和在被轉(zhuǎn)染COS細胞中的高效表達，首先制備pSV.Sport載體(Life Technologies，Gaithersburg，MD)的一種衍生物。這是通過用含有來自質(zhì)粒pDSRG(ATCC68233)的SRα啟動子和SV40t抗原內(nèi)含子的一個pstⅠ-HindⅢ(末端填充)片段取代含有來自pSV.Sport的SV40復(fù)制原點和早期啟動子的一個PstⅠ-ClaⅠ(末端填充)片段來完成。所得質(zhì)粒命名為pSR.Sport。
人IL-4受體的細胞內(nèi)功能區(qū)(ⅠC)的重建下面將hIL-4的ⅠC分為兩個獨立的部分，兩者結(jié)合形成ⅠC。以質(zhì)粒pME18S-hIL-4R(ATCC68263)為模板，利用命名為C3632CC(SEQ ID NO5)和C3633CC(SEQ ID NO6)的引物通過PCR合成一個BamHⅠ-PstⅠ片段。通過靜止突變將原Sau 3A位點轉(zhuǎn)進BamHⅠ位點以利于克隆。用BamHⅠ和PstⅠ限制性酶切該片段，克隆入pUC19(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)，用DNA測序核實。
然后用PstⅠ處理質(zhì)粒pME18S-hIL-4R以釋放一個900bp PstⅠ-PstⅠ片段，該片段在如上文描述所修飾的質(zhì)粒pUC19的PstⅠ位點被插入。用DNA測序核實含有完全人IL-4ⅠC的所得構(gòu)建物。因此hIL-4ⅠC被重建為一BamHⅠ……PstⅠ……PstⅠ插入在pUC19中。
人IL-10受體細胞外功能區(qū)(EC)的重建通過兩個限制性片段的連接完成EC的構(gòu)建。在hIL-10受體亞單位(SEQ ID NO1)的346堿基處(甘氨酸95密碼子的第三個堿基)通過靜止突變產(chǎn)生一個KpnⅠ位點以利于克隆。通過PCR單獨地合成5′和3′末端片段并克隆到pUC19中，分別為一個EcoRⅠ/SalⅠ…KpnⅠ片段和一個KpnⅠ…BstEⅡ-Stop/EcoRⅠ/BamHⅠ片段?？寺W8.1DNA(ATCC69146)被用作合成兩個片段的模板。命名為C3628CC(SEQ ID NO7)和C3629CC(SEQ ID NO8)的引物被用來制備5′片段，而用C3630CC(SEQ ID NO9)和C3631CC(SEQ ID NO10)命名的引物被用來制備3′片段。
如下面所描述的，通過堿基757(SEQ ID NO1)的靜止突變產(chǎn)生一個BstEⅡ位點。在EC末端加入一個終止密碼子以進行可溶hIL-10受體的構(gòu)建，該構(gòu)建物作為一個EcoRⅠ-EcoRⅠ片段被克隆。
將KpnⅠ-BstEⅡ-Stop/EcoRⅠ/BamHⅠ片段與EcoRⅠ/SalⅠ-KpnⅠ片段連接形成hIL-10R的EC，即一個EcoRⅠ/SalⅠ-KpnⅠ-BstEⅡ-Stop/EcoRⅠ/BamHⅠ片段后，用DNA測序驗證EcoRⅠ/SalⅠ-KpnⅠ和KpnⅠ-BstEⅡ-Stop/EcoRⅠ/BamHⅠ片段。
跨膜功能區(qū)(TM)的重建用質(zhì)粒pME18S-hIL-4R(ATCC68263;1990年3月20日保藏)為模板，且引物用C3634CC(SEQ ID NO11)和C3635CC(SEQ ID NO12)命名，通過PCR合成編碼hIL-4R TM的DNA，為一個EcoRⅠ/BstEⅡ-BamHⅠ片段。引入靜止性變化產(chǎn)生限制性位點，將TM克隆到pUC19后用DNA測序驗證所得構(gòu)建物。
全長嵌合受體DNA的裝配從上文所描述的載體中切除hIL-4R ⅠC作為一個BamHⅠ-HindⅢ片段，并插入到已經(jīng)含有hIL-10R EC的pUC19載體中。然后由hIL-4R合成的TM被插入到pUC19載體中作為一個BstEⅡ-BamHⅠ片段，以生成一個含有全長嵌合受體DNA的質(zhì)粒。然后從該質(zhì)粒上切除該DNA，作為SalⅠ……HindⅢ片段克隆到表達載體pSR.Sport中，且被表達生成嵌合受體。
可溶性人IL-10受體從載體中切下上文所述的EcoRⅠ/SalⅠ-KpnⅠ-BstEⅡ-Stop/EcoRⅠ/BamHⅠ片段作為一個EcoRⅠ……EcoRⅠ片段并克隆到pDSRG中用以直接轉(zhuǎn)染，或切下作為一個EcoRⅠ末端填充的片段和SalⅠ片段并克隆到用SalⅠ/SnaBⅠ限制的pSR.Sport中用以與pDSRG共轉(zhuǎn)染。
可溶性人IL-10受體的純化和鑒定通過將用標準方法(參見U.S.Patent No.5231012，Mosmann et al)制備的hIL-10交聯(lián)到N-羥基丁二酰胺酯活化的瓊脂糖凝膠顆粒上構(gòu)建人IL-10親和柱。來自產(chǎn)生可溶受體的轉(zhuǎn)染細胞的調(diào)理培養(yǎng)基被用于該柱。該柱然后裝入2M MgCl2(pH7.5)以釋放結(jié)合的可溶hIL-10受體，通過用銀染色的SDS-PAGE分析洗脫產(chǎn)物。
觀察到一組三個帶，兩大一小，表觀分子量為大約43kKa。用借助標準方法制備的多克隆抗受體多肽(包括SEQ ID NO1的殘基147-168)抗血清進行Western印跡分析表明這三個帶對應(yīng)于用銀染色得到的帶，說明都是hIL-10R相關(guān)的。用免疫前血清的對照實驗來測得信號。
由于被推測的hIL-10受體蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有大量可能的N-糖基化位點，所以觀察到的純化受體蛋白質(zhì)的復(fù)雜性可能是由于多變的糖基化作用。為了研究這種可能性，首先將洗脫產(chǎn)物滲析到PBS中，然后再用內(nèi)聚糖酶F(N-glycanase)處理，并與未處理產(chǎn)物一起進行電泳和Western印跡分析。
在聚糖酶處理的樣品中在大約43kDa的三個帶作為一個具有表觀分子重量大約為25kDa的帶一起遷移，它具推測的未糖基化重組可溶性hIL-10受體的大小。另外，由親和柱洗脫的產(chǎn)物的氨基末端測序顯示了頭15個氨基酸殘基對應(yīng)于由hIL-10受體DNA核苷酸序列推測的殘基22～36(SEQ ID NO2)。因此，很明顯純化的可溶性受體的多肽骨架根據(jù)分子量大小而言是均一的。
序列表(1)一般情報(ⅰ)申請人(A)姓名Schering Corporation(B)街道One Giralda Farms(C)城市Madison(D)州New Jersey(E)國家U.S.A.
(F)郵編(ZIP)07940-1000(G)電話201-822-7375(H)傳真201-822-7039(I)電傳219165(ⅱ)發(fā)明題目哺乳動物的白細胞介素-10受體(ⅲ)序列數(shù)目12(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy盤(B)機型Apple Macintosh(C)操作系統(tǒng)Macintosh 6.0.8(D)軟件Microsoft Word 5.1 a(ⅴ)目前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(ⅵ)優(yōu)先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/110683(B)申請日23-8-1993(ⅵ)優(yōu)先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/011066(B)申請日29-1-1993(ⅵ)優(yōu)先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 07/989792(B)申請日10-12-1992(2)SEQ ID NO1的情報
(ⅰ)序列特征(A)長度3632個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1
(2)SEQ ID NO2(ⅰ)序列特征(A)長度578個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2
(2)SEQ ID NO3(ⅰ)序列特征(A)長度3520堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3
(2)SEQ ID NO4(ⅰ)序列特征(A)長度575個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4
(2)SEQ ID NO5(ⅰ)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5ATGGTGGGAT CCGATTCCCA ACCCAGCCCG CAGCCGCCTC GT(2)SEQ ID NO6(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6ACGCTCAGCA CTG CAGCTGC CCCATGCTGG AGGACAT(2)SEQ ID NO7(ⅰ)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7GCAGCGAATT CGTCGACGCC GCCACCATGC TGCCGTGCCT CGTAGTGTGCT(2)SEQ ID NO8(ⅰ)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8CACTCTGGCT CACCGGTACC CATTGCTGTG GTACAGGTCC AAGGTC
(2)SEQ ID NO9(ⅰ)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9GTACCACAGC AATGGGTACC GGGCCAGAGT GCGGGCTGTG GAC(2)SEQ ID NO10(ⅰ)序列特征(A)長度65個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10GCTTCAGTAG CTGGATCCGA ATTCTCAGTT GGTCACCGTG AAATACTGCCTGGTGAGGGA GATGC(2)SEQ ID NO11(ⅰ)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11GAATTCGTGA GGTGACCAAC CTCCTGCTGG GCGTCAGCGT TTCCTGC(2)SEQ ID NO12(ⅰ)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12GCTCGACGAT GGATCCCACC ATTCTTTCTT AATCTTGGTG ATGC
權(quán)利要求
1.一種被分離的核酸，編碼哺乳動物IL-10受體蛋白質(zhì)或其片段。
2.一種被分離的核酸，其在嚴格條件下與保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心登記號為ATCC69146或69147的質(zhì)粒雜交。
3.一種權(quán)利要求1或2的核酸，其編碼特異性結(jié)合IL-10的受體蛋白質(zhì)或片段。
4.一種含有權(quán)利要求1至3中任何一個權(quán)利要求的核酸的重組載體。
5.權(quán)利要求1至4的任一權(quán)利要求的核酸或重組載體，其中所說的核酸編碼人或鼠IL-10受體蛋白質(zhì)或片段。
6.權(quán)利要求1至5的任一權(quán)利要求的核酸或重組載體，其中所說的核酸編碼可溶形式的人IL-10受體蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求5的核酸或重組載體，其中，該核酸具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3定義的核苷酸序列，或者由于遺傳密碼的簡并性，該核酸是這兩個序列中每一個的功能等價物。
8.一種含有權(quán)利要求4至7任一權(quán)利要求的重組載體的宿主細胞。
9.一種制備哺乳動物IL-10受體蛋白質(zhì)或其片段的方法，包括在核酸被表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8的宿主細胞。
10.一種被分離的、特異性結(jié)合IL-10的哺乳動物受體蛋白質(zhì)或片段。
11.權(quán)利要求10的受體蛋白質(zhì)或片段，它是一種人或鼠IL-10受體蛋白質(zhì)或片段。
12.權(quán)利要求11的受體蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4定義的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求10或11的片段，它是一種可溶形式的人IL-10受體蛋白質(zhì)。
14.一種嵌合的受體蛋白質(zhì)，包括人IL-10受體細胞外功能區(qū)和人IL-4受體細胞內(nèi)功能區(qū)。
15.一種抗權(quán)利要求10至14任一權(quán)利要求中的受體蛋白質(zhì)或片段的抗體或其結(jié)合片段。
16.權(quán)利要求15的抗體或結(jié)合片段，其是一個單克隆抗體或結(jié)合片段。
17.一種拮抗IL-10生物活性的藥物組合物，含有一種藥學(xué)上可接受的載體和權(quán)利要求15或16中的一種可溶形式的人IL-10受體蛋白質(zhì)或一種抗體或結(jié)合片段。
18.一種制備拮抗IL-10生物活性的藥物組合物的方法，包括將一種藥學(xué)上可接受的載體與權(quán)利要求15或16中的一種可溶性形式的人IL-10受體蛋白質(zhì)或一種抗體或結(jié)合片段進行混合。
19.一種含有一種容器的藥盒，所述容器中含有權(quán)利要求1至3、10至13、15或16中任一權(quán)利要求中的一種核酸、受體蛋白質(zhì)或其片段或抗體或其結(jié)合片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了哺乳動物IL-10受體亞單位，以及編碼所說亞單位的各種變異體的核酸。也提供了該核酸和受體亞單位的應(yīng)用，包括篩選該受體配體的拮抗劑或興奮劑的方法，制備診斷或治療試劑的方法和制備抗體的方法。也提供了治療或診斷試劑和藥盒。
文檔編號A61P31/04GK1090326SQ9312168
公開日1994年8月3日 申請日期1993年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月10日
發(fā)明者K·W·穆爾, 劉 英, 何淑榆, 徐迪惠, J·C·陳, 周傳初, J·F·巴桑 申請人:先靈公司