專利名稱：促紅細(xì)胞生成素抗貧血作用的增強(qiáng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以球形炭作為有效成分的促紅細(xì)胞生成素，特別是由重組體·促紅細(xì)胞生成素(recombinanthumanEPO以下有時(shí)稱之為rHuEPO)引起的抗貧血作用的增強(qiáng)劑?；蛘?，涉及上述抗貧血作用增強(qiáng)劑的制造工藝中球形炭的使用。
隨著遺傳工程學(xué)的發(fā)展，在貧血治療中已開始使用rHuEPO制劑。促紅細(xì)胞生成素是存在于生物體內(nèi)的造血促進(jìn)因子之一，貧血的一個(gè)因素是缺乏促紅細(xì)胞生成素?？梢源_認(rèn)rHuEPO，在化學(xué)、免疫學(xué)及生物學(xué)上和人的促紅細(xì)胞生成素是相同的。
rHuEPO是由165個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的分子量約3萬的糖蛋白質(zhì)，在兩個(gè)地方(7-161及29-33)上有二硫化物鍵，3根N-葡糖苷型糖鏈和1根O-葡糖苷型糖鏈，分別在第24、第38及第83的天門冬酰胺和第126的絲氨酸上鍵合。根據(jù)糖鏈結(jié)構(gòu)不同，存在各種不同的rHuEPO。作為rHuEPO的例子，可舉出現(xiàn)在已商品化的エポジン(商品名)和エスポ-(商品名)等(參看巖川精吾，醫(yī)學(xué)のあゅ2，Vol，155，No.10，631-633，1990)。
通常，一旦貧血厲害，血中的促紅細(xì)胞生成素濃度就會變高。但是，對于腎貧血患者的情況來說，如果與腎機(jī)能正常的貧血患者相比，不僅是血中促紅細(xì)胞生成素濃度低的情況居多，而且由于存在造血抑制因子，因此，如期待的那樣，要使紅細(xì)胞比容上升，就需要大量的rHuEPO。
然而，rHuEPO，作為副作用，會引起血壓上升，頭痛、高血壓性腦病，因血栓形成導(dǎo)致的腦梗塞和心肌梗塞、網(wǎng)膜靜脈閉塞，支脈閉塞，或透析效率低下等。此外，作為rHuEPO導(dǎo)致的變應(yīng)性疾病或類過敏性病癥，還可見到血壓低下、關(guān)節(jié)痛、搔癢、浮腫、紅眼睛、胸部壓迫感、出血斑等癥狀。有時(shí)還可見到輕度發(fā)熱、出疹或肝不適等。因副作用引起的高血壓，也被認(rèn)為是由于未稍血管的收縮和血液粘度的上升而導(dǎo)致未稍血管阻力增大所致。
本發(fā)明者們對抑制因投與rHuEPO而引起的副作用的方法進(jìn)行了努力地研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過合并使用球形炭，可以既維持rHuEPO的抗貧血作用，同時(shí)又大幅度減少rHuEPO的投與量，從而避免或減輕上述的副作用。也就是說，發(fā)現(xiàn)了球形炭增強(qiáng)rHuEPO的抗貧血作用。本發(fā)明就是基于上述發(fā)現(xiàn)而完成的。
因此，本發(fā)明涉及以球形炭作為有效成分的、促紅細(xì)胞生成素抗貧血作用的增強(qiáng)劑。也就是說，本發(fā)明涉及在具有抗貧血作用的促紅細(xì)胞生成素中并用球形炭，從而增強(qiáng)促紅細(xì)胞生成素抗貧血作用的醫(yī)藥制劑。也就是說，本發(fā)明涉及上述抗貧血作用增強(qiáng)劑制造工藝中球形炭的使用。并且，涉及促紅細(xì)胞生成素抗貧血作用的增強(qiáng)方法，該方法是與促紅細(xì)胞生成素的貧血治療有效量的份量配合起來，給患者投與有效量的球形炭。
以下詳述本發(fā)明。
作為本發(fā)明增強(qiáng)劑有效成分使用的球形炭，只要是可用于醫(yī)療方面的球形的活性炭即可，對此并沒有特別的限制。以前，作為解毒劑而使用于醫(yī)療的粉末狀活性炭，其副作用是容易引起便秘，而且，病態(tài)時(shí)的便秘特別危險(xiǎn)，因而這一點(diǎn)是最大的缺點(diǎn)。
本發(fā)明中所用的球形炭，其粒徑范圍是直徑為0.05-2mm。不足0.05mm時(shí)，不能充分地去除便秘等副作用，而超過2mm時(shí)，不僅服用困難，而且不能迅速地發(fā)揮期待的藥理效果。球形炭的形狀是為獲得本發(fā)明效果的重要因素之一，也就是必需使其基本上為球狀。
球形炭制造時(shí)，作為原料，可使用任意的活性炭原料，例如鋸末、煤、椰子殼、石油系或煤炭系的各種瀝青類，或有機(jī)合成高分子，最好是石油系烴。作為球形炭，最好是用球形活性炭和/或球形吸附炭。
可在本發(fā)明中使用的球形活形炭，是一種直徑為0.05-2mm的活性炭。制造活性碳的基本方法是將原料碳化之后再活化而制得。作為活化的方法，可采用水蒸汽活化，藥品活化、空氣活化或二氧化碳?xì)饣罨雀鞣N公知的方法。
球形活性炭，例如可用以下三種方法制備。第一種方法是首先用瀝青等粘合劑將粉末原料造粒成小粒球形，然后在惰性氣氛中加熱至600-1000℃煅燒以使其碳化，繼而在水蒸汽氣氛中于850-1000℃活化。第二種方法，如特公昭51-76號公報(bào)中所記載的那樣，先將瀝青類于熔融狀態(tài)制成小粒球形狀，然后用氧使之不融化后，在與上述第一種方法相同條件下進(jìn)行碳化活化。第三種方法，如特公昭59-10930號公報(bào)中所記載的那樣，先將瀝青類于熔融狀態(tài)制成繩狀瀝青，將它破碎后投入熱水中使之球狀化，然后用氧使它不融化后，在與上述第一種方法相同條件下進(jìn)行碳化活化。
可用于本發(fā)明的球形吸附炭，其直徑為0.05-2mm，小孔半徑為80埃以下的空隙量為0.2-1.0ml/g?？偹嵝曰?A)為0.30-1.20meq/g，總堿性基(B)為0.20-0.70meq/g，而總酸性基(A)/總堿性基(B)為0.40-2.5的活性炭為最好。作為這樣的球形活性炭之一例，可列舉美國專利第4681764號說明書中記載的球形碳素質(zhì)吸附劑。
球形吸附炭可用以下方法制備，將直徑為0.05-2mm、和小孔率半徑為80埃以下的空隙量為0.2-1.0ml/g的球形活性炭，進(jìn)一步經(jīng)高溫氧化處理和還原處理而制得。最好是通過高溫下的氧化和還原處理，將制得的球形吸附炭的酸性基和堿性基調(diào)整在總酸性基(A)為0.30-1.20meq/g、總堿性基(B)為0.20-0.70meq/g，以及總酸性基(A)/總堿性基(B)為0.40-2.5的范圍內(nèi)。
此處，所說的總酸性基(A)和總堿性基(B)，是按常規(guī)方法定量的物性。
(甲)總酸性基(A)在0.05N的NaOH溶液50ml中，添加粉碎至200目以下的球形吸附炭1g，振蕩48小時(shí)，濾出球形吸附炭，通過中和滴定求得的NaOH消耗量。
(乙)總堿性基(B)在0.05N的HCl溶液50ml中，添加粉碎至200目以下的球形吸附炭1g，振蕩24小時(shí)后，濾去球形吸附炭，然后通過中和滴定求得的HCl消耗量。
所說在高溫下的氧化處理，是指在氧化氣氛中進(jìn)行的高溫?zé)崽幚?。作為氧源，可以使用純氧、氧化氮或空氣等。另外，所說在高溫下的還原處理是指在一種對碳為惰性的氣氛中進(jìn)行的高溫?zé)崽幚?。作為對于碳是惰性的氣氛，可以采用氮、氬或氦氣等。，或是它們的混合氣體。氧化熱處理最好是在氧含量為0.5-25體積%，優(yōu)選為氧含量為3-10體積%的氣氛中，以及最好是在300-700℃，優(yōu)選在400-600℃的溫度下進(jìn)行。原處理最好是在700-1100℃，優(yōu)選800-1000℃的溫度下氮?dú)夥罩羞M(jìn)行。
本發(fā)明的增強(qiáng)劑是和具有抗貧血作用的任一種促紅細(xì)胞生成素，特別是與rHuRPO并用。作為rHuEPO，例如可以用遺傳工程學(xué)的方法，通過含有編碼遺傳因子的媒介物使人的促紅細(xì)胞生成素至少是其活性部位轉(zhuǎn)化的各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主所產(chǎn)生的各種rHuEPO。
本發(fā)明者對貧血大白鼠試驗(yàn)了僅給予有效量的rHuEPO皮下注射，與此相對照，對球形吸附炭的口服和rHuEPO的皮下注射的并用效果進(jìn)行了調(diào)研，結(jié)果驚奇地發(fā)現(xiàn)，與球形炭并用時(shí)，即使僅用rHuEPO投與量的一半，其效果也和僅僅皮下注射正常有效量的rHuEPO時(shí)的效果相同。也就是說，球形炭增強(qiáng)了rHuEPO的抗貧血作用，從而揭曉了將球形炭作為rHuEPO抗貧血作用的增強(qiáng)劑是十分有用的。將本發(fā)明的增強(qiáng)劑投與正常大白鼠時(shí)，沒有引起任何異?，F(xiàn)象。
本發(fā)明的抗貧血作用增強(qiáng)劑，通過口服投與，其投與量根據(jù)施藥對象(動(dòng)物或人)、年齡，個(gè)人情況，病況等而異。例如，施藥對象是人時(shí)的口服量，通常是每1天投與的球形炭為0.2-20g，也可以是一次或分成2-4次服用。也可以根據(jù)癥狀，適當(dāng)增或減投與量。球形炭制劑可以是顆粒、片劑、糖衣片、膠囊、密封袋裝劑(スティフク劑)，分包包裝體或懸濁劑等任意投與形態(tài)施藥。以膠囊形式服用時(shí)，可以用通常的明膠膠囊，或根據(jù)需要可用腸溶性的膠囊。作為顆粒、片劑或糖衣片使用時(shí)，必需是一到體內(nèi)即可解體成微小的顆粒體。
促紅細(xì)胞生成素的投與是按通常的方法，一般是作為注射劑，注射到靜脈，皮下或腹腔內(nèi)等處。通常僅投與單一形式的rHuEPO時(shí)，作為投與方法的一例，如下所述。
也就是說，對于成人，是一次3000單位，每周3次，盡可能緩慢地靜脈注射。然而，為了確認(rèn)貧血的改善效果，作為維持量，對于成人是一次1500單位，每周2次或3次，或者是一次3000單位每周投與2次。作為貧血改善的目標(biāo)值，紅細(xì)胞比容是30%左右。防止紅細(xì)胞比容在1周內(nèi)不能上升1%以上的副作用是很重量的。
并用本發(fā)明增強(qiáng)劑時(shí)促紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)的投與量，是僅用rHuEPO作為抗貧血?jiǎng)r(shí)的上述投與量的5-90%，優(yōu)選30-90%。
本發(fā)明的球形炭增強(qiáng)劑的施用時(shí)期和促紅細(xì)胞生成素抗貧血?jiǎng)┑氖┯脮r(shí)期，可自由選擇進(jìn)行組合。例如，既可以前后施用，也可以同時(shí)施用。還可以僅僅是部分時(shí)期同步施用，還可以將這種施藥方案適當(dāng)組合，反復(fù)進(jìn)行。
以下通過實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但這些實(shí)施例并不是用于限定本發(fā)明范圍。
制造例1球形吸附炭的制備將一種在偏光顯微鏡下的各向異性領(lǐng)域呈均勻性的瀝青(氫原子/碳原子比＝0.55，流動(dòng)點(diǎn)＝220℃)300g和萘100g放在安裝有攪拌機(jī)的高壓釜中，于180℃溶解混合，添加聚乙烯醇的0.5%水溶液1200g，然后于140℃經(jīng)30分鐘劇烈攪拌后，攪拌下冷卻至室溫，獲得球形粒子。濾除大部分水后，將所得球形粒子放入萃取器，通入己烷，萃取除去萘，通風(fēng)干燥。然后用流化床，流入加熱空氣以25℃/小時(shí)升溫至300℃，進(jìn)而在300°時(shí)保持2小時(shí)不溶化。然后，在水蒸汽中升溫至900℃，于900℃保持2小時(shí)進(jìn)行碳化活化，得到多孔質(zhì)的球形活性炭。所得球形活性炭的直徑為0.05-1.0mm，小孔半徑為80
以下的空隙量為0.755ml/(按照采用自動(dòng)吸附量測定裝置的甲醇吸附法測出)。
將如此制得的碳質(zhì)球狀體，用流化床，于溫度為600℃，氧濃度為3%的氣氛中處理3小時(shí)后，于氮?dú)夥罩猩郎刂?50℃，于950℃保持30分鐘，獲得球形吸附炭(以下稱為試料1)。這種球形吸附炭的直徑為0.05-1mm，小孔半徑為80
以下的空隙量為0.751mg/g(按照采用自動(dòng)吸附量測定裝置的甲醇吸附法測出)，總酸性基(A)為0.542meq/g，總堿性基(B)為0.525meq/g，而總酸性基(A)/總堿性基(B)為1.03。
在大白鼠(CpbWUウィスタ-ランダム)口服急性毒性試驗(yàn)中，即使是按照毒性試驗(yàn)法控制線(藥審118號)的最大投藥量(雌雄大白鼠5000mg/kg)也沒觀察到異?，F(xiàn)象。
實(shí)施例1對貧血大白鼠的抗貧血增強(qiáng)作用作為抗貧血作用增強(qiáng)劑的有效成分-吸附炭，使用按上述制造例1方法制得的試料。
作為rHuEPO，使用エポエチンァルフ
(遺傳因子組變換)〔麒麟麥酒(株)的エスポ-(商品名)〕。所謂エポエチンァルフ
，是根據(jù)來源于人肝細(xì)胞的促紅細(xì)胞生成素基因組DNA而發(fā)現(xiàn)的，由中國田鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生的165個(gè)氨基酸殘基(C809H1301N229O240S5j分子量18，235.96)構(gòu)成的糖蛋白質(zhì)(分子量約30，000)。
使用ウィスタ-雄大白鼠(體重260g左右)，用腎動(dòng)脈分支部分結(jié)扎法，使其患腎性貧血癥。手術(shù)后的第9天，測定紅細(xì)胞比容，進(jìn)行選擇，使各組間沒有任何偏差，將選擇出來的大白鼠分成6組對照組(C組)，球形吸附炭投與組(A組)，rHuEPO單獨(dú)投與組(E組)，rHuEPO半量投與組(E1/2組)、球形吸附炭和rHuEPO半量的并用投與組(AE1/2組)，以及球形吸附炭和rHuEPO1/3量的并用投與組(AE1/3組)。
試驗(yàn)期間定為3周。讓各組大白鼠自由地?cái)z取飼料。對各組投與的藥物，具體按以下方法實(shí)施。
C組將生理食鹽水按每次0.4ml/kg(大白鼠體重)的用量每周2次的比例進(jìn)行皮下注射。
A組大白鼠飼料中混合5%的球形吸附炭，讓其自由地?cái)z取。
E組將rHuEPO的生理食鹽水溶液(60單位/kg(大白鼠體重)〕按每周2次的比例進(jìn)行皮下注射。
E1/2組將rHuEPO的生理食鹽水溶液(30單位/kg(大白鼠體重)〕按每周2次的比例進(jìn)行皮下注射。
AE1/2組在大白鼠飼料中混合5%球形吸附炭，讓其自由攝取的同時(shí)，將rHuEPO的生理食鹽水溶液〔30單位/kg(大白鼠體重)〕按每周2次的比例進(jìn)行皮下注射。
AE1/3組在大白鼠飼料中混合5%球形吸附炭，讓其自由攝取的同時(shí)，將rHuEPO的生理食鹽水溶液(20單位/kg(大白鼠體重)]按每周2次的比例進(jìn)行皮下注射。
三周的試驗(yàn)期結(jié)束后，從頸靜脈采血樣，測定紅細(xì)胞比容。將結(jié)果示于表1。
值每組5只的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(AE1/3組是3只的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差)明顯差異鑒定在t-test中的P值(N·S表示沒有明顯差異)
C組中，與試驗(yàn)開始時(shí)相比較，紅細(xì)胞比容降低，相對于觀察貧血狀況，A組中紅細(xì)胞比容降低受到一定程度的抑制。E組的紅細(xì)胞比容比試驗(yàn)開始時(shí)升高，貧血受到抑制。但是E1/2組中紅細(xì)胞比容與試驗(yàn)開始時(shí)相比較，降低很少。然而，按照本發(fā)明的AE1/2組中，與試驗(yàn)開始時(shí)相比較，其紅細(xì)胞比容增加，其紅細(xì)胞比容值比E1/2組的高許多。抑制貧血的程度與E組相同。E組和AE1/2組之間沒有明顯差異。E組和AE1/3組之間沒有明顯差異。也就是說，由于與球形吸附炭并用，即使rHuEPO是半量投與，和1/3量投與，也顯示出與單獨(dú)投rHuEPO時(shí)的效果相同。此外，由攝取量計(jì)算的抗貧血作用增加劑(球形吸附炭)的投與量是約18.8g/kg(大白鼠體重)/周。
制劑制備例1膠囊劑的制備將上述制造例1制得的球形吸附炭200mg封入明膠膠囊，制得膠囊劑。
制劑制備例2密封袋裝劑的制備將上述制造例1制得的球形吸附炭2g填充到層壓膜(其構(gòu)成＝玻璃紙/聚乙烯/鋁箔/聚乙烯/聚偏氯乙烯;厚度＝74±8μm)制的密封袋中后，將薄片熱壓密封制成密封袋裝劑。
在使用rHuEPO抗貧血?jiǎng)r(shí)，通過并用由球形炭構(gòu)成的本發(fā)明增強(qiáng)劑，可顯著增強(qiáng)rHuEPO的抗貧血作用，從而能使rHuEPO的投與量大大減少。因此，由于rHuEPO引起的副作用也會明顯減少。
以上是按具體實(shí)施方案說明本發(fā)明，而本技術(shù)領(lǐng)域的人都知道的一些改良也都將包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.在促紅細(xì)胞生成素抗貧血作用增強(qiáng)劑制造中球形炭的使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用，其中球形炭是球形活性炭。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用，其中球形炭是球形吸附炭。
全文摘要
本發(fā)明涉及以球形炭作為有效成分的促紅細(xì)胞生成素抗貧血作用增強(qiáng)劑。使用γHuEPO抗貧血?jiǎng)r(shí)，通過并用由球形炭構(gòu)成的本發(fā)明增強(qiáng)劑，使γHuEPO的抗貧血作用顯著增強(qiáng)，γHuEPO的投與量大大減少。因此，由γHuEPO引起的副作用明顯減輕。
文檔編號A61K38/18GK1090175SQ9311954
公開日1994年8月3日 申請日期1993年10月29日 優(yōu)先權(quán)日1992年10月29日
發(fā)明者伊勢道仁, 林英雄 申請人:吳羽化學(xué)工業(yè)株式會社