專利名稱：一種蛇毒溶栓素的配方和制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種醫(yī)療藥物的配方和制備工藝。
現(xiàn)有的抗血栓的蛇毒制劑有兩類，一是取材于蝮蛇毒的蛇毒抗栓酶，另一類是取材于蘄蛇毒的去纖酶(類凝血酶)。它們雖然對(duì)治療血栓有一定的效果，但其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，只經(jīng)過(guò)一次離子交換柱二乙氨基葡聚糖凝膠A-50層析，分離工藝粗糙，故藥用組分不純，藥效不高。加之含有神經(jīng)毒、出血毒和磷酯酶A等有毒物質(zhì)，其毒付作用反應(yīng)較大。
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有抗栓酶的缺點(diǎn)，建立了一套制備蛇毒抗血栓最為有效的新工藝及其配方。將兩種蛇毒的優(yōu)勢(shì)有效組分，經(jīng)分離、純化后定量檢測(cè)，制備時(shí)去除有毒物質(zhì)，按防治目的合理配方組合，使研制出來(lái)的新制劑具有高純、高效和低毒的特點(diǎn)。
本發(fā)明的制備工藝先分兩步工藝，即蝮蛇毒及蘄蛇毒的制備工藝(見(jiàn)附圖
)。
一、蝮蛇毒制備工藝蝮蛇毒經(jīng)二乙氨基乙基瓊脂糖凝膠CL-6B(DEAE-SepharoseCL-6B)柱層析分離(A)-經(jīng)葡聚糖凝膠(Sephadex)G-100柱純化(B-)純精氨酸酯酶(C)。
二、蘄蛇毒制備工藝蘄蛇毒經(jīng)Sephadex G-100柱分離(D)-經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B柱分離(E)-經(jīng)Sephadex G-75柱純化(F)-高純度類凝血酶(G)。
三、組合工藝將純精氨酸酯酶組分(C)與高純度類凝血酶(G)組合(H)-微孔濾膜過(guò)濾(I)-加賦形劑(J)-包裝、冷凍干燥、熔封(K)。
其中蝮蛇毒層析的分離中所用的緩沖液PH為6.5-7.6，濃度為0.005-0.03mol/L;蘄蛇毒層析的分離中所用的緩沖液PH為7.6-9.0，濃度為0.01-0.05mol/L。它們?cè)诜蛛x階段梯度洗脫中氯化鈉濃度為0.4-0.8mol/L。
本發(fā)明的配方為纖溶組分10-30u，抑聚組分300-600u，舒緩組分0.3-0.6u，類凝血酶6-10u。
現(xiàn)結(jié)合附圖簡(jiǎn)述實(shí)施例一、蝮蛇毒制備工藝經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B柱層析分離(A)，用PH7.0，濃度為0.01mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-Hcl)緩沖液浸泡、裝柱并平衡，柱高50cm，直徑2.6cm。蝮蛇毒4g，溶于上述緩沖液中上柱。而后第一步平衡洗脫，第二步加濃度為0.6mol/L的氯化鈉直線梯度洗脫。洗脫液流經(jīng)蛋白檢測(cè)儀描繪出蛋白峰圖譜，用收集器收集。繼而將各蛋白峰進(jìn)行精氨酸酯酶、纖溶組分、抑聚組分、舒緩組分的活力測(cè)定，分別按各活力峰收集。
而后，經(jīng)Sephadex G-100柱純化(B)，用PH7.0，濃度為0.01mol/L的Tris-Hcl緩沖液浸泡，裝柱并平衡，柱高100cm，直徑2.6cm。將(A)柱分離得到纖溶組分、抑聚組分、舒緩組分的收集液，分別上Sephadex G-100柱，用PH7.0，濃度為0.01mol/L Tris-Hcl緩沖液洗脫，洗脫液經(jīng)酶活力和蛋白量測(cè)定后分別收集，總蛋白回收率為23%，獲得純精氨酸酯酶，其中纖溶組分68000u，抑聚組分2040000u，舒緩組分1700u。
二、蘄蛇毒制備工藝
蘄蛇毒經(jīng)Sephadex G-100柱分離(D)，用PH8.0，濃度為0.02mol/L Tris-Hcl平衡緩沖液浸泡、裝柱并平衡，柱高100cm，直徑2.6cm。蘄蛇毒3g，溶于上述平衡緩沖液中上柱、洗脫，洗脫液流經(jīng)蛋白檢測(cè)儀描繪出蛋白峰圖譜，用部分收集器收集。繼而將分離得到的各蛋白峰進(jìn)行類凝血酶活力及蛋白量的測(cè)定，收集合并活力峰。
而后進(jìn)入DEAE-Sepharose CL-6B柱分離(E)。用PH8.0，濃度為0.02mol/L Tris-Hcl平衡緩沖液浸泡、裝柱并平衡，柱高40cm，直徑2.6cm。將上述分離得到的較粗的類凝血酶收集液上柱、洗脫，先是平衡洗脫，后是加0.6mol/L Tris-Hcl直線梯度洗脫，并測(cè)定洗脫液中類凝血酶活力及蛋白量，合并收集酶活力峰洗脫液。
第三是經(jīng)Sephadex G-75柱純化(F)。用PH8.0，濃度為0.02mol/L Tris-Hcl平衡緩沖液浸泡、裝柱并平衡，柱高100cm，直徑2.6cm。將上述離子交換層析再分離得到的類凝血酶收集液上柱，用平衡緩沖液洗脫，收集酶活力峰，測(cè)定其類凝血酶活力及蛋白量?？偟鞍谆厥章蕿?3.6%，獲得類凝血酶48000u。
三、組合工藝將純精氨酸酯酶(C)與高純度類凝血酶(G)組合(H)。按內(nèi)定配方的量，取纖溶組分10u，抑聚組分300u，舒緩組分0.3u，類凝血酶6u混合，測(cè)定精氨酸酯酶每安瓿為0.25u。再經(jīng)0.2μ微孔濾膜過(guò)濾(I)，附加適量的賦形劑(J)，分裝灌入2ml安瓿進(jìn)行冷凍干燥、熔封(K)。
本發(fā)明工藝精細(xì)，制劑高純、高效、低毒，臨床試用對(duì)防治各種血栓疾病均有顯著療效。
權(quán)利要求
1.一種蛇毒溶栓素的配方和制備工藝，其特征在于其配方為纖溶組分 10-30u； 抑聚組分 300-600u；舒緩組分 0.3-0.6u； 類凝血酶 6-10u。其制備工藝為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛇毒溶栓素的配方和制備工藝，其特征在于蝮蛇毒層析的分離中所用的緩沖液PH為6.5-7.6，濃度為0.005-0.03mol/L;蘄蛇毒層析的分離中所用的緩沖液PH為7.6-9.0，濃度為0.01-0.05mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛇毒溶栓素的配方和制備工藝，其特征在于蝮蛇毒與蘄蛇毒在分離階段梯度洗脫中，氯化鈉濃度為0.4-0.8mol/L。
全文摘要
一種蛇毒溶栓素的配方和制備工藝。將蝮蛇毒及蘄蛇毒的優(yōu)勢(shì)有效組分，經(jīng)分離、純化，制備時(shí)去除有毒物質(zhì)，按防治目的的合理配方組合，新制劑具有工藝精細(xì)、高純、高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)抗血栓有顯著療效。
文檔編號(hào)A61P3/00GK1063041SQ9210055
公開(kāi)日1992年7月29日 申請(qǐng)日期1992年1月21日 優(yōu)先權(quán)日1992年1月21日
發(fā)明者舒雨雁, 韋世秀, 黃湘萍, 雷丹青, 劉綿林 申請(qǐng)人:廣西醫(yī)學(xué)院