專利名稱：血液調(diào)節(jié)肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新型肽，它具有血液調(diào)節(jié)活性可用于刺激血細胞生成并且適用于治療病毒、真菌和細菌感染性疾病。
各種各樣的調(diào)節(jié)信使和調(diào)節(jié)物例如克隆刺激因子、干擾素以及不同類型的肽決定著骨髓細胞生成的調(diào)節(jié)。Metcalf，Cell，43∶5(1985);Baserga R.，F(xiàn)oa P.，Metcalf D，Polli EE(編)Biological Regulation of Cell Proliferation(1986);Nicola等人，J.Cell.Physiol.128∶501(1986)，Zoumbos等人，Proyr.Hemat.1∶341和14∶201(1986)Werner等人，Experientia 42∶521(1986)。二十年前，Rytomaa和Kivieniemi Cell Tissue Kinet 1∶329-340(1968);Rytomaa等人，Control of Cellular Growth in Adult Organisms pp106-138(1967)，報道了成熟的粒細胞的提取液(粒細胞分裂抑制素)能夠在蓋載玻片培養(yǎng)中特異地抑制鼠骨髓生成細胞的增殖。后來，他們證明了分子重量低于3000道爾頓的該因子能夠引起一種可移植的鼠粒細胞白血病的退化以及阻礙人白血病細胞的生長。Paukovits和其他人從鼠的骨髓細胞中提取出一種類似的因子，并證明了它抑制骨髓細胞吸收氚化胸腺嘧啶脫氧核苷(Paukovits，W.R.，Cell Tissue Kinet 4∶539-547(1971);Naturforsch 37∶1297(1982))。在1979年，Boll等人ActaHaematologica 6∶130(1979)證明了在培養(yǎng)的人骨髓細胞上鼠粒細胞提取液的抑制效應，一些其他研究者證實了這種粗制粒細胞提取液在試管內(nèi)抑制嚙齒動物骨髓細胞g-CFUC和/或gm-CFUC的生長。
把這種生物劑稱為粒細胞分裂抑制素，按照這個理論概念，當它在同樣的組織中被分泌時它應當是細胞增殖作用的內(nèi)源抑制因子。發(fā)現(xiàn)從粗制提取液中獲得的這種物質(zhì)是非種間特異的卻具有高的組織特異性。進一步發(fā)現(xiàn)，它是無毒的和具有可逆活性的。
在1982年，報道了一種具有下列結構的血液調(diào)節(jié)五肽pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys它在骨髓生成細胞上，在體內(nèi)和體外均具有選擇性抑制作用。其中主要作用似乎是發(fā)生在骨髓生成干細胞(CFU-gm)上，(Paukovits等人，Z.Naturforsch 37∶1297(1982)和美國專利4，499，081)。這種肽被認為是一種在骨髓提取物中已經(jīng)以小量發(fā)現(xiàn)的自然產(chǎn)生的粒細胞生成抑制因子的類似物。這種肽通過抑制血細胞生成，特別是粒細胞生成，傾向于阻止休眠細胞進入細胞分裂，而對細胞毒素的抗癌藥物的攻擊變得敏感。除了在使用細胞毒素藥物的治療中提供一種保護功能，該肽也可用于阻止涉及骨髓細胞生成系統(tǒng)(即骨髓白血病)的癌細胞增殖。
在1987年，Laerum等人報道了這種肽的氧化產(chǎn)品是通過二硫橋鍵形成的二聚物(HP-5)。這種二聚物具有與單體相反的作用，在試管中它強烈刺激人或鼠的CFU-gm的克隆形成，并且在體內(nèi)向上調(diào)節(jié)鼠骨髓生成細胞。在歐洲專利申請87309806.5中，它已被提出權利要求。
報道的二聚物對于一些病人刺激骨髓細胞生成是有用的，這些病人是指患骨髓細胞生成活性下降的病人，包括骨髓損傷，粒性白血細胞缺乏癥和再生障礙性貧血，包括在骨髓移植外科中為了免疫抑制治療而抑制組織反應，降低了骨髓機能的病人。該化合物也可以用于對腫瘤和病毒性疾病進行抑制細胞生長的化療和放療以后激勵骨髓更迅速的再生。它們對隨著骨髓的衰竭而導致的缺乏免疫應答的嚴重感染患者有特殊的價值。
在HP-5二聚物中二硫鍵的存在提示出這個單體可能在體內(nèi)是代謝物。由于該單體抑制血細胞生成，當用于體內(nèi)刺激骨髓細胞生成時，HP-5二聚物的穩(wěn)定性是關鍵性的。一種穩(wěn)定的二聚物的發(fā)現(xiàn)將會消除這個潛在的問題。
本發(fā)明包括由以下公式(Ⅰ)表示的肽，它具有血液調(diào)節(jié)活性，并能用于刺激血細胞生成和治療細菌、病毒和真菌疾病。這些肽可用于由于各種臨床情況造成的細胞計數(shù)降低病人的白細胞的恢復，例如，外科導致的骨髓抑制、愛滋病、先天性骨髓發(fā)育不良、骨髓和器官移植;對于預防白細胞減少的感染，對于治療嚴重燒傷病人和使用于一些細胞周期特異的抗病毒藥劑的觀察中，對骨髓抑制的改善是有用的。這些肽對于治療病毒、真菌和細菌感染疾病，特別是念珠菌和皰疹，在免疫抑制和“常規(guī)”治療中均是有用的。
這些化合物也可用于與美國專利4，499，081中的單體結合，在骨髓細胞中提供高、低活性的交替峰，以此促進血細胞生成的自然生理節(jié)奏的節(jié)律。使得抑制細胞的治療能在低的骨髓活性期間進行，由此減少骨髓損傷的危險，而通過活性的高峰期來激勵再生。本發(fā)明還涉及一種藥用組合物，它包括公式(Ⅰ)的化合物和一種藥用載體。
本發(fā)明進一步建立一種用于刺激動物(包括人)的骨髓細胞生成系統(tǒng)的方法，該方法包括將公式(Ⅰ)的化合物的有效量給需要治療的動物施用。
本發(fā)明還建立一種用于治療受病毒、真菌和細菌感染的免疫抑制的和正常的動物(包括人)的方法，該方法包括將公式(Ⅰ)的化合物以有效量給需要治療的動物服用。
本發(fā)明的肽可用式(Ⅰ)或它的藥用鹽來表明
Y1和Y2各獨立地是CH2或S;
x是0，1，2，3或4;
m是0，1或2;
n是0，1或2;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸;
B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;
C是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;
D是賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、N-甲基精氨酸、二氨基己炔酸或羧基酰胺、或它的羥甲基的衍生物。
E是谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸或一個肽鍵。
規(guī)定當Y1和Y2是S時，x是2、3或4，并且m和n是1;或當Y1和Y2是CH2時，x是0，1或2，并且m和n是0;或當Y1和S和Y2是CH2時，x是0并且n是1;或當Y2是S和Y1是CH2時，x是0和m是1。
在本發(fā)明中還包括本發(fā)明的化合物的藥用鹽絡合物。在式(Ⅰ)中應當注意A包括相應于焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸的氨基酸殘基的末端氨基。與此相似，D包括與賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、N-甲基精氨酸、二氨基己炔酸或羧基酰胺或它的羥甲基的衍生物相應的氨基酸殘基的末端羧基。
在現(xiàn)有技術中通常使用的符號在此用來描述這些肽pGlu＝焦谷氨酸Pro＝脯氨酸Gln＝谷氨酸胺Glu＝谷氨酸Asp＝天冬氨酸Lys＝賴氨酸Arg＝精氨酸Cys＝半胱氨酸
Tyr＝酪氨酸Sub＝二氨基辛二酸Hna＝二氨基己炔酸Pim＝二氨基庚二酸Adp＝二氨基己二酸按照通常的表示法，氨基的末端在左邊，羧基的末端在右邊。所有的手性氨基酸可以是D或L的絕對構型形式。
可以通過?；饔帽Ｗo氨基末端，這樣的保護基團的實例是t-丁氧基碳酰(t-Boc)、CH3CO和Ar-CO(Ar＝苯甲基)。
C末端可以在天然的氨基酸情況下是羧基，或羧基酰胺(
)或羥甲基(-CH2-OH)。
優(yōu)選的化合物是其中的Y1和Y2為CH2、x是1或2，其中A是pGlu，B是Glu，C是Asp，D是Lys和E是一個肽鍵，并且手征性氨基酸是以L的構型形式。
特別優(yōu)選的化合物是
本發(fā)明的化合物不同于現(xiàn)有技術的化合物，其中的二聚物是通過碳-碳鍵來聯(lián)系而不是二硫鍵。碳-碳鍵在體內(nèi)不容易斷裂，所以，在體內(nèi)它比歐洲專利申請87309806.5的化合物更穩(wěn)定。
本發(fā)明的肽用Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1964)報道的固相技術來制備，現(xiàn)有技術公知的溶液法也可以成功地使用。肽合成的方法一般記載在J.M.Stewart和J.D.Young Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Company，Rockford，I1(1984)或M.Bodansky，Y.A.Klauser和M.A.Ondetti Peptide Synthesis，John Wiley & Sons，Inc.，New York，N.Y.(1976)中，可以用來制備本發(fā)明的肽并在此作為參考結合到本發(fā)明中。
象已知的肽技術一樣，適當?shù)乇Ｗo每一個氨基酸或肽。例如，芴基甲氧基羰基基團(Fmoc)或t-丁氧基羰基(t-Boc)基團優(yōu)選地用于保護氨基，特別是在α位置。一種相應地取代的羰芐氧基團可以用于賴氨酸的ε氨基，苯甲基分別用于Asp和Glu的β和γ羧基。羰芐氧基團保護基的合適的取代是鄰和/或對位氯、溴、硝基或甲基的取代。并用予改進保護基團的反應性。除了t-Boc基，最常用的保護基是用溫和的酸處理不被去掉的那些，如已知的現(xiàn)有技術那樣，這些保護基團要通過催化氫化作用，用在液態(tài)氨中的鈉或HF處理的方法除去。
如果使用固相方法，從羧基末端開始朝著肽的氨基末端按順序地建造肽。通過把保護的氨基酸的C端與一個合適的樹脂共價連接，來開始固相合成這些樹脂。例如，二苯甲基胺樹脂(BHA)、甲基二苯甲基胺樹脂(MBHA)或氯基甲基樹脂(CMR)(這在美國專利4，244，946中作了一般描述)或苯乙酰胺一甲基樹脂(PAM)。如果產(chǎn)品肽的羧基端打算是羧基酰胺，則使用BHA或MBHA載體樹脂。如果產(chǎn)品肽的羧基端打算是一個羧基基團，則通常使用CMR或Pam樹脂，盡管它也可用于生產(chǎn)羧基酰胺或酯。
通過溫和的酸(即三氟乙酸)的處理來去除α氨基上的保護基團。對于Y1和/或Y2是CH2而不是S的化合物，用合適的偶合劑把di-Boc(二氨基二羧基酸)偶合到樹脂上的兩個氨基酸上。用適當?shù)乇Ｗo的D衍生物使游離的羧基酰胺化。在不分離中間產(chǎn)品的情況下，用現(xiàn)有技術中已知的技術適當?shù)拿摫Ｗo、中和以及偶合循環(huán)去依次地加成氨基酸直到形成所期望的肽。然后可以以任意順序從載體樹脂中分離出和/或裂解出完成的肽。
用HF或HBr/乙酸處理支持肽的樹脂，從樹脂中裂解出肽，并像生成羧酸一樣，產(chǎn)生羧基末端氨基酸。
如果期望的是酯，則可用適當?shù)拇碱惱缂状?、乙醇、丙醇、丁醇或苯甲基醇來處理CMR或Pam樹脂，在有三乙基胺存在的情況下，從樹脂中裂解出肽，并直接得到酯。
本發(fā)明的肽的酯出可通過一般的方法從其羧酸母體制備。通常在有酸催化劑存在下用一種醇處理該羧酸。另一方面，羧酸可以轉化成為一種活性酰基的中間體，例如一種酸鹵化物，并且最好在有一種堿存在的情況下用一種醇處理。
用于從支持樹脂中分解肽的優(yōu)選方法是在有合適的陽離子凈化劑例如苯甲醚或二甲氧基苯存在的情況下用無水HF處理支持肽的樹脂。該方法同時地去除所有的保護基團(除了保護硫的硫代烷基)并從樹脂中裂解出肽，用這種方法從CMR和Pam樹脂中進行水解的肽是羧酸，從BHA樹脂中裂解出的肽是如羧基酰胺那樣的肽。
該肽的末端氨基的修飾象現(xiàn)有技術中通常已知的那樣，用烷基化和?；饔脕硗瓿?。這種修飾可以在結合到肽之前的氨基酸上進行，或在該肽已經(jīng)合成和釋放了末端氨基之后，但是要在保護基被去掉之前在肽上進行。
通常，?；饔迷谟惺灏返那闆r下，使用相應的烷基酸或芳基酸的?；u、酸酐或活性醚在游離的氨基上進行。在有溫和的還原劑例如氰氫硼化鋰或鈉存在下，用相應的脂肪族醛或酮通過氨基的還原性烷基化作用進行單烷基化是最易于進行的。在有堿存在下，用過量的烷基鹵化物處理該氨基可以進行雙烷基化。
肽的溶液合成可以使用通常形成酰胺鍵的方法來實現(xiàn)。通常使用適當?shù)呐己蟿├鏝，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)將具有游離羧基的被保護的t-Boc氨基酸偶合到具有游離氨基的被保護氨基酸上?？蛇x擇在有催化劑如1-羥基苯并三唑(HOBT)或二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下進行。其他的方法，例如使被保護的t-Boc-氨基酸的游離羧基形成活性醚、酐或?；u，然后可選擇地在有堿存在情況下，與被保護的氨基酸的游離氨基反應也是適合的。例如，在有堿例如N-甲基嗎啉、DMAP(二甲基氨基吡啶)、或三烷基胺存在下，將一個被保護的Boc-氨基酸或肽在一種無水溶劑例如二氯甲烷或四氫呋喃(THF)中處理，用異丁基氯甲酸酯來形成“活化酸酐”，然后與另一個被保護的氨基酸或肽進行反應。通過這些方法形成的肽可以用一般的技術在氨基或羧基末端選擇地去保護，和用類似技術與其他肽或氨基酸耦合。在肽完成之后，可以像前面所描述的那樣，去掉保護基團。例如在有鈀或鉑催化劑的情況下，用在氨液、氫氟酸或強堿中的鈉處理進行氫化作用。
在肽去掉保護之后，如果最終的肽含有一個堿性基團，可以制備一種酸加成鹽。肽的酸加成鹽以標準方式在一種適當?shù)娜軇┲杏稍撃阁w化合物和一種過量的酸制備。這些酸是例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、馬來酸、琥珀酸、或甲磺酸。乙酸鹽的形式是特別有用的。如果最終的肽含有一種酸性基團，則可以制備陽離子鹽。通常將母體化合物用過量堿性試劑處理，例如含有適當陽離子的氫氧化物、碳酸鹽或醇鹽。陽離子如Na++、K+、Ca+和NH+是藥用鹽中陽離子的實例，最好選用陽離子Na+和NH+4。
概括地說，為了產(chǎn)生刺激作用，本發(fā)明的肽可以通過注射或口服，以0.1-10mg的劑量范圍，例如每天每70Kg重的人體給1-5mg予病人施用。如果用輸注或類似的技術引入體內(nèi)，則劑量可以為每70Kg重人體使用30-300mg的范圍，例如約100mg(在6天中)，原則上，希望在病人的細胞外液體中產(chǎn)生約10-13M-10-15M的肽濃度。
按照本發(fā)明的進一步的特征，提供了藥用組合物，該組合物包括一個或幾個如前面所定義的結構式(Ⅰ)的化合物或其藥用鹽作為活性組份，與藥用載體或賦形劑相結合。按照本發(fā)明所述的組合物，可以以適合于例如口、鼻、非腸道或直腸的施用形式使用。
在此使用的術語“藥用的”包括本發(fā)明的獸醫(yī)的應用。
這些肽可以形成膠囊、制片或制成乳劑或糖漿劑用于口服?？杉尤胨幱玫墓虘B(tài)和液態(tài)的載體來制備或穩(wěn)定該組合物，或便利于該組合物的制備。液態(tài)載體包括糖漿、花生油、橄欖油、甘油、鹽水和水。固態(tài)載體包括淀粉、乳糖、硫酸二水合鈣、石膏粉、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。載體也可以包括一種持續(xù)釋放材料例如甘油單硬脂肪酯或甘油雙硬脂酸酯，單獨使用或與一種蠟合用。固體載體的用量可以變化，但是最好是每單位劑量在約20mg到1g之間。該藥劑可以用以下藥學的常規(guī)方法制備，包括碾磨、混合、制粒和壓制。必要時作成片劑;或碾磨、混合和充填硬明膠膠囊。當使用液態(tài)載體時，可將制劑制備成糖漿劑、酏劑、乳劑或含水或非水的懸浮劑。這樣的液體形式可直接用于口服或充填軟明膠膠囊。器宮特異的載體系統(tǒng)也可以使用。
另一方面本發(fā)明的肽或它的衍生物的藥用組合物可以制成用于非腸道給藥的溶液或凍干粉末。凍干粉在使用前可通過加入適當?shù)南♂寗┗蚱渌幱幂d體回復水份。該液體的配方一般是緩沖的、等滲的水溶液。適當?shù)南♂寗┑膶嵗浅Ｒ?guī)的等滲鹽水溶液、規(guī)范的5%右旋糖水溶液或緩沖的乙酸鈉或銨的溶液。這樣的組成特別適用于非腸道給藥，但是也可以用于口服或包含在計量給藥吸入器或噴霧器中用于吸入。它也可以加入所期望的賦形劑如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化鈉或檸檬酸鈉。
對于直腸給藥，可將本發(fā)明的肽的粉末以與賦形劑例如可可油、甘油、明膠或聚乙二醇結合并壓制成為栓劑。該粉末也可以與一種油狀制劑、凝膠、霜膏或乳劑組合，進行緩沖或不緩沖，并通過一種透皮膏給藥。
鼻用噴霧劑可以相似地在水溶液中制備，并且將它裝在含有氣霧推進劑或提供手動壓縮裝置的氣霧劑容器中?？梢灾苽涑珊幸环N或多種活性組份的膠囊，例如通過將惰性載體如乳糖或山梨糖醇與活性組份混合，并將該混合物充填到明膠膠囊中。
含有本發(fā)明化合物的劑量單位最好為0.1-10mg，例如1-5mg的通式(Ⅰ)的肽或它的鹽。
按照本發(fā)明的進一步特征，還提供一種刺激骨髓細胞生成的方法，其中包括將一個如前面所定義的藥物組合物以有效劑量給患者施用。
本發(fā)明的另一個特征是提供在免疫抑制患者和正常的動物中治療病毒、真菌和細菌感染的方法，其中包括給予所需要治療的動物施用一個有效劑量的如前面所定義的藥用組合物。
通式(Ⅰ)的化合物的生物活性通過以下試驗來證實。
基質(zhì)細胞(stromal cell)克隆刺激活性的誘導人的骨髓基質(zhì)細胞系C6在塑料組織培養(yǎng)皿中，在RPMI-1640培養(yǎng)基和5%FBS中融合生長。在實驗的前一天，將培養(yǎng)基換成沒加血清的DMEM。將該化合物加到這些培養(yǎng)液中一小時后，洗滌培養(yǎng)物，用新鮮的DMEM代替該培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)該細胞24小時。24小時后收集C6細胞培養(yǎng)物上清液，無菌過濾、冷凍。直到按如下所述方法測定是否存在血細胞生成克隆刺激活性(CSA)。
軟瓊脂測試從路易斯(Lewis)鼠中獲得骨髓細胞。在沒有血清的DMEM中把它們調(diào)節(jié)到106細胞/毫升。使用如下的單層瓊脂系統(tǒng)用營養(yǎng)素(NaHCO3、丙酮酸、氨基酸、維生素和HEPES緩沖液)富集的DMEM;0.3%Bacto瓊脂和20%路易斯鼠血清，對它加入上面所述的C6細胞系上清液(10-2.5%)以及鼠骨髓細胞(最終濃度＝105細胞/ml)。該瓊脂板在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)7-8天。在顯微鏡下計數(shù)增殖的骨髓細胞(CFU-C)克隆。計數(shù)的瓊脂克隆的數(shù)目是與在C6骨髓基質(zhì)細胞系上清液中存在的CSA成正比例。
表15%的上清液的血細胞生成克隆的刺激活性劑量對照(pGlu-Glu-Asp)2-Sub-(LyS)2ng/ml 的百分比(實例2)1000 192100 24110 2071 1880.1 1540.01 970.001 -單純性皰疹鼠模型在感染前七天，給Balb/c鼠每天一次腹膜內(nèi)注射0.2ml體積，劑量為10和1ng/Kg的本化合物。對照鼠接受注射稀釋緩沖劑、DPBS和0.5%熱非活性正常鼠血清的混合物0.2ml。
在鼠的每一個后足肉趾上注射懸浮在0.05毫升PBS中的5.0×105/pfu，使鼠感染單純性皰疹病毒(菌株MS)。這些鼠繼續(xù)得到化合物或對照注射，直到垂死(不可給予進食或水)。
或者通過陰道培育病毒。將含有5.0×105/pfu的MS-NAP菌株的棉塞插入鼠的陰道。
用Wilcoxin試驗測定生存者在治療組與對照組中是否顯著性增加。
念珠菌的攻擊用白色念珠菌菌株B311a。該菌株是通過鼠傳代然后在-70℃溫度下冷凍。B311a對于免疫抑制鼠在5.0到8.0×104Cfu/鼠的范圍內(nèi)有毒力，而對于正常鼠是1.0～2.0×105cfu/鼠的范圍。將冷凍的念珠菌原種的一個樣品在Sabouraud右旋糖斜面上培養(yǎng)，然后取出50ml震蕩培養(yǎng)Sabouraud培養(yǎng)液18小時。洗滌細胞三次，然后用血細胞計數(shù)器計數(shù)。并用亞甲基染料的不相容性進一步證實其存活性。在接種物上進行存活性計數(shù)，進一步確定其數(shù)量。
用懸浮在0.2ml鹽水中的細胞靜脈注射念珠菌使所有的鼠(Bal b/c)感染。一些鼠用300拉德的輻射使其產(chǎn)生不致命的骨髓抑制。輻射之后的開始兩小時，給這些動物每天注射化合物CSF作為陽性對照，或注射賦形劑。輻射和治療開始后七天，靜脈注射白色念珠菌，對這些鼠進行攻擊。注意對于正常的鼠這大約相當于LD75。在其他研究對象中，鼠不被免疫抑制。在這些研究對象中，象被輻射的鼠一樣，以同樣的方式在感染后最初七天治療這些鼠。觀察這兩個模型中的鼠直到垂死。用wilcoxin試驗比較存活率的不同。
以下的實例用以說明本發(fā)明。這些實施例不限制本發(fā)明的范圍，但是展示了本發(fā)明化合物的制備和使用。
在這些實例中，所有溫度均是攝氏度。氨基酸分析是在Dionex Autoion 100上完成的。肽含量分析基于氨基酸分析。使用快原子轟擊在VG ZAB質(zhì)譜儀上進行FAB質(zhì)譜測定。所使用的縮寫如下Arg＝精氨酸Asp＝天冬氨酸t(yī)-BOC＝叔丁氧基羰基Bz＝苯甲基Cl-Z＝對-氯羧芐氧基羰基(Z＝羧芐氧基羰基)DCC＝二環(huán)己基碳化二亞胺DIEA＝二異丙基乙胺EDC＝(N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺Glu＝谷氨酸p-Glu＝焦谷氨酸Tyr＝酪氨酸Hna＝二氨基己炔酸HOBT＝羥基苯并三唑
Lys＝賴氨酸NMP＝N-甲基-2-吡咯烷酮Pro脯氨酸Gln＝谷氨酰胺Cys＝半胱氨酸Pim＝
(二氨基庚二酸)Sub＝
(二氨基辛二酸)Adp＝
N-MeArg＝N-甲基精氨酸Prc＝雙Boc-S，S′-1，3-丙烷二基半胱氨酸Etc＝雙Boc-S，S′-1，2-乙烷二基半胱氨酸Buc＝雙Boc-S，S′-1，4-丁烷二基半胱氨酸實例1制備(p-Glu-Glu-Asp)2-Pim-(Lys)2
半克t-Boc-Lys(Cl-Z)-OCH2-Pam樹脂(0.63mmol/gm)裝載到博克曼(Beckman)990B合成器的反應容器中，在去除保護的步驟中，用在二氯甲烷(CH2Cl2)中含40%的三氟乙酸(TFA)去除t-Boc基然后用10%的DIEA/CH2Cl2中和三氟乙酸鹽。使用2mM DDC和HOBT耦合2mM(780mg)的雙-Boc-2，6-二氨基庚二酸。耦合是在15ml CH2Cl2和10ml DMF的混合物中，在室溫下進行2小時。凱色(Kaiser)的試驗慣用于監(jiān)視該耦合。對剩余的游離羧基用3mM(1.65mg)的H-Lys(Z)-OBz、HCl和3mM的DCC和3mM的HOBT在25ml的CH2Cl2/DMF(15/10)中進行二次酰胺化作用。
耦合2小時之后，該樹脂用15ml的CH2Cl2洗滌二次，用15ml的DMF洗二次，用15ml的MeOH/CH2Cl2(1∶1)洗二次，最后用15ml的CH2Cl2洗二次。在對t-Boc使用40%TFA/CH2Cl2去保護并用10%DIEA/CH2Cl2中和之后，加入2mM(0.646gm)的Boc-Asp(Bzl)和2mM的DCC以及2mM的HOBT，在25ml的CH2Cl2/DMF(15/10)中耦合兩小時。然后如前所述的那樣對樹脂進行洗滌步驟。重復去保護步驟和中和作用步驟后在25ml的CH2Cl2/DMF(15/10)中耦合2mM(0.674gm)的BoC-Glu(Bzl)，2mM DCC和2mM的HOBT。在洗滌，去保護和中和作用步驟之后，再與2mM(0.258gm)的pGlu、2mM的DCC和2mM的HOBT在25ml的CH2Cl2/DMF(15/10)中耦合兩小時，然后將樹脂進行一次洗滌步驟。通過Kaiser的試驗監(jiān)視耦合的完成，并且在每一步上只需要單偶合。在合成完成之后，樹脂被干燥和稱重。產(chǎn)量1.2g。
將該肽樹脂(1.2g)裝入一個裂化裝置，在-15℃條件下用10ml的氫氟酸(HF)和1ml苯甲醚進行兩小時裂解。在真空條件下去除HF之后用醚徹底地洗滌樹脂和肽的混合物，在冰醋酸(30ml)中提取肽。在一個旋轉蒸發(fā)器(rotavap)上從提取液中去除大部分酸，殘留物在水中稀釋并冷凍干燥。乙酸提取液具有810mg粗制肽。
從乙酸提取液中獲得的粗制肽(80mg)用制備C-18柱進一步提純，使它流過一個預平衡(在0.1%TFA/H2O中)的柱。采用一種線性梯度的80%乙腈、20%H2O和0.1%TFA洗脫該肽。
三個同分異構體同時被洗脫(8.52min)。在C-18柱上用30%(0.1%TFA在CH3CN中)，70%(0.1%TFA在水(H2O)中)到80%(在CH3CN中0.1%的TFA)、20%(0.1%TFA在H2O中)的梯度在流速為1.5ml/min進行35分鐘條件下，對他們進行分離。洗脫得下列組分
組份118.69min組份219.68min組份322.95min氨基酸的分析給出下列結果氨基酸分析 觀察值Glu 1.99Asp 1.0Lys 1.05二氨基庚二酸 未測質(zhì)譜＝1157.5(M+H)+實例2(pGlu-Glu-Asp)2-Sub-(Lys)2的制備
A.BOC-SUB-Lys-(ε-Z)COOBz的合成Bis-Boc(1，1)二氨基辛二酸用R.Nutt的方法合成(J.Org.Chem.45，3078，1980)。
2mM的Boc-Sub(808mg)，4mM的Lys-(ε-Z)-COOBz.HCl(1.56g)和4mM的HOBT(0.613g)溶解在10ml的二氯甲烷(CH2Cl2)中，將該溶液用冰/丙酮浴冷凍到-15℃。加入4mM(0.692ml)的二異丙基乙胺(DIEA)隨后加入0.772g(4mM)水溶性碳化二亞胺(EDC)。攪拌一小時之后，將該混合物加溫至室溫，三小時之后蒸發(fā)掉二氯甲烷，將殘留物在200ml的乙酸乙酯中溶解。該溶液首先用1N HCl洗滌，隨后用1N NaOH、飽和NaCl溶液和水洗滌，這樣的洗滌重復三次，每次洗液約100ml。有機層用MgSO4干燥并且蒸干。未進一步的純化。1.86克的BOC-Sub-(ε-Z)Lys-COOBz(產(chǎn)率79%)被獲得和使用。B.BOC Asp-(β-OBz)Sub Lys-(ε-Z)-COOBz.的合成在4N HCl-二惡烷中溶解Boc-Sub-Lys-(ε-Z)-COOBz(1.8g)半小時，然后蒸發(fā)至干。用醚洗滌剩余物，干燥過夜。將該鹽酸鹽溶解在30ml的CH2Cl2中，且加入BOCAsp-(β-OBz)(1.292g)。將該溶液冷凍至-15℃，加入0.613g HOBT，0.554ml DIEA和0.772g EDC。攪拌兩小時之后，該混合物升溫至室溫。18小時之后(過夜)處理該反應混合物，蒸發(fā)掉CH2Cl2把剩余物溶解在200ml的乙酸乙酯中。該溶液用1N HCl，1N NaOH，飽和NaCl溶液和水洗滌(洗滌重復三次，每次洗液約100ml)。該有機層用MgSO4干燥并且將蒸發(fā)。BOC-Asp-(β-OBz)-Sub-Lys-(ε-Z)COOBz 1.9g(產(chǎn)率73%)。未進一步提純，這個肽即被使用。
C.BOC-Glu-(γ-OBz)Asp-(β-OBz)Sub-Lys-(ε-z)COOBz.的合成在15ml的4N HCl二惡烷中溶解1.8g BOC-(β-OBz)Asp-Sub-(ε-Z)Lys-COOBz。15分鐘之后去除溶劑和用醚洗滌剩余物，并干燥。在15ml的N-甲基吡咯烷酮(NMP)中溶解該鹽酸鹽。把該溶液冷凍至-15℃，且加入4mM(1.338)的BOC-Glu(γ-OBz)，0.204mlDIEA，0.772g EDC和0.612g的HOBT。將該混合物攪拌過夜，逐漸升溫至室溫。該反應混合物加到含有1升冷凍的10%Na2CO3在飽和NaCl溶液中的燒瓶中。過濾該沉淀物，用水洗滌，且在真空條件下干燥。不作進一步提純。獲得BOC-(γ-OBz)Glu-(β-OBz)Asp-Sub-(ε-Z)Lys-COOBz(1.3g)，備用，產(chǎn)率68%D.pGlu-(γ-OBz)Glu-(β-OBz)Asp-Sub-(ε-Z)Lys-COOBz的合成在15ml的4N HCl二惡烷中溶解1.2g BOC-(γ-OBz)Glu-(β-OBz)Asp-Sub-(ε-Z)Lys-COOBz。15分鐘后，去除溶劑，用醚洗滌該剩余物并干燥。在15ml的NMP中溶解該鹽酸鹽。冷凍該溶至-15℃、且加入4mM(0.516g)Pyro-Glu(p-Glu)，0.106ml DIEA、0.772gEDC和0.612g的HOBT。將該混合物攪拌過夜，而逐漸將其升溫至室溫。將該反應混合物加到一個含有一升冷凍的10%Na2CO3(在飽和NaCl溶液中)的燒瓶中。過濾該沉淀物，用水洗滌，且在真空條件下干燥。未進一步提純，獲得(0.830g)pGlu-(γ-OBz)-Glu-(β-OBz)Asp-Sub-(ε-Z)Lys-COOBz。備用。產(chǎn)率69%E.pGlu-Glu-Asp-Sub-Lys-COOH的合成pGlu-(γ-OBz)Glu-(β-OBz)Asp-Sub-(ε-Z)Lys-COOBz(0.200g)使用5ml HF/1.5ml苯甲醚在0℃條件下去保護。去除HF，且在醚和0.1N乙酸之間分配該肽。含水層被洗滌和冷凍干燥。獲得0.089g的pGlu-Glu-Asp-Sub-Lys-COOH。該肽20mg在C18制備性Vyadec柱上，使用isocratic條件(10%乙腈，90%水和0.1%三氟乙酸，流速5.6ml/min)，進行提純。FAB質(zhì)量M+H＝1171.4。氨基酸分析Asp(1.0)，Glu(2.19)，Lys(1.01)，Sub N.D。HPLC在C18 Vyadec 0.23×25mm分析柱上的保持時間7.01分鐘(流速為1.5ml梯度0%至80%B A＝0.1%TFA在水中，B＝0.1%TFA在乙腈中)。
實例3(pGLu-Glu-Asp)2-Lan-(Lys)2的制備〔Lan＝羊毛硫氨酸(SCH2CH(NH2)COOH)〕0.5克的t-BOC-Lys(Cl-Z)-CH2PAM(0.63mm/g)裝入Beckman 990合成器的反應容器中。用在二氯甲烷中的40%TFA去除t-BOC基。用10%DIEA/CH2Cl2中和三氟乙酸鹽。在室溫條件下在15ml的CH2Cl2和10ml的DMF中用4mM的DCC和HOBT偶合2mM的Bis Boc羊毛硫氨酸。使用Kaiser試驗監(jiān)視其偶合。在25ml的CH2Cl2/DMF(15/10)中使用3mM的H-Lys-O-Bz·HCl;和3mM的DCC以及HOBT酰胺化游離的剩余羧基。在該偶合樹脂用CH2Cl2，30%MeOH-CH2Cl2，和CH2Cl2(25ml×3)徹底洗滌之后，用目的肽中其余的氨基酸(Asp，Glu，pGlu)重復去保護、中和和偶合這一循環(huán)。把4mM的每一個氨基酸、DCC和HOBT用于每一個偶合。用Kaiser試驗監(jiān)視每一個偶合。在合成完成之后，干燥和稱重該樹脂。
把上述肽樹脂裝入裂解裝置中，在-15℃條件下用10ml的氫氟酸(HF)和1ml的苯甲醚裂解二小時。在去掉HF之后，用醚徹底洗滌該樹脂，用冰醋酸(30ml)提取肽。在旋轉蒸發(fā)器(rotavap)上去掉大部分醋酸，余留物在水中稀釋和冷凍干燥。在用HPLC純化之后，獲得肽。
實例4制備(Pro-Asp-Asp)2-Sub-(Lys)2把0.5克的t-BOC-Lys(Cl-Z)-CH2·Pam(0.63mM/g)裝入Beckman 990合成器的反應容器中。在二氯甲烷中用40%TFA去除t-BOC基團。用10%DIEA/CH2Cl2中和該三氟乙酸鹽，在室溫條件下，在15ml的CH2Cl2和10ml的DMF中用4mM的DCC和HOBT偶合2mM的BisBOC二氨基辛二酸。用Kaiser試驗監(jiān)視其偶合。在25ml的CH2Cl2/DMF(15/10)中用3mM的H-Lys-O-Bz·HCl;和3mM的DCC以及HOBT酰胺化剩余的游離羧基。偶合之后，用CH2Cl2、30% MeOH-CH2Cl2，和CH2Cl2，和CH2Cl2(25ml×3)徹底洗滌該樹脂。用目標肽中其余的氨基酸(Asp，Asp和Pro)重復去保護、中和，以及偶合這一循環(huán)。把4mM氨基酸、DCC和HOBT用于各次偶合。每一次偶合均用Kaiser試驗監(jiān)視。在合成完成之后，干燥和稱重該樹脂。
上述肽樹脂裝入裂解裝置中，在-15℃溫度條件下用10ml的氫氟酸(HF)和1ml的乙腈裂解二小時。去除HF之后，用醚徹底洗滌該樹脂，用冰醋酸(30ml)提取肽。在一個旋轉蒸發(fā)器(votavap)上去除大部分乙酸，用水稀釋其剩余物并且冷凍干燥。過HPLC提純作用之后，獲得肽。
實例5制備(pGlu-Asp-Asp)2-Pim-(Lys)20.5克的BOC-Lys(Cl-Z)-CH2PAM(0.63mM/g)裝入一個Beckman 990合成器的反應容器中。用在二氯甲烷中的40%TFA去除t-BOC基。用10%DIEA/CH2Cl2中和三氟乙酸鹽。在室溫條件下，在15ml的CH2Cl2和10ml的DMF中使用4mM的DCC以及HOBT偶合2mM的Bis Boc庚二酸，用Kaiser試驗監(jiān)視其偶合。在25ml的CH2Cl2/DMF(15/10)中用3mM的H-Lys-O-Bz·HCl;3mM的DCC和HOBT酰胺化游離的剩余羧基。偶合之后，用CH2Cl2，30%MeOH-CH2Cl2，和CH2Cl2(25ml×3)徹底洗滌該樹脂。用目的肽中剩余的氨基酸(Asp，Asp和p-Glu)重復去保護、中和作用和偶合循環(huán)。把4mM的氨基酸、DCC和HOBT用于每一次偶合，用Kaiser試驗監(jiān)視每一次偶合。在合成完成之后，干燥和稱重該樹脂。
把上述樹脂裝入裂解裝置，在-15℃條件下，用10ml的氫氟酸(HF)和1ml的苯甲醚裂解二小時。在去除HF之后，用醚徹底洗滌該樹脂和用冰醋酸30ml提取肽。在一個旋轉蒸發(fā)器(Votvap)上去除大部分乙酸，在水中稀釋其剩余物且冷凍干燥。在通過HPLC提純作用之后，獲得肽。
實例6(pGlu-Glu-Asp)2-Pim-(Arg-CONH2)2的制備0.5克的BOC-Tos Arg-BHA(0.5mM/g)被裝入Beckman 990合成器的反應容器中，用在二氯甲烷中的40%TFA去掉BOC基。用10%的DIEA/CH2Cl2中和三氟乙酸鹽。在15ml的CH2Cl2和10ml的DMF中在室溫條件下用2mM的DCC和HOBT偶合1mM的Bis BOC庚二酸。用Kaiser試驗監(jiān)視其偶合，在25ml的CH2Cl2/DMF(15/10)中用3mM的H-Lys-OBz·HCl;和3mM的DCC和·HOBT使游離的剩余羧基酰胺化。偶合之后，用CH2Cl2，30%MeOH-CH2Cl2和CH2Cl2(25ml×3)徹底洗滌該樹脂。用目標肽中其余的氨基酸(Asp，Glu和pGlu)重復去保護、中和和偶合循環(huán)，把3mM的氨基酸、DCC和HOBT用于每一次偶合。用Kaiser試驗監(jiān)視每一次偶合，在合成完成之后，干燥和稱重該樹脂。
將肽樹脂裝入一個裂解裝置中，在-15℃條件下用10mM的(HF)氫氟酸和1ml的苯甲醚裂解二小時。去掉HF之后，用醚徹底洗滌該樹脂，用冰醋酸(30ml)提取肽。在旋轉蒸發(fā)器(votavap)上去除大部分的乙酸，在水中稀釋其殘余物并且冷凍干燥。在用HPLC提純之后，獲得肽。
實例7含有酪氨酸的類似物的合成(Tyr-Glu-Asp)2-Sub-(Lys)2;
(pGlu-Tyr-Glu-Asp)2-Sub-(Lys)2;
(pGlu-Glu-Tyr-Asp)2-Sub-(Lys)2;
(pGlu-Glu-Asp-Tyr)2-Sub-(Lys)2。
2克的BOC-Lys(Cl-Z)-O-樹脂(PeninsulaLabs
，取代0.49mM/g)裝入一個手動震搖器的容器中。在去保護和中和作用步驟之后，用4mM(824mg)的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和4mM(612mg)的1-羥基苯并三唑水合物(HOBT)在25ml的50%N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和二氯甲烷(DCM)中，把2mM(808mg)的di-BOC二氨基辛二酸偶合到樹脂上，使反應進行過夜隨后加入10mM(4.06g)H-Lys(Z)-OBz·HCl，10mM(1.29g)二異丙基乙胺(DIEA)，10mM(2.06g)DCC和10mM(1.53g)HOBT。在兩小時之后，使用在NMP/DCM(1∶1)中的乙酸酐覆蓋未反應的氨基酸。把近三分之一的所得的BOC-Sub-Lys-樹脂轉移到另一個反應容器中。樹脂多的部分稱為部分Ⅰ，少的部分稱為部分Ⅱ，在部分Ⅱ中采用標準的去保護，中和，和偶合循環(huán)把BOC-Tyr(Br-Z)，BOC-Asp(OBz)，BOC-Glu(OBz)，和p-Glu耦合到樹脂上。使用5mM的氨基酸、DCC和HOBt，在25ml NMP/DCM(1/1)中進行偶合，且用Kaiser試驗監(jiān)視偶合的合成，在部分Ⅰ中把5mM的BOC-Asp(OBz)耦合到樹脂上。所得BOC-Asp-Sub-Lys樹脂的四分之一被移到另一個容器中(部分Ⅲ)。剩余的樹脂被稱為部分Ⅳ。在部分Ⅲ中采用標準的去保護、中和和偶合循環(huán)把BOC-Tyr(Br-Z)，BOC-Glu(OBz)、和p-Glu偶合到樹脂上。使用5mM的氨基酸、DCC和HOBt。在25ml NMP/DCM(1/1)中進行偶合和用Kaiser試驗完成對偶合的監(jiān)視。在多的部分(部分Ⅳ)中把5mM的BOC-Glu(OBz)偶合到樹脂上。把該樹脂的三分之一轉移到另一個容器中，且把5mM的p-Glu偶合到這部份(部份Ⅵ)上合成pGlu-Glu-Asp-Sub-Lys-樹脂。把5mM的BOC Tyr(Br-Z)偶合到多的部分(部分Ⅴ)上，且把該樹脂進一步分成兩半。一半樹脂照現(xiàn)在的樣子留下，而另一半樹脂(部分Ⅶ)與5mM的p-Glu偶合，導致在p-Glu-Tyr-Glu-Asp-Sub-Lys-樹脂中的合成。在說明書附圖
中用圖解來進行描述。這些樹脂多肽被去掉保護，且在0℃條件下用HF/苯甲醚裂解一小時。在C-18Vydac 2.5cm×30cm的制備柱上用水/0.1%三氟乙酸(TFA)和乙腈/0.01%TFA緩沖劑系統(tǒng)對粗制肽(近100mg)提純。
實例8(pGlu，Glu Asp)2Prc(Lys)2的制備a)雙BOC-S，S′-1-3-丙烷二基半胱氨酸的合成用干燥的氨飽和3ml的甲醇，加入在0.5ml甲醇中的0.5g BOC一半胱氨酸，隨后加入0.35ml的1，3二溴丙烷。10分鐘后，再加入在0.5ml甲醇中的0.5g的BOC一半胱氨酸。4.5小時之后，蒸發(fā)其溶劑，將油性剩余物溶解在水中。溶液PH值被調(diào)節(jié)到9，且用醚提取溶液。水層被酸化到PH2，并用乙酸乙酯提取，把有機層干燥和蒸發(fā)，得到1.12g雙BOC-S，S-1，3-丙烷二基半胱氨酸。未進行進一步純化。使用該氨基酸，F(xiàn)AB/MS M+H＝469。
b)(pGluGluAsP)2Prc(Lys)2的制備把BOC-Lys樹脂(0.53g，取代0.63mM/g)裝入一個手動震搖器中，在去保護和中和作用循環(huán)之后，在10mlNMP/DCM(1/1)中用1mM(206mg)DCC和1mM(153mg)HOBt偶合雙BOC-S，S′-1，3丙烷二基半胱氨酸(290mg，0.6mM)。兩小時后，用NMP和DCM洗滌該樹脂。加入2mM(765mg)的H-Lys(Z)-OBz隨后裝入在4ml的NMP/DCM(1/1)中的1.5mM(390mg)DCC和1.5mM(230mg)的HOBt。18小時后，用20ml NMP和DCM洗滌該樹脂。為偶合BOC-Asp(OBz)，BOC-Glu(OBz)和p-Glu重復一般的去保護，中和以及偶合的循環(huán)，使用1mM的氨基酸，DCC和HOBt。在5ml的NMP/DCM(1/1)中進行偶合。用Kaiser試驗監(jiān)視該偶合的完成。把所得的樹脂肽(416mg)去掉保護，在0℃條件下，用0.5ml的苯甲醚和8ml的HF裂解二小時。把HF蒸發(fā)，用醚洗滌樹脂混合物，且用冰醋酸提取，在冷凍干燥之后，獲得130mg的粗制肽。在C-18 Vydac制備柱上用乙腈-水(0.1%TFA)緩沖系統(tǒng)提純上述粗制肽(61.5mg)。獲得純肽16.5mg。
FAB/MSM+H1249.3氨基酸分析AsP 2.0(2)Glu 4.28(4)Dpc 1.14Lys 1.96(2)實例9和10按照上述制備雙BOC-S，S′-1，3-丙烷二基半胱氨酸(Prc)的方法制備雙BOC-S，S′-1，2-乙烷二基半胱氨酸(Etc)和雙BOC-S，S′-1，4-丁烷二基半胱氨酸(Buc)。
按照上述制備(pGlu Glu Asp)2Prc(Lys)2的方法，制備30mg的(pGlu Glu Asp)2Etc(Lys)2和17mg的(pGlu Glu Asp)2Buc(Lys)2。
實例11(pGlu-Glu-Asp)2Sub(N-MeArg)2的合成將羥基甲基樹脂0.5g(0.45meg/g)懸浮在DCM(5ml)中，且與0.5mM(221mg)BOC-NMeArg，0.5mM(61mg)二甲基氨基吡啶，和0.5mM(103mg)DCC起反應，用DCM(3X)，NMP(3X)，和DCM(4X)洗滌己酰胺代的樹脂。在20ml的DCM中用0.5ml的異氰酸苯酯覆蓋未反應的羥基。用DCM和NMP徹底洗滌該樹脂。用40%TFA/DCM去掉BOC基，用在DCM0.05mM(20.2mg)中的10%DIEA中和之后，用0.125mM(25.7mg)的DCC和0.125(19.1mg)mMHOBt偶合BOC-Sub。72小時之后，用NMP和DCM洗滌該樹脂。重復一般的去保護、中和作用以及偶合循環(huán)進行BOC-Asp(OBz)，BOC-Glu(OBz)和p-Glu的偶合。使用1mM的氨基酸、DCC和HOBt。在5ml的NMP/DCM(1/1)中進行偶合，用Kaiser試驗監(jiān)視該偶合的完成。上述所得的樹脂肽(484mg)被去掉保護。且在0℃條件下用0.5ml的苯甲醚和10ml的HF裂解2小時。把HF蒸發(fā)，用醚洗滌上述肽樹脂混合物，且用冰醋酸提取。在冷凍干燥之后，獲得12.5mg的粗制肽。在C-18Vydac制備柱上用乙腈-水(0.1%TFA)緩沖劑系統(tǒng)提純上述粗制肽(6mg)。獲得2.2mg的純肽。
實例12(pGlu-Glu-Asp)2Sub(Hna)2的合成羥基甲基樹脂0.5g(0.45meq/g)懸浮在DCM(5ml)中，且與126mg(0.335mM)2，N-BOC-6，N-Z-2，6二氨基-4-己炔酸(Hna)，40mg(0.335)二甲基氨基吡啶(DMAP)，69mg(0.335)DCC和50mg(0.335)HOBt起反應。用DCM(3X)，NMP(3X)，和DCM(4X)洗滌該酰胺代的樹脂。在20ml的DCM中用0.5ml異氰酸苯酯覆蓋未反應的羥基。用DCM和NMP徹底洗滌該樹脂。用40%TFA/DCM去除BOC基。用在DCM中的10%DIEA中和之后，用50mg(0.22mM)的DCC和33.6mg(0.11mM)HOBt偶合BOC-Sub 44mg(0.11mM)。16小時之后，用NMP和DCM洗滌該樹脂。重復常規(guī)的去保護，中和作用以及偶合的循環(huán)對于BOC Asp(OBz)，BOC-Glu(OBz)和p-Glu進行偶合。使用1mM的氨基酸，DCC和HOBt，在5ml的NMP/DCM(1/1)中進行偶合，用Kaiser試驗監(jiān)視其偶合的完成。將所得的樹脂肽(608mg)去掉保護，且在0℃條件下用0.6ml苯甲醚和10ml的HF裂解2小時。蒸發(fā)掉HF，用醚洗滌該肽樹脂混合物，且用冰醋酸提取。在冷凍干燥之后，獲得93.7mg的粗制肽。在C-18Vydac制備柱上用乙腈-水(0.1%TFA)緩沖系統(tǒng)提純上述粗制肽(20.6mg)。獲得7.5mg的純肽。分析氨基酸和確定其結構。
FAB/MSM+H 1163氨基酸分析Asp 2.0(2)Glu 4.01(4)Sub 2.01(1)Hna 1.44(2)實例13(pGlu-Glu-Asp)2Adp(Lys)2的合成
a)雙BOC2，5(S，S)二氨基己二酸的合成。用R.Nutt的方法(J.Org.Chem.45，3078，1980)合成雙-BOC·2，5(S，S)二氨基己二酸，將192mgNaOCH3和57.56g BOC-Asp(OBz)加入到240ml甲醇和80ml吡啶的混合物中。當該溶液均勻后，將其反應混合物冷卻到0℃。用鉑電極，將約1.5安的電流(100伏)通過該反應混合物，溶液的溫度保持在15℃和25℃之間。通過TLC(三氯甲烷∶甲醇∶乙酸/95∶4∶1)使起始物質(zhì)消失。5小時之后，終止反應。在旋轉蒸發(fā)器(rotavap)上去除溶劑。其油性褐色剩余物溶解在150乙酸甲酯中。該溶液在室溫下放置18小時，通過過濾，去除沉淀物，蒸發(fā)濾液，獲得雙BOC2，5二氨基辛二酸的粗制二芐基酯(61.7g)。在己烷中將61g的粗制產(chǎn)品裝入硅膠柱上。順序地用在己烷中的10%，20%，25%和30%的乙酸乙酯洗脫這個柱。用TLC分析組分。把含有期望產(chǎn)品的各組分匯集起來。在旋轉蒸發(fā)器(rotavap)上去掉溶劑。在真空中干燥上述純化的產(chǎn)品(3.78g)。把3g二芐基酯溶解在120ml的甲醇中，且在帕爾(Parl)裝置中用378mg的10%Pd/活性炭氫化。在5小時完成氫化。過濾該溶液，在旋轉蒸發(fā)器(rotavap)上濃縮其濾液。粗制的雙BOC2，5-二氨基己二酸用三氯甲烷裝填，用快速硅膠色譜法純化。順序地用98∶2∶0.1，98∶2∶0.5，95∶4∶1，90∶8∶2，85∶10∶5和70∶20∶10的三氯甲烷，甲醇和乙酸洗脫該柱。把含有所期望的產(chǎn)品的各個部分匯集起來，在一個旋轉蒸發(fā)器(rotavap)上濃縮，在真空中干燥殘留余物(1.07g)。用NMR、以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)確定其產(chǎn)品結構。
b)(pGlu·Glu AsP)2AdP(Lys)2的合成0.5克BOC-Lys(Cl-Z)-PAM樹脂(0.63mM)裝入一手動震搖器的容器中，在二氯甲烷中用40%TFA去掉BOC基。用10%DIEA/DCM中和三氟乙酸鹽。在15ml DCM和15ml NMP中用4mM DCC和HOBt偶合2MM的雙Boc2，5二氨基己二酸(AdP)。在30ml DCM/NMP(1/1)中用3mM H-Lys(Z)-OBz和3mM DCC及HOBt酰胺化游離的羧基。偶合之后，用DCM，NMP徹底地洗滌該樹脂，用目的肽中其余的氨基酸(Asp，Glu和pGlu)重復去保護、中和作用和偶合循環(huán)。4mM的各種氨基酸、DCC和HOBt用于各次偶合。用Kaiser試驗監(jiān)視每一次偶合的完成。在合成完成之后，把該樹脂肽裝入裂解裝置中，且在-15℃條件下用10ml HF和1ml苯甲醚裂解兩小時。去除HF之后，用醚徹底洗滌該樹脂，和在冰醋酸中提取肽。在旋轉蒸發(fā)器(rotavap)上去除大部分乙酸，用水稀釋其剩余物和冷凍干燥。通過HPLC純化作用之后，獲得所期望的肽。
權利要求
1.一種用于制備公式Ⅰ的化合物或它的一種藥用鹽的方法
其中Y1和Y2獨立地各自為CH2或SX是0，1，2，3或4m是0，1或2n是0，1或2，A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸；B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸；C是谷氨酸，酪氨酸或天冬氨酸；D是賴氨酸，精氨酸，酪氨酸，N-甲基精氨酸，二氨基己炔酸或羧基酰胺，或其羥基甲基衍生物。E是谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸或一個肽鍵。并規(guī)定當Y1和Y2是S時，X是2，3或4，m和n是1，或當Y1和Y2是CH2時，X是0，1或2，m和n是0，或當Y1是S或Y2是CH2時，X是0，n是1，或當Y2是S并且Y1是CH2時，X是0，m是1；該方法包括a)偶合被保護的氨基酸來形成一種適當?shù)谋槐Ｗo的下式所示的化合物
其中A、B、C、E、Y1、Y2、m、x和n是與上述公式I所定義的一樣，而[D′]是氯甲基、甲基二苯甲基胺、二苯甲基胺或苯乙酰胺甲基樹脂，或D如上述公式Ⅰ所定義的一樣。b)去除保護基，若需要，從樹脂上裂解肽；和c)選擇性地形成它的藥用的鹽。
2.如權利要求1用于制備一種化合物的方法，其中Y1和Y2是CH2。
3.如權利要求1的方法，其中X是1或2。
4.如權利要求1的方法，其中Y1是硫。
5.如權利要求1的方法，其中Y1和Y2是硫。
6.如權利要求1的方法，其中A是焦谷氨酸、B是谷氨酸、C是天冬氨酸、D是賴氨酸和E是一個肽鍵。
7.如權利要求1的方法，用于制備一種(pGlu-Glu-Asp)2-Pim-(Lys)2的化合物。
8.如權利要求1的方法，用于制備一種(pGlu-Glu-Asp)2-Sub-(Lys)2的化合物。
9.按照權利要求1的一個化合物，選自于下列一組化合物(Tyr-Glu-Asp)2Sub(Lys)2(pGlu-Tyr-Glu-Asp)2Sub(Lys)2(pGlu-Glu-Tyr-Asp)2Sub(Lys)2(pGlu-Glu-Asp-Tyr)2Sub(Lys)2(pGlu-Glu-Asp)2Sub(N-MeArg)2(pGlu-Glu-Asp)2Sub(HNA)2(pGlu-GluAsp)2Prc(Lys)2(pGluGluAsp)2Etc(Lys)2(pGluGluAsp)2Buc(Lys)2
10.一種用于制備藥用組合物的方法，其中包括把如權利要求1所定義的公式Ⅰ的化合物或它的藥用鹽與一種藥用載體結合在一起。
11.如權利要求1所定義的公式1的化合物或它的藥用鹽在生產(chǎn)刺激骨髓細胞生成系統(tǒng)的藥物中的使用。
12.使用公式Ⅰ的化合物或一種藥物治療病毒、真菌和細菌的感染。
全文摘要
本發(fā)明提供下列公式的化合物該化合物具有血液調(diào)節(jié)活性，可用于刺激血細胞的生成。
文檔編號A61K38/08GK1054773SQ9010706
公開日1991年9月25日 申請日期1990年7月13日 優(yōu)先權日1989年7月14日
發(fā)明者普拉迪普·庫馬·巴特納加, 威廉·弗朗西斯·赫夫曼, 詹姆斯·愛德華·塔爾梅奇 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司