專利名稱:生長抑制組合物的制備方法
本發(fā)明涉及生長抑制組合物的制備方法，更具體地涉及含有高溶解度環(huán)糊精衍生物和潛在或活性生長抑制化合物的生長抑制組合物的制備方法。
肝素和血管生成的抑制作用
血管生成導致新的毛細血管生長，對胚胎發(fā)育、黃體形成和傷口愈合等正常過程是重要的，它 2也是慢性炎癥、某些免疫答應和腫瘤形成等病理過程的重要組成部分。目前普通認為大多數惡性腫瘤導致血管生成，而血管生成對惡性腫瘤的繼續(xù)生長和存活是不可少的。血管生成是糖尿病性視網膜炎，晶體后纖維組織形成和新血管性青光眼等許多眼病理學的主要組成部分。另外，目前認為血管生成也是其它非腫瘤形成性病理狀態(tài)，如風濕性關節(jié)炎(異常的毛細血管生長能破壞關節(jié)軟骨)，血管瘤(新生兒出現(xiàn)的異常毛細血管生成，可持續(xù)兩年以上)、血管纖維瘤(在鼻咽部產生)、及牛皮癬(過度增生和脫落決定于真皮中異常毛細血管的生長)的主要組成部分[見Folkman和Klagsbrun，Science 235 442(1987)]。
以前發(fā)現(xiàn)肝素(或肝素片段)和可的松可協(xié)同作用抑制血管生成。這在1984年8月16日遞交的美國專利申請?zhí)枮?41,305的申請中已經述及，其內容列入本文參考文獻。當將它們一同給予患有某些類型腫瘤的小鼠時，能夠抑制支持腫瘤生長的基本毛細血管的生成并破壞支持腫瘤生長的血液供應。[“正常和瘤形成組織血管生長是如何調節(jié)的？”(G.H.A.Clowts Memorial AwardLecture)，Judah Fdkman，Cancer Research，46467(1986)]一文綜述了該發(fā)現(xiàn)的歷史及其相關的主題內容，該文的內容作為背景技術列為本申請參考文獻。
可的松是一種抗炎藥，其本身不能抑制毛細血管生長。據Shubik等人[JNat′lCancer Inst.57769，(1976)]報道，在一定條件下6α-甲基潑尼松龍可部分地抑制鼠煩囊腫瘤的血管生成，但是腫瘤生長不停止。其它許多文章報道即使有大量的可的松存在，腫瘤仍繼續(xù)生長。也有報道甲氧基黃體酮、地塞米松和更少的可的松可抑制兔角膜腫瘤的血管生成。而雌二醇和睪酮則無效[Gross et al.，Proc.Nat′1.Acad，Sci.USA78176(1981)]。
現(xiàn)在已經知道除了可的松以外，其它一些類固醇和肝素或肝素片段一起使用也能成功地抑制血管生成。這些有效應的類固醇稱作“肝素依賴性類固醇”，因為肝素的效應是獨有的(至今是這樣認為)。這些血管生成抑制性類固醇的發(fā)現(xiàn)及特性已在“在肝素或肝素片段存在下抑制血管生成的一類新類固醇”[R.Grum，S.Szabo和J.Folkman，Sci-ence 2301375(1985)]和“成血管生成抑制性類 3固醇”[J.Folkman和D.E.Ingber，Annals of Sur-gery，206 374(1987)]中討論，這些將以背景技術列為本申請參考文獻。
肝素—一種粘多糖—是許多組織，尤其是肝和骯及幾種哺乳類肥大細胞的一種成分，從化學角度，肝素是D-葡糖胺和D-葡糖醛酸以α，β糖苷鏈相連的硫酸化共聚物。然而，雖然半個世紀來醫(yī)學上一直將肝素用作抗凝劑，但肝素的確切結構和其抗血凝固作用的真正本質尚未探明。確定肝素結構的主要困難在于其本身的復雜性和其本身不是一種均一的、定義明確的物質。肝素是分子量為5，000至40,000的多分散體。在一特定的鏈上，也有諸如硫酸化、N-乙酰化和糖醛酸殘基C-5差向異構化等結構變化。
用肝素與類固醇抑制血管生成的主要缺點是，由不同方法和不同公司生產的肝素，盡管其抗凝血作用相似，但是它們抗血管生成的活性差異相當大。由于原料和制造方法不同，商品肝素的精確組分也顯然不同。某些肝素可與可的松相結合抑制血管生成，而其它肝素就沒有這種效果。事實上，為了達到這種效果，可以增加某些肝素的劑量，但由于肝素的抗凝血作用，這樣使用可能引起麻煩。第二個缺點是，雖然當使用合適劑量并與類固醇有合適比例時，肝素明顯地抑制相應的肝瘤生長，甚至在稍微高些劑量和比例時能促進腫瘤退化，但是當使用更高劑量水平和對類固醇的比例高時，肝素也能恢復腫瘤的迅速生長。肝素中顯然存在血管生成的正負調節(jié)因子，這在適當給藥時可能產生麻煩。肝素的抗凝血活性可帶來另一個缺點，即為避免出血，給藥時須限制在較低劑量水平或采用口服給藥。最后，因為肝素不能透過角膜，所以不能在角膜外局部用藥以對角膜產生抗血管生成作用。
環(huán)糊精
環(huán)糊精(下面為方便起見分別用CD或CDs代表其單復數)為至少含有6個吡喃型葡萄糖單位的環(huán)狀寡聚糖。盡管已經知道具有12個吡喃型葡萄糖單位的CDs，但是已被廣泛研究的只有前三個同系物。這些化合物具有如
圖1(A)所示的簡單、明確限定的化學結構。在整個說明書中較低分子量α，β和r-CDs使用共同命名，參見圖1(A)中所示的化學結構，其中分別為n＝6，7，或8個吡喃型葡萄糖單位。約在本世紀初CDs是 4作為淀粉的降解物而首先發(fā)現(xiàn)的，Schardinger證明用浸麻芽孢桿菌(Bacillus Macerans)淀粉酶作用于淀粉可制得這些化合物。在較老的文獻中，這些化合物經常稱為Schardinger糊精。它們有時還叫做環(huán)鏈淀粉。
拓撲學上，CDs可被表示為一個如圖1(B)所示的環(huán)形曲面體，它的上面主要由-CH2OH基團排列成線狀，下邊為仲羥基。與環(huán)形曲面體共軸的渠道樣洞，α-、β-和α-CDs的洞的直徑分別為5，6，或7A.U。這些洞穴使得環(huán)糊精能形成具有合適直徑的外來疏水分子的包含化合物。
已制備并在文獻中描述了大量的CD衍生物?？偟膩碚f，這些化學修飾的CDs都是通過與碳2，3或6相連的伯或仲羥基的反應，而不破壞α(1→4)半縮醛鍵而獲得的?！八拿骟w報告147號，化學修飾的環(huán)糊精的合成”[A.P.Croft和R.A.Bartsch，Tetrahedron39(9)1417-1474(1983)]中綜述了這類制品，該文列為本文的參考文獻(下文稱為“四面體報告147號”)。
四面體報告147號(出處同上)的表26(第1456頁)中特別將α-，β-和γ-CD硫酸鹽(Na鹽)作為化合物207，208，和209號給出。Berg-er的美國專利2,923,704號中描述了環(huán)糊精硫酸鹽的制備。Berstein等人的US4,020,160和Lewis等人的US4,247,535及4,258,180號專利公開了修飾的環(huán)糊精硫酸鹽作為補體抑制劑的使用。Lipari的US4,383,992中描述了一種類固醇的水溶性包含化合物和未修飾的β-環(huán)糊精的制備。Pitha的US4,596,795中公開了性激素(尤其是睪酮、黃體酮和雌二醇)和羥丙基-β-CD或聚-β-CD以包含化合物形式給藥的方法(經舌下或肛門途徑)。前述文獻均沒有顯示或明確如本文描述和要求保護的
發(fā)明內容
。
我們目前已經發(fā)現(xiàn)，某些簡單和非常易溶于水的環(huán)糊精衍生物與可的松或氫化可的松等潛在的生長抑制性類固醇或非類固醇生長抑制有機化合物一起作用時，可有效地抑制血管生成而沒有表現(xiàn)出肝素的不期望有的性質。
本發(fā)明的目的是提供含有環(huán)糊精衍生物和生長抑制化合物的新組合物的制備方法，該組合物可有效地抑制哺乳動物(包括人類)的細胞或組織生長，尤其是血管生成或治療腫瘤。 5
本領域的專業(yè)技術人員通過閱讀下面的描述和待批權利要求
，將會明確本發(fā)明的這些和其他目的、方面及優(yōu)點。
本發(fā)明提供了一種抑制哺乳動物(包括人類)的不期望的或病理性的細胞或組織生長的組合物，所述的組合物包括主要由(1)一種非常易溶于水的α-，β-，或γ-環(huán)糊精衍生物和(2)一種潛在的生長抑制性類固醇或一種非類固醇生長抑制有機化合物相結合而成的活性劑。
本發(fā)明進一步提供了一種抑制哺乳動物(包括人類)的不期望的或病理性的細胞或組織生長(包括血管生成)的方法，該方法包括給予主要由(1)一高水溶性α-，β-，或γ-環(huán)糊精衍生物和(2)一潛在的生長抑制性類固醇或一非類固醇生長抑制有機物組成的生長抑制量的活性試劑。本發(fā)明的方法是通過混合兩種活性試劑并通過單途徑聯(lián)合給藥，或者分別使用每個活性試劑并使其在體內結合而完成的。根據可替代方式，兩種活性試劑可分別通過以相同或不同途徑給藥，只要兩者在體內迅速地結合即可。
本發(fā)明進一步提供了一種抑制哺乳動物(包括人類)血管生成的方法，該方法包括給予主要由(1)一高水溶性α-，β-，或γ-環(huán)糊精衍生物和(2)至少一種選自潛在生長抑制類固醇和非類固醇生長抑制有機化合物的血管生成抑制劑組成之活性劑的血管生成抑制量組合物，所述的衍生物的特征在于其溶解度為0℃時每100ml水中至少可溶解約20g。
本發(fā)明進一步提供一種抑制(需要治療的)哺乳動物(包括人類)的平滑肌細胞病理性生長的方法，該方法包括給予含有以高水溶性環(huán)糊精衍生物作為活性劑的生長抑制量的組合物，其中優(yōu)選的高水溶性環(huán)糊精硫酸鹽為基本上是由α-，β-，或γ-環(huán)糊精上的硫酸根陰離子與生理上可接受的無毒性陽離子結合而成的。
參考下面的詳細描述，優(yōu)先實施例和附圖可更全面地理解本發(fā)明圖1(A和B)是(A)α-，β-和γ-環(huán)糊精化學結構和(B)這些環(huán)糊精的三維形狀的圖解描述。
圖2(A和B)圖解說明β-環(huán)糊精十四硫酸鹽(β-CD-TDs)或肝素對(A)大鼠主動脈平滑肌細胞及(B)牛主動脈平滑肌細胞生長的影響。 6
圖3(A-D)為顯示在家兔角膜上外用試劑對內毒素誘導的毛細血管發(fā)生之影響的照片，(A)只用內毒素(即對照組)；(B)只用氫化可松的(第二組)；(C)用β-CD-TDs十氫化可的松(第三組)；和(D)只用β-CD-TDs。實驗細節(jié)參見正文。
圖4圖解說明植入持續(xù)釋放的摻有不同試劑的聚合物對家兔角膜中內毒素所致毛細血管延長的影響。(o)＝只用內毒素(對照組)；(o)＝β-CD-TDs+11-脫氧皮質醇(第二組)；[Δ]＝只用11-脫氧皮質醇(第三組)和(口)＝只用β-CD-TDs(第四組)。實驗細節(jié)參見正文。
本發(fā)明人尋找了一種肝素以外的化合物，該化合物沒有肝素的缺點，但當它與類固醇結合時，可有效地抑制不期望的或病理性的細胞或組織生長(包括血管生成)，所以它尤其對控制或消除包括人類在內的哺乳動物的腫瘤有效。
因為已經知道環(huán)糊精(包括β-CD)能與類固醇形成水溶性包含化合物，所以我們試圖使用未修飾的CDs和氫化可的松的混合物。然而，發(fā)現(xiàn)這種混合物并沒有抑制血管生成的作用(如實施例18-20所示(下文第7節(jié)))。
令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)環(huán)糊精的高水溶性鹽與如氫化可的松等類固醇結合可有效地抑制血管生成。尤其是β-CD四硫酸鹽(β-CD-TDs)的效果最佳。換句話說，類固醇和水溶性環(huán)糊精衍生物的組合物對抑制哺乳動物的包括血管生成在內的不期望的細胞或組織生長的治療是有效的。
已發(fā)現(xiàn)本文所討論的CD硫酸鹽和其它高水溶性衍生物的效應在小雞絨毛膜尿囊膜(CAM)所作檢測是可以重復的。這種檢測法已用作檢測不同物質的血管生成活性的檢測模型(Klagsbrun eta1，Cancer Res.3610(1976))。三批由實施例1(A)所述方法制備的β-CD-TDs已用CAM檢測法進行了比較。高水溶性CD衍生物均具有肝素的抗血管生成的優(yōu)點，而沒有肝素的缺點。這些發(fā)現(xiàn)還克服了當與適當類固醇結合以抑制血管生成時，肝素所起的作用是獨一無二的這一技術偏見。
我們還發(fā)現(xiàn)β-CD-TDs等高水溶性CD衍生物在沒有外源肝素存在時能與抑制生長的非類固醇化合物(即本身就有一定抗血管生成活性的化合物)一起使用，驚人地增強該化合物的抗血管生成 7活性。這些非類固醇化合物的例子包括但不只限于，如L-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸(見下文實施例24)、順羥基脯氨酸、或3，4-二羥脯氨酸及反式視黃酸等脯氨酸類似物。L-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸
在Merch文章中已作為化合物911述及并列為本文參考文獻(見Ingber和Folkman LabInvestng5944(1988)有關作為脯氨酸類似物的非類固醇生長抑制化合物的描述]。
為了明確地將類固醇(沒有外源肝素存在，沒有固有的抗血管生成活性)與非類固醇生長抑制化合物區(qū)分開，這里使用“潛在的生長抑制劑”這一限定性術語。本文所說的“非固醇類”是指該化合物沒有固醇的碳環(huán)結構特征。
環(huán)糊精的水溶性衍生物
依照本發(fā)明，帶有非離子或離子取代基的高水溶性CD衍生物對抑制不期望的生長是有用的。適宜的高水溶性CD衍生物包括帶有但不限于有甲基、乙基等非離子取代基的α，β和γ-CD衍生物，同時為了增加CD的親水性，這些衍生物上的許多羥基基團被其它基團取代。這些基團可包括酯、醚、硫酯、硫醚、碳酸或其它通過極性或氫鍵組成改變親水括性的基團，或它們可包括允許參與保留羥基基團以得到更好的氫鍵的部分羥基取代。
在本發(fā)明中有用的CD衍生物都是高親水性的，所以非常易溶于水。無需理論支持，我們相信高親水特性對于使之與細胞表面相互作用是很重要的。我們同樣認為本發(fā)明提供的外源類固醇與CD結構固有的復雜能力協(xié)同作用以有效地抑制血管生成，衍生物的高水溶性是一個重要因素。我們認為，可通過測定水溶性確定與水的親和能力來粗略地表示親水活性。在0℃的相同溫度下測定是重要的，因為在較高的溫度下，大部分合適衍生物具有很高的溶解性而使有意義的測定難以進行。
如表II(實施例18-22，下文第7節(jié))所示，大部分水溶性衍生物(在0℃測定)顯示出最高的抗血管生成活性。CDs的β-CD衍生物似乎是有效的。一般來說，于0℃測得的蒸餾水中溶解度至少約為15g/100ml，較好為至少約 820g/100ml，最好約為30g/100ml者是適用的。這里所有溶解度均指相對基本無水的衍生物的溶解度而言，這些衍生物為鹽類時，則為無水鈉鹽形式的。術語“非常易溶的”在這里是指按上述方法測定其溶解度至少為15g/100ml者。
帶有離子或非離子取代基的高水溶性CD衍生物可能在某些例子中表現(xiàn)有良好的特性，這些衍生物也屬于在本發(fā)明之范圍內的。盡管總的來說高水溶性衍生物者是有用的，但優(yōu)選的是鹽類衍生物。
這里使用的術語“鹽類衍生物”是指通過CD與合適試劑反應所獲得的離子化合物。優(yōu)選的鹽類衍生物是由具有選自硫酸鹽、磷酸鹽、羧酸鹽或其混合物之取代的環(huán)糊精與一非毒性的生理上可接受的陰離子結合而成的，許多所述的優(yōu)選衍生物是已知化合物(見四面體報告147號，出處同上)。但是許多潛在的有用的形式都是已知化合物在結構上或化學上的變體。它們也可能有幾個不同的取代基，如例ID中的環(huán)糊精丙氧基硫酸鹽，我們認為此前尚未報道過。衍生物的某些優(yōu)選鹽類形式是鈉和鉀鹽，因為它們傾向于增加水對有機陰離子的溶解性。所說的有用的鹽類衍生物在水溶液中表現(xiàn)出電解質和聚電解質的電解導電性和滲透特性。特別優(yōu)選的鹽類衍生物為β-環(huán)糊精十四硫酸鹽(β·CD-TDs)。
在本發(fā)明權利要求
中得到的α-，β-和γ-CD硫酸鹽類都是有用的。其中優(yōu)選的是β-CD硫酸鹽，可采用每個葡萄糖單位有不同硫酸化程度的產物，如每兩個葡萄糖單位平均有一個硫酸根基團，或每個葡萄糖單位有兩個硫酸根基團。其中優(yōu)選的是每葡萄糖單位有兩個硫酸根基團的環(huán)糊精，尤其優(yōu)選的是β-CD-TDs，它平均每個葡萄糖單位有兩個硫酸根基團。
類固醇和非類固醇有機化合物
本發(fā)明涉及的有效的且可利用的類固醇有
17α，21-二羥基-4-孕烯-3，11，20-三酮及其21-乙酸酯(或可的松)；
11α，17，21-二羥基孕-4-烯-3，20-二酮(或11α-氧化可的松)；
11β，17α，21-二羥基孕-4-烯-3，20-二酮(或氫化可的松)；
17α-，21-二羥基孕-4，9(11)-二烯-3， 920-二酮；
15α，17α，21-三羥基-4-孕烯-3，30-二酮；
16α，17α，21-三羥基-6α-甲基孕-4-烯-3，20-二酮-21-乙酸酯-16，17丙酮的縮醋；
6α-氟-17α，21-二羥基-16β-甲基-孕-4，9(11)-二烯-3，20-二酮；
6α-氟-18α，21-三羥基-16β-甲基-孕-4，9(11)-二烯-3，20-二酮-17，21-二乙酸酯；
6β，17α，21-三羥基孕-4-烯-3，20-二酮；
17α，21-二羥基孕-4-烯-3，20-二酮-21-乙酸酯；
17α，21二羥基孕-4-烯-3，20-二酮(或11-脫氧皮醇)；
9β，11β-環(huán)氧-17αα，21-二羥基-2α-甲基孕-4-烯-3，20-二酮-21-乙酸酯；
17α，21-二羥基-16α-甲基孕-4-烯-3，20-二酮；
9α，11β-二氯-17α，21-二羥基孕-4-烯-3，20-二酮-21-乙酸酯；
17α，21-二羥基-6α，16α-二甲基孕-4-烯-3，20-二酮-21-乙酸酯；
17α，21-二羥基-16α-甲基孕-4，9(11)-二烯-3，20-二酮-21-乙酸酯；
17α，21-二羥基-16β-甲基孕-4，9(11)-二烯-3，20-二酮-21-苯甲酸酯；
6α-氟-17α，21-二羥基-16β-甲基孕-4，9(11)-二烯-3，20-二酮-17-乙酸酯-21-苯甲酸酯；
17α，21-二羥基-16β-甲基孕-1，4，9(11)-三烯-3，20-酮-17-琥珀酸鈉單水合物；
9α-氟-11β，16α，17α，21-四羥基孕-4-烯-3，20-二酮-16，21-二乙酸酯；
17α，21-二羥基-16α-甲基孕-1，4，9(11)-三烯-3，20-二酮-21-琥珀酸鈉單水合物；
6α-氟-17α，21-二羥基-16β-甲基-孕-1，4，9(11) 三烯-3，20-二酮-21-琥珀酸鈉；
脫氧皮質酮；
睪甾酮；和
雌甾酮。 10
更優(yōu)選的是無糖皮質激素和鹽皮質激素活性的類固醇，因為這種活性是不期望有的效應，它限制了達到本發(fā)明目的的使用范圍和劑量。其中更為優(yōu)選的類固醇為11α，17，21-三羥基孕-4-烯-3，20-二酮(或11α-氫化可的松)、17α，21-二羥基孕-4-烯-3，20-二酮(11-脫氧皮質醇或11-脫氧皮質醇)和17α，21-二羥基孕-4，9(11)-二烯-3，20-二酮。
在沒有本發(fā)明涉及的水溶性環(huán)糊精衍生物存在時，類固醇本身便不能有效地抑制血管生成也不能使腫瘤消退。
如本發(fā)明所指出的，與水溶性環(huán)糊精衍生物結合加強了非類固醇有機化合物的生長抑制活性。有效地并被本發(fā)明所采用的非類固醇生長抑制有機化合物包括L-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸，順羥基脯氨酸和3，4-二羥基脯氨酸及反式視黃酸等脯氨酸類似物。
另外，用下述任一生物檢測法檢測證明有生長抑制活性的任何一種非類固醇有機化合物與環(huán)糊精衍生物結合均可用于本發(fā)明的權利要求
的方法中。
已有幾種生物學測試方法來估計物質的生長抑制能力，家兔角膜是建立這些方法之一的基礎。角膜是無血管的，可在其中作一個小袋，在家兔被麻醉時可植入腫瘤移植物。從宿主的血管床中分離腫瘤。新的毛細血管將很快地朝著腫瘤的方向生長并可以測定血管生長的速度。[有關方法的更詳細的描述參見Gimbrone et al，J.Nat’lCancer Inst。52413(1973)，該文已列入本文參考文獻]。
更經濟的生物檢測法是利用雞胚的絨毛膜尿囊膜，為了方便，下文將其簡稱為″CAM法″。(有關CAM法的更詳細的說明參見Folkman et a1.Sci-ence221719(1983)，該文已列入本文的參考文獻)。如下文第7節(jié)實施例中所采用的典型CAM法，每次實驗使用16個雞蛋。將含有試驗物質的2mm直徑的甲基纖維素圓片貼在6天雞胚的絨毛膜尿囊膜上，在培養(yǎng)皿中于含3％二氧化碳的增濕孵箱內培養(yǎng)，2天后(8天雞胚)在放大6-10倍的立體顯微鏡下檢查膜。甲基纖維素圓片周圍形成無血管區(qū)即證明試驗物質對血管生成的抑制作用。4mm的無血管區(qū)表示為(++)和2mm的無血管區(qū)表示為(+)。2mm和4mm帶上的抑制能力是作為該試驗中標定為(++)或(+)者占總卵數 11(通常是16)的百分比，即“成功”的百分數來表示的。0％表示在該試驗條件下該試驗物質沒有抑制作用。
通過在0.45％的甲基纖維素水溶液中擴散適量的試驗物質，在Teflon模中各涂敷10ml，然后在層流通風櫥中空氣干燥約一小時，獲得持續(xù)釋放的甲基纖維素圓片。
CAM法的一個很大的特點是雞胚對毒性物質有很高的敏感性。另外，CAM法中一物質無毒性是與該物質給予其他動物時無毒性相關聯(lián)的。
應用和使用方法
本發(fā)明的組合物對抑制包括血管生成在內的不期望細胞和組織生長是有用的，當然，含有水溶性α-，β-或γ-CD衍生物及類固醇的本發(fā)明組合物可用于需要這種治療的包括人類在內的哺乳動物。
例如，患有腫瘤需要治療的哺乳動物，可用本發(fā)明的組合物進行治療。雖然尚未完全明了，但據信用本發(fā)明組合物治療可抑制腫瘤生長必須的新毛細血管生成，這使得腫瘤得不到其生長甚至生存所必需的足夠的養(yǎng)分供應。因此，當根據本發(fā)明治療時，包括人類的內的哺乳動物腫瘤不能生長，甚至喪失生存力和死亡。對本發(fā)明組合物和方法有反應的腫瘤有網狀細胞肉瘤，Lewis肺瘤，B-16黑素瘤和膀胱癌等。
用本發(fā)明組合物處理對成熟的非生長血管和血管組織沒有影響。根據本發(fā)明，抑制血管生成除對患腫瘤動物的腫瘤消退及轉移有影響外，它對治療許多其他疾病也有所俾益。
本發(fā)明進一步提供一種治療許多以包括血管生成在內的病理性細胞或組織生長為特征的非腫瘤疾病的方法。因此本發(fā)明提供了治療包括人類在內的哺乳動物的許多非瘤性病理狀況的方法，這些疾病包括風濕性關節(jié)炎(其異常毛細血管生長能破壞關節(jié)軟骨)；血管瘤(在新生兒出現(xiàn)異常血管增生，且能持續(xù)2年以上)；血管纖維病(在鼻咽中發(fā)展)；牛皮癬(過多的增殖和脫屑可能依賴于真皮中的異常毛細血管生長)。此外，本發(fā)明為許多與不需要血管生成相聯(lián)系的眼病提供了治療方法，這些眼病包括糖尿病性視網膜病、晶體后纖維組織形成和新血管青光眼。
本發(fā)明進一步提供了一種抑制常常在血管成熟后出現(xiàn)的平滑肌細胞發(fā)育的方法或除去堵塞血管的 12動脈粥樣硬化斑塊的治療方法。
根據本發(fā)明方法的一個實施方案，在給藥前將活性試劑混合在一起，從而使類固醇或非類固醇生長抑制化合物與水溶性環(huán)糊精衍生物得以聯(lián)合給藥。制得混合物后，可經口服或胃腸道外途徑給藥，如局部用藥、靜脈內、動脈內或皮下注射以及用注入和導入身體的孔或管口中吸收的其他途徑給藥。
可的松和它的生理上可接受的非毒性衍生物(如乙酸酯)及其它本發(fā)明有用的類固醇只微溶于水，然而當它們與本發(fā)明的水溶性環(huán)糊精衍生物混合時，所得到的復合物便增加了水溶解度。從而使本發(fā)明的組合物更易于使用。本發(fā)明說明書和權利要求
書中使用的術語“可的松”和“氫化可的松”及氫化可的松的11-α異構體，包括類固醇本身和它們的衍生物以及結構變體。
根據本發(fā)明方法的另一個實施方案，可將活性試劑單獨使用，使兩種活性試劑在體內結合。該實施方案中，兩種活性試劑可按相同或不同的使用途徑分開導入體內，只要兩者一旦進入體內，即可形成該兩種活性試劑的復合混合物。
由于可的松、氫化可的松或11α異構體在使用上受到的限制，所以給藥劑量是有限的。因為在這里所用的CD衍生物沒有抗凝血效應并且在CAM試驗中給予下述劑量時也未顯示出毒性(見下)，所以使用類固醇的劑量至少可達到與肝素合用時所用的劑量?？诜┝靠梢愿撸绨?984年8月16日提交的美國專利641,305號申請中例3所述的簡單試驗足以決定有效性和合適劑量，該專利申請列入本文參考文獻。
由于特定的腫瘤及需要抑制或消退腫瘤的時間不同，所以使腫瘤生長抑制和消退的劑量也不同。開始治療時的腫瘤大小影響完全消退的時間。因為可的松與或不與β-CD-TDs(Na)一起使用幾天后會導致肺感染，根據本發(fā)明可采用合適的抗生素進行預防。這種抗生素能與本發(fā)明的水溶性環(huán)湖精和類固醇或非類固醇生長抑制劑混合作為混合物給藥，或者，通過相同或不同給藥途徑將該抗生素單獨與本發(fā)明的水溶性環(huán)糊精及生長抑制劑同時給藥。
如表I(下文第七節(jié))所示，如水溶性CD衍生物與類固醇的重量比大于2∶1或摩爾比大于 130.4，則會減低抗血管生成活性。優(yōu)選的摩爾范圍和CD衍生物與血管靜止劑(類固醇或非類固醇)的摩爾比為0.004至0.7，最好為0.04至0.7。后一范圍對包括治療眼病的眼藥水在內的外用尤其適宜。與CD衍生物混合時血管生成抑制劑的量通常為0.1至10mg/ml，然而，絕對量則決定于給藥方式和頻率。
本發(fā)明的有效組合物最好與合適載體一起使用，該載體必須為無毒性和生理上可接受的，如水或生理鹽水。可以使用干的或在合適載體中的，含活性劑混合物的或只含一種活性劑的組合物。
實施例
下面的實施例用來說明本發(fā)明，但是，它們并不限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由整個說明書和待批權利要求
決定。除非特別說明者外，所有的量和比例均是按重量計，但對于CAM方法來說，％表示“成功”的比率(見上文6.3)。
實施例1(A-D)
該實施例說明了就我們所知的制備和純化環(huán)糊精硫酸鹽的最好方法，該方法本身不屬于本發(fā)明的內容。
(A)β-CD-TDS(Na)
β-環(huán)糊精(99％的純二水化合物)購自Chemalog公司(General Dynamics公司的分公司，South Plainfield，New Jersey)。
將5.0gβ-環(huán)糊精(4.4mmol，即約92meq-OH(溶于250ml二甲基甲酰胺(DMF)中，在該溶液中一次加于15.0g(CH3)3N-SO3(108mmo1)，將反應混合物加熱至70℃。2小時后，沉淀出一種膠狀物?；旌衔镌趧×艺袷幭卤３钟?0℃，然后冷卻至室溫。倒出并棄去DMF層，將固體殘留物溶于250ml水中，然后再加入75m130％的乙酸鈉，將該混合物劇裂振蕩4小時，再加入4000ml乙醇中，靜止過夜，過濾得到結晶的固體。濾餅先用無水乙醇洗滌后再用二乙醚洗。然后再將產物在P2O5上真空干燥，得到10.3g白色粉末。產物是吸濕的。
在吸水量最小的條件下分析產物，元素分析結果如下C＝18.84，H＝2.65，S＝17.33(計算C0H8O11S2Na2C＝19.67，H＝2.19，S＝17.49)。(α)D22＝75°(在0.5MNacl中C＝2.63)。分析與預想的每個吡喃型葡萄糖單位平均有兩個羥基被取代相 14一致，即每個CD分子有14個羥基被取代。這種β-CD-TDS鹽計算的產量為10.96克，比測得的10.3g約多6％。
(B)α-和γ-CD-S(Na鹽)
除了制備α-CD時使用86mmolCH3N-SO3。制備γ-CD時為117mmol外，其他步驟均與上述方法一樣。
硫酸化α-CD鹽分析結果C＝18.76；H＝2.60；S＝16.22，這與每個α-CD分子平均約有11.7個羥基單位被取代相符。
硫酸化γ-CD鹽分析結果C＝18.96；H＝2.69；S＝14.84。這與每個γ-CD分子平均約有14羥基單位被取代相符。
(C)βCD-SO4(Na鹽)(7.1重量％S)
將1.0gβ-環(huán)糊精溶于50mlDMF中，加入883mg(CH3)3)N·SO3(7.2當量)，該溶液于75℃保持12小時，在這段時間內沒有沉淀。將反應混合物冷卻至室溫，在該溶液中再加入200ml乙醇，再將得到的膠狀溶液加到600ml二乙醚中，二小時后形成白色固體。過濾收集固體物，再溶于30ml水中，溶液攪拌2小時。攪拌后倒入900ml2∶1的EtOH-Et2O溶液中。8小時后形成結晶，收集該結晶，用Et2O沖洗。將產物在P2O5上真空干燥，得到1.18g粉末(產率72.4％)。
產物元素分析結果C＝32.49；H＝4 99；和S＝7.06。表明每個β-CD分子平均約有3.5個羥基被取代。
(D)β-CD-丙氧基化物-14SO4
從American Maize-Products公司(Hammond，IN)得到β-CD-(羥基-n-丙醚)，制備β-CD-(～4Pr～14SO4)硫酸鹽的方法如上所述。
實施例2-15
用CAM方法來估價這些實施例中的將氫化可的松與不同劑量按實施例1方法制備的β-CD-TDS結合使用所產生的血管生成抑制能力。所有甲基纖維素圓片均含有60μg類固醇，但β-CD-TDS量為100μg降至0.05μg不等。結果總結于表I。從數據可以看出，CD化合物在相當低劑量(0.05μg)時即有抑制血管生成作用，在多達兩千倍濃度時沒有顯出血管生成激活作用。
表I(見文后) 15
與這些結果相反，用100μgα-，β-或γ環(huán)糊精與50μg氫化可的松所作用的CAM試驗表明。它們均沒有血管生成抑制作用[在1mm區(qū)域(+)或2mm區(qū)域(++)水平上均沒有成功)]。
實施例16-17
如表II所示，實施例16和17說明了由硫酸化α-CD和γ-CD提供的雖低但有用的括性。實施例5和6的數據也列于此表進行比較。
所有試驗都是用25μg所指出的CD硫酸鹽和50μg可的松作的。
表II(見文后)
實施例18-22
該組實驗表明血管生成抑制活性除了需要CD結構的特征性復合活性外，還需要高水溶性。CAM法檢測是用含有10μ10.45％甲基纖維素水溶液中的50μg至60μg劑量氫化可的松進行的。
為了比較高水溶性CD硫酸鹽，在室溫下測得的溶解度太高是不實際的，因此所有的溶解度測定應在0℃液態(tài)水中進行。我們能繪出它與水的親水結合相對于水本身有序結合的競爭測量圖。這些比較結果如表III所示。
實施例18、19和20描述了未被取代的CDS在CAM檢測法中顯示沒有血管生成抑制活性的結果。實施例21顯示用得自American Maiza-Products公司(Hommond，IN)的丙氧基化β-CD(羥基-n-丙基醚)(每CD分子平均約有4個羥丙基基團)所作試驗的結果。實施例22顯示用實施例1(C)得到的較少硫酸化的β-CD產物所作試驗的結果。為了完整地進行比較，試驗中還包括0℃時水溶解度的實施例16、17和5的結果。(表III見文后)
實施例23
本實施例說明了11-脫氧皮質醇和β-CD-TDS是特別有效的抗血管生成組合物。11-脫氧皮質醇在化學上與可的松相近，然而，它除了在有肝素存在情況下有抗血管生成作用以外，幾乎沒有可的松的功能。
單用50μg/10μl 11-脫氧甾皮醇，用CAM檢測法顯示無血管區(qū)為0％。
以相同劑量與25μg/10μlβ-CD-TDS合用，在CAM檢測法中顯示85％的無血管區(qū)域，其中31％是(++)或更高。
實施例24 16
本實施例證明了L-2-氯雜丁烷羧酸的抗血管生長活性，該化其活力大大提高，在表IV中分別給出實施例24(a)和24(b)有或無CD-TDS存在情況下CAM檢測的結果。
無CD-TDS存在情況下CAM檢測的結果。
表IV(見文后)
實施例25
本實施例證明單獨使用β-CD-TDS和肝素抑制平滑肌細胞(SMC)生長時(即沒有外來可的松類固醇或其他輔助物時)，前者的效果約為后者的三倍，該活性的生物檢測是使用大鼠或牛主動脈SMC的組織培養(yǎng)進行的，劑量范圍為0.03μg/ml至400μg/ml。
結果如圖2(A)和(B)所示。
實施例26
本實施例證明β-CD-TDS與氫化可的松結合使用可有效地抑制角膜的新血管形成。
Perlin[Fed.Proc.36101(1997)]描述的家兔角膜試驗的改進方法如下所述，其用于檢測β-CD-TDS和氫化可的松結合的效應。該角膜試驗中，首先將浸有細菌內毒素的緩釋聚合物植入家兔角膜內。從移植物中慢慢釋放的內毒素誘導的角膜內血管生成與在拒絕做角膜移植的患者中觀察到的新血管形成相似。本實驗的試驗物質不是通過通常的第二移植物導入，而是以眼藥水的形式局部滴加于角膜表面。將接受帶有內毒素的移植物的動物分成四組，進行局部(眼藥水)治療第一組，不進行治療，作為對照；第二組，只用氫化可的松(0.5mg/ml)；第三組，氫化可的松-21-磷酸鹽和β-CD-TDS(分別為0.5mg/ml和1.0mg/ml)；第四組，β-CD-TDS(1.0mg/ml)。圖3(A-D)顯示移植并治療后9天的典型結果。
如圖3的照片所示，將氫化可的松和β-CD-TDS混合用于角膜時抑制血管生成非常有效(圖3C)。當所得結果與未治療組或對照組(圖3C和圖3A)比較時，該治療效果尤其明顯。事實上，用氫化可的松和β-CD-TDS治療動物，不僅毛細血管生長受到抑制，而且在治療前已形成的新毛細血管呈現(xiàn)消退(圖3C)。另一方面，單獨使用氫化可的松對血管生成具有微弱的抑制作用(圖3B)。而單用β-CD-TDS則產生輕微刺激血管生 17成的作用(圖3D)。
在另外一系列實驗中，用Gimbrone等人[JNatl Cancer Inst52413(1974)]描述的家兔角膜試驗來估計水溶性環(huán)糊精衍生物和11-脫氧皮質醇相結合的抗血管生成活性。在這些實驗中，使大腸桿菌內毒素(17μg/mm3)摻入緩釋聚合物丸乙烯乙酸乙烯酯共聚物[Elvax，SigmaChemical，St，Louis，MO(下文簡稱“Elvax”)]中，將其移植在家兔角膜的血管緣之間。借助第二個摻入了特定試驗物質的Elvax移植物來施用這些試驗物質。
將含有內毒素的Elvax移植物植入12只家兔的角膜中。然后將動物分成四組，對每一組動物的四只眼進行治療如下
第一組，不進行治療，作為對照組；第二組，含15μg/mm3β-CD-TDS的Elvax丸；第三組，用含30μg/mm311-脫氧皮質醇的Elvax丸；和第四組，終濃度為15μg/mm3β-CD-TDS和30μg/mm311-脫氧皮質醇的β-CD-TDS和11-脫氧皮質醇混合物的Elvax丸。用10倍狹縫光源視體鏡每兩天測定一次新毛細血管生長的長度(用目鏡框格校正至±0.1mm)。
只測定血管長度則低估了抗血管生成活性的程度，因為這種測定不能估計毛細血管的密度。為此，對血管密度也進行了估價，利用下列標準來分級0＝沒有血管/角膜； 1＝1～4個血管/角膜；2＝5～20個血管/角膜；3＝20～50個血管/角膜；以及4＝多于50個血管/角膜。將這一級別乘以血管最大長度的平均值即得到每個角膜血管密度的半定量估計值(長度-密度指數)。結果如圖4和表V所示。
圖4顯示，在植入Elvax丸13天后可觀察到治療組和對照組角角膜的最大差異。在第13天觀察到的血管平均長度和密度示于表V中。
表V(見文后)
如表V所示，β-CD-TDS和11-脫氧皮質醇抑制毛細血管的線性生長，約為未治療眼中的18％。當估測毛細血管密度時，該組合物抑制血管密度約為未治療眼中的8％。反之，如表V所示，單獨使用11-脫氧皮質醇抑制血管直線生長僅為未治療的49％，而血管密度為未治療的61％。預想不到的是，表V還進一步表明單獨使用 18β-CD-TDS可刺激血管生長，血管長度約為未治療組的164％，密度約為未治療組的303％。
根據這些結果，將本發(fā)明環(huán)糊精鹽衍生物與類固醇聯(lián)合給藥顯然是一種抑制眼組織血管生成的有效方法。表I
CAM法
實施例序號 氫化可的松 β-CD-TDS (++) (+)
μg μg ％ ％
2 60 100 3 60 50 60 100
4 60 50 22 55
5 60 25 10 60
6 60 25 18 55
7 60 10 40 70
8 60 10 6 40
9 60 5 0 50
10 60 1 0 50
11 60 1 0 42
12 60 0.5 0 40
13 60 0.1 0 45
14 60 0.1 0 37
15 60 0.05 0 20表II
實施例序號 CD 硫 CAM法
重量％ (+) (++)
％ ％
16 α 16.2 8 0
17 γ 18.9 15 0
5 β-CD-TDS 17.3 60 15
6 β-CD-TDS 17.3 55 18 19
表II
CAM法實施例序號 化合物 濃度 實驗 無血管區(qū)域 溶解度，0℃，
μg/10μl 例數 g/100ml H2O18 α-CD 100 37 5±0.3 6
25 20 0 619 β-CD 100 19 0 0.7
25 23 0.04 0.720 γ-CD 100 0 *21 β-CD- 100 52 29±10.5 20
丙氧基化 25 50 31±9.7 20
(～4Pr)21a β-CD-14Me 100 57 22±5.7 32+
(～14Meth) 25 37 20±4.2 32+22 β-CD- 100 25 20±9.6 13
(～7SO4) 25 27 8±3.1 13
表III(續(xù))
CAM法實施例序號 化合物 濃度 實驗 無血管區(qū)域 溶解度，0℃，
μg/10μl 例數 g/100ml H2O22a β-CD
(～4丙氧基化) 25 37 39
(～14SO4)16 α-CD 100 40 17±4.7 36
(～12SO4) 25 25 4±2.7 3617 γ-CD 100 19 32±5.3 38
(～16SO4) 25 20 19±1.7 38 5 β-CD-TDS 100 101 55±7.5 42
50 75 75±5.8 42
25 107 58±7.0 42*溶解度測定的資料不足
表IVL-2-氮雜丁烷
μg/10μl μgCD-TDS ％無血管區(qū)a L-2-氮雜丁烷 400 0 28b L-2-氮雜丁烷 400 25 100**50％的無血管區(qū)為2+25％的為3+，即具有最大的無血管區(qū)，大于10mm。表V
對角膜中血管生成的抑制作用
抑制作用(占未治療的對照組的百分率)
β-CD-TDS 11-脫氧皮質醇 β-CD-TDsa
11-脫氧皮質醇 (單用) (單用)血管長度 18％ 49％ 164％血管密度 8％ 61％ 303％a.百分比大于100％表示對血管生長有刺激作用
權利要求
1.制備用于人口服或非胃腸給藥的含有(1)α-，β-或γ-環(huán)糊精衍生物和(2)潛在的生長抑制性類固醇或非類固醇生長抑制性有機化合物的組合物的方法，其特征在于
將α-，β-或γ-環(huán)糊精水溶性衍生物和潛在的生長抑制性類固醇或非類固醇生長抑制性有機化合物與生理學上可接受的無毒載體相混合，其中所述α-，β-或γ-環(huán)糊精水溶性衍生物0℃時蒸餾水中的溶解度至少為20g/100ml；
其中，水溶性環(huán)糊精衍生物與生長抑制性類固醇或非類固醇化合物的摩爾比為0.004-0.4。
2.根據權利要求
1所述的方法，其特征還在于其中的α-，β-或γ-環(huán)糊精衍生物為其陰離子鹽衍生物，所述衍生物帶有選自硫酸根、磷酸根、碳酸根及其混合物者與生理上可接受的陽離子結合成的取代基。
3.根據權利要求
2所述的方法，其特征還在于其中的α-，β-或γ-環(huán)糊精衍生物是環(huán)糊精硫酸鹽。
4.根據權利要求
3所述的方法，其特征還在于其中的環(huán)糊精硫酸鹽為β-環(huán)糊精十四硫酸鹽。
5.按權利要求
1，3或4所述的方法，其中所述類固醇至少包含以下化合物之一
可的松；
11α-氫化可的松；
氫化可的松；
17α-，21-二羥基孕-4.9(11)-二烯-3，20-二酮；
15α，17α，21-二羥基-4-孕烯-3，30-二酮；
16α，17α，21-二羥基-6α-甲基孕-4-烯-3，20-二酮-21-乙酸酯-16，17丙酮的縮醋；
6α-氟-17α，21-二羥基-16β-甲基-孕-4，9(11)-二烯-3，20-二酮；
6α-氟-18α，21-三羥基-16β-甲基-孕-4，9(11)-二烯-3，20-二酮-17，21-二乙酸酯；
6β，17α，21-三羥基孕-4-烯-3，20-二酮；
17α，21-三羥基孕-4-烯-3，20-二酮-21-乙酸酯；
11-脫氧皮質醇；1
9β，11β-環(huán)氧-17α，21-二羥基-2α-甲基孕4-烯-3，20-二酮-21-乙酸酯；
17α，21-二羥基-16α-甲基孕-4-烯-3，20-二酮；
9α，11β-二氯-17α，21-二羥基孕-4-烯-3，20-二酮-21-乙酸酯；
17α，21-二羥基-6α，16α-二甲基孕-4-烯-3，20-二酮-21-乙酸酯；
17α，21-二羥基-16α-甲基孕-4，9(11)-二烯-3，20-二酮-21-乙酸酯；
17α，21-二羥基-16β-甲基孕-4，9(11)-二烯-3，20-二酮-21-苯甲酸酯；
6α-氟-17α，21-二羥基-16β-甲基孕-4，9(11)-二烯-3，20-二酮-17-7酸酯-21-苯甲酸酯；
17α，21-二羥基-16β-甲基孕-1，4，9(11)-三烯-3，20-酮-17-琥珀酸鈉單水合物；
9α-氟-11β，16α，17α，21-四羥基孕-4-烯-3，20-二酮-16，21-二乙酸酯；
17α，21-二羥基-16α-甲基孕-1，4，9(11)-三烯-3，20-二酮-21-琥珀酸鈉單水合物；
6α-氟-17α，21-二羥基-16β-甲基-孕-1，4，9(11)-三烯-3，20-二酮-21-琥珀酸鈉；
脫氧皮質酮；
睪甾酮；和
雌甾酮
6.根據權利要求
5所述的方法，其中的類固醇是可的松、氫化可的松或11-脫氧皮質醇。
7.根據權利要求
1所述的方法，其特征還在于其中的非類固醇生長抑制性有機化合物是L-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸，且其中的環(huán)糊精衍生物是環(huán)糊精硫酸鹽。
專利摘要
本發(fā)明提供一種生長抑制組合物的制備方法，該組合物由(1)一種水溶性環(huán)糊精硫酸鹽和(2)一種潛在或活性生長抑制有機化合物與生理上可接受的無毒載體混合而成。該組合物可抑制包括人在內的哺乳動物的血管生成和控制腫瘤生長，用于治療包括血管生成在內的不期望有的細胞或組織生長相關的疾病和病理狀態(tài)。
文檔編號A61P27/04GKCN1038304SQ89101050
公開日1998年5月13日 申請日期1989年1月17日
發(fā)明者摩基斯·朱旦·福克邁, 波耳·波格·威治 申請人:摩塞斯·朱旦·?？诉~, 波耳·波格·威治導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan