本發(fā)明涉及藥物制劑，具體涉及一種載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative?colitis，uc）是一種涉及大腸或結(jié)腸的胃腸道慢性復(fù)發(fā)性炎性疾病，持續(xù)損害直腸側(cè)結(jié)腸粘膜，通常導(dǎo)致糜爛和潰瘍，是炎癥性腸?。╥nflammatory?bowel?disease，ibd）的兩種主要形式之一，同時(shí)是結(jié)直腸癌最常見的病因之一。該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但確切機(jī)制尚不清楚，通常被認(rèn)為是與腸道菌群紊亂、遺傳易感性、環(huán)境因素、腸道上皮屏障缺陷、免疫因素及炎性介質(zhì)等因素共同作用有關(guān)，同時(shí)該病病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)、遷延難愈、難以根治，且易發(fā)生癌變，是目前公認(rèn)的較難治愈的病癥之一。

2、uc目前主要的治療方式為藥物治療。氨基水楊酸鹽是輕中度潰瘍性結(jié)腸炎的主要治療選擇，局部和全身類固醇可用于治療潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)作，而免疫抑制劑和新型生物制劑以及不斷涌出的細(xì)胞信號(hào)通路抑制劑等則用于治療中度至重度潰瘍性結(jié)腸炎。雖然常規(guī)的藥物治療可以緩解大部分uc患者的初期癥狀，但隨著疾病的進(jìn)展，患者容易出現(xiàn)藥物耐受和大劑量的藥物使用帶來(lái)的副作用。因此，開發(fā)出一種能夠特異性且有效地向炎癥部位遞送低劑量藥物的制劑對(duì)uc的治療至關(guān)重要。

3、細(xì)胞外囊泡（extracellular?vesicles，evs）是由幾乎所有類型細(xì)胞都能釋放的納米級(jí)脂質(zhì)雙層囊泡，攜帶了核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等重要的生物分子，包括外泌體、微囊泡和凋亡小體等。與哺乳動(dòng)物的evs相比，植物來(lái)源的evs具有相似的形態(tài)（納米囊泡）、組成（脂質(zhì)、rna和蛋白質(zhì)）和功能，但其研究相對(duì)仍在起步階段。植物evs具有作為天然納米載體的獨(dú)特的形態(tài)和組成特征，十分有潛力開發(fā)成下一代生物治療和藥物遞送平臺(tái)：(1)?植物evs是脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，能夠?qū)⒂H水性藥物封裝在水性核心內(nèi)，同時(shí)在脂質(zhì)雙層中容納疏水性藥物，從而改善大分子藥物的不溶性和穩(wěn)定性，進(jìn)而提高藥物的療效；(2)?植物evs不含有人畜共患或人類病原體，幾乎無(wú)毒性或免疫原性；(3)?植物evs具有內(nèi)在治療活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化等；(4)植物來(lái)源具有成本效益、環(huán)保經(jīng)濟(jì)，是可持續(xù)和可再生的資源；(5)植物evs有優(yōu)異的細(xì)胞攝取性、胃腸道穩(wěn)定性和特異性靶向能力。

4、裸花紫珠（callicarpa?nudiflora?hook.?&?arn.）是一種馬鞭草科植物，中醫(yī)理論認(rèn)為其在消炎、解郁、抗?jié)?、收斂止血、治療燒傷和燙傷等方面存在功效，現(xiàn)代藥理研究已證實(shí)其具有抗炎、抗血栓、神經(jīng)保護(hù)、鎮(zhèn)痛和抗氧化等活性。然而國(guó)內(nèi)外對(duì)裸花紫珠的化學(xué)成分研究開展較晚，目前尚未有關(guān)于裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡的報(bào)道。因此可研究一種裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡裝載uc治療藥物的方案解決上述問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在提供一種載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡及其制備方法與應(yīng)用，所述載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡具有較高的包封率和載藥率以及良好的胃腸道穩(wěn)定性和生物相容性，可靶向結(jié)腸炎癥部位，解決藥物不溶于水的問(wèn)題且提高療效，減少全身用藥引發(fā)的不良反應(yīng)。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡，所述載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡包括裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡和裝載于所述裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡內(nèi)的潰瘍性結(jié)腸炎治療藥物；所述載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡中潰瘍性結(jié)腸炎治療藥物的裝載量為4.39%~8.72%。

3、裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡作為用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物遞送載體時(shí)，不僅在穩(wěn)定性、生物相容性以及細(xì)胞內(nèi)化方面顯示出優(yōu)勢(shì)，而且還具有內(nèi)在治療活性，能夠與藥物協(xié)同治療起到抗炎和抗氧化的作用，同時(shí)靶向結(jié)腸炎癥部位可降低藥物的不良反應(yīng)以及提高療效，保證了藥物遞送的有效性和安全性。

4、可選地，所述載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡的粒徑為100?nm~200?nm。

5、可選地，所述載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡的ζ電勢(shì)為-30?mv~-10?mv，如此可保證載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡體系處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。

6、可選地，所述載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡為雙層磷脂囊泡結(jié)構(gòu)，因此可將親水性藥物封裝且容納疏水性藥物，起到改善大分子藥物的不溶性和穩(wěn)定性、提高藥物療效的效果。

7、可選地，所述潰瘍性結(jié)腸炎治療藥物包括氨基水楊酸類藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制藥和生物制劑中至少一種。

8、可選地，所述氨基水楊酸類藥物包括美沙拉嗪和柳氮磺吡啶中至少一種。

9、可選地，所述糖皮質(zhì)激素包括地塞米松、布地奈德和潑尼松中至少一種。

10、可選地，所述免疫抑制藥包括硫唑嘌呤和巰嘌呤中至少一種。

11、可選地，所述生物制劑包括英夫利西單抗和阿達(dá)木單抗中至少一種。

12、第二方面，本發(fā)明提供一種載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡的制備方法，包括以下步驟：

13、將裸花紫珠榨汁后過(guò)濾得濾液，濾液依次經(jīng)差速離心和蔗糖密度梯度離心，得裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡；

14、在裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡上包載藥物，得載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡。

15、本發(fā)明提供的制備方法可為構(gòu)建其他植物來(lái)源細(xì)胞外囊泡載體平臺(tái)提供參考，具有較好的創(chuàng)新性和開發(fā)應(yīng)用前景。

16、可選地，所述差速離心包括：將濾液于4?℃下以1,000×g離心10?min~20?min后得上清液一；將上清液一于4?℃下以5,000×g離心20?min~40?min后得上清液二；將上清液二于4?℃下以10,000×g離心40?min~60?min后得上清液三；將上清液三于4?℃下以150,000×g離心1.5?h~2?h后，用2?ml~5?ml?pbs溶液重懸沉淀，得裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡粗提液。

17、差速離心法是利用樣品中各組分沉降系數(shù)的差異，對(duì)不同的微粒施以不同的離心力，多次離心中離心速度逐步加大，將不同的微粒依次沉降，從而得到大小相近的裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡；具體地，1,000×g、5,000×g和10,000×g的低速離心可去除濾液中裸花紫珠葉片的大顆粒雜質(zhì)和細(xì)胞碎片，150,000×g的超速離心可去除濾液中的大分子蛋白質(zhì)和可溶性雜質(zhì)。

18、可選地，所述蔗糖密度梯度離心包括：向混合蔗糖溶液中加入裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡粗提液后于4?℃下以150,000×g離心1.5?h~2?h后，得含裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡的條帶，加入等量的pbs溶液混勻于4?℃下以150,000×g離心1?h~1.5?h后，2?ml~5?ml?pbs溶液重懸沉淀并過(guò)450?nm濾膜，得裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡。

19、蔗糖密度梯度離心法是利用蔗糖在不同濃度下的密度差異，使樣品在混合蔗糖溶液中形成密度梯度，通過(guò)離心加速樣品的沉降，使不同密度的分子在密度梯度中分層，實(shí)現(xiàn)分離純化的目的，從而獲得高純度的裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡。

20、可選地，所述混合蔗糖溶液中包括濃度為8%、30%、45%和60%的蔗糖溶液，其中8%、30%、45%和60%蔗糖溶液的體積比為3:3:2:2。

21、可選地，所述含裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡的條帶位于所述30%的蔗糖溶液和所述45%的蔗糖溶液的濃度梯度層之間。

22、可選地，所述在裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡上包載藥物包括：將所述裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡和所述藥物按投料比(20~1):1混合，于37?℃下共孵育1?h~8?h后，55?℃~60?℃下攪拌30?min~60?min；其中，裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡和藥物的投料比優(yōu)選為10:1，共孵育時(shí)間優(yōu)選為4?h。

23、因疏水性藥物不溶于水，在裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡上包載藥物前需將藥物預(yù)先溶于乙醇中，包載后于55?℃~60?℃下攪拌以使溶液中的乙醇揮發(fā)，最后過(guò)450?nm濾膜以去除未包載的游離藥物。

24、共孵育法是將藥物裝載到細(xì)胞外囊泡中最簡(jiǎn)單、最常用的方法，藥物通過(guò)疏水作用、擴(kuò)散或靜電作用被包裹到細(xì)胞外囊泡中，也可以沿著濃度梯度載入細(xì)胞外囊泡中，其中載藥效率取決于藥物分子的疏水性，疏水性藥物可以與囊泡膜的脂質(zhì)層相互作用、提高藥物的載藥效率。

25、第三方面，本發(fā)明提供一種上述載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。

26、本發(fā)明所提供的載藥裸花紫珠來(lái)源細(xì)胞外囊泡可靶向結(jié)腸炎癥部位，降低藥物不良反應(yīng)的同時(shí)還能提高療效，為治療潰瘍性結(jié)腸炎提供了一種新型的給藥策略，有望成為臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎的一條有效策略。