本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種重組非洲豬瘟弱毒疫苗及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、非洲豬瘟(african?swine?fever,asf)是非洲豬瘟病毒(asfv)感染引起的一種高度接觸傳染致死性傳染病，對于家豬的致死率高達(dá)100％。迄今為止，asf在世界范圍內(nèi)持續(xù)發(fā)生，不僅對全球養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成威脅，也對人類公共衛(wèi)生安全帶來重大風(fēng)險。目前尚未有防治該病的有效疫苗，針對asf的防控，目前主要采取撲殺和拔牙清除等措施。

2、asfv結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是唯一的dna蟲媒病毒，非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬成員，是一種有囊膜的雙鏈dna病毒。asfv具有20面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑為175-215nm，可以編碼54種以上的結(jié)構(gòu)蛋白，具有復(fù)雜的免疫逃避機制?；蚪M結(jié)構(gòu)與痘病毒相似，為末端共價閉合的單分子線狀雙鏈dna，大小為170-190kb，末端堿基相互連接。asfv主要感染各種組織中網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞。動物感染強毒力毒株后組織表現(xiàn)出廣泛性的損傷；感染低毒力毒株后，感染組織范圍和對組織的損傷較輕。研究證明影響asfv毒力的基因，也是引起細(xì)胞病變的主要因素。asfv的多個基因?qū)邑i的致病性有關(guān)，但并不影響病毒在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制，如dp96r和dp71l等；asfv感染也會影響并調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答，病毒操縱細(xì)胞死亡途徑為自身復(fù)制提供有力條件，包括細(xì)胞凋亡、焦亡、壞死性凋亡等。細(xì)胞凋亡作為一種程序性細(xì)胞死亡機制，在清除病毒感染的細(xì)胞和維持組織穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。大量研究表明，asfv感染顯著誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡，這在asf的發(fā)病機制中占有舉足輕重的地位。先前的研究表明，在病毒感染的早期階段，病毒傾向于抑制細(xì)胞凋亡，以建立有利于其復(fù)制的微環(huán)境。隨著病毒感染進(jìn)入晚期，病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生大量攜帶無外包膜病毒顆粒的凋亡小體；一旦被鄰近細(xì)胞吞噬，這些asfv可以以“特洛伊木馬”的方式巧妙地逃避宿主免疫監(jiān)視，引發(fā)新一輪感染。

3、p54蛋白存在于病毒粒子內(nèi)層囊膜，是asfv重要的結(jié)構(gòu)蛋白，由e183l基因編碼，分子質(zhì)量約為25kda，含有一段跨膜區(qū)域，主要集中在衍生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處，p54蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)在病毒蛋白經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)化成病毒膜前體時起到重要作用。之前的研究表明，p54蛋白的羧基末端區(qū)域含有一個動力蛋白lc8鏈的結(jié)合基序，參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。然而，目前還沒有直接證據(jù)證明p54蛋白在asfv感染期間凋亡中的作用。

4、因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種缺失p54蛋白促凋亡基序的重組非洲豬瘟弱毒疫苗及其制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是開發(fā)一種缺失p54蛋白促凋亡基序的重組非洲豬瘟弱毒疫苗及其制備方法和應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種重組非洲豬瘟弱毒疫苗，包括促凋亡基序缺失的p54蛋白，由e183l基因編碼，核苷酸序列如seq?id?no.1所示；缺失的促凋亡基序為asfv?gz分離株全基因組序列162311-162355和162251-162355的核苷酸序列，缺失促凋亡基序的p54蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

3、本發(fā)明還提供了一種重組非洲豬瘟弱毒疫苗的制備方法，包括以下步驟：

4、步驟1、構(gòu)建同源重組載體：利用puc19載體作為骨架載體，構(gòu)建p54蛋白150-164位氨基酸和150-184位氨基酸敲除用同源重組轉(zhuǎn)移載體，獲得同源重組載體質(zhì)粒p72gfp-p54△dbm(p54△150-164)和p72gfp-p54△ctm(p54△150-184)。

5、步驟2、構(gòu)建重組asfv-p54△dbm和asfv-p54△ctm重組病毒：將步驟1得到的同源重組載體質(zhì)粒p72gfp-p54△dbm或p72gfp-p54△ctm轉(zhuǎn)染至pam細(xì)胞，然后感染asfv?gz病毒；然后通過連續(xù)的egfp陽性單細(xì)胞純化得到asfv-p54△dbm和asfv-p54△ctm重組病毒。

6、進(jìn)一步地，步驟1還包括：p54蛋白由e183l基因編碼，e183l基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，敲除的e183l基因序列為asfv?gz分離株全基因組序列162311-162355和162251-162355的核苷酸序列。

7、進(jìn)一步地，步驟1還包括：將p54蛋白第150-164位氨基酸或150-184位氨基酸的基因片段上下游序列各1200bp作為同源重組同源臂、asfvp72啟動子和gfp基因的pcr片段通過融合pcr試劑盒克隆至puc19載體，其中g(shù)fp基因在asfvp72晚期啟動子的控制下進(jìn)行表達(dá)。

8、進(jìn)一步地，同源重組同源臂包括左臂和右臂，左臂核苷酸序列如seq?id?no.2所示；右臂核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

9、進(jìn)一步地，步驟2還包括：

10、將2μg的p72gfp-p54△dbm或p72gfp-p54△ctm轉(zhuǎn)染至pam細(xì)胞，然后在轉(zhuǎn)染后6h，以1moi的劑量感染asfv?gz病毒；感染后24h，從單層pam細(xì)胞中挑選表達(dá)egfp的細(xì)胞并用無菌pbs沖洗，然后接種至新的pam細(xì)胞中，然后通過連續(xù)的egfp陽性單細(xì)胞純化得到asfv-p54△dbm和asfv-p54△ctm重組病毒。

11、進(jìn)一步地，轉(zhuǎn)染使用的試劑盒為-macrophage。

12、進(jìn)一步地，步驟2還包括通過常規(guī)pcr程序?qū)χ亟M病毒的純度進(jìn)行評估和鑒定，使用的引物為p54-check-f和p54-check-r；p54-check-f序列為：5'-gttttgatgcatttagatacca-3'；p54-check-r序列為:5'-caacatactgttgtatattataag-3'。

13、進(jìn)一步地，asfv?gz病毒全長序列見genbank登錄號：mt496893.1。

14、本發(fā)明還提供了重組非洲豬瘟弱毒疫苗在預(yù)防非洲豬瘟的應(yīng)用。

15、在本發(fā)明的較佳實施方式1中，詳細(xì)說明了重組非洲豬瘟弱毒疫苗的制備過程；

16、在本發(fā)明的另一較佳實施方式2中，詳細(xì)說明了asfv?p54蛋白與宿主因子相互作用鑒定過程；

17、在本發(fā)明的另一較佳實施方式3中，詳細(xì)說明了asfv?p54與scamp3相互作用對細(xì)胞凋亡的影響；

18、在本發(fā)明的另一較佳實施方式4中，詳細(xì)說明了asfvp54誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基序鑒定過程；

19、在本發(fā)明的另一較佳實施方式5中，詳細(xì)說明了asfv?p54促凋亡基序缺失顯著降低asfv通過凋亡體途徑的胞間傳播；

20、在本發(fā)明的另一較佳實施方式6中，詳細(xì)說明了asfv-p54△dbm和asfv-p54△ctm重組病毒的生物活性分析過程。

21、本發(fā)明有益的技術(shù)效果如下：

22、本發(fā)明通過免疫沉淀—質(zhì)譜分析，篩選出了asfv感染過程中與p54蛋白發(fā)生相互作用的宿主因子scamp3；并發(fā)現(xiàn)p54蛋白發(fā)揮促凋亡功能的關(guān)鍵基序，參與asfv誘導(dǎo)的出芽性凋亡體的產(chǎn)生，從而促進(jìn)asfv的胞間傳播；通過在asfv?gz分離株中缺失了p54蛋白的促凋亡基序，構(gòu)建獲得了一種p54蛋白促凋亡基序敲除的重組asfv，asfv重組病毒促凋亡能力顯著減弱；并且缺失p54蛋白促凋亡基序的重組asfv與scamp3互作削弱導(dǎo)致病毒通過凋亡體傳播受阻；動物實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明構(gòu)建的p54蛋白促凋亡基序敲除的重組asfv對家豬的致病力顯著降低，可作為重組疫苗株，能夠促進(jìn)宿主免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)高水平抗體，并有效抵抗野生型強毒的致死劑量攻擊，具備良好的應(yīng)用前景。

23、本發(fā)明篩選鑒定asfv編碼的與致病性相關(guān)的毒力靶點，通過基因工程手段構(gòu)建相關(guān)毒力基因缺失的重組病毒，使其喪失致病力并保留免疫原性。制備了一種基于p54蛋白促凋亡基序缺失的重組非洲豬瘟弱毒疫苗。

24、本發(fā)明鑒定了p54蛋白促凋亡基序，通過基因編輯技術(shù)成功得到p54蛋白促凋亡基序缺失的重組asfv。通過部分缺失p54蛋白發(fā)揮促凋亡作用的關(guān)鍵基序，使其喪失促凋亡功能，但不影響其參與病毒粒子的組裝。突破了asfv膜蛋白p54無法人工缺失的問題，獲得一株缺失p54蛋白促凋亡基序的重組asfv。

25、本發(fā)明通過免疫沉淀—質(zhì)譜分析，篩選出了p54蛋白通過與scamp3相互作用發(fā)揮促凋亡功能。證明了宿主因子scamp3在細(xì)胞凋亡體釋放中發(fā)揮重要作用。解析了p54蛋白發(fā)揮促凋亡功能的分子機制，豐富了我們對asfv感染與致病的理論認(rèn)知。

26、通過缺失p54蛋白與宿主因子scamp3發(fā)生相互作用的關(guān)鍵氨基酸區(qū)段，削弱凋亡體途徑的胞間傳播。削弱凋亡體途徑的胞間傳播能力的重組asfv對家豬的致病性顯著降低，可作為重組疫苗株，能夠促進(jìn)宿主免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)高水平抗體，并有效抵抗野生型強毒的致死劑量攻擊。發(fā)現(xiàn)p54蛋白通過胞外域150-184aa基序與宿主細(xì)胞中scamp3蛋白發(fā)生相互作用，參與asfv誘導(dǎo)的出芽性凋亡體的產(chǎn)生，從而促進(jìn)asfv的胞間傳播。

27、以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。