本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，涉及一種促進(jìn)傷口愈合的水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、大面積皮膚傷口、糖尿病傷口和皮膚燒傷等皮膚創(chuàng)口的治療仍是傷口治療中面臨的一大挑戰(zhàn)。皮膚愈合需經(jīng)歷止血、炎癥、增殖、重塑一系列復(fù)雜階段，其中炎癥階段是一個(gè)必要的自然階段，如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)形成慢性炎癥傷口。而氧化應(yīng)激又與炎癥息息相關(guān)，因此，控制傷口微環(huán)境的氧化還原穩(wěn)態(tài)對(duì)傷口愈合至關(guān)重要。

2、已有研究表明，多種植物來(lái)源的外泌體具有抗氧化、抗炎及促傷口愈合的作用。植物外泌體是一種磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的囊泡，主要成分是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等，可作為細(xì)胞間交流的信使調(diào)節(jié)多種生理和病理過(guò)程，其特征類(lèi)似于哺乳動(dòng)物外泌體，但具有更低的免疫原性以及大規(guī)模生產(chǎn)的潛力。然而，受限于靶向性差、易被清除的缺點(diǎn)，直接應(yīng)用植物外泌體在傷口上效果并不理想。水凝膠因其能夠填充不規(guī)則傷口、維持濕潤(rùn)環(huán)境、可調(diào)節(jié)機(jī)械性能以及良好的生物相容性而廣泛應(yīng)用于醫(yī)用敷料領(lǐng)域。作為常用的藥物遞送系統(tǒng)，水凝膠可以實(shí)現(xiàn)藥物的持續(xù)釋放，減少臨床環(huán)境中重復(fù)給藥的需要。

3、基于此，本發(fā)明研發(fā)設(shè)計(jì)一款負(fù)載植物外泌體的新型水凝膠以促進(jìn)傷口愈合。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，提出了一種促進(jìn)傷口愈合的水凝膠及其制備方法和應(yīng)用，通過(guò)負(fù)載從香菜中提取的香菜外泌體，制備得到一種促進(jìn)傷口愈合的新型水凝膠，有望成為在臨床傷口治療中更安全、經(jīng)濟(jì)的醫(yī)用敷料。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供了一種促進(jìn)傷口愈合的水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

4、通過(guò)梯度離心結(jié)合蔗糖密度梯度法從香菜中提取香菜外泌體，將香菜外泌體與海藻酸鈉溶液按質(zhì)量體積比0.5～2mg：1ml的比例混合，得到外泌體混懸液，然后將外泌體混懸液與氯化鈣溶液按體積比0.5～2：1的比例混合，交聯(lián)得到負(fù)載香菜外泌體的水凝膠。

5、進(jìn)一步的，所述香菜外泌體與海藻酸鈉溶液混合的質(zhì)量體積比為1mg:1ml。

6、進(jìn)一步的，所述外泌體混懸液與氯化鈣溶液的體積比為1:1。

7、進(jìn)一步的，所述海藻酸鈉溶液由海藻酸鈉溶于pbs得到，海藻酸鈉溶液的濃度為1.5～2.5％(w/v)；所述氯化鈣溶液由氯化鈣溶于蒸餾水得到，氯化鈣溶液的濃度為1.5～2.5％(w/v)。

8、優(yōu)選的，所述海藻酸鈉溶液的濃度為2％(w/v)，所述氯化鈣溶液的濃度為2％(w/v)。

9、本發(fā)明還提供了一種香菜外泌體的提取方法，包括以下步驟：

10、(1)將蒸餾水與香菜按質(zhì)量比0.75～1.25：1的比例榨汁，得到香菜汁；

11、(2)將香菜汁依次進(jìn)行梯度離心，取最終得到的上清液過(guò)濾得到濾液，梯度離心依次為：

12、第一次離心：4℃下，3000×g～3500×g離心20min～25min，

13、第二次離心：4℃下，9500×g～10000×g離心100min～120min；

14、(3)將濾液在4℃下，100000×g～120000×g離心1.5h～2h，棄上清，重懸沉淀于適量pbs(0.01m,ph＝7.4)得到重懸液；

15、(4)將重懸液轉(zhuǎn)移至質(zhì)量分?jǐn)?shù)從上到下依次為8％、30％、45％、60％蔗糖密度梯度溶液，并在140000×g～160000×g下離心1.5h～2h，收集30-45％蔗糖層之間的懸浮液；

16、(5)將懸浮液加8～12倍體積的pbs后于4℃下，100000×g～120000×g離心45min～60min，棄上清，沉淀重懸于適量pbs(0.01m,ph＝7.4)后過(guò)濾，得到純化后的香菜外泌體。

17、進(jìn)一步的，步驟(3)和(5)中涉及到的適量pbs的體積以沒(méi)過(guò)沉淀為宜。

18、進(jìn)一步的，所述香菜外泌體提取方法的具體步驟為：

19、(1)將適量新鮮香菜去根、洗凈、切碎后加入破壁機(jī)榨汁，再加入蒸餾水榨汁，紗布過(guò)濾得到香菜汁；所述蒸餾水與香菜的質(zhì)量比為1:1；

20、(2)將香菜汁在4℃下3000×g、10000×g依次離心20min、120min，取最終得到的上清過(guò)0.45μm濾膜得到濾液；

21、(3)將濾液4℃下100000×g離心1.5h，棄上清，重懸沉淀于適量pbs(0.01m,ph＝7.4)得到重懸液；其中，所用pbs的體積以沒(méi)過(guò)沉淀為宜；

22、(4)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8％、30％、45％、60％的蔗糖溶液，將適量60％蔗糖溶液加入離心管底部，然后依次貼壁緩慢加入等體積的45％、30％、8％蔗糖溶液，要求溶液界面分明，將步驟(3)的重懸液轉(zhuǎn)移至8％蔗糖溶液上層，并在150000×g下離心1.5h，離心后收集30-45％蔗糖層之間的懸浮液；

23、上述蔗糖溶液體積以大于等于步驟(3)的重懸液體積為宜。

24、(5)將懸浮液加10倍體積的pbs后，在4℃下，100000×g離心45min，棄上清，沉淀重懸于適量pbs(0.01m,ph＝7.4)后過(guò)0.22μm濾膜，得到純化后的香菜外泌體；其中，所加的適量pbs體積以沒(méi)過(guò)沉淀為宜。

25、本發(fā)明還提供了采用上述任一項(xiàng)所述的制備方法制得的負(fù)載香菜外泌體的水凝膠。

26、本發(fā)明還提供了上述所述的負(fù)載香菜外泌體的水凝膠和/或上述任一項(xiàng)制備方法制得的負(fù)載香菜外泌體的水凝膠在制備促傷口愈合的藥物中的應(yīng)用。

27、本發(fā)明又提供了一種促進(jìn)傷口愈合的藥物，包括任一項(xiàng)所述制備方法制得的負(fù)載香菜外泌體的水凝膠和/或所述的負(fù)載香菜外泌體的水凝膠。

28、進(jìn)一步的，所述藥物中還包括藥學(xué)上可接受的敷料。

29、本發(fā)明的有益效果：

30、(1)本發(fā)明提供的負(fù)載香菜外泌體的新型水凝膠，具有良好的黏彈性和生物相容性，可作為敷料應(yīng)用在皮膚傷口表面；同時(shí)，該水凝膠具有香菜外泌體緩釋效果，延長(zhǎng)了外泌體的釋放時(shí)間，使其更好發(fā)揮生物功能；通過(guò)緩釋香菜外泌體，該水凝膠能夠緩解傷口氧化應(yīng)激與炎癥，促進(jìn)傷口修復(fù)。

31、(2)本發(fā)明水凝膠負(fù)載的香菜外泌體呈典型的茶托狀雙層膜結(jié)構(gòu)，粒徑在150nm左右，提取得到的香菜外泌體中每毫升有2.11×1011個(gè)外泌體顆粒，且能被皮膚細(xì)胞攝入，具有促細(xì)胞遷移、抗氧化、抗炎功效，能有效促進(jìn)皮膚傷口愈合；本發(fā)明提供的香菜外泌體的提取方法，能夠得到較高的產(chǎn)量和純度。

技術(shù)特征：

1.一種促進(jìn)傷口愈合的水凝膠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述香菜外泌體與海藻酸鈉溶液混合的質(zhì)量體積比為1mg:1ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述外泌體混懸液與氯化鈣溶液的體積比為1:1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述海藻酸鈉溶液由海藻酸鈉溶于pbs得到，海藻酸鈉溶液的濃度為1.5～2.5％(w/v)；所述氯化鈣溶液由氯化鈣溶于蒸餾水得到，氯化鈣溶液的濃度為1.5～2.5％(w/v)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述香菜外泌體的提取，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的制備方法制得的負(fù)載香菜外泌體的水凝膠。

8.權(quán)利要求7所述的負(fù)載香菜外泌體的水凝膠和/或權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的制備方法制得的負(fù)載香菜外泌體的水凝膠在制備促傷口愈合的藥物中的應(yīng)用。

9.一種促進(jìn)傷口愈合的藥物，包括權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述制備方法制得的負(fù)載香菜外泌體的水凝膠和/或權(quán)利要求7所述的負(fù)載香菜外泌體的水凝膠。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于，還包括藥學(xué)上可接受的敷料。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種促進(jìn)傷口愈合的水凝膠及其制備方法和應(yīng)用，首先，本發(fā)明通過(guò)梯度離心結(jié)合蔗糖密度梯度法從香菜中提取香菜外泌體，然后，將香菜外泌體與海藻酸鈉溶液按質(zhì)量體積比0.5～2mg：1mL的比例混合，得到外泌體混懸液，再將外泌體混懸液與氯化鈣溶液按體積比0.5～2：1的比例混合，交聯(lián)得到負(fù)載香菜外泌體的水凝膠。本發(fā)明提供的負(fù)載香菜外泌體的新型水凝膠，具有良好的黏彈性和生物相容性，可作為敷料應(yīng)用在皮膚傷口表面；同時(shí)，該水凝膠具有香菜外泌體緩釋效果，延長(zhǎng)了外泌體的釋放時(shí)間，使其更好發(fā)揮生物功能；通過(guò)緩釋香菜外泌體，該水凝膠能夠緩解傷口氧化應(yīng)激與炎癥，促進(jìn)傷口修復(fù)。

技術(shù)研發(fā)人員：易華西,王婷,章檢明,蔣璐,劉伊索,曹佳媛
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)海洋大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19