本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料中的組織修復(fù)領(lǐng)域，涉及一種異質(zhì)纖維微結(jié)構(gòu)的人工角膜、其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明還涉及作為異質(zhì)纖維微結(jié)構(gòu)的人工角膜的制備原料的高堆積密度膠原材料，及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、角膜移植是臨床上角膜盲視力康復(fù)的主要治療選擇，由于供體角膜組織嚴(yán)重短缺，我國每年完成約5000例的移植手術(shù)，僅占患者總數(shù)的1/40，臨床上亟待開發(fā)人工角膜移植物acs(artificial?cornea?implant)以替代人體捐獻(xiàn)。早在20世紀(jì)90年代，公開號為us5067961a的美國專利申請設(shè)計了一種不可生物降解的角膜植入物，該植入物包括：(1)具有酰化胺或酯化羧基的中央透明區(qū)域，(2)圍繞核心的纖維狀、不透明的外圍區(qū)域。理論上，該角膜可以植入并具備與天然角膜相仿的性能。

2、現(xiàn)有acs從材料成分上大體分為兩類，即動物源脫細(xì)胞基質(zhì)類acs和合成聚合物類acs。中國市場上的兩種動物源脫細(xì)胞acs，如深圳艾欣瞳與廣州優(yōu)得清，面臨諸多挑戰(zhàn)，例如脫細(xì)胞工藝復(fù)雜、抗原性、免疫排斥和透明性不足等，同時也存在傳播動物疾病的風(fēng)險。另一方面，基于合成高分子的acs，常見的問題包括與眼組織相容性差、無法與宿主組織整合等，這些問題可能導(dǎo)致嚴(yán)重炎癥和血管生成，影響角膜的正常功能。因此，具有優(yōu)異眼組織相容性的acs材料是該領(lǐng)域研究的重要課題。

3、天然角膜組織是由無數(shù)排列緊密、縱橫交錯成網(wǎng)狀的膠原纖維有序構(gòu)成，膠原蛋白無疑是最為理想的acs原材料。膠原蛋白在體內(nèi)從三螺旋分子逐級有序組裝，形成從納米到微米尺度不同的排列有序的成熟纖維，以執(zhí)行不同的生理功能。以眼球的角膜和鞏膜組織為例，膠原蛋白的獨特微結(jié)構(gòu)不僅賦予了角膜高度的透明性，也為鞏膜提供了必要的機械支持。眼球壁上中間區(qū)域的角膜與邊緣的鞏膜中的膠原纖維的微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)顯著差異。其中，角膜由層狀緊密排列的均勻小直徑的膠原微纖組成，表現(xiàn)出高透明性以允許光線進(jìn)入，從而滿足視覺功能；而鞏膜由寬分布大直徑的膠原纖維組成，表現(xiàn)出優(yōu)化的機械性能為眼球提供結(jié)構(gòu)支撐和保護(hù)。通常，膠原分子在體內(nèi)可以受到內(nèi)源性信號指導(dǎo)進(jìn)行受限空間內(nèi)的分級有序組裝，形成特定的內(nèi)部微結(jié)構(gòu)，從而實現(xiàn)高透光性和較強力學(xué)特性。通過模仿角膜和鞏膜的內(nèi)部微結(jié)構(gòu)特征，可以有效地提升合成膠原材料的光學(xué)和力學(xué)性能，為制造具有優(yōu)異光學(xué)性能(即高透明度和低霧度)且能手術(shù)縫合的膠原基acs材料提供可行的解決方案。

4、專利號為5067961的美國發(fā)明設(shè)計了一種不可生物降解的角膜植入物，該植入物包括(1)具有?；坊蝓セ然闹醒胪该鲄^(qū)域，以及(2)圍繞核心的纖維狀、不透明的外圍區(qū)域。還提供了一種制備這種植入物的方法，并將其驗證于穿透性角膜移植術(shù)，研究了該移植物的透明度、炎癥以及再上皮化的結(jié)果。

5、然而，目前的合成膠原材料在模仿這些自然結(jié)構(gòu)時面臨諸多挑戰(zhàn)，包括：在體外，膠原分子的自組裝是一個在非受限空間內(nèi)的典型熱力學(xué)吸熱過程，傾向于發(fā)生原纖維的聚集而形成更大尺寸的纖維結(jié)構(gòu)，且排列高度松散無規(guī)，因此對入射光的散射效應(yīng)強烈。形成的膠原材料視覺上不透明或半透明，并且力學(xué)性能較差，無法滿足縫合要求。如何能夠在分子水平上控制膠原在體外的分級組裝過程，從而控制其內(nèi)部微結(jié)構(gòu)，是仿生制造高透光和可縫合的膠原基人工角膜的切入點。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是使人工角膜同時保持高透明度及良好的耐縫合性。

2、針對上述問題，一方面，本發(fā)明提供了一種具備空間異質(zhì)性的膠原纖維網(wǎng)絡(luò)的異質(zhì)纖維微結(jié)構(gòu)膠原人工角膜，在控制組裝纖維直徑的同時維持纖維的致密堆積狀態(tài)。膠原纖維直徑可達(dá)到500nm，膠原網(wǎng)絡(luò)堆積密度約為230mg/cm3。

3、本發(fā)明通過濕度控制，即限制水分子的參與程度，調(diào)控膠原組裝體微觀結(jié)構(gòu)，仿生膠原蛋白在體內(nèi)受限空間環(huán)境中的分級組裝過程。在擁擠環(huán)境中，水分子被有限的保留在膠原蛋白分子間有助于氫鍵的形成，觸發(fā)分子間聚集成核觸發(fā)纖維形成，而部分的脫水效應(yīng)可以促進(jìn)膠原蛋白分子/纖維間更緊密的結(jié)合，促進(jìn)其纖維的生長。同時，以動力學(xué)組裝得到的膠原微纖為熱力學(xué)組裝起點，使纖維尺寸從納米尺度(約為10nm)向介觀尺度可控轉(zhuǎn)變，最終纖維直徑可達(dá)到400-500nm，從而構(gòu)建具有晶態(tài)粗纖維結(jié)構(gòu)的力學(xué)強化膠原網(wǎng)絡(luò)。利用電信號啟動膠原蛋白分子的動力學(xué)組裝，可省時高效地制備出高密度的膠原凝膠網(wǎng)絡(luò)，密度可達(dá)到450mg/cm3，與傳統(tǒng)提高膠原密度的方法相比，大幅縮短了制備時間，且較大程度地提高了組織密度。

4、另一方面，本發(fā)明提供了上述異質(zhì)纖維微結(jié)構(gòu)膠原人工角膜(在本發(fā)明中可以簡稱為人工角膜)的制備方法?？梢酝ㄟ^控制光交聯(lián)條件的方式處理而獲得動-熱力學(xué)接力式膠原蛋白，高堆積密度膠原材料。具體為將掩模板覆蓋在動力學(xué)組裝膠原蛋白(也可以稱為amf-col)上，然后暴露在紫外光源下進(jìn)行交聯(lián)，以固定定制區(qū)域，被光交聯(lián)的定制化區(qū)域在隨后的熱力學(xué)組裝過程中保持原有纖維微結(jié)構(gòu)不變，未被光交聯(lián)的區(qū)域在組裝過程中形成大尺度原纖維。

5、優(yōu)選地，所述的異質(zhì)纖維微結(jié)構(gòu)膠原人工角膜的制備方法，包括：

6、(1)溶解i型膠原蛋白，通過電沉積反應(yīng)形成電場觸發(fā)動力學(xué)組裝的膠原蛋白膜；

7、(2)在電場觸發(fā)動力學(xué)組裝的膠原蛋白膜上覆蓋預(yù)設(shè)的光掩膜，再暴露在紫外光光源下進(jìn)行局部的光交聯(lián)；

8、(3)將經(jīng)過局部光交聯(lián)的膠原蛋白膜放置在恒溫恒濕條件下，誘導(dǎo)未交聯(lián)膠原蛋白的持續(xù)組裝：恒溫恒濕條件下放置3—30小時，溫度為4—45℃，恒溫恒濕空間內(nèi)控制相對濕度為40％—100％。

9、優(yōu)選地，誘導(dǎo)膠原蛋白膜的持續(xù)組裝包括：將膠原蛋白膜放置在恒溫恒濕環(huán)境中(例如恒溫恒濕箱內(nèi))，誘導(dǎo)膠原蛋白膜的持續(xù)組裝；恒溫恒濕箱內(nèi)溫度為25-40℃，更優(yōu)地，溫度為30-37℃，例如，溫度為32、33、34、35、36℃。時間為12—36小時，更優(yōu)地，時間為12—30小時，例如，時間為18—24小時。

10、優(yōu)選地，控制相對濕度為40％—100％，更優(yōu)的，為40％-60％或者60％-80％。恒溫恒濕箱中放置水或者含水的溶液，優(yōu)選地，為放置銨鹽溶液。例如，恒溫恒濕箱中放置銨鹽溶液為nh4hco3溶液，濃度為50mm-200mm。更優(yōu)地，濃度為100mm-150mm，例如80mm、120mm、130mm、140mm、160mm等。

11、如本發(fā)明的實驗結(jié)果顯示，在溫度37℃、濕度60％條件下組裝24h后得到的膠原組裝體的縫合強度為4.69n/mm，拉伸強度為5.97mpa。在溫度4℃、濕度60％條件下組裝24h的組裝體的縫合強度為1.83n/mm，拉伸強度為3.59mpa；溫度為25℃、濕度和時間不變的條件下組裝體的縫合強度為2.58n/mm，拉伸強度為4.42mpa；在溫度為37℃、濕度為40％條件下組裝24h后的膠原組裝體的縫合強度為3.23n/mm，拉伸強度為5.34mpa；溫度和時間不變，濕度為80％條件下的組裝體的縫合強度為2.69n/mm，拉伸強度為4.23mpa。

12、優(yōu)選地，所述的動-熱力學(xué)接力式膠原蛋白組裝體，或者稱為膠原蛋白膜，其制備方法包括至少兩步：首先是膠原蛋白的動力學(xué)組裝，然后是熱力學(xué)組裝。膠原蛋白的動力學(xué)組裝后，后續(xù)還要進(jìn)行熱力學(xué)組裝，即前面描述的在恒溫恒濕箱中優(yōu)選條件下的繼續(xù)組裝過程，稱為“膠原蛋白的接力熱力學(xué)組裝”。兩個步驟統(tǒng)稱為“動-熱力學(xué)接力式組裝”，得到最終的膠原蛋白組裝體。

13、以下的制備過程稱為“膠原蛋白的動力學(xué)組裝”：

14、將i型膠原蛋白溶解，加入冰醋酸使其ph為酸性；加入過氧化氫，得到膠原蛋白電解液；

15、采用電沉積的三電極體系，利用電極反應(yīng)建立ph梯度，使膠原蛋白發(fā)生相轉(zhuǎn)變，由膠原蛋白溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槟z原蛋白凝膠膜amf-col；

16、陽極和陰極的反應(yīng)式如下：

17、陽極：2h2o–4e-→4h++o2；

18、陰極：2h2o+4e-→4oh-+2h2。

19、所獲得的膠原蛋白膜是一種外觀非常均勻的膠原凝膠膜，在干態(tài)和濕態(tài)均高度透明，以短程取向的膠原微纖以非共價鍵連接而成；膠原排列致密；材料外觀透明、結(jié)構(gòu)均勻。

20、該膠原凝膠膜能在電極上直接獲得，制備完成后能夠從電極剝離，具體可以參見申請?zhí)枮?02210102037.x的中國發(fā)明專利。其制備過程可以按照如下步驟進(jìn)行：

21、s1，膠原溶液的配置：在膠原蛋白溶液中添加醋酸使膠原完全溶解，調(diào)節(jié)最終溶液的ph值為1.5-4，濃縮后獲取濃度在1-20mg/ml范圍的膠原溶液。

22、s2，向步驟s1獲得的膠原溶液中加入過氧化氫使其在溶液中的終濃度為5-200μl/ml，并攪拌、除去氣泡，置于0-10℃?zhèn)溆茫豢蛇x的，加入過氧化氫的量為5-17％。

23、s3，以鈦片作為工作電極、鉑作為對電極，兩個電極平行放置在電解池中電極之間的距離控制在0.5-3.0cm，在電解池中緩慢加入步驟s2所制備的膠原溶液。

24、s4，采用恒電壓或者恒電流沉積進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)，沉積時間10—120分鐘，獲得在陰極上沉積的膠原凝膠膜。

25、本發(fā)明中，交聯(lián)可以采用光交聯(lián)、戊二醛交聯(lián)。所述光交聯(lián)是指，將膠原蛋白膜浸泡在0.2—3.0mg/ml的核黃素溶液中，在紫外光照射下交聯(lián)1—3天。核黃素溶液以90％v/v乙醇-水為溶劑，濃度為0.5—2.0mg/ml，交聯(lián)時間為20—40小時。

26、所述戊二醛交聯(lián)是指，將膠原蛋白膜浸泡在0.1％-1％(體積百分比)的戊二醛溶液里，交聯(lián)10分鐘—2小時；隨后去除膠原膜中殘留的戊二醛組分。戊二醛溶液以0.5％w/v、90％v/v乙醇-水為溶劑，交聯(lián)時間為30—50分鐘。

27、可選的，去除膠原膜中殘留的交聯(lián)劑組分，例如戊二醛等，可以使用超純水反復(fù)沖洗。例如，使用超純水沖洗3—5次。

28、本發(fā)明中，超純水又稱up水，電阻率達(dá)到18mω*cm(25℃)的水，這種水中除了水分子外，幾乎沒有雜質(zhì)，沒有礦物質(zhì)微量元素，更沒有細(xì)菌、病毒、含氯二惡英等有機物。超純水處理時，既將水中的導(dǎo)電介質(zhì)幾乎完全去除，又將水中不離解的膠體物質(zhì)、氣體及有機物均去除至很低程度的水，通常需要采用預(yù)處理、反滲透技術(shù)、超純化處理以及后級處理四大步驟。

29、本發(fā)明的異質(zhì)纖維微結(jié)構(gòu)膠原人工角膜的制備方法中，將動-熱力學(xué)接力式膠原蛋白組裝方式與光掩模技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)膠原纖維網(wǎng)絡(luò)的空間異質(zhì)性控制。這將允許在同一材料中實現(xiàn)不同微結(jié)構(gòu)的集成，從而模擬天然角膜和鞏膜的結(jié)構(gòu)與功能特性。

30、本發(fā)明的動-熱力學(xué)接力式膠原蛋白組裝體，可以應(yīng)用在體內(nèi)角膜板層缺損修復(fù)中。將所述異質(zhì)纖維微結(jié)構(gòu)膠原人工角膜直接作為植入材料用于角膜缺損修復(fù)，它可以促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞遷移至缺損部位，從而實現(xiàn)角膜缺損部位的上皮化。同時幫助角膜基質(zhì)層再生，使角膜能夠恢復(fù)至健康水平。

31、本發(fā)明中，rh代表相對濕度。

32、本發(fā)明中，amf-col為電場調(diào)控下通過動力學(xué)組裝方法得到的膠原蛋白組裝體的縮寫，其內(nèi)部由緊密堆積的納米微纖維(約為10nm)組成，使其具有優(yōu)異的光學(xué)透明度，外觀上呈現(xiàn)高度透明的特征。

33、由于動力學(xué)組裝得到的膠原微纖具有繼續(xù)組裝的潛力，因此amf-col可繼續(xù)通過熱力學(xué)手段進(jìn)行組裝。cf-col為amf-col在恒溫恒濕條件下接力熱力學(xué)組裝得到的膠原蛋白組裝體的縮寫，其內(nèi)部由寬分布的膠原纖維構(gòu)成，直徑較大，可達(dá)到400-500nm。外觀則表現(xiàn)為乳白色，光學(xué)透明度較差，視覺上不透明。

34、本發(fā)明中，acs為人工角膜移植物artificial?cornea?implant的縮寫。

35、本發(fā)明中，hfs-acss為異質(zhì)纖維微結(jié)構(gòu)膠原人工角膜(是rh為60％條件下制備的)的縮寫。該人工角膜模仿了天然角膜和鞏膜的內(nèi)部微結(jié)構(gòu)特征，即中間核心區(qū)域為直徑較小的納米微纖構(gòu)成，提供優(yōu)異的光學(xué)性能，外環(huán)區(qū)域則由寬分布大直徑的膠原纖維構(gòu)成，提供耐手術(shù)縫合的機械性能。該人工角膜實現(xiàn)了高透光、可縫合的一體化可控構(gòu)筑。

36、本發(fā)明的有益效果包括：

37、第一，空間區(qū)域化微結(jié)構(gòu)調(diào)控：現(xiàn)有膠原組裝技術(shù)通常都是均質(zhì)的，尚無法像生物學(xué)一樣在空間上控制膠原組裝微結(jié)構(gòu)以定制局部的特性，最終實現(xiàn)整合的多樣生物學(xué)功能，本發(fā)明通過動－熱力學(xué)接力組裝技術(shù)與光掩模技術(shù)串聯(lián)實現(xiàn)全膠原材料中不同纖維微結(jié)構(gòu)的集成功能的整合。本發(fā)明通過動－熱力學(xué)接力組裝技術(shù)聯(lián)合光掩模技術(shù)，實現(xiàn)了膠原纖維網(wǎng)絡(luò)的空間異質(zhì)性控制，同時集成：i)層狀緊密排列的均勻小直徑的膠原微纖，與ⅱ)寬分布的大直徑的膠原纖維結(jié)構(gòu)，在實現(xiàn)局部高透明性的同時，表現(xiàn)出優(yōu)化的機械性能。

38、第二，體外省時高效地復(fù)現(xiàn)高堆積密度的膠原分級組裝結(jié)構(gòu)：與以往報道的體外提高膠原蛋白組裝濃度的方法相比，本發(fā)明提出的通過電信號啟動膠原蛋白的動力學(xué)組裝方式能夠省時有效地制備出高堆積密度的膠原蛋白組裝體。本發(fā)明的膠原網(wǎng)絡(luò)中纖維結(jié)構(gòu)從納米尺度(～1-100nm)到介觀尺度(～100-1μm)，構(gòu)建了具有晶態(tài)粗纖維結(jié)構(gòu)的力學(xué)強化膠原網(wǎng)絡(luò)。通過這種方式在控制組裝纖維直徑的同時仍保持了纖維網(wǎng)絡(luò)的致密堆積狀態(tài)，最大程度地提高了機械性能。