本發(fā)明屬于醫(yī)藥，涉及一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、幾乎所有原核生物和真核生物的細(xì)胞都會釋放細(xì)胞外囊泡(extracellularvesicle,ev)。這些納米級的細(xì)胞外小囊泡可以攜帶含有許多細(xì)胞成分,包括dna、rna、脂質(zhì)、代謝產(chǎn)物、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞表面蛋白質(zhì)等，通過與周圍細(xì)胞的交互作用，產(chǎn)生相應(yīng)的生理功能。目前，細(xì)胞外囊泡已經(jīng)發(fā)展成為一種新型的納米藥物遞送載體，可以提高藥物的組織滲透、貯留和攝取效率。然而，未經(jīng)修飾的普通囊泡缺乏組織靶向性，這阻礙了細(xì)胞外小囊泡的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

2、對細(xì)胞外小囊泡表面進(jìn)行靶向分子修飾可以提高組織靶向性。目前使用的修飾材料主要有蛋白質(zhì)、肽、納米材料等。通過各種細(xì)胞外小囊泡膜表面修飾方式,將膜修飾材料附著于細(xì)胞外小囊泡表面,從而使修飾后的細(xì)胞外小囊泡高選擇性地富集于特定的組織器官,提高療效，并降低因藥物異位富集而帶來的毒副作用。

3、雖然表面修飾可以提高細(xì)胞外囊泡的靶向性，但囊泡仍然存在靶向性不足的問題，這可能導(dǎo)致藥物分布不均，大大降低治療效果，而且目前細(xì)胞外囊泡的制備和修飾成本較高，這也限制了它們的大規(guī)模應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡，通過在肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡中荷載抗腫瘤藥物，從而發(fā)揮精準(zhǔn)、高效的抗腫瘤效應(yīng)。

2、本發(fā)明的目的可通過下列技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

3、一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡，所述細(xì)胞外小囊泡為從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲取后經(jīng)過gpc3適配體修飾。

4、在上述的一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡中，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為balb/c小鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

5、作為優(yōu)選，細(xì)胞外小囊泡從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲取具體包括如下步驟：

6、s1、從balb/c小鼠的股骨和脛骨中獲取其骨髓，在dmem/f12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，其中，加入不含細(xì)胞外囊泡的血清；

7、s2、在原代balb/c小鼠細(xì)胞的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞被提取后的第14天在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)；

8、s3、用流式細(xì)胞儀檢測原代balb/c小鼠細(xì)胞的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞穩(wěn)定增殖的第三代細(xì)胞表面標(biāo)志物sca-1、cd44、cd45、cd11b和cd31；

9、s4、收集穩(wěn)定傳代的原代balb/c小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的上清液，采用“經(jīng)典的差速超速離心法”，得到的細(xì)胞外小囊泡并重懸于pbs溶液中，-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

10、其中，每800-1000ml的上清液在經(jīng)過“經(jīng)典的差速超速離心法”處理后獲得的細(xì)胞外小囊泡用800μl-1000μl的pbs重懸。

11、在上述的一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡中，所述gpc3適配體能夠與肝癌細(xì)胞表面高表達(dá)的gpc3受體進(jìn)行高親和力和強(qiáng)特異性結(jié)合。

12、在上述的一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡中，所述gpc3適配體的核苷酸序列如seqid?no.1所示。

13、在上述的一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡中，所述gpc3適配體的3'端和5'端各有連續(xù)三個(gè)磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯修飾。本發(fā)明通過將寡核苷酸骨架中的一個(gè)非橋氧原子替換為硫原子，從而使其對核酸酶(特別是外切酶)的降解更具抗性，大大提高其在生物體內(nèi)中的穩(wěn)定性。

14、作為優(yōu)選，所述gpc3適配體的3'端從第一個(gè)磷酸二酯鍵開始有連續(xù)三個(gè)磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯修飾；

15、所述gpc3適配體的5'端從第一個(gè)磷酸二酯鍵開始有連續(xù)三個(gè)磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯修飾。

16、在上述的一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡中，所述gpc3適配體的3`端連接有膽固醇?xì)埢?`端連接有熒光基團(tuán)。本發(fā)明通過在寡核苷酸分子的3`端連接疏水的膽固醇?xì)埢?，促進(jìn)其嵌插和錨定于囊泡膜中。

17、作為優(yōu)選，熒光基團(tuán)為cy5熒光探針。

18、本發(fā)明還提供了一種上述肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡的制備方法，所述方法包括如下步驟：將細(xì)胞外小囊泡、gpc3適配體加入pbs溶液，室溫孵育，然后去除雜質(zhì)得到靶向性細(xì)胞外小囊泡。

19、在上述的一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡的制備方法中，所述細(xì)胞外小囊泡以其蛋白含量計(jì)，每1mg的細(xì)胞外小囊泡的溶液中，適配體的量為2-5nmol。

20、在上述的一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡的制備方法中，去除雜質(zhì)采用透析或者超濾。

21、本發(fā)明還提供了一種上述肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡在治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

23、1.本發(fā)明通過使用小分子gpc3核酸適配體修飾細(xì)胞外小囊泡，可以顯著提高這些囊泡向肝癌組織的靶向性。這種靶向性的提高使得細(xì)胞外小囊泡能夠更有效地荷載抗腫瘤藥物并遞送到肝癌細(xì)胞，從而發(fā)揮精準(zhǔn)、高效的抗腫瘤效應(yīng)，gpc3核酸適配體的選擇基于其與肝癌細(xì)胞表面gpc3受體的高度親和力，確保了藥物能夠特異性地與肝癌細(xì)胞結(jié)合。

24、2.本發(fā)明利用gpc3不僅是肝細(xì)胞癌的一個(gè)標(biāo)志性分子，而且還是一個(gè)潛在的治療靶標(biāo)，通過核酸適配體靶向gpc3受體，可以直接抑制肝癌細(xì)胞的增殖和進(jìn)展，這種直接作用機(jī)制有助于增強(qiáng)整體治療效果，并減少非特異性藥物遞送所帶來的副作用。

25、3.本發(fā)明利用小分子gpc3核酸適配體修飾的細(xì)胞外小囊泡作為藥物遞送載體，不僅提高了肝癌組織的靶向性，而且還能夠直接抑制肝癌的進(jìn)展，這種方法為肝細(xì)胞癌的治療提供了一個(gè)全新的視角，具有明確的理論基礎(chǔ)、成熟的實(shí)驗(yàn)方法和簡便的操作流程。隨著進(jìn)一步的研究和臨床驗(yàn)證，這種創(chuàng)新療法有望為肝癌患者帶來更加精準(zhǔn)和有效的治療方案。

技術(shù)特征：

1.一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡，其特征在于，所述細(xì)胞外小囊泡為從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲取后經(jīng)過gpc3適配體修飾。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡，其特征在于，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為balb/c小鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡，其特征在于，所述gpc3適配體能夠與肝癌細(xì)胞表面高表達(dá)的gpc3受體進(jìn)行高親和力和強(qiáng)特異性結(jié)合。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡，其特征在于，所述gpc3適配體的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡，其特征在于，所述gpc3適配體的3'端和5'端各有連續(xù)三個(gè)磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯修飾。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡，其特征在于，所述gpc3適配體的3`端連接有膽固醇?xì)埢?`端連接有熒光基團(tuán)。

7.一種如權(quán)利要求1所述肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：將細(xì)胞外小囊泡、gpc3適配體加入pbs溶液，室溫孵育，然后去除雜質(zhì)得到靶向性細(xì)胞外小囊泡。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡的制備方法，其特征在于，所述細(xì)胞外小囊泡以其蛋白含量計(jì)，每1mg的細(xì)胞外小囊泡的溶液中，適配體的量為2-5nmol。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡的制備方法，其特征在于，去除雜質(zhì)采用透析法或者超濾法。

10.一種如權(quán)利要求1所述肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡在制備核酸藥物、小分子靶向藥物或化療藥物等藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種肝癌靶向性細(xì)胞外小囊泡及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過使用小分子GPC3核酸適配體修飾細(xì)胞外小囊泡，可以顯著提高這些囊泡向肝癌組織的靶向性。這種靶向性的提高使得細(xì)胞外小囊泡能夠更有效地荷載抗腫瘤藥物并遞送到肝癌細(xì)胞，從而發(fā)揮精準(zhǔn)、高效的抗腫瘤效應(yīng)，GPC3核酸適配體的選擇基于其與肝癌細(xì)胞表面GPC3受體的高度親和力，確保了藥物能夠特異性地與肝癌細(xì)胞結(jié)合。

技術(shù)研發(fā)人員：李陽,丁一楠,武小俠,張定虎,羅君,鄭家平,邵國良
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江省腫瘤醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19