發(fā)明領(lǐng)域本技術(shù)涉及癌癥免疫療法領(lǐng)域。特別地，本技術(shù)涉及用于治療患者的癌癥以增加基于鵝膏蕈毒素(amatoxin)的抗體-藥物綴合物的治療指數(shù)的給藥方案。本技術(shù)還涉及用于此類治療方案的基于鵝膏蕈毒素的抗體-藥物綴合物。

背景技術(shù)：

0、背景

1、目前批準(zhǔn)的抗體-藥物綴合物(adc)諸如enhertu(her2)、trodelvy(trop-2)和blenrep(bcma)僅基于少數(shù)細(xì)胞毒性機(jī)制，主要以微管或dna靶向毒素作為有效載荷。鵝膏蕈毒素是一組熟知的毒素，其由天然存在于鵝膏屬(amanita)擔(dān)子菌綱(basidiomycetes)蘑菇中的九種結(jié)構(gòu)相關(guān)的毒素組成。最突出的成員是四十多年前在綠色死亡帽蘑菇鬼筆鵝膏(amanita?phalloides)中鑒定的α-鵝膏蕈堿和β-鵝膏蕈堿。鵝膏蕈毒素為公眾所熟知，并且由于其在蘑菇攝入后的毒性作用而在保健和醫(yī)學(xué)科學(xué)中得到了深入研究。它們是全世界95％的所有致命蘑菇中毒的原因。鵝膏蕈毒素是高度耐熱的，耐酶和酸降解，并且在水中示出優(yōu)異的溶解度。特別是α-鵝膏蕈堿已被證明是鬼筆鵝膏(a.phalloides)中毒后觀察到的嚴(yán)重肝臟和腎臟損傷的主要原因。在肝臟中，它被位于肝細(xì)胞上的特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(oatp1b3))吸收，導(dǎo)致其細(xì)胞溶解。

2、由于其親水性質(zhì)，鵝膏蕈堿不會(huì)被動(dòng)地穿透細(xì)胞，并且對(duì)于除肝細(xì)胞之外的大部分其他人類細(xì)胞類型沒有示出或僅示出差的攝取。然而，據(jù)報(bào)道，除肝臟外，其他器官，主要是腎臟，也受到影響。由于鵝膏蕈毒素不會(huì)被進(jìn)一步代謝，它們?cè)跀z入后的最初幾天內(nèi)主要通過腎臟和尿液排出，導(dǎo)致嚴(yán)重的腎毒性。

3、鵝膏蕈毒素是雙環(huán)八肽，包含三種獨(dú)特的氨基酸：二羥基-異亮氨酸、羥基-色氨酸和羥基-脯氨酸。它們以最高親和力與真核生物rna聚合酶ii結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成顯著降低1000倍以上。羥基化側(cè)鏈的oh基團(tuán)負(fù)責(zé)分子的高親水性，并且在一定程度上負(fù)責(zé)其與rna聚合酶ii的接合。由于這種高度特異性抑制，鵝膏蕈堿已被廣泛用作研究基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的工具。

4、重要的是，鵝膏蕈堿誘導(dǎo)的影響不限于分裂細(xì)胞，并且也在靜息(非分裂)細(xì)胞中起作用，這與目前在大多數(shù)批準(zhǔn)的adc中使用的靶向dna或微管蛋白的毒素不同。

5、通過這種新的作用模型，基于鵝膏蕈堿的adc因此與市售adc相比具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：首先，基于鵝膏蕈堿的adc也影響非增殖和靜止細(xì)胞。其次，鵝膏蕈堿不是外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的已知底物。因此，基于鵝膏蕈堿的adc在對(duì)其他線療法有抗性的腫瘤中也是有效的。第三，沒有已知的鵝膏蕈堿作為adc有效載荷的抗性機(jī)制，這可能是由于真核細(xì)胞中rna聚合酶ii的嚴(yán)格結(jié)構(gòu)-活性要求，真核細(xì)胞幾乎不為rna聚合酶ii中的逃逸突變提供空間。

6、鵝膏蕈毒素基于其物理化學(xué)性質(zhì)非常適合用作adc的有效載荷：首先，鵝膏蕈毒素允許接頭的附接而不降低其細(xì)胞毒性潛力，其次，鵝膏蕈毒素具有高細(xì)胞毒性潛力以在低濃度實(shí)現(xiàn)細(xì)胞殺傷，并且第三，當(dāng)與抗體偶聯(lián)時(shí)，鵝膏蕈毒素僅在細(xì)胞內(nèi)展現(xiàn)其細(xì)胞毒性潛力。

7、除了其有希望的功效概況外，鵝膏蕈堿還示出一些有利的物理化學(xué)性質(zhì)。與通常用作adc有效載荷(彈頭(warhead))的所有其他毒素相比，該分子是非常親水性的。這有利于在水性緩沖液中的綴合并防止adc聚集，這使得其易于處理并降低其免疫原性的潛力。還表明，鵝膏蕈堿是啟動(dòng)多藥耐藥性(mdr)過程的非常差的底物，并且鵝膏蕈堿綴合物在表達(dá)mdr的腫瘤細(xì)胞中是高度有效的。

8、鵝膏蕈堿在血漿中高度穩(wěn)定，并且由于其低分子量和親水性，它經(jīng)由腎臟非常迅速地清除，這使得它不太可能在其他組織中積累。另一個(gè)安全特征是其不能經(jīng)由被動(dòng)攝取進(jìn)入正常細(xì)胞。與鵝膏蕈堿綴合的抗體相比，游離毒素示出20,000倍降低的細(xì)胞毒性。當(dāng)與抗體綴合時(shí)，鵝膏蕈堿或鵝膏蕈毒素不再是oatp1b3介導(dǎo)的細(xì)胞攝取的底物，這尤其降低了肝毒性，然而，在動(dòng)物模型中可以觀察到一些肝毒性，如通過施用基于鵝膏蕈堿的adc后肝酶諸如alt、ast或ldh的瞬時(shí)增加所證明的，這縮小了此類基于鵝膏蕈堿的adc的治療窗口。因此，仍然存在進(jìn)一步改進(jìn)耐受性并由此提高基于鵝膏蕈毒素的adc的治療指數(shù)或治療窗口的持續(xù)的醫(yī)學(xué)需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、如本技術(shù)中所示，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，通過在施用治療劑量的第二基于鵝膏蕈毒素的adc之前施用第一亞治療劑量的第一基于鵝膏蕈毒素的adc，可以進(jìn)一步降低第二基于鵝膏蕈毒素的adc的肝毒性，導(dǎo)致第二基于鵝膏蕈毒素的adc的治療指數(shù)增加。發(fā)明人另外令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，如果第一基于鵝膏蕈毒素的adc和第二基于鵝膏蕈毒素的adc確實(shí)結(jié)合不同的靶蛋白，也可以實(shí)現(xiàn)這種效果，如通過使用針對(duì)本發(fā)明方法的所述第一adc的非結(jié)合抗體所證明的。

2、因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種提高抗體-藥物綴合物的治療指數(shù)的方法，其中本發(fā)明的方法包括向患者施用第一劑量的第一抗體-藥物綴合物的步驟，其中所述第一劑量的所述第一抗體-藥物綴合物在施用第二劑量的抗體-藥物綴合物之前約30天至約15天之間施用，并且其中所述抗體-藥物綴合物具有以下結(jié)構(gòu)：

3、ab-(z-l-ama)n，

4、其中抗體或其抗原結(jié)合片段(ab)通過化學(xué)部分(z)綴合(共價(jià)連接)至接頭(l)、綴合至鵝膏蕈毒素部分(ama)，并且n為約1、2、3、4至約5、6、7、8。

5、本發(fā)明還提供了如本文公開的第一和/或第二基于鵝膏蕈毒素的adc，用于在本發(fā)明的提高所述第二基于鵝膏蕈毒素的adc的治療指數(shù)的方法中使用，其中第一基于鵝膏蕈毒素的adc和第二基于鵝膏蕈毒素的adc可以相同，或者可以彼此不同。

6、附圖描述

7、圖1各種鵝膏蕈毒素的結(jié)構(gòu)式。粗體數(shù)字(1至8)表示形成鵝膏蕈毒素的八種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)。還示出了氨基酸1、3和4中原子的標(biāo)準(zhǔn)名稱(分別為希臘字母α至γ、希臘字母α至δ和數(shù)字1’至7’)。

8、圖2(a)在有和沒有基于鵝膏蕈毒素的adc預(yù)處理的cb17-scid小鼠中的研究的實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)。(b)使用不同劑量的抗dig鵝膏蕈毒素-adc進(jìn)行3只(上圖)或5只(下圖)小鼠/組的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。描繪了在肝臟中具有肉眼可見變化的小鼠數(shù)量以及存活率；由于自溶狀態(tài)，不能檢查所有小鼠的肝臟異常。使用gehan-breslow-wiloxon檢驗(yàn)計(jì)算p值。

9、圖3重復(fù)給藥減少食蟹猴中鵝膏蕈毒素-adc誘導(dǎo)的器官損傷。(a)將鵝膏蕈毒素-adc的最大耐受劑量(mtd)的單劑量毒性(左)與作為劑量遞增方案的最后步驟給予相同劑量后發(fā)生的毒性進(jìn)行比較的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。(b)在用鵝膏蕈毒素-adc?i.v.處理后食蟹猴的血清中的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)和乳酸脫氫酶(ldh)水平，鵝膏蕈毒素-adc作為單劑量(圓形)或作為劑量遞增方案的最后步驟(三角形)給予。虛線：未經(jīng)處理的動(dòng)物的基線水平。示出了三次生物重復(fù)的平均值與sem。p值：welch?t檢驗(yàn)；*：p≤0.05。(c)比較不同輪處理后給予鵝膏蕈毒素-adc的mtd毒性的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。(d)在用鵝膏蕈毒素-adc的mtd?i.v.處理后食蟹猴的血清中的ast、alt和ldh水平，鵝膏蕈毒素-adc以第一輪(三角形)、第二輪(空心圓形)、第三輪(空心三角形)或第四輪(多邊形)處理給予。描繪了三個(gè)生物重復(fù)的平均值與sem。

10、圖4用基于鵝膏蕈毒素的抗psma?adc的重復(fù)給藥提高了s.c.lncap?cdx模型中的抗腫瘤功效。(a)在s.c.人類前列腺腺癌lncap?cdx模型中比較基于鵝膏蕈毒素的抗psmaadc的單劑量與多劑量(每周一次，持續(xù)4周，q7dx4)處理的體內(nèi)功效研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)置；(b)s.c.lncap腫瘤的腫瘤生長(zhǎng)，通過卡尺測(cè)量持續(xù)84天(n＝18只動(dòng)物/組)，三角形：?jiǎn)蝿┝刻幚?，正方形：多劑量處理，?shí)心圓形：pbs對(duì)照。示出了平均值與sd。p值：通過holm-sídák方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正的welch?t檢驗(yàn)；從第21天至第56天具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。**p<0.01；(c)用單劑量(三角形)或多劑量(正方形)的基于鵝膏蕈毒素的抗psmaadc處理的攜帶lncap?s.c.腫瘤的小鼠的存活概率；圓形：pbs對(duì)照。p值：gehan-breslow-wiloxon檢驗(yàn)；****：p<0.001。