本發(fā)明涉及一種茶葉總黃酮制備方法、測(cè)試方法及應(yīng)用，特別是一種從茶葉中分離茶葉總黃酮的生產(chǎn)工藝和方法。
背景技術(shù)：
：茶葉總黃酮是以茶的葉采用合適的提取，分離和純化手段提取制得的一類產(chǎn)品，包括黃酮和黃酮醇類的提取物，該類成分也有重要的生理作用。已有事實(shí)證明茶中的類黃酮混合物具有非常強(qiáng)的抗氧化和清除自由基殺害的活性大大高于維生素c和e。同時(shí)茶中的類黃酮物質(zhì)有維生素p的功能，能促進(jìn)人體從食物中攝取并蓄積維生素c。茶葉總黃酮具有淺黃色，可流動(dòng)的外觀，固有的香氣，味苦，可廣泛用于化妝品領(lǐng)域。其在化妝品領(lǐng)域主要作為輔料和功能性成分，主要有美白、收斂、保濕、防曬、抗皺等作用。我國(guó)是世界上最大的茶葉產(chǎn)地之一，茶葉資源十分豐富。深入開展茶葉中總黃酮的提取及其生物學(xué)活性的研究，開發(fā)出一系列具有醫(yī)療和保健作用的化妝品在人類護(hù)膚美容方面將會(huì)發(fā)揮更大的作用，不僅可以滿足愛美人士的需要而且可以創(chuàng)造出巨大的經(jīng)濟(jì)效益。申請(qǐng)?zhí)枮?00610097615.6的發(fā)明專利公開了一種總黃酮提取物的制備方法，但該種方法針對(duì)的是黃蜀葵花，而非茶葉；并且在提取步驟、提取的純度、用途等多個(gè)方面存在較大區(qū)別。在現(xiàn)有技術(shù)中未發(fā)現(xiàn)從茶葉中提取總黃酮的制備方法，并進(jìn)而將產(chǎn)物用于化妝品領(lǐng)域。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：(1)使用乙醇對(duì)茶葉進(jìn)行提??；(2)對(duì)提取液進(jìn)行預(yù)處理:將步驟(1)的乙醇溶液提取液過(guò)濾，加入明膠溶液進(jìn)行沉淀，過(guò)濾(若難以澄清，加入硅藻土處理)，濃縮干燥；(3)大孔樹脂柱洗脫:將步驟(2)處理好的過(guò)濾液用少量水溶解，用大孔樹脂拌樣加在大孔樹脂柱上，先用水洗脫，然后分別不同梯度的乙醇對(duì)大孔樹脂柱進(jìn)行洗脫；乙醇水溶液的梯度分別是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、純乙醇；(4)收集洗脫液:收集步驟(3)中自大孔樹脂柱中流出的20-60％乙醇之間的洗脫液；(5)減壓濃縮:將步驟(4)中的洗脫液合并進(jìn)行減壓濃縮，蒸干，控制溫度在40-50℃；(6)溶解:步驟(5)蒸干得到的產(chǎn)物，加乙醇溶解；(7)靜置；(8)抽濾，取濾液，洗滌沉淀；(9)濃縮干燥、研細(xì)粉，即得。(10)含量測(cè)定：對(duì)照品溶液制備：精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取20ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得(每1ml中含無(wú)水蘆丁0.2mg)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對(duì)照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分別置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亞硝酸鈉溶液1ml，搖勻，放置6分鐘，加10％硝酸鋁溶液iml，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，立即照紫外一可見分光光度法，在500nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得曲線斜率。測(cè)定方法：取本品細(xì)粉約0.2g，精密稱定，置于索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流提取至提取液無(wú)色，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去三氯甲烷，加甲醇繼續(xù)提取至無(wú)色(約4小時(shí))，提取液蒸干，殘?jiān)酉∫掖既芙?，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，作為供試品貯備液。取供試品貯備液，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5ml，置25ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取2ml，置25ml量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加水至6ml”起依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量，計(jì)算，即得。本品按干燥品計(jì)算，含總黃酮以無(wú)水蘆丁(c27h3006)計(jì)，可以達(dá)到41％。有益效果，本發(fā)明的從茶葉中分離純化高含量總黃酮的方法，主要目的是通過(guò)除去黃烷醇(兒茶素)類雜質(zhì)增加黃酮(黃酮，黃酮醇)含量。其制備工藝簡(jiǎn)單、可靠、成本低，過(guò)程中不使用有毒試劑，安全、可控。其所得總黃酮，含量高、浪費(fèi)少。成品為棕褐色粉末，具較好的流動(dòng)性，粘附較小?？勺鳛樵祥_發(fā)，用于化妝品、食品等領(lǐng)域。附圖說(shuō)明圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線圖圖2樣品含量測(cè)定圖具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1：本實(shí)施例包括以下步驟：(1)茶葉5kg置于提取罐中，加入70％乙醇，加熱提取1小時(shí)，過(guò)濾得提取液，按10：1得比例加入10％明膠溶液適量，靜置，過(guò)濾取濾液，濃縮干燥。(2)取大孔樹脂d101適量，大孔樹脂d101是一種非極性有機(jī)高聚物吸附劑預(yù)處理后濕法裝柱，95％乙醇沖洗后，水洗至無(wú)醇味，即可上樣；(3)分別以不同濃度梯度乙醇對(duì)大孔樹脂柱進(jìn)行洗脫，收集20-60％乙醇部位的洗脫液，50-60℃減壓回收蒸干。乙醇水溶液的梯度分別是:乙醇水溶液的梯度分別是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、乙醇；(4)減壓濃縮:將步驟(3)中的洗脫液合并進(jìn)行減壓濃縮，蒸干，控制溫度在40-50℃；蒸干得到的產(chǎn)物，加乙醇溶解、靜置、抽濾，取濾液，洗滌沉淀、濃縮干燥、研細(xì)粉，即得。(5)經(jīng)含量測(cè)定，總黃酮提取物中總黃酮含量為41.1％，提取物得率為8.1％。實(shí)施例2：本實(shí)施例包括以下步驟：(1)茶葉5kg置提取罐中，加入80％乙醇，加熱提取1小時(shí)，過(guò)濾得提取液，按10：1得比例加入10％明膠溶液適量，靜置，過(guò)濾取濾液，濃縮干燥。(2)取大孔樹脂d101適量，預(yù)處理后濕法裝柱，95％乙醇沖洗后，水洗至無(wú)醇味，即可上樣；(3)分別以不同濃度梯度乙醇對(duì)大孔樹脂柱進(jìn)行洗脫，收集20-60％乙醇部位的洗脫液，50-60℃減壓回收蒸干。乙醇水溶液的梯度分別是:乙醇水溶液的梯度分別是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、乙醇；(4)減壓濃縮:將步驟(3)中的洗脫液合并進(jìn)行減壓濃縮，蒸干，控制溫度在40-50℃；蒸干得到的產(chǎn)物，加乙醇溶解、靜置、抽濾，取濾液，洗滌沉淀、濃縮干燥、研細(xì)粉，即得。(5)經(jīng)含量測(cè)定，總黃酮提取物中總黃酮含量為39.3％，提取物得率為7.5％。實(shí)施例3：本實(shí)施例包括以下步驟：(1)茶葉10kg置于提取罐中，加入70％乙醇，加熱提取1小時(shí)，過(guò)濾得提取液，按10：1得比例加入10％明膠溶液適量，靜置，過(guò)濾取濾液，濃縮干燥。(2)取大孔樹脂d101適量，預(yù)處理后濕法裝柱，95％乙醇沖洗后，水洗至無(wú)醇味，即可上樣；(3)分別以不同濃度梯度乙醇對(duì)大孔樹脂柱進(jìn)行洗脫，收集20-60％乙醇部位的洗脫液，50-60℃減壓回收蒸干。乙醇水溶液的梯度分別是:乙醇水溶液的梯度分別是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、乙醇；(4)減壓濃縮:將步驟(3)中的洗脫液合并進(jìn)行減壓濃縮，蒸干，控制溫度在40-50℃；蒸干得到的產(chǎn)物，加乙醇溶解、靜置、抽濾，取濾液，洗滌沉淀、濃縮干燥、研細(xì)粉，即得。(5)經(jīng)含量測(cè)定，總黃酮提取物中總黃酮含量為38.6％，提取物得率為8.5％。實(shí)施例4：本實(shí)施例包括以下步驟：(1)茶葉5kg置于提取罐中，加入70％乙醇，加熱提取1小時(shí)，過(guò)濾得提取液，按10：1得比例加入10％明膠溶液適量，靜置，過(guò)濾取濾液，濃縮干燥。(2)取大孔樹脂d101適量，預(yù)處理后濕法裝柱，95％乙醇沖洗后，水洗至無(wú)醇味，即可上樣；(3)分別以不同濃度梯度乙醇對(duì)大孔樹脂柱進(jìn)行洗脫，收集10-60％乙醇部位的洗脫液，50-60℃減壓回收蒸干。乙醇水溶液的梯度分別是:乙醇水溶液的梯度分別是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、乙醇；(4)減壓濃縮:將步驟(3)中的洗脫液合并進(jìn)行減壓濃縮，蒸干，控制溫度在40-50℃；蒸干得到的產(chǎn)物，加乙醇溶解、靜置、抽濾，取濾液，洗滌沉淀、濃縮干燥、研細(xì)粉，即得。(5)經(jīng)含量測(cè)定，總黃酮提取物中總黃酮含量為28.7％，提取物得率為12.2％。實(shí)施例5：本實(shí)施例包括以下步驟：(1)茶葉5kg置于提取罐中，加入70％乙醇，加熱提取1小時(shí)，過(guò)濾得提取液，按10：1得比例加入10％明膠溶液適量，靜置，過(guò)濾取濾液，濃縮干燥。(2)取大孔樹脂d101適量，預(yù)處理后濕法裝柱，95％乙醇沖洗后，水洗至無(wú)醇味，即可上樣；(3)分別以不同濃度梯度乙醇對(duì)大孔樹脂柱進(jìn)行洗脫，收集20-60％乙醇部位的洗脫液，50-60℃減壓回收蒸干。乙醇水溶液的梯度分別是:乙醇水溶液的梯度分別是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、乙醇；(4)減壓濃縮:將步驟(3)中的洗脫液合并進(jìn)行減壓濃縮，蒸干，控制溫度在40-50℃；蒸干得到的產(chǎn)物，加乙醇溶解、靜置、抽濾，取濾液，洗滌沉淀、濃縮干燥、研細(xì)粉，即得。(5)對(duì)照品溶液制備：精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取20ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得(每1ml中含無(wú)水蘆丁0.2mg)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：對(duì)照樣品濃度為199.12mg/ml，純度為100％。精密量取對(duì)照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分別置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亞硝酸鈉溶液1ml，搖勻，放置6分鐘，加10％硝酸鋁溶液iml，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，立即照紫外一可見分光光度法，在500nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度(wl500.0)為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，其中，斜率為0.122371，截距為-0.00047，相關(guān)系數(shù)為0.99997。標(biāo)準(zhǔn)表樣品id類型ex濃度w_500.0權(quán)重因子注釋1＊1standard1.0000.1211.00022standard2.0000.2431.00033standard3.0000.3691.00044standard4.0000.4911.00055standard5.0000.6101.00066standard6.0000.7331.0007測(cè)定法：取本品細(xì)粉約0.2g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流提取至提取液無(wú)色，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去三氯甲烷，加甲醇繼續(xù)提取至無(wú)色(約4小時(shí))，提取液蒸干，殘?jiān)酉∫掖既芙?，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，作為供試品貯備液。取供試品貯備液，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5ml，置25ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。濾液的稀釋濃度為250倍，精密量取2ml，置25ml量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加水至6ml”起依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量，計(jì)算，即得。標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度分別為0.121、0.243、0.369、0.491、0.610、0.733。精密稱取蘆丁對(duì)照品24.89mg，茶葉提取物0.2023g和0.2011g，按照前述方法操作，繪制樣品含量測(cè)定圖(圖2)(5)經(jīng)含量測(cè)定，總黃酮提取物中總黃酮含量為41.1％，提取物得率為8.1％。當(dāng)前第1頁(yè)12