本發(fā)明涉及藥物技術領域，特別涉及一種嘧啶衍生物在制備抑制細菌群體感應系統(tǒng)的藥物中的應用。

背景技術：

抗生素的使用使人類許多嚴重的細菌感染性疾病得到有效控制，但抗生素的廣泛使用也導致了耐藥菌株的增加，降低了現(xiàn)有抗生素的抗菌效率。因此，開發(fā)新的抗生素和建立新的治療模式是及其必要的。目前認為，最有前景的治療策略應是不致死病原菌細胞而僅削弱病原菌的致病毒性，該策略不威脅病原菌自身的生存而不會引起耐藥性問題。近來的研究發(fā)現(xiàn)，病原菌的致病性是由一種密度依賴的群體感應系統(tǒng)(qs)調控，群體感應系統(tǒng)通過介導致病基因的表達以實現(xiàn)其致病性。當致病菌密度達到一定程度時，致病菌自身合成、釋放某種信號分子，能夠啟動相關基因的表達，調控致病菌的多種生物行為，諸如生物發(fā)光、產(chǎn)生毒素、形成生物膜、產(chǎn)生抗生素等等。

鑒于上述描述，亟待發(fā)現(xiàn)一種能夠在不抑制致病菌生長的前提下，減弱致病菌毒性的物質被制備成藥物，用于治療細菌感染性疾病，避免耐藥菌株的增加。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種嘧啶衍生物在制備抑制細菌群體感應系統(tǒng)的藥物中的應用。

為了實現(xiàn)如本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種嘧啶衍生物在制備抑制細菌群體感應系統(tǒng)的藥物中的應用，其特征在于，所述嘧啶衍生物的化學名稱為[(5r，7r)-7-(4-苯酰氧基)-5-(2-氯苯基)-4,5,6,7-四氫化-[1,2]三唑[1,5-a]嘧啶，結構式如下：

優(yōu)選的是，嘧啶衍生物在制備抑制細菌群體感應信號分子的藥物中的應用。

優(yōu)選的是，嘧啶衍生物在制備降低細菌生物被膜形成的藥物中的應用。

優(yōu)選的是，嘧啶衍生物在制備降低細菌毒力因子致病性的藥物中的應用。

優(yōu)選的是，所述細菌毒力因子為彈性蛋白酶、溶血素或外毒素a。

優(yōu)選的是，嘧啶衍生物在制備降低細菌群集運動能力的藥物中的應用。

優(yōu)選的是，所述細菌為銅綠假單胞菌。

優(yōu)選的是，所述嘧啶衍生物的最低有效抑制濃度為47.4μm。

本發(fā)明中，嘧啶衍生物為有效成分可以直接使用，為了方便給藥，可以加入藥學上可接受的常規(guī)輔料，通過常規(guī)制藥方法制成片劑、膠囊劑、注射劑、散劑、顆粒劑。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

本發(fā)明選取lasr蛋白作為靶蛋白，進行虛擬篩選得到了得分較高的嘧啶衍生物，并應用嘧啶衍生物對銅綠假單胞菌進行生物活性評價。實驗證明嘧啶衍生物對lasr相關的三種基因lasr、lasb、lasi在菌種中均表現(xiàn)下調。說明本次篩選結果中得分較高的嘧啶衍生物與靶蛋白作用，對下游相關基因的表達產(chǎn)生了抑制作用。即嘧啶衍生物通過抑制群體感應信號分子，最終降低細菌的生物被膜的形成、有效抑制毒力因子的致病性和細菌的群體效應。計算機虛擬篩選作為高效、低成本的一種化合物篩選手段，將該技術應用于群體感應藥物的研究具有可行性。

本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述的嘧啶衍生物對質控菌株及臨床分離菌株(孔慶翔菌株)的毒力基因表達影響；

圖2為本發(fā)明所述的嘧啶衍生物的加入對質控菌株及臨床分離株的生物被膜影響；

圖3為本發(fā)明所述的嘧啶衍生物的加入對質控菌株及臨床分離株的彈性蛋白酶影響。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。

應當理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術語并不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。

嘧啶衍生物的性質如下表1所示：

實施例1

一種嘧啶衍生物在制備抑制細菌群體感應系統(tǒng)的藥物中的應用。

嘧啶衍生物在制備抑制細菌群體感應信號分子的藥物中的應用。

嘧啶衍生物在制備降低細菌群集運動能力的藥物中的應用。

1.1材料

計算機，生物數(shù)據(jù)庫(ncbi，pdb等軟件):openbabel；mgltoolsautodockvina軟件；discoverystudioviewer3.5等；lasr蛋白數(shù)據(jù)來自蛋白晶體數(shù)據(jù)庫http://www.pdb.org/pdb/home/home.do(pdbid:2uvo)；供虛擬篩選的數(shù)據(jù)庫為zinc數(shù)據(jù)庫(https://zinc.docking.org/)

菌株：pa質控菌株(atcc27853)(開灤總醫(yī)院微生物實驗室保存)；pa臨床分離株(使用細菌鑒定及藥敏測定儀對臨床分離菌株進行重新鑒定。選取開灤總醫(yī)院某患者pa臨床分離株分純培養(yǎng)用于本研究)。

1.2培養(yǎng)基

lb液體培養(yǎng)基:蛋白胨1％，酵母粉0.5％，nacl1％，ph7.0。

swarming培養(yǎng)基:8.6mmnacl0.2492g，20mmnh4cl0.525g，22mmkh2po41.496g，12mmna2hpo4·7h2o2.149g，0.4％瓊脂糖瓊脂粉2.0g,11mm葡萄糖1.98g，0.5％酸水解干酪素2.5g，1mmmgso4·7h2o0.123g，1mmcacl20.0735g。

1.3試劑

zinc01130988(stk135354)購自vitas-mlaboratory

1.4方法

1.4.1群體感應活性物質的虛擬篩選

從蛋白晶體數(shù)據(jù)庫http://www.pdb.org/pdb/home/home.do(pdbid:2uvo)中檢索lasr蛋白數(shù)據(jù)，從zinc數(shù)據(jù)庫(https://zinc.docking.org/)(截止到2015年5月，已收錄的全部化合物超過3.5千萬個)中，利用計算機分子對接技術通過autodockvina軟件將每個處理好的zinc數(shù)據(jù)庫中的化合物與lasr的活性中心進行對接，篩選與lasr蛋白具有高親和力的化合物。選取購買得分較高的化合物進行活性檢測。

1.4.2rt-qpcr檢測嘧啶衍生物對qs調控相關基因(lasr、lasi、lasb)表達的影響

1.4.2.1pa質控菌株及臨床分離菌株cdna準備

采用倍比稀釋的方法確定嘧啶衍生物在400μm-6400μm濃度范圍內不影響銅綠假單胞菌生長，分別配置400umμm的嘧啶衍生物的lb培養(yǎng)基，將400μm嘧啶衍生物放入0.5麥氏濁度的pa標準菌株及臨床分離菌株的5mllb培養(yǎng)基中，并設置空白對照組，將復蘇好的銅綠假單胞菌質控菌株和臨床分離株分別調整至0.5麥氏比濁標準，經(jīng)lb肉湯1:1000稀釋后，吸取100ul至含有4種化合物的lb培養(yǎng)基中，同時吸取100ul至不含有4種化合物的lb培養(yǎng)基中，37度，220rpm培養(yǎng)至對數(shù)期。菌液收集并處理提取8種總rna并反轉錄成cdna。

1.4.2.2rt-pcr檢測嘧啶衍生物對qs調控相關基因(lasr、lasi、lasb)表達

由生物公司設計引物(做溶解曲線，以驗證引物的特異性)，參見下表1或核苷酸序列如seqidno.1-8所示，

擴增lasr、lasi、lasb目的基因(核苷酸序列如seqidno.9、seqidno.10和seqidno.11所示)，并將b-actin作為內參基因(核苷酸序列如seqidno.12所示)，將cdna進行適當稀釋，進行梯度qpcr檢測。操作體系：rnasefreedh209.5ul，cdna/dna1ul，上下游引物各1ul，2xgoldstartaqmastermix12.5ul。

反應程序，三步法：預變性95℃，3min；變性95℃，10s；退火55-60℃，30s；延伸72℃，30s，共40個循環(huán)；終延伸72℃，10min。

表2.引物序列

1.5rt-pcr檢測嘧啶衍生物對qs調控相關基因表達的影響

嘧啶衍生物減少了pa質控菌株及臨床分離株的lasr、lasi、lasb基因的表達，結果見圖1a和圖1b。

實施例2

嘧啶衍生物在制備降低細菌生物被膜形成的藥物中的應用。

2.1銅綠假單胞菌生物被膜活性檢測

分別挑取質控菌株和銅綠假單胞菌臨床分離株于新鮮的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，150rpm搖床過夜培養(yǎng)；用新鮮lb液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液以1：100比例稀釋，培養(yǎng)1h。將每種菌液分裝5組，每組三個平行；向其中加入終濃度為0、300μm的300μm的嘧啶衍生物。分裝入96孔板，每個孔150μl，于37℃靜置下培養(yǎng)20h；使用移液器輕輕吸出菌液，注意不要是槍頭碰到孔底與孔壁，使用pbs緩沖液輕輕洗滌96孔板2次，風干；每孔加入150μl的0.1％結晶紫溶液染色15min，再加入150μl的pbs緩沖液輕輕洗滌3次，風干；加入10μl33％的冰乙酸溶解，a595測定其吸收值。

2.2嘧啶衍生物對pa生物被膜的影響

嘧啶衍生物減少了pa菌株的生物被膜的產(chǎn)生，結果見圖2a和圖2b。

實施例3

嘧啶衍生物在制備降低細菌毒力因子致病性的藥物中的應用；所述細菌毒力因子為彈

性蛋白酶、溶血素或外毒素a。

3嘧啶衍生物對銅綠假單胞菌毒力因子影響檢測

3.1對銅綠假單胞菌彈性蛋白酶活性檢測

分別挑取質控菌株和銅綠假單胞菌臨床分離株于新鮮的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，150rpm搖床過夜培養(yǎng)；用新鮮lb液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液以1：100比例稀釋后，將每種菌液分裝5組，每組3個平行，向其中加入終濃度為0、400μm的嘧啶衍生物，37℃、150rpm搖床培養(yǎng)12h；吸取1ml菌體，4℃、12000rpm離心15min，小心吸取200μl上清液于2mleppendorf管中；加入800μl反應緩沖液以及3mg剛果紅底物，30℃恒溫振蕩反應10h；加入11mm葡萄糖0.9911g，4℃、12000rpm離心15min，除去未反應的剛果紅底物；吸取10μl上清液，酶標儀檢測其在490nm處吸光度。

3.2嘧啶衍生物對pa彈性蛋白酶影響

嘧啶衍生物減少了pa菌株的彈性蛋白酶的產(chǎn)生，結果見圖3a和圖3b。

實施例4

采用與實施例1-3對應的實驗方法，將嘧啶衍生物的濃度進行調整，檢測在各個應用中的最低有效濃度，檢測結果見下表3、4、5和6：

表3：c對lasb基因表達影響

表4：c對lasi基因表達影響

表5：c對lasr基因表達影響

表6：c對pa毒力因子表達影響

群體感應系統(tǒng)在多種細菌中普遍存在，系統(tǒng)間呈級聯(lián)調控，銅綠假單胞菌的致病性和耐藥性受到群體感應系統(tǒng)的影響。當細菌數(shù)量到一定程度，首先激發(fā)las系統(tǒng)的啟動，3-oxo-c12-hsl與lasr結合形成復合物，進而引起諸如彈性蛋白酶、溶血素、外毒素a等多種毒力因子基因的表達，并對rhl系統(tǒng)pqs系統(tǒng)進行正向調節(jié)。鑒于lasr系統(tǒng)的重要性，本發(fā)明選取lasr蛋白作為靶蛋白，進行虛擬篩選得到了34種得分較高的化合物，購買嘧啶衍生物對銅綠假單胞菌進行生物活性評價。

本發(fā)明用實時熒光定量pcr這一分子研究中的重要工具，對銅綠假單胞菌質控菌株及臨床分離株在分別加入兩種目標化合物的前后進行l(wèi)asr系統(tǒng)相關基因進行轉錄水平的活性比較，所加入的化合物濃度都在不影響細菌正常生長的濃度范圍內進行。與空白相比，加入嘧啶衍生物對lasr相關的三種基因lasr、lasb、lasi在兩株菌種均表現(xiàn)下調。說明本次篩選結果中得分較高的化合物，與靶蛋白作用，對下游相關基因的表達產(chǎn)生了抑制作用。計算機虛擬篩選作為高效、低成本的一種化合物篩選手段，可作為初篩為我們設計研發(fā)藥物提供方便。

銅綠假單胞菌有超過10％的基因調節(jié)與其群體感應系統(tǒng)有關，這一系統(tǒng)能夠調控銅綠假單胞菌毒力因子的產(chǎn)生而目前尚未發(fā)現(xiàn)對人體有任何影響。因此，通過對信號分子的化學修飾、天然產(chǎn)物中分離篩選、高通量篩選等多種途徑研發(fā)群體感應活性藥物可作為抗菌新策略應用于人體。計算機虛擬篩選具有低成本、高效的優(yōu)點，將該技術應用于群體感應藥物的研究具有可行性。

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。

<110>華北理工大學基礎醫(yī)學院

<120>c化合物在制備抑制細菌群體感應系統(tǒng)的抑制劑中的應用

<160>12

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