本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖
技術(shù)領(lǐng)域：
，進(jìn)一步涉及針對(duì)魚類的免疫調(diào)節(jié)技術(shù)，具體涉及一種用于石斑魚的當(dāng)歸多糖免疫增強(qiáng)劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：石斑魚(epinephelussp.)肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，為名貴的海水魚。隨著養(yǎng)殖密度的不斷擴(kuò)大，石斑魚健康水平和抗病能力顯著下降，病害頻發(fā)。而抗生素和化學(xué)消毒劑不僅增加致病病原菌的耐藥性，而且造成藥物污染水體，破壞生態(tài)環(huán)境。更嚴(yán)重的是，抗生素和化學(xué)消毒劑在魚體內(nèi)富集，危害人類健康。當(dāng)歸作為中國傳統(tǒng)中草藥，入藥首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，治療疾病已有2000年歷史，其藥用部位主要是當(dāng)歸的根。當(dāng)歸具有活血、補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止痛等作用。隨著現(xiàn)代分離技術(shù)和儀器的進(jìn)步，當(dāng)歸的多種成分被分離出來，其中當(dāng)歸多糖(angelicasinensispolysaccharide，asp)是當(dāng)歸的主要有效成分之一。近年國內(nèi)外學(xué)者對(duì)當(dāng)歸多糖進(jìn)行的大量研究表明：當(dāng)歸多糖是一種大分子物質(zhì)，可作為一種免疫增強(qiáng)劑，可以調(diào)節(jié)陸生高等動(dòng)物的免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，具有抗腫瘤、抗輻射、抗氧化和鎮(zhèn)痛等藥理學(xué)作用。然而當(dāng)歸多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫力的影響研究很少，如何利用當(dāng)歸多糖調(diào)節(jié)水產(chǎn)動(dòng)物免疫力，還缺乏技術(shù)支持。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種用于石斑魚的當(dāng)歸多糖免疫增強(qiáng)劑，以解決現(xiàn)有技術(shù)的石斑魚養(yǎng)殖過程中，缺乏一種針對(duì)石斑魚的免疫促進(jìn)手段的技術(shù)問題。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是常規(guī)的石斑魚抗病治療藥物若長期使用可能產(chǎn)生耐藥性。本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是常規(guī)的石斑魚抗病治療藥物可能在石斑魚體內(nèi)富集，進(jìn)而影響人類的食用健康。本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是當(dāng)采用當(dāng)歸多糖對(duì)石斑魚進(jìn)行免疫干預(yù)時(shí)，缺乏一種有效的使用手段。為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種用于石斑魚的當(dāng)歸多糖免疫增強(qiáng)劑，包括當(dāng)歸粗多糖和脫蛋白當(dāng)歸多糖。作為優(yōu)選，所述當(dāng)歸粗多糖的注射劑量為37.5～300mg/kg魚體重。作為優(yōu)選，所述脫蛋白當(dāng)歸多糖的注射劑量為120～180mg/kg魚體重。同時(shí)，本發(fā)明提供了上述當(dāng)歸多糖免疫增強(qiáng)劑用于制備石斑魚免疫促進(jìn)藥物的應(yīng)用。作為優(yōu)選，所述藥物是注射劑。作為優(yōu)選，所述注射劑中當(dāng)歸粗多糖的用量為37.5～300mg/kg魚體重，所述注射劑中脫蛋白當(dāng)歸多糖的用量為120～180mg/kg魚體重。作為優(yōu)選，所述藥物是提高石斑魚白細(xì)胞吞噬活力的藥物。作為優(yōu)選，所述藥物是提高石斑魚血漿溶菌酶活力的藥物。作為優(yōu)選，所述藥物是提高石斑魚血漿中白蛋白/球蛋白比值的藥物。同時(shí)，本發(fā)明提供了上述當(dāng)歸多糖免疫增強(qiáng)劑用于預(yù)防石斑魚感染遲緩愛德華氏菌的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種用于石斑魚的當(dāng)歸多糖免疫增強(qiáng)劑及其應(yīng)用，該技術(shù)方案以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)研究了當(dāng)歸多糖對(duì)石斑魚的免疫干預(yù)作用，在此基礎(chǔ)上明確了以當(dāng)歸粗多糖和脫蛋白當(dāng)歸多糖為核心成分的免疫增強(qiáng)劑配方，并進(jìn)一步研究了二者的有效劑量及其藥理作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以casp(當(dāng)歸粗多糖)劑量為37.5～300mg/kg魚體重、asp(脫蛋白當(dāng)歸多糖)劑量為120～180mg/kg魚體重對(duì)石斑魚執(zhí)行腹腔注射后，在3～14d內(nèi)其血紅蛋白含量，nbt陽性細(xì)胞數(shù)，血漿溶菌酶活力、白蛋白/球蛋白(a/g)、血漿sod超氧化物歧化酶(sod)活力和過氧化氫酶(cat)活力顯著升高；血漿丙二醛(mda)含量顯著降低；白細(xì)胞增殖、吞噬和呼吸爆發(fā)活力顯著提高，并顯著降低感染遲緩愛德華氏菌石斑魚的累積死亡率。基于以上有益的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明確定了以當(dāng)歸粗多糖、脫蛋白當(dāng)歸多糖復(fù)合物作為石斑魚免疫促進(jìn)藥物的應(yīng)用，可在調(diào)節(jié)石斑魚的非特異性免疫力的基礎(chǔ)上有效提升其抗病性能。本發(fā)明基于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)手段獲得了有益的技術(shù)效果，同時(shí)成本較低、易于實(shí)現(xiàn)，因此具有良好的推廣前景。附圖說明圖1是casp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血液nbt陽性細(xì)胞的影響圖。圖2是asp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血液nbt陽性細(xì)胞數(shù)的影響圖。圖3是casp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血液血紅蛋白含量的影響圖。圖4是asp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血液血紅蛋白含量的影響圖。圖5是casp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血漿lzm活力的影響圖。圖6是asp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血漿lzm活力的影響圖。圖7是casp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血漿a/g的影響圖。圖8是asp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血漿a/g的影響圖。圖9是casp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血漿t-sod活力的影響圖。圖10是asp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血漿t-sod活力的影響圖。圖11是casp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血漿cat活力的影響圖。圖12是asp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血漿cat活力的影響圖。圖13是casp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血漿mda含量的影響圖。圖14是asp對(duì)點(diǎn)帶石斑魚血漿mda含量的影響圖。圖15是casp對(duì)頭腎白細(xì)胞增殖的影響圖。圖16是csap對(duì)頭腎白細(xì)胞的吞噬活力的影響圖。圖17是casp對(duì)頭腎白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力的影響圖。圖18是注射casp14天后，每尾注射100μl遲鈍愛德華菌(1.4×108cfu/ml)，點(diǎn)帶石斑魚的累積死亡率比較圖。圖19是注射asp14天后，每尾注射100μl遲鈍愛德華菌(1.4×108cfu/ml)，點(diǎn)帶石斑魚的累積死亡率比較圖。具體實(shí)施方式以下將對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。在以下實(shí)施例中，所用到的當(dāng)歸粗多糖(crudeangelicasinensispolysaccharide,casp)，可以是利用乙醇沉淀法提取得到的；所用到的去蛋白當(dāng)歸多糖(angelicasinensispolysaccharide，asp)，可以是利用seveg法去除當(dāng)歸多糖中的蛋白質(zhì)而得到的。1、當(dāng)歸粗多糖(casp)的制備提取方法i：將風(fēng)干后的當(dāng)歸加蒸餾水，料液比為1:30，煮沸30min，過濾，向水煮液中加無水乙醇，使乙醇在混合液中的濃度為80％，攪拌均勻，4℃靜置6h，4000r/min離心10min。提取方法ii：將新鮮當(dāng)歸自然風(fēng)干并處理成小片，用體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇溶液浸泡一周，料液比為1：10，浸泡并不時(shí)攪動(dòng)。醇提后殘?jiān)扔盟蠓?0min，料液比為1:30，上清液中加入無水乙醇使乙醇終濃度至80％，攪拌均勻后4℃冷藏靜置6h后離心(4000r/min，10min)。提取方法iii：將自然風(fēng)干后的新鮮當(dāng)歸處理成小塊狀，用78％的乙醇浸泡一周，料液比為1：10，要經(jīng)常攪拌，浸泡好后用76％的乙醇進(jìn)行滲漉，直到滲出液無色為止，將滲漉后的當(dāng)歸用蒸餾水煮沸30min，料液比為1:30，水煮后得到的提取液加入無水乙醇使乙醇終濃度至80％，攪拌，4℃冷藏靜置后離心(4000r/min，10min)。以上三種提取方法制備的沉淀，均反復(fù)用95％的乙醇脫色，直到上清液無色，沉淀冷凍干燥后均為casp。2.脫蛋白當(dāng)歸多糖(asp)的制備以上方法制備的當(dāng)歸粗多糖(casp)加三蒸水溶解(濃度為2mg/ml)，采用sevag法脫蛋白：當(dāng)歸多糖粗提物溶液中按體積比為3:1加入sevag試劑，放在磁力攪拌器上攪拌45min后離心(4000r/min，10min)。離心后溶液分為三層，上層為多糖溶液，中層為蛋白質(zhì)凝膠層，底層為有機(jī)溶劑。取上層多糖溶液重復(fù)上述步驟，直到蛋白質(zhì)凝膠層消失。多糖溶液在280nm波長附近無特征吸收峰，說明多糖中的蛋白質(zhì)已經(jīng)去除。將脫蛋白后的多糖溶液移到處理好的透析袋中，放入三蒸水中透析3-4d。透析過程中，要注意勤換水。透析好的多糖溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后冷凍干燥得到當(dāng)歸多糖(angelicasinensispolysaccharide，asp)。3、腹腔注射當(dāng)歸多糖對(duì)石斑魚體液非特異性免疫指標(biāo)的影響選取選取規(guī)格一致、活潑健康的石斑魚，體質(zhì)量50～80g。分組(每組4個(gè)箱子，每個(gè)箱子45尾魚)，分別注射casp或asp，注射劑量分別為37.5mg/kg、75mg/kg、150mg/kg和300mg/kg魚體重，對(duì)照組注射無菌生理鹽水。注射前以及注射后第3、7、14、21、28d取樣(取樣前停食1d)，可以檢測到注射casp或asp顯著增加石斑魚血液血紅蛋白含量，nbt陽性細(xì)胞數(shù)量，血漿溶菌酶活力、a/g、sod活力和cat活力、mda含量，結(jié)果如說明書附圖1-14所示。注射casp還可以增強(qiáng)石斑魚白細(xì)胞的增殖、吞噬和呼吸爆發(fā)活力，結(jié)果如說明書附圖15-17所示。4、腹腔注射當(dāng)歸多糖對(duì)石斑魚體抗愛德華氏菌能力的影響石斑魚注射casp或asp14d后，用遲緩愛德華氏菌(edwardsiellatarda)進(jìn)行攻毒，菌體濃度度1.4×108cfu/ml，每尾魚注射100μl遲緩愛德華氏菌液。每天喂食2次，每天觀察魚的死亡情況并記錄死亡數(shù)，連續(xù)觀察7d，以計(jì)算累積死亡率，計(jì)算公式為：第n天的累積死亡率(％)＝n天總共死亡的魚數(shù)目÷攻毒魚總數(shù)目×100。未注射多糖的石斑魚，累計(jì)死亡率在攻毒第2天即達(dá)到80％，第4天接近100％，而注射casp的石斑魚，攻毒4d內(nèi)累計(jì)死亡率低于20％，5天內(nèi)低于40％。注射asp的石斑魚，攻毒后2d內(nèi)死亡率低于60％，3d低于80％。具體結(jié)果如說明書附圖18、19所示。以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。應(yīng)用實(shí)例1：在石斑魚疾病易發(fā)季節(jié)，選2池體重為20-30g/尾的石斑魚幼魚。用無菌生理鹽水將當(dāng)歸粗多糖配成26mg/ml。1號(hào)池每尾魚腹腔注射當(dāng)歸粗多糖0.2ml，2號(hào)池每尾魚腹腔注射無菌生理鹽水0.2ml。每天記錄每池石斑魚發(fā)病和死亡情況，連續(xù)飼養(yǎng)30天。結(jié)果表明，腹腔注射當(dāng)歸粗多糖能顯著降低石斑魚的發(fā)病率和死亡率(表1)。表1當(dāng)歸粗多糖腹腔注射試驗(yàn)結(jié)果池號(hào)注射藥物開始魚數(shù)發(fā)病魚數(shù)死亡魚數(shù)發(fā)病率％死亡率％1#當(dāng)歸粗多糖247684733834.213.72#生理鹽水24821433108357.743.6應(yīng)用實(shí)例2：在石斑魚疾病易發(fā)季節(jié)，選2池體重為45-65g/尾的石斑魚幼魚。用無菌生理鹽水將脫蛋白當(dāng)歸多糖配成45mg/ml。1號(hào)池每尾魚腹腔注射當(dāng)歸粗多糖0.2ml，2號(hào)池每尾魚腹腔注射無菌生理鹽水0.2ml。每天記錄每池石斑魚發(fā)病和死亡情況，連續(xù)飼養(yǎng)30天。結(jié)果表明，腹腔注射脫蛋白當(dāng)歸多糖能顯著降低石斑魚的發(fā)病率和死亡率(表2)。表2脫蛋白當(dāng)歸多糖腹腔注射試驗(yàn)結(jié)果當(dāng)前第1頁12