本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種負(fù)載替莫唑胺的靶向納米粒及其制備方法，尤其涉及一種以樹枝狀聚合物作為載體的靶向納米粒子及其制備方法。
背景技術(shù)：
：黑素瘤是由異常黑素細(xì)胞過度增生引發(fā)的皮膚腫瘤，惡性程度極高，預(yù)后較差，其病死率占皮膚腫瘤死亡病例的80％左右。近年來發(fā)病率不斷增加，年增長率為3～5％，且具有年輕化的趨勢(siegelrl,millerkd,jemala.cancerstatistics,2016.cacancerjclin.2016,66(1):7-30.)。臨床上治療黑素瘤常用的化療藥物有達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺(tmz)、鉑類、紫杉醇、福莫司汀等，然而療效并不令人滿意。其中，占主導(dǎo)地位的達(dá)卡巴嗪有效率僅為7.5％～12.2％，患者中位生存期5～6月(gogashj,kirkwoodjm,sondakvk.chemotherapyformetastaticmelanoma.cancer.2007,109(3):455-464.)。替莫唑胺是一種新型的第2代口服烷化劑，因其可口服，生物利用度高，能透過血腦屏障，對腦轉(zhuǎn)移有治療和預(yù)防作用，被很多國家推薦用于黑素瘤一線治療(agarwalass,kirkwoodjm.temozolomide,anovelalkylatingagentwithactivityinthecentralnervoussystem,mayimprovethetreatmentofadvancedmetastaticmelanoma.theoncologist.2000,5(2):144-151.)。tmz通過dna鏈甲基化，引起dna單鏈或雙鏈斷裂，阻斷dna復(fù)制，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。然而，同其它化療藥物一樣，tmz的療效有限，且由于缺少靶向性，tmz在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時對其他非腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用，引起毒副作用。藥代動力學(xué)顯示口服tmz后血漿藥物濃度于1h內(nèi)達(dá)峰，之后消除迅速，平均半衰期為1.8h。tmz在生理環(huán)境下很容易降解，在腫瘤部位的酸性環(huán)境中反而較穩(wěn)定(鄭蓉,蔣德錫,廖心丹，等.溫度及ph對替莫唑胺溶液穩(wěn)定性的影響.華西藥學(xué)雜志.2012,(05):550-551.)。此外，tmz作用機(jī)制會啟動細(xì)胞內(nèi)修復(fù)機(jī)制，上調(diào)o6-甲基鳥嘌呤-dna-甲基轉(zhuǎn)移酶(mgmt)基因表達(dá)，后者通過自身活性中心的半胱氨酸殘基與o6-甲基鳥嘌呤上的烷基基團(tuán)共價結(jié)合并將其移除，從而使損傷的dna修復(fù)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對tmz耐藥(bradburypa,middletonmr.dnarepairpathwaysindrugresistanceinmelanoma.anti-cancerdrugs.2004,15(5):421-426.)。因此，如何提高tmz的穩(wěn)定性和敏感性，增強(qiáng)其靶向性從而降低其副作用是目前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，也是提高黑素瘤整體療效的關(guān)鍵。近年來，納米技術(shù)在腫瘤的診斷和治療上的研究發(fā)展快速，越來越多的研究人員將研究焦點(diǎn)放于納米技術(shù)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用上，利用納米粒獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)為惡性腫瘤的診斷和治療提供新的策略和手段。目前研究較多的用作藥物載體的納米材料有脂質(zhì)體、聚合物膠束、樹枝狀聚合物、二氧化硅、金納米粒等，其中聚酰胺-胺(polyamidoamine,pamam)是一種人工合成的納米級大分子化合物。tomalia等(tomaliad,bakerh,dewaldj,etal.anewclassofpolymers:starburst-dendritic.polymerjournal.1985,17(1):117-132.)首次研究的樹枝狀高分子pamam，是以乙二胺為核，通過michael加成反應(yīng)和對酯基的酰胺化反應(yīng)這兩個重復(fù)的步驟合成的。但是pamam表面的正電荷對細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性和溶血毒性(imaet,hamaguchis.networkofsodiumhyaluronatewithnano-knotsjunctionofpoly(amidoamine)dendrimer[j].carbohydratepolymers.2012,88(1):352-360.)，因此需要進(jìn)一步修飾才能更好的發(fā)揮作用。kim等(kimt,seohj,choijs,etal.pamam-peg-pamam:noveltriblockcopolymerasabiocompatibleandefficientgenedeliverycarrier.biomacromolecules.2004,5(6):2487-2492.)用peg修飾pamam來降低其正電荷毒性，細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)證明修飾peg后的pamam毒性明顯降低。然而，peg的存在會導(dǎo)致納米粒的粒徑急劇增大(jiangg,lir,tangj,etal.formulationoftemozolomide-loadednanoparticlesandtheirtargetingpotentialtomelanomacells.oncologyreports,2016.)，影響納米載體的被動靶向性和腫瘤滲透性。另外，經(jīng)peg修飾后的載體會在一定程度上降低藥物的釋放，且對pamam本身的酸敏感性及質(zhì)子海綿效應(yīng)造成一定的影響，這將降低藥物的抗腫瘤效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種毒性小、抗腫瘤效果顯著的、以樹枝狀聚合物作為載體的靶向納米粒子及其制備方法。為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究并不懈努力，最終獲得了如下技術(shù)方案：一種pamam靶向納米給藥載體，該靶向納米給藥載體的通式為ha-pamam-cooh，其中ha為透明質(zhì)酸，pamam為樹枝狀聚合物；cooh為羧基。另一方面，本發(fā)明還提供了一種負(fù)載替莫唑胺的靶向納米粒，該靶向納米粒的通式為ha-pamam-cooh-tmz，其中ha為透明質(zhì)酸，pamam為樹枝狀聚合物；cooh為羧基，tmz為替莫唑胺。進(jìn)一步優(yōu)選地，如上所述負(fù)載替莫唑胺的靶向納米粒，其中的樹枝狀聚合物為以乙二胺為核的第1-10代聚酰胺-胺樹狀大分子。再進(jìn)一步優(yōu)選地，所述負(fù)載替莫唑胺的靶向納米粒，其中的樹枝狀聚合物為以乙二胺為核的第4-6代聚酰胺-胺樹狀大分子。再進(jìn)一步優(yōu)選地，所述負(fù)載替莫唑胺的靶向納米粒，其中的樹枝狀聚合物為以乙二胺為核的第5代聚酰胺-胺樹狀大分子。再一方面，本發(fā)明還提供了一種上述負(fù)載替莫唑胺的靶向納米粒的制備方法，該方法包括如下2個步驟：(1)pamam-cooh的合成；該步驟可以采用現(xiàn)有的常規(guī)方法；(2)ha-pamam-cooh-tmz的合成：將pamam-cooh與tmz共溶于去離子水中，得到a液；將tmz與ha共溶于去離子水中，得到b液；b液置于功率為150-300w的探頭超聲下，一邊超聲一邊將a液緩慢加到b液中，超聲5-20min后，將超聲后得到的液體超濾，超濾后用去離子水洗1-4次，凍干，得到負(fù)載替莫唑胺的靶向納米粒ha-pamam-cooh-tmz。進(jìn)一步優(yōu)選地，如上所述負(fù)載替莫唑胺的靶向納米粒的制備方法，其中步驟(1)pamam-cooh的合成步驟為：將pamam溶解于甲醇中，旋干，并加入無水dmso重新溶解，形成反應(yīng)體系；取丁二酸酐溶于無水dmso中，滴加入反應(yīng)體系內(nèi)，室溫攪拌12-24h，使用mw＝3000-4000da的透析袋透析2-4天后，冷凍干燥，得到產(chǎn)物pamam-cooh。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用聚酰胺-胺樹狀大分子作為載體，使用丁二酸酐來對pamam進(jìn)行修飾，將pamam表面的大部分氨基變?yōu)楦影踩聂然瑥亩档推涠拘?。紅外光譜和核磁氫譜結(jié)果顯示，pamam表面的氨基成功地被羧基取代，取代率為67％，降低了pamam的正電荷毒性，dls結(jié)果顯示納米載體的zeta電位由40.1mv變?yōu)?2.3mv，而其粒徑大小并沒有發(fā)生明顯的變化。為了進(jìn)一步減少納米載體表面的正電荷，同時提高其穩(wěn)定性和藥物包封的效率，我們將ha包裹在載體表面。dls和tem結(jié)果表明，ha包封的載體大小均勻，呈單分散狀態(tài)，zeta電位進(jìn)一步減小，變?yōu)?6.4mv。紫外吸收法測得tmz的包封率為44.91％，顯著高于現(xiàn)有技術(shù)報道的20.87％和10％。釋藥曲線可以看出，在ph＝7.4和ph＝5.0的模擬液中，72h時tmz釋放率分別約為32％和27％，包封在內(nèi)部的藥物釋放較緩慢，可以長時間緩釋藥物，維持體內(nèi)血藥濃度穩(wěn)定，減少給藥次數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)光熱治療不僅能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還能夠抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，增加化療藥物敏感性等。因此將本發(fā)明的化療與現(xiàn)有的熱療結(jié)合起來能夠增強(qiáng)對腫瘤的殺傷能力；此外熱療產(chǎn)生的過高熱還能夠引起載藥納米粒中藥物的釋放，從而起到“控釋”的作用，使腫瘤局部藥物濃度瞬間增大，提高抗腫瘤能力。為了檢驗(yàn)合成的載藥納米粒對人黑素瘤a375細(xì)胞的殺傷能力，我們進(jìn)行了cck-8實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示本發(fā)明的hpct組與control組相比，細(xì)胞活力有顯著下降(p<0.05)，說明tmz可以被有效釋放出來發(fā)揮抗黑素瘤作用，與游離的tmz相比其細(xì)胞毒性明顯減弱，表明使用納米載體負(fù)載tmz能夠提高其穩(wěn)定性，減少其毒副作用。納米藥物的安全性問題制約著其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。為了進(jìn)一步評估本發(fā)明的納米藥物治療對機(jī)體的影響，我們進(jìn)行了血生化和重要器官(心、肝、脾、肺、腎)病理檢查。結(jié)果顯示谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、肌酐、尿素氮、尿酸、磷酸肌酸同工酶的值在正常范圍內(nèi)，各器官均未見明顯損傷，該結(jié)果表明載藥納米粒能有效治療黑素瘤，且對荷瘤小鼠無系統(tǒng)毒性。附圖說明圖1為pc納米粒合成和鑒定結(jié)果圖。a：載藥納米粒的合成過程；b:pamam和pc的1hnmr圖譜；c:pamam、pc和hpc的紅外光譜圖。圖2為pamam、pc、hpct納米粒的表征結(jié)果圖。dls測定pamam(a)、pc(b)、hpct(c)的水合粒徑和zeta電位；hpct的透射電鏡照片(d)。圖3為tmz的含量測定結(jié)果圖。a:tmz和mtic的紫外吸收光譜；b:tmz的標(biāo)準(zhǔn)曲線；c：mtic的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為hpct在不同條件下的釋藥曲線結(jié)果圖。圖5為各組對黑素瘤治療后腫瘤剝離的照片。圖6為治療后各組腫瘤生長曲線圖。系列1：control組；系列2：tmz組；系列3：hpct組。圖7為normal組和hpct治療組各臟器的組織切片(200×)。a：normal；b：hpct。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。另外，實(shí)施例中未注明具體技術(shù)操作步驟或條件者，均按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1：pamam-cooh的合成及表征pamam表面的氨基所帶的正電荷使其具有一定的細(xì)胞毒性，為了使其具有更好的生物相容性，可對其進(jìn)行表面修飾。本研究擬使用丁二酸酐來對pamam進(jìn)行改性，將pamam表面的大部分氨基變?yōu)楦影踩聂然?，從而得到pc納米粒(圖1a)。合成方法為：將1.5mlpamam-g5.0(290mg，0.01mmol)的甲醇溶液置于單口燒瓶中，旋干，并加入1ml無水dmso重新溶解。使丁二酸酐(640mg，6.4mmol)溶于1ml無水dmso中，滴加入反應(yīng)體系內(nèi)，室溫攪拌24h。使用mw＝3500da的透析袋透析三天后，冷凍干燥，得到產(chǎn)物pamam-cooh(pc)。利用傅里葉紅外光譜儀分析產(chǎn)物的紅外光譜測定聚合物官能團(tuán)，以固體溴化鉀粉末作為稀釋劑，壓片測試。使用核磁共振儀分析測定聚合物的核磁氫譜(1hnmr)，以d2o為溶劑，tms為內(nèi)標(biāo)。核磁氫譜結(jié)果顯示，在2.3ppm處出現(xiàn)了丁二酸酐的-ch2-的質(zhì)子振動峰。根據(jù)峰面積比計算得出丁二酸酐的取代度為67％(圖1b)。紅外光譜結(jié)果顯示，與pamam相比，pc在1257cm-1處出現(xiàn)了羧基的伸縮振動峰，表明了羧基已被成功修飾到納米粒表面；為了增加納米粒的穩(wěn)定性，提高其對藥物的包封能力，我們在其表面修飾ha，合成了ha-pamam-cooh(hpc)。紅外光譜顯示hpc的光譜與pc相比，在1084和1045cm-1處出現(xiàn)了ha上羥基的伸縮振動峰，說明了成功將ha包裹在pc的表面(圖1c)。以上結(jié)果表明，我們成功合成了pc納米粒，并且可以實(shí)現(xiàn)ha對納米粒的修飾。實(shí)施例2：ha-pamam-cooh-tmz的合成及表征將5mgpc(實(shí)施例1制備)與2mgtmz共溶于0.5ml去離子水中，得到a液，將3mgtmz與5mgha共溶于2ml去離子水中，得到b液。b液置于功率為180w的探頭超聲下，一邊超聲一邊將a液滴加到b液中，超聲10min后，使用30k超濾管將超聲后得到的液體用6000rpm/min的轉(zhuǎn)速超濾，用去離子水洗濃縮液三次后，凍干得到載tmz的納米粒(ha-pamam-cooh-tmz,hpct)。納米粒形態(tài)使用場發(fā)射透射電子顯微鏡測定。用動態(tài)散射粒度儀測定納米粒水合直徑、多分散指數(shù)(pdi)和zeta電位等參數(shù)。我們在pc的基礎(chǔ)上分別成功包封tmz合成hpct納米粒(圖2)。dls結(jié)果顯示pamam的平均水合粒徑為5.46nm，其zeta電位為40.1mv，多分散指數(shù)(pdi)為0.308(圖2a)；pc的平均水合粒徑為5.80nm，zeta電位為12.3mv，pdi為0.27(圖2b)；hpct的平均水合粒徑為7.43nm，其zeta電位為-6.43mv，pdi為0.213(圖2c)。該結(jié)果表明載藥后的hpct納米粒較pamam和pc在粒徑上有輕微的增加，其表面電荷由正值變?yōu)樨?fù)值，進(jìn)一步說明了ha修飾成功。此外hpct的pdi值更小，說明了ha能夠使納米粒更均勻的分散在溶液中。tem結(jié)果顯示hpct呈球形，大小較為均勻，呈單分散狀態(tài)，無明顯團(tuán)聚，與dls測定結(jié)果一致(圖2d)。實(shí)施例3：tmz含量測定為了精確測定藥物tmz的含量，我們測定了tmz的降解曲線。將一定量的tmz溶于ph＝7.4的pbs中，配成50μg/ml的溶液，放于37℃的搖床上，速度為150rpm/min。間隔一定的時間點(diǎn)，取出來200μl液體，測定200-400nm的紫外吸收光譜。由于tmz在水溶液中不穩(wěn)定，會逐漸降解為化合物mtic(5-(3-甲基三氮烯-1-基)咪唑-4-酰胺)，因此需要建立tmz和mtic的測定方法。紫外吸收法測定結(jié)果顯示tmz的最強(qiáng)吸收峰位于328nm，其降解產(chǎn)物mtic的最強(qiáng)吸收波長為266nm(圖3a)，而hpct納米粒在此波長處無吸收，不會干擾tmz的測定。因此我們可以使用328nm和266nm波長處的吸光強(qiáng)度作為藥物定量的標(biāo)準(zhǔn)。為了進(jìn)一步研究tmz的穩(wěn)定性，我們測定tmz在不同時間的吸收譜。結(jié)果表明，tmz在6h的時候已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化為mtic，而6～24h在266nm處的吸光度并未發(fā)生明顯變化，表明mtic是比較穩(wěn)定的。配置一系列濃度的藥物，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度a對濃度c進(jìn)行線性回歸處理，得回歸方程：a＝0.0591c+0.1243，r2＝0.9988(tmz)和a＝0.0591c+0.135，r2＝0.9997(mtic)(圖3b、3c)。實(shí)施例4：包封率和載藥率的測定通過紫外可見吸收光譜儀測定上清液中328nm和266nm處的光吸收，然后使用差減法來確定tmz含量。納米粒包封率(ee)和載藥率(dl)計算公式如下：根據(jù)公式計算tmz的包封率和載藥率分別為44.91％和16.64％。實(shí)施例5：hpct在不同條件下對tmz的釋放動力學(xué)研究將含有1.5mgtmz的溶液使用ph＝2.0的pbs分散為3ml，放入透析袋中(其中ph＝5.0+haase組的透析袋中加入1mg的ha酶)。將透析袋分別放入50ml離心管中，并在離心管中加入ph＝5.0和ph＝7.4的pbs溶液40ml。將離心管放入37℃，150rpm的搖床上，模擬釋藥。在不同的時間點(diǎn)取出1ml釋放液后，加入1ml新鮮的對應(yīng)ph的pbs。測定不同時間點(diǎn)所取液體在328nm和266nm處的吸收，計算得到對應(yīng)時間點(diǎn)的釋放量。釋藥曲線顯示，在72h時，tmz在ph＝7.4的條件下釋放量(32％)略高于在ph＝5.0環(huán)境中的釋放量(27％)，但是在酸性環(huán)境中添加了透明質(zhì)酸酶之后，tmz的釋放量明顯上升，72h時約為38％(圖4)。實(shí)施例6：人黑素瘤a375細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞凍存1、細(xì)胞復(fù)蘇(1)取出凍存于液氮中的人黑素瘤a375細(xì)胞凍存管，迅速放入37℃的水浴鍋中，使其迅速融化，置于超凈工作臺中。(2)無菌條件下打開凍存管，將細(xì)胞用移液槍轉(zhuǎn)移至15ml無菌離心管中，加入dmem高糖培養(yǎng)液4ml，輕輕混勻，1000rpm離心3min。棄上清液，加入5ml含10％fbs的dmem高糖培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞。(3)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(4)次日更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。2、細(xì)胞培養(yǎng)a375細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dmem培養(yǎng)液中，在37℃，5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3、細(xì)胞傳代倒置顯微鏡下見a375細(xì)胞貼壁生長至培養(yǎng)瓶面積80％～90％融合時，去掉原培養(yǎng)基，加入pbs液2ml漂洗細(xì)胞兩次。加入0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察待細(xì)胞大部分變圓后，吸除消化液，加入培養(yǎng)液終止消化。吸管輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按1:3比率，接種到培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)液，置37℃、5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4、細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)至飽和密度，消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，1000rpm離心3min，棄上清，加入2ml含血清培養(yǎng)基，吹打混勻，20μl移液槍吸取一滴細(xì)胞懸液，從計數(shù)板邊緣滴入。計數(shù)4個大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)公式：細(xì)胞數(shù)目/每毫升懸液＝(4個大方格的細(xì)胞數(shù)目/4)×104換算。5、細(xì)胞凍存(1)選取處于對數(shù)生長期的a375細(xì)胞，凍存前一天換培養(yǎng)液一次。(2)用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，置離心管中，1000rpm×3min離心。(3)棄上清，加入細(xì)胞凍存液，輕輕吹打使細(xì)胞重懸浮。(4)每只凍存管內(nèi)加入細(xì)胞懸液1ml，旋緊蓋子，并在凍存管上標(biāo)記。(5)將凍存管4℃冰箱放置15min，然后迅速移入-20℃冰箱放置20min，最后-80℃冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)移至液氮瓶內(nèi)。實(shí)施例7：荷瘤模型研究載藥納米粒的治療作用balb/c-nu裸鼠，雌性，6～8周齡，體重約19-21g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于恒溫(22～25℃)、恒定濕度的spf級的屏障系統(tǒng)中。經(jīng)高壓滅菌的標(biāo)準(zhǔn)飼料和水供動物自由飲食。實(shí)驗(yàn)分組：ⅰ：normal(不接腫瘤)，ⅱ：control，ⅲ：tmz，ⅴ：hpct。取對數(shù)生長期a375細(xì)胞消化離心后收集，用pbs洗3次，1000rpm×5min，快速置于冰上，與提前解凍的matrigel1:1混合，配成4×107/ml的混合液，取100μl接種于balb/c裸鼠右后腿。待腫瘤長至100cm3后將裸鼠隨機(jī)分成6組，每組5只。進(jìn)行尾靜脈注射藥物：control組注射100μl生理鹽水；tmz組每只注射70mg/kgtmz；hpct組每只注射含tmz70mg/kg的hpct。記錄腫瘤生長情況，每兩天稱量體重和測量腫瘤體積，腫瘤體積(mm3)＝長徑×短徑×短徑/2。自給藥開始連續(xù)觀測14天，繪制腫瘤生長曲線。14天后眼球采血進(jìn)行血生化檢測，處死所有裸鼠，剝離移植瘤進(jìn)行拍照，解剖出主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)，進(jìn)行病理切片檢測。腫瘤生長曲線(圖6)顯示，control組腫瘤生長迅速，tmz組腫瘤生長速度被部分抑制，hpct組腫瘤生長速度較游離tmz組降低。圖5為腫瘤剝離照片，各組腫瘤大小有差異，同腫瘤生長曲線結(jié)果一致。實(shí)施例8：載藥納米粒對荷瘤小鼠系統(tǒng)毒性研究考察了合成的納米載體治療后對機(jī)體正常組織(心、肝、脾、肺、腎)的毒性，如圖7所示。同normal組(未接種腫瘤)相比，治療組對各器官均未產(chǎn)生損害。此外，眼球取血后進(jìn)行了血生化檢查(表1)，結(jié)果顯示谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、肌酐、尿素氮、尿酸、磷酸肌酸同工酶的值均在正常范圍內(nèi)，說明治療后無明顯的系統(tǒng)毒性。以上結(jié)果表明載藥納米粒能有效治療黑素瘤，且對荷瘤小鼠無系統(tǒng)毒性。表1normal組和治療組血生化結(jié)果groupast(u/l)alt(u/l)cre(u/l)bun(u/l)tbil(u/l)ck(u/l)ua(u/l)normal141.42±32.9334.84±5.2072.69±6.964.37±0.634.06±0.43516.22±160.52121.75±15.10hpct118.37±10.8230.80±4.6370.94±6.254.24±0.623.66±0.90416.88±114.99117.81±32.93當(dāng)前第1頁12