本發(fā)明屬于腫瘤的診療和治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種rgd-石墨烯/mno2磁性納米球的復(fù)合探針和其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

石墨烯，作為新型二維納米材料，具有良好的生物相容性、細(xì)胞跨膜運(yùn)輸性能以及易于表面修飾的特點(diǎn)，為構(gòu)建細(xì)胞、組織甚至活體腫瘤檢測(cè)的分子探針提供良好的基材。目前已報(bào)道的石墨烯腫瘤檢測(cè)分子探針，按照醫(yī)學(xué)成像技術(shù)大體可以歸為以下五類：熒光成像、計(jì)算機(jī)x射線斷層掃描(computedtomography，ct)、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(positronemissiontomography，pet)、磁共振成像(magneticresonanceimaging，mri)的石墨烯分子探針。其中由于mri能穿透不透明組織，具有空間和軟組織分辨率高、非侵入性、無(wú)輻射等優(yōu)點(diǎn)，是癌癥檢測(cè)的首選成像模式。也是我們研究關(guān)注的重點(diǎn)。

當(dāng)前制備mri石墨烯分子探針的基本方法就是在石墨烯表面組裝mri信號(hào)組件。例如，xue等通過(guò)簡(jiǎn)單的揮發(fā)溶劑法，合成了三氧化二釓磁性納米粒子的mri信號(hào)組件負(fù)載的石墨烯復(fù)合探針，并通過(guò)研究驗(yàn)證了該探針具有杰出的t1加權(quán)成像性能。中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所張智軍課題組報(bào)道了四氧化三鐵磁納米的信號(hào)組件組裝的氧化石墨烯mri分子探針，與單純的四氧化三鐵磁納米分子探針相比更容易被細(xì)胞吞噬，因而具有更高敏感性。中國(guó)科學(xué)院上海硅酸鹽研究所施劍林課題組以石墨烯為基材，在其表面組裝四氧化三鐵、氧化錳磁性納米粒子的信號(hào)組件和抗腫瘤藥物阿霉素，制備出具有三重信號(hào)響應(yīng)型的mri納米診療體系。盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)石墨烯的mri分子探針的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但將石墨烯的mri分子探針應(yīng)用于肺癌的診斷和治療還是目前研究的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，一方面要求納米探針具有高度的安全性和診療的雙功能性，另一方面要求探針?lè)肿佑凶銐虻奶禺愋院兔舾行浴?/p>

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種rgd-石墨烯/mno2空心磁性納米球的復(fù)合探針和其應(yīng)用，該復(fù)合探針通過(guò)rgd配體與癌細(xì)胞上的受體特異性結(jié)合的靶向診斷和治療的策略，引導(dǎo)分子探針選擇性的識(shí)別腫瘤細(xì)胞，促使分子探針在預(yù)定病灶部位富集，腫瘤細(xì)胞的核磁信號(hào)被點(diǎn)亮，同時(shí)抗腫瘤藥物在弱酸性的腫瘤微環(huán)境中釋放出來(lái)，同步實(shí)現(xiàn)針對(duì)肺癌腫瘤的靶向診斷和靶向治療。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：

一種rgd-石墨烯/mno2空心磁性納米球的復(fù)合探針，其制備方法包括如下步驟：

1、mno2空心磁性納米粒子的制備：

1.1、在1-十八烯中，油酸錳和油酸在300-350℃下反應(yīng)20-40min，油酸錳與油酸的摩爾比為1-3:1，得到油酸包裹的mno2實(shí)心磁性納米粒子，記為oa@smno2；

1.2、將oa@smno2分散于氯仿中，然后加入去離子水和牛血清白蛋白，oa@smno2與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:4-6，超聲分散均勻，在室溫下攪拌0.5-1.5天，得到表面修飾牛血清白蛋白的oa@smno2，記為bsa-oa@smno2；

1.3、將bsa-oa@smno2加入到ph＝4-6的弱酸性溶液中進(jìn)行刻蝕，反應(yīng)20-28h，得到mno2空心磁性納米粒子，記為hmno2；

2、hmno2/graphene的制備：

將hmno2分散在去離子水中，得到hmno2懸浮液，將氧化石墨烯分散在去離子中，得到氧化石墨烯懸浮液，將hmno2懸浮液加入到氧化石墨烯懸浮液中，hmno2與氧化石墨烯的質(zhì)量比為8-12:1，在室溫下攪拌0.5-1.5h，得到石墨烯/mno2空心磁性納米球，記為hmno2/graphene。

3、rgd-hmno2/graphene的制備：

將hmno2/graphene分散在去離子水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、n-羥基琥珀酰亞胺和環(huán)肽rgd，其中hmno2/graphene、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽、n-羥基琥珀酰亞胺和環(huán)肽rgd的質(zhì)量比為1:0.5-2.5:0.5-1.5:0.5-1.5，攪拌1-3h，得到rgd-石墨烯/mno2空心磁性納米球的復(fù)合探針，記為rgd-hmno2/graphene。

進(jìn)一步，步驟1.1.1中，以3.3℃/min的加熱速率加熱到320℃。

進(jìn)一步，步驟1.1.3中，所述的弱酸性溶液為ph＝4的pbs緩沖溶液。

進(jìn)一步，步驟3.1中，將hmno2/graphene分散在去離子水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽攪拌過(guò)夜以活化羧基，再加入n-羥基琥珀酰亞胺和環(huán)肽rgd。

一種rgd-石墨烯/mno2空心磁性納米球的復(fù)合探針在制備肺癌腫瘤mri診斷和治療試劑中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明采用液相“一鍋法”，以空心的mno2磁性納米粒子和石墨烯的懸浮液作為前軀體，在超聲作用的輔助下將空心的mno2磁性納米粒子組裝到石墨烯的表面，進(jìn)一步修飾靶向基團(tuán)環(huán)肽rgd，制備靶向性、診療一體化的rgd-mno2/graphene分子探針。

2、本發(fā)明以石墨烯為基材，組裝高弛豫率、高載藥率的空心的二氧化錳(mno2)納米粒子作為磁共振檢測(cè)基元和藥物的載體，選用癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的細(xì)胞整合素受體αvβ方法的特異性配體rgd進(jìn)行靶向修飾，得到rgd連接的空心mno2磁性納米粒子組裝的石墨烯(rgd-mno2/graphene)靶向診療一體化的分子探針。

3、該復(fù)合探針通過(guò)實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌腫瘤靶向mri顯影和靶向治療，為肺癌的早期診斷和治療提供新的思路和見(jiàn)解。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1制備的graphene和hmno2/graphene的透射電鏡圖以及hmno2和graphene反應(yīng)的示意圖(a為采用液相法，以mno2空心磁性納米粒子和氧化石墨烯的懸浮液作為前軀體制備hmno2/graphene的示意圖；b)制備的氧化石墨烯graphene的tem圖；c)制備的hmno2/graphene的tem圖)。

圖2為實(shí)施例1制備的go(a)和hmno2/graphene(b)的原子力顯微鏡圖。

圖3為實(shí)施例1制備的go和hmno2/graphene的xps圖(其中a為原圖，b為局部放大圖)。

圖4為實(shí)施例1制備的go(下)、hmno2/graphene(中)和rgd-hmno2/graphene(上)的紅外光譜圖。

圖5為實(shí)施例1制備的go(下)、hmno2/graphene(中)和rgd-hmno2/graphene(上)的拉曼光譜圖。

圖6為實(shí)施例1制備的hmno2/graphene(上)與mno2/graphene(下)的縱向弛豫率與濃度的關(guān)系曲線(a)和橫向弛豫率與濃度的關(guān)系曲線(b)。

圖7為實(shí)施例1制備的hmno2/graphene與mno2/g的t1加權(quán)成像與濃度的關(guān)系圖(a)和t2加權(quán)成像與濃度的關(guān)系圖(b)。

圖8為實(shí)施例1制備的rgd-hmno2/graphene診療一體化分子探針靶向釋藥的機(jī)理圖。

圖9為實(shí)施例1制備的rgd-hmno2/graphene對(duì)肺癌細(xì)胞a549的殺傷效果圖。

圖10為實(shí)施例1制備的rgd-hmno2/graphene對(duì)裸鼠腫瘤部位的t1、t2加權(quán)成像圖。

圖11為實(shí)施例1制備的rgd-hmno2/graphene靶向治療肺癌腫瘤細(xì)胞時(shí)的mri圖。

圖12為實(shí)施例1制備的rgd-hmno2/graphene靶向治療肺癌腫瘤細(xì)胞時(shí)的腫瘤體積與治療天數(shù)的關(guān)系圖。

圖13為實(shí)施例1制備的rgd-hmno2/graphene的組織器官毒性測(cè)試圖。

注：hmno2/graphene簡(jiǎn)記為hmno2-g，mno2/graphene簡(jiǎn)記為mno2-g，rgd-hmno2/graphene簡(jiǎn)記為rgd-mno2-g。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

1、mno2空心磁性納米粒子的制備：

1.1、將3.96gmncl2·4h2o(20mmol)、18.25g油酸鈉(60mmol)溶解在40ml乙醇、30ml水和70ml正己烷的混合溶液中，在70℃下加熱4h，冷卻至室溫(25℃)并分層，分離，將上層有機(jī)相用30ml水和分液漏斗分液洗滌，再將正己烷蒸發(fā)掉，得到蠟狀固體產(chǎn)物油酸錳。

1.2、在室溫(25℃)下，將6.2g油酸錳(10mmol)、1.43g(5mmol)攪拌溶解到50g1-十八烯中，然后以3.3℃/min的加熱速率加熱到320℃，當(dāng)反應(yīng)液加熱到320℃時(shí)，會(huì)發(fā)生劇烈的反應(yīng)，最初透明的溶液會(huì)變得渾濁，反應(yīng)液顏色變?yōu)楹稚?20℃下保溫反應(yīng)30min，將所得的混合產(chǎn)物冷卻至室溫，向混合產(chǎn)物中加入500ml乙醇，混勻后離心分離，干燥，得到油酸包裹的mno2實(shí)心磁性納米粒子，記為oa@smno2；

1.3、將20mgoa@smno2溶解于4ml氯仿中，加入20ml去離子水和100mg牛血清白蛋白(bsa)，放入超聲儀(170w)中超聲30min，所得的反應(yīng)液放在室溫(25℃)攪拌1天，揮發(fā)除去氯仿，離心分離，干燥，得到修飾牛血清白蛋白的mno2實(shí)心磁性納米粒子，記為bsa-oa@smno2，將bsa-oa@smno2重新分散在去離子水中，得到5mg/mlbsa-oa@smno2分散液；

1.4、將10mlbsa-oa@smno2分散液加入到20mlph＝4的pbs緩沖溶液中，反應(yīng)24h后，過(guò)濾，濾渣用去離子水洗滌，干燥，得到mno2空心磁性納米粒子，記為hmno2。

2、石墨烯的制備：

2.1、取一定量325目(粒徑≤45μm)天然鱗片石墨，在80℃烘箱中干燥24h后待用；將30ml濃h2so4(98wt％)、10gk2s2o8和10gp2o5加入三口燒瓶中，加熱至80℃，接著加入20g干燥后的天然鱗片石墨，待反應(yīng)液完全變?yōu)樗{(lán)黑色時(shí)停止加熱，冷卻至室溫并放置6h，過(guò)濾，將濾渣用水充分地沖洗、過(guò)濾，直至所得的濾液呈中性，在室溫下晾干，得到固體物；將2g固體物和92ml濃h2so4(98wt％)置于三口燒瓶中，在0℃水浴中緩慢加入12gkmno4，控制溫度不能高于20℃，加完kmno4后繼續(xù)攪拌15min，然后向三口燒瓶中加入2gnano3，在室溫(25℃)下攪拌2h，加入560ml蒸餾水猝滅反應(yīng)后加入10mlh2o2，三口燒瓶中的液體由黃褐色變成亮黃色，約15min后停止反應(yīng)，過(guò)濾，接著用37wt％的鹽酸溶液反復(fù)洗滌濾餅以移除部分金屬離子，將所得固體物裝進(jìn)透析袋中，在蒸餾水中進(jìn)行透析，每2h更換一次蒸餾水，直至用bacl2溶液檢驗(yàn)滲出液中無(wú)so4^2-，且用agno3溶液檢驗(yàn)無(wú)cl-為止，透析完成后，將透析后的保留液放入離心機(jī)中，在4000r.p.m.的速度下離心40min，除去少量未被氧化的石墨顆粒，得到呈粘性的棕色膠體，在p2o5存在的條件下，將棕色膠體在60℃真空干燥箱中真空干燥24h，得到氧化石墨，密封保存待用；

2.2、將一定量的氧化石墨加入蒸餾水中，攪拌分散3h，然后在超聲機(jī)(120w)中超聲3h，使氧化石墨片層剝落，再在4000r.p.m.下離心40min，移去沉淀物，上清液即為0.05mg/ml氧化石墨烯的懸浮液。分散液中片層結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯表面帶有大量的含氧功能團(tuán)，使得片層彼此之間靠靜電排斥達(dá)到很好的分散效果，這種方法合成的氧化石墨烯表面存在大量的含氧基團(tuán)易于被修飾。

3、將hmno2分散在去離子中，得到5mg/ml的hmno2懸浮液，取1mlhmno2懸浮液加入到10ml氧化石墨烯的懸浮液，在室溫下(25℃)攪拌1h，將得到的混合產(chǎn)物過(guò)濾，濾渣用乙腈離心分離(4000rpm，10min)，除去上清液，即去除未修飾的空心的mno2磁性納米粒子，真空干燥，得到粉末狀的石墨烯/mno2空心磁性納米球，記為hmno2/graphene。

4、將合成得到的hmno2/graphene分散在去離子水中，得到20ml0.02mg/ml的hmno2/graphene懸浮液，加入1.5ml10^-3mol/l的edc溶液攪拌過(guò)夜活化羧基，然后加入2ml10^-3mol/lnhs溶液和400μl10^-3mol/l的環(huán)肽c(rgd)yk溶液，繼續(xù)攪拌約2h，最終通過(guò)真空干燥制備得到rgd-石墨烯/mno2空心磁性納米球的復(fù)合探針?lè)勰洖閞gd-hmno2/graphene。

將本實(shí)施例制備hmno2/graphene的過(guò)程從透射電鏡觀察，所得的透射電鏡圖和反應(yīng)示意圖如圖1所示，圖1非常直觀的顯示分子探針的修飾過(guò)程。

將本實(shí)施例制備的氧化石墨烯go和hmno2/graphene用原子力顯微鏡觀察，所得的原子力顯微鏡如圖2所示，從圖2中可以看出，go和hmno2/graphene的厚度分別為1.0±0.2nm和22.0±0.2nm，修飾前go的厚度有1.0±0.2nm，與文獻(xiàn)中報(bào)道的經(jīng)典單層石墨烯具有相同的厚度，經(jīng)過(guò)修飾后，hmno2/graphene的厚度明顯的增加，說(shuō)明hmno2成功修飾到石墨烯表面。

對(duì)本實(shí)施例制備的氧化石墨烯go和hmno2/graphene進(jìn)行x射線光電子能譜分析，所得的xps圖如圖3所示，從圖3中可以看出mn元素特征新峰的出現(xiàn)，從而證明hmno2空心磁性納米粒子負(fù)載到了石墨烯表面上。

本實(shí)施例制備的氧化石墨烯go、hmno2/graphene和rgd-hmno2/graphene的紅外光譜圖如圖4所示，從圖4中可以看出，氧化石墨烯go和hmno2/graphene上-cooh的伸縮振動(dòng)峰均在1686cm^-1，而rgd-hmno2/graphene上-cooh的伸縮振動(dòng)峰紅移到了1615cm^-1處，證明環(huán)肽rgd成功連接到了hmno2/graphene上。

本實(shí)施例制備的氧化石墨烯go、hmno2/graphene和rgd-hmno2/graphene的拉曼光譜圖如圖5所示，從圖5中可以看出，rgd-hmno2/graphene的id/ig的比率是1.1，與文獻(xiàn)中報(bào)道的修飾后的石墨烯相同，但是這一數(shù)值大于原始的未共價(jià)修飾的石墨烯graphene、hmno2/graphene(id/ig是0.99)，同樣說(shuō)明了靶標(biāo)分子環(huán)肽rgd成功修飾到hmno2/graphene表面上。

將本實(shí)施例制備的hmno2/graphene和mno2/graphene在7t的核磁共振波譜儀上測(cè)弛豫率，得到的hmno2/graphene與mno2/graphene的縱向弛豫率與濃度的關(guān)系曲線(a)和橫向弛豫率與濃度的關(guān)系曲線(b)如圖6所示，得到的hmno2/graphene與mno2/graphene的t1加權(quán)成像與濃度的關(guān)系圖(a)和t2加權(quán)成像與濃度的關(guān)系圖(b)如圖7所示，從圖6和圖7可以看出，hmno2/graphene具有更高的弛豫率和更好的核磁成像性能。

石墨烯/mno2實(shí)心磁性納米球mno2/graphene的制備方法為：

將1mlbsa-oa@smno2(5mg/ml)懸浮液加入到10ml石墨烯懸浮液中(0.05mg/ml)，在室溫下(25℃)攪拌1h，將得到的混合產(chǎn)物過(guò)濾，濾渣用乙腈離心分離(4000rpm，10min)，除去上清液，即去除未修飾的bsa-oa@smno2，真空干燥，得到石墨烯/mno2實(shí)心磁性納米球，記為mno2/graphene。

將本實(shí)施例制備的rgd-hmno2/graphene對(duì)藥物的釋放效果在細(xì)胞中考察，得到的rgd-hmno2/graphene診療一體化分子探針靶向釋藥的機(jī)理圖如圖8所示。

將本實(shí)施例制備的rgd-hmno2/graphene對(duì)肺癌細(xì)胞a549的殺傷作用通過(guò)經(jīng)典的mtt法進(jìn)行考察，所得的殺傷效果圖如圖9所示，從圖9可以看出，rgd-hmno2/graphene對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的殺傷作用，有望用作細(xì)胞甚至活體靶向治療的試劑。

試驗(yàn)一、本發(fā)明的rgd-hmno2/graphene的肺癌腫瘤靶向mri診斷效果試驗(yàn)

試驗(yàn)方法：

在鼠齡4-5周的balb/c雄性裸鼠大腿皮下種植a549細(xì)胞(使用細(xì)胞數(shù)量1*10⁷)，并將種植腫瘤后的裸鼠再飼養(yǎng)2周，直到腿部可以用肉眼觀察到小的腫瘤，通過(guò)尾靜脈對(duì)裸鼠注射rgd-hmno2/graphene(將rgd-hmno2/graphene分散在去離子水中后再注射)，注射劑量為150μl、濃度為1.1mgmn(以mn元素計(jì))/kg(裸鼠體重)，使用7.0t小動(dòng)物成像(brukerbiospec70/20usr)對(duì)裸鼠腫瘤部位進(jìn)行t1、t2加權(quán)成像。

試驗(yàn)結(jié)果：

所得t1、t2加權(quán)成像圖如圖10所示，從圖10可以看出，注射1小時(shí)后腫瘤部位的t1、t2弛豫時(shí)間發(fā)生明顯改變，t1弛豫縮短、t2弛豫縮短，證明rgd-hmno2/graphene可用作造影劑，進(jìn)而可以用于腫瘤部位的t1、t2雙模態(tài)成像，。

試驗(yàn)二、本發(fā)明的rgd-hmno2/graphene的肺癌腫瘤靶向治療效果試驗(yàn)

試驗(yàn)方法：在鼠齡4-5周的balb/c雄性裸鼠大腿皮下種植a549細(xì)胞(使用細(xì)胞數(shù)量1*10⁷)，并將種植腫瘤后的裸鼠再飼養(yǎng)2周，直到腿部可以用肉眼觀察到小的腫瘤，通過(guò)尾靜脈對(duì)裸鼠注射負(fù)載抗癌藥物dox后的rgd-hmno2/graphene(將負(fù)載抗癌藥物dox后的rgd-hmno2/graphene分散在去離子水中后注射)，注射劑量為150μl、濃度為1.1mgmn(以mn元素計(jì))/kg(裸鼠體重)，使用7.0t小動(dòng)物成像(brukerbiospec70/20usr)對(duì)裸鼠腫瘤部位進(jìn)行t1、t2加權(quán)成像。同時(shí)以注射rgd-hmno2/graphene和生理鹽水做對(duì)照試驗(yàn)。

試驗(yàn)結(jié)果：

1、裸鼠腫瘤部位的mri圖如圖11所示，從圖11所示可以看出，尾靜脈注射rgd-hmno2/graphene-dox組裸鼠(試驗(yàn)組)腫瘤在治療第0、7、14、21、28天時(shí)，腫瘤體積大小分別為2、5、10、14、18mm³，注射生理鹽水組裸鼠(對(duì)照組)在第0、7、14、21、28天時(shí)，腫瘤體積大小分別為2、9、18、28、40mm³。rgd-hmno2/g-dox注射組腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程要比對(duì)照組慢很多，且最終腫瘤也比對(duì)照組小很多。由此可見(jiàn)，本發(fā)明rgd-hmno2/graphene能夠在裸鼠體內(nèi)具有良好的抗腫瘤效果。

2、根據(jù)檢測(cè)裸鼠腫瘤部位腫瘤大小的情況，以裸鼠腫瘤部位腫瘤體積大小為縱坐標(biāo)，以注射天數(shù)為橫坐標(biāo)，建立腫瘤體積與注射天數(shù)的關(guān)系曲線，如圖12所示，從圖12中可以看出，與兩對(duì)照組相比，rgd-hmno2/g-dox實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程要慢很多，且最終腫瘤也比對(duì)照組小很多。由此同樣可以證明，本發(fā)明rgd-hmno2/graphene能夠在裸鼠體內(nèi)具有良好的抗腫瘤效果。

試驗(yàn)三、本發(fā)明的rgd-hmno2/graphene的組織毒性測(cè)試試驗(yàn)

試驗(yàn)方法：將試驗(yàn)二中試驗(yàn)組和對(duì)照組的裸鼠(注射28天后)的心、肝、脾、肺、腎組織取出，做病理切片，通過(guò)h&e染色后，在顯微鏡下觀察其組織切片形態(tài)。

試驗(yàn)結(jié)果：

組織器官毒性檢測(cè)結(jié)果如圖13所示，從圖13中可以看出，本發(fā)明的rgd-hmno2/graphene器官毒性很小，生物安全性較高。