本發(fā)明涉及一種大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑及其制備方法，可作為sod酶模擬物，屬于天然高分子復(fù)合材料領(lǐng)域及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

活性氧包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫和單線態(tài)氧等，是人類新陳代謝的天然副產(chǎn)物。但當(dāng)其過量時，就會攻擊生物分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、酶、dna和rna，導(dǎo)致細(xì)胞或組織損傷。超氧化物歧化酶（sod）是一種體內(nèi)的金屬酶，能夠催化氧自由基的歧化反應(yīng)來平衡體內(nèi)的氧自由基。雖然天然sod清除氧自由基的能力很強(qiáng)，但是它的提取工藝復(fù)雜、價(jià)格高并且通過細(xì)胞膜的通透性很差。因此，研究sod酶模擬物受到關(guān)注。

希夫堿及其金屬配合物由于具有較好的抑菌、抗氧化、抗腫瘤活性，已被用作sod酶模擬物。然而，大多數(shù)具有生物活性的希夫堿金屬配合物在水中的溶解度差，且有一定毒性，并且限制了它們的應(yīng)用。因此，尋找一種既能使配合物毒性降低又具有較好的水溶性，同時還能保持或提高藥效的方法就顯得非常必要。

聚乙烯醇（pva）是一種用途廣泛的水溶性高分子，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為60~85℃，其分子結(jié)構(gòu)中含有許多羥基（-oh），具有極性，且可通過氫鍵與水相連，遇水敏感且易形成微凝膠，因此在水中具有良好的溶解性。但是純pva凝膠溶脹性能低，且有反應(yīng)惰性，這些特點(diǎn)限制了它在藥物釋放系統(tǒng)領(lǐng)域的應(yīng)用。

大豆分離蛋白作為一類天然高分子材料，不僅來源豐富、價(jià)格低廉、營養(yǎng)價(jià)值高，且具有可降解、生物相容、熱穩(wěn)定、無污染、綠色環(huán)保等一些優(yōu)良性能，可被廣泛應(yīng)用于高分子復(fù)合材料領(lǐng)域及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。因此，將大豆分離蛋白、聚乙烯醇及希夫堿及其金屬配合物通過一定的方式結(jié)合起來，形成水溶性高、生物相容好、熱穩(wěn)定性好，具有較強(qiáng)清除氧自由基能力的抗氧化劑，可作為sod酶模擬物，在藥物、食品加工與包裝材料領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是制備一種水溶性高、生物相容好、熱穩(wěn)定性好，具有較強(qiáng)清除氧自由基能力的大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑。

一、大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的制備

本發(fā)明將親水性差但相對穩(wěn)定的大豆分離蛋白，與水溶性高分子聚乙烯醇結(jié)合，通過熱分散與冷收縮法使大豆分離蛋白中含有的羥基、羧基、氨基與聚乙烯醇中的羥基發(fā)生氫鍵作用，形成在水中均勻分散的大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠，然后將微凝膠與水楊醛縮半胱氨酸希夫堿金屬配合物結(jié)合，得到大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑。其具體制備工藝如下：

（1）大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠的制備：將大豆分離蛋白分散于naoh水溶液或koh水溶液中，配制成濃度為1~5mg/ml的大豆分離蛋白分散液；攪拌下加熱至50℃~90℃，在高速（600~800rpm）攪拌下，勻速滴加聚乙烯醇溶液，繼續(xù)攪拌1~5h，然后于–20℃~–10℃下冷凍12~36h，室溫解凍12~36h，透析12~36h，得到大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠。

naoh水溶液或koh水溶液的濃度0.5~2.5mol·l^-1，聚乙烯醇溶液的濃度0.5~6mg/ml，大豆分離蛋白與聚乙烯醇的質(zhì)量比為1:1~1:6。

（2）大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的制備：在大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠中加入氨基酸希夫堿金屬配合物的二甲亞砜溶液，室溫避光振搖15~36h，透析12~36h，得到大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑。

氨基酸希夫堿金屬配合物為氨基酸希夫堿銅配合物，是由2,4-二羥基苯甲醛縮半胱氨酸希夫堿配體與醋酸銅發(fā)生配位反應(yīng)得到。大豆分離蛋白與氨基酸希夫堿金屬配合物的質(zhì)量比為25:1~50:1。

上述透析采用2000～18000da的透析袋，蒸餾水為透析液，透析過程中需更換3~10次透析液。

二、大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的形貌結(jié)構(gòu)

1、宏觀與微觀形貌

宏觀形貌：本發(fā)明制備的大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠的水溶液透明性高，說明其粒徑較小。

微觀形貌：本發(fā)明制備的大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠的掃描電鏡照片見圖1。通過掃描電鏡可看出，大豆分離蛋白與聚乙烯醇通過物理交聯(lián)作用形成微凝膠后，微凝膠呈相對規(guī)則的橢圓片狀結(jié)構(gòu)，直徑約為150~400nm左右。

2、紅外光譜

圖2為大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠的紅外光譜。由圖2可知，3428cm^-1為-oh的特征吸收峰，與聚乙烯醇的-oh特征吸收峰相比，變寬且向低波數(shù)移動，證明氫鍵的增加，在1654cm^-1附近出現(xiàn)了聚乙烯醇中c=o的伸縮振動吸收峰，同時在1628cm^-1、1532cm^-1、1226cm^-1附近出現(xiàn)了大豆分離蛋白酰胺i、ii、iii帶的特征吸收峰，表明大豆分離蛋白與聚乙烯醇成功結(jié)合。

3、x射線衍射光譜

圖3為大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠的x-射線衍射光譜。從圖3中可以看出，在2θ為19.3^o處出現(xiàn)了聚乙烯醇的特征衍射峰，在2θ為26.9^o處為大豆分離蛋白的衍射峰。當(dāng)大豆分離蛋白結(jié)合聚乙烯醇得到微凝膠后其衍射峰強(qiáng)度變?nèi)?。大豆分離蛋白與聚乙烯醇復(fù)合之后結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生了變化，說明成功得到大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠。

4、紫外-可見光譜

圖4為大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的紫外-可見光譜。由圖4可知，金屬配合物在260nm左右的吸收峰與微凝膠的特征吸收峰（280nm）發(fā)生重疊，在300nm之后，沒有微凝膠的特征吸收峰，有金屬配合物的特征吸收。因此，可以在300nm之后用紫外-可見吸收光譜檢測金屬配合物與微凝膠的結(jié)合情況?？梢钥闯觯航Y(jié)合小分子希夫堿后，微凝膠在345nm處的吸收強(qiáng)度增大，最大吸收峰發(fā)生了紫移，這是與希夫堿配體吸收峰重疊造成的，且在350nm出現(xiàn)了吸收峰，說明小分子希夫堿金屬配合物和微凝膠成功結(jié)合。

三、大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的性能

通過測試大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑對超氧陰離子的清除能力，以考察其抗氧化性能。通過nbt光化學(xué)還原法檢測了大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的清除超氧陰離子能力（圖5）。由圖5可知，大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠的抗氧化活性較弱，當(dāng)其與希夫堿金屬配合物形成結(jié)合體后，清除清除超氧陰離子的能力有較大的提高。其ec50值為0.0132μmol/l，對sod的模擬度達(dá)到了297.10%，因而是一種優(yōu)異的sod模擬物。

綜上所述，本發(fā)明通過熱分散-冷收縮方法，將天然高分子大豆分離蛋白與水溶性高分子聚乙烯醇相結(jié)合，制得水溶性復(fù)合高分子微凝膠；然后將其與氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合，形成微凝膠金屬配合物結(jié)合體－大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑，在提高氨基酸希夫堿金屬配合物水溶性的同時降低其毒性?？寡趸阅軠y試表明，該微凝膠基抗氧化劑清除氧自由基的能力得到大幅度提高，因此可作為sod酶模擬物，用于抗氧化藥物的制備。

附圖說明

圖1為大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠的掃描電鏡圖。

圖2為大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠的紅外光譜。

圖3為大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的x-射線衍射光譜。

圖4為大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的紫外光譜。

圖5為大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的超氧陰離子清除活性。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的制備和性能作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

（1）大豆分離蛋白分散液的配制：取0.01g的大豆分離蛋白，分散于10ml0.5mol/lnaoh水溶液中，配制成濃度為1mg/ml的大豆分離蛋白分散液；

（2）大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠的制備：將上述大豆分離蛋白分散液攪拌下加熱至50℃，在高速（600rpm）攪拌下用注射器勻速滴加60ml0.5mg/ml聚乙烯醇溶液（含聚乙烯醇0.03g），滴完繼續(xù)攪拌1h，在–20℃冷凍24h，室溫解凍24h，采用2000da的透析袋在蒸餾水中透析24h（透析過程中需更換3~5次透析液），得到大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠；

（3）大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的制備：將上述大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠加入到0.3ml氨基酸希夫堿銅配合物的二甲亞砜溶液（氨基酸希夫堿銅配合物0.4mg），室溫避光振搖24h，采用2000da的透析袋在蒸餾水中透析24h（透析過程中需更換3~5次透析液），得到大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑。

該復(fù)合物的清除活性與微凝膠相比有了大幅度提高，相對于天然超氧化物歧化酶，其模擬度達(dá)到了297.10%。

實(shí)施例2

（1）大豆分離蛋白分散液的配制：取0.025g的大豆分離蛋白，分散于10ml1mol/lnaoh水溶液中，配制成濃度為2.5mg/ml的大豆分離蛋白分散液；

（2）大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠的制備：將上述大豆分離蛋白分散液攪拌下加熱至70℃，在高速（700rpm）攪拌下用注射器勻速滴加50ml2mg/ml聚乙烯醇溶液（含聚乙烯醇0.1g），滴完繼續(xù)攪拌5h，在–15℃冷凍12h，室溫解凍36h，采用10000da的透析袋在蒸餾水中透析12h（透析過程中需更換3~5次透析液），得到大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠；

（3）大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的制備：將上述大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠加入到0.8ml氨基酸希夫堿銅配合物的二甲亞砜溶液（含氨基酸希夫堿銅配合物1mg），室溫避光振搖15h，采用10000da的透析袋在蒸餾水中透析12h（透析過程中需更換3~5次透析液），得到大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑。

該復(fù)合物的清除活性與微凝膠相比有了大幅度提高，相對于天然超氧化物歧化酶，其模擬度達(dá)到了284.3.%。

實(shí)施例3

（1）大豆分離蛋白分散液的配制：取0.02g的大豆分離蛋白，分散于10ml2.5mol/lkoh水溶液中，配制成濃度為2mg/ml的大豆分離蛋白分散液；

（2）大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠的制備：將上述大豆分離蛋白分散液攪拌下加熱至90℃，在高速（800rpm）攪拌下用注射器勻速滴加20ml6mg/ml聚乙烯醇溶液（含聚乙烯醇0.12g），滴完繼續(xù)攪拌2.5h，–10℃冷凍36h，室溫解凍12h，采用18000da的透析袋在蒸餾水中透析36h（透析過程中需更換3~10次透析液），得到大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠；

（3）大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑的制備：將上述大豆分離蛋白復(fù)合高分子微凝膠加入到0.3ml氨基酸希夫堿銅配合物的二甲亞砜溶液（氨基酸希夫堿銅配合物0.4mg），室溫避光振搖36h，采用18000da的透析袋在蒸餾水中透析36h（透析過程中需更換3~10次透析液），得到大豆蛋白復(fù)合高分子微凝膠基抗氧化劑。

該復(fù)合物的清除活性與微凝膠相比有了大幅度提高，相對于天然超氧化物歧化酶，其模擬度達(dá)到了268.3%。