本發(fā)明涉及一種用于治療慢性阻塞性肺疾病的藥物組合物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限為特征的疾病，與肺部對有害顆粒及氣體的異常炎癥反應(yīng)相關(guān)，是呼吸系統(tǒng)疾病中的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率及患病率不斷上升，嚴(yán)重影響患者的勞動(dòng)力和生活質(zhì)量，是倍受重視與廣泛研究的疾病。

COPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未完全闡明，目前認(rèn)為肺部氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、慢性炎癥等與COPD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，西醫(yī)將COPD病程分為急性加重期與穩(wěn)定期，對COPD的治療一般采用給氧、消炎、解痙、祛痰等，但很多藥物都有毒副作用，而且臨床治療效果不夠理想。

COPD屬中醫(yī)的“肺脹”范疇，早在《內(nèi)經(jīng)》就有本病的論述，《靈樞.脹論》記載“肺脹者，虛滿而喘咳?！彼濉こ苍肌吨T病源候論·咳逆短氣侯》認(rèn)為肺脹的發(fā)病機(jī)理是由于“肺虛為微寒所傷則咳嗽，嗽則氣還于肺間則肺脹，肺脹則氣逆，而肺本虛，氣為不足，復(fù)為邪所乘，壅痞不能宣暢，故咳逆，短乏氣也”，提出本病的病機(jī)為肺虛感寒，邪正相搏，氣聚于肺，肺氣脹滿，氣逆而上。肺脹主要病因?yàn)榫貌》翁?，痰濕、瘀血?nèi)阻，肺氣壅滯，氣不斂降，每因復(fù)感外邪誘使本病發(fā)作或加劇。治療當(dāng)標(biāo)本兼顧，方可取得良好療效。從中醫(yī)藥中研發(fā)能夠有效治療COPD的藥物，尚且存在很大的挖掘潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種治療慢性阻塞性肺疾病的藥物組合物及其制備方法和用途。

本發(fā)明提供了一種治療慢性阻塞性肺疾病的藥物組合物，它是由包含下述重量配比的原料藥制備而成：

紅參56-104份、蛤蚧28-52份、三七56-104份、川貝母28-52份、甘草96-144份、地龍28-52份、川芎480-720份。

其中，它是由下述重量配比的原料制備而成：

紅參80份、蛤蚧40份、三七80份、川貝母40份、甘草120份、地龍40份、川芎600份。

其中，它是由紅參、蛤蚧、三七、川貝母、甘草、地龍、川芎的原生粉或水或有機(jī)溶劑提取物為活性成分，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的口服制劑。

進(jìn)一步的，所述口服制劑為膠囊劑、膏劑、口服液、顆粒劑、丸劑、片劑、散劑。

本發(fā)明還提供了上述組合物的制備方法，它包括如下步驟：

a、稱取各重量配比的原料；

b、將甘草、川芎加水浸泡，煎煮二次，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮為清膏，烘干成干浸膏，備用；

c、將紅參、蛤蚧、三七、川貝母、地龍五味藥材粉碎，與步驟b的干浸膏混合，粉碎，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成。

本發(fā)明還提供了上述組合物在制備治療或輔助治療慢性阻塞性肺疾病的藥物中的用途。

其中，所述慢性阻塞性肺疾病是指急性加重期和/或穩(wěn)定期的慢性阻塞性肺疾病。

其中，所述慢性阻塞性肺疾病是指中醫(yī)癥候的氣虛血瘀痰阻證型的慢性阻塞性肺疾病。

其中，所述慢性阻塞性肺疾病是指中醫(yī)癥候的肺氣虛證型的慢性阻塞性肺疾病。

本發(fā)明還提供了上述組合物在制備降低MMP-2、MMP-9、和/或TNF-a的藥物中的用途。

MMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶2；

MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶9；

TNF-a：腫瘤壞死因子-a。

本發(fā)明提供的組合物，配伍合理，益肺補(bǔ)腎，化瘀祛痰。用于慢性阻塞性肺疾病所致的咳嗽、咯痰，慢性支氣管炎、肺氣腫、肺心病，支氣管哮喘的緩解期。對慢性阻塞性肺疾病療效顯著，臨床治愈率和有效率好；而且本發(fā)明組合物安全性好，無毒副作用，使用方便，為臨床提供了一種新的藥物選擇。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1為對照組MMP-2陽性細(xì)胞圖(↑)，免疫組織化學(xué)染色(SABC法)，×400

圖2為模型組MMP-2陽性細(xì)胞圖(↑)，免疫組織化學(xué)染色(SABC法)，×400

圖3為治療組MMP-2陽性細(xì)胞圖(↑)，免疫組織化學(xué)染色(SABC法)，×400

圖4為對照組MMP-9陽性細(xì)胞圖(↑)，免疫組織化學(xué)染色(SABC法)，×400

圖5為模型組MMP-9陽性細(xì)胞圖(↑)，免疫組織化學(xué)染色(SABC法)，×400

圖6為治療組MMP-9陽性細(xì)胞圖(↑)，免疫組織化學(xué)染色(SABC法)，×400

圖7為對照組TNF-a表達(dá)圖(SP×400)

圖8為模型組TNF-a表達(dá)圖(SP×400)

圖9為本發(fā)明藥物低劑量組TNF-a表達(dá)圖(SP×400)

圖10為茶堿緩釋組TNF-a表達(dá)圖(SP×400)

圖11為本發(fā)明藥物高劑量組圖(SP×400)

具體實(shí)施方式

下面以實(shí)施例作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1本發(fā)明組合物的制備

處方：紅參80g、蛤蚧40g、三七80g、川貝母40g、甘草120g、地龍40g、川芎600g。

制法：

(1)按處方稱取各原料藥；

(2)將甘草、川芎加7倍量水浸泡30分鐘，煎煮二次，每次1小時(shí)；合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至5000ml，靜至12小時(shí)，過濾，濾液減壓濃縮至相對密度為1.20—1.25(80℃測)的清膏，100℃烘干成干浸膏，備用；

(3)將紅參、蛤蚧、三七、川貝母、地龍五味藥材粉碎成細(xì)粉，與步驟(2)的干浸膏混合，粉碎成細(xì)粉，裝入膠囊，制成1000粒，即得。

性狀：本品為硬膠囊，內(nèi)容物為黃褐色粉末；氣微腥，味微甜而后苦。

實(shí)施例2本發(fā)明組合物的制備

處方：紅參56g、蛤蚧28g、三七56g、川貝母28g、甘草96g、地龍52g、川芎720g。

制備工藝：同實(shí)施例1的制備工藝。

實(shí)施例3本發(fā)明組合物的制備

處方：紅參104g、蛤蚧52g、三七104g、川貝母52g、甘草144g、地龍28g、川芎480g。

制備工藝：同實(shí)施例1的制備工藝。

實(shí)施例4本發(fā)明組合物的制備

處方：同實(shí)施例1的處方。

制備工藝：按處方稱取各原料藥，粉碎，過篩，混合均勻，分裝，即得。

以下用試驗(yàn)例的方式說明本發(fā)明的有益效果：

試驗(yàn)例1本發(fā)明組合物對COPD的功效

(一)對COPD大鼠肺MMP-2表達(dá)的影響

一、實(shí)驗(yàn)材料

本發(fā)明藥物膠囊：實(shí)施例1制備的藥物組合物，

本發(fā)明藥物膠囊溶液：用生理鹽水稀釋的本發(fā)明藥物膠囊，按生藥計(jì)濃度為100g/L。

脂多糖(lipopolysaccharicle,LPS)(美國Sigma公司)，紅河牌過濾嘴香煙(云南紅河卷煙廠生產(chǎn))，兔抗鼠MMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶2)、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(棕黃色)，均為武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。

OLYMPUS Bx-50顯微鏡、DP12數(shù)碼相機(jī)為日本OLYMPUS光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，GD-8病理彩色圖像分析系統(tǒng)為成都電子科技大學(xué)生產(chǎn)。

Wistar雄大鼠30只(220-250g)由四川瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供(為一級合格動(dòng)物，許可證號(hào)：川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第17號(hào))。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、動(dòng)物分組

將成年Wistar雄大鼠(220-250g)30只隨機(jī)分為對照組、模型組和治療組，各10只。

2、COPD大鼠動(dòng)物模型的建立及取材

模型組大鼠于第1、14天氣管內(nèi)滴注LPS各200μg·(200μl)^－1，第2～13天、第15～28天每天上午在自制的54L密閉箱內(nèi)熏體積分?jǐn)?shù)為0.05的紅河牌香煙霧0.5h。治療組大鼠先制作COPD模型，然后于實(shí)驗(yàn)第29～56天用100g/L的本發(fā)明藥物膠囊溶液灌胃(0.43g/㎏·日)，第57天乙醚麻醉大鼠，快速開胸，剪開氣管，從氣管內(nèi)向肺內(nèi)注射40g/L的中性甲醛溶液(使壓力維持在1kPa左右，約10cmH₂O)，30分鐘后取右肺中葉組織0.5mm³，置于40g/L的中性甲醛溶液繼續(xù)固定12h。對照組大鼠于第1、14天用相同體積的生理鹽水代替LPS作氣管內(nèi)滴注，但不熏煙，第29～56天用相同體積的生理鹽水代替本發(fā)明藥物膠囊溶液灌胃，余同治療組。模型組經(jīng)造模后用相同體積的生理鹽水代替本發(fā)明藥物膠囊溶液灌胃，余同治療組。

3、石蠟切片與免疫組化

各大鼠肺組織行常規(guī)石蠟切片，片厚4μm。各切片脫蠟至水，常規(guī)SABC法進(jìn)行MMP-2免疫組織化學(xué)反應(yīng)(一抗?jié)舛葹?1﹕150)，DAB室溫顯色。陰性對照用0.01M的PBS代替一抗。

4、照相、圖像分析

用DP12數(shù)碼相機(jī)在400倍下照相，用GD-8病理彩色圖像分析系統(tǒng)對各切片在400倍下進(jìn)行圖象分析，每張切片在有細(xì)支氣管的周圍隨機(jī)選擇2個(gè)計(jì)算機(jī)視野，測定各組有MMP-2陽性反應(yīng)物質(zhì)的光密度，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。光密度反應(yīng)某物質(zhì)吸收光的程度，被測結(jié)構(gòu)顏色越深，光密度值則越大。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

組間比較用方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

見表1、圖1-3。

表1.三組大鼠肺組織MMP-2陽性細(xì)胞的光密度(x±s)

▲P<0.05，與對照組比；★P<0.05，與模型組比

MMPs是降解氣道各種細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，其中，MMP-2主要降解彈力纖維、纖維連接素及I、Ⅳ、V、Ⅶ型膠原等，MMP-2的增多使氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞失去正常的支撐作用，是肺氣腫形成的重要環(huán)節(jié)，參與了COPD病理過程中氣道的重塑。

由表1、圖1-3可知，三組大鼠肺組織MMP-2的表達(dá)均廣泛且相似，主要位于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡隔內(nèi)的成纖維細(xì)胞及部分Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞，陽性細(xì)胞為胞質(zhì)染棕色。

其中模型組大鼠肺組織MMP-2的表達(dá)較對照組顯著增強(qiáng)(P<0.05)，且陽性的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增多；而治療組大鼠肺組織MMP-2的表達(dá)較模型組顯著減弱(P<0.05)。

可見，本發(fā)明組合物可以降低COPD大鼠肺組織中MMP-2的表達(dá)，有效地預(yù)防大鼠肺氣腫的形成,可用于預(yù)防及治療COPD。

(二)對COPD大鼠肺MMP-9表達(dá)的影響

一、實(shí)驗(yàn)材料

本發(fā)明藥物膠囊：實(shí)施例1制備的藥物組合物，

本發(fā)明藥物膠囊溶液：用生理鹽水稀釋的本發(fā)明藥物膠囊，按生藥計(jì)濃度為100g/L。

脂多糖(lipopolysaccharicle,LPS)(美國Sigma公司)，紅河牌過濾嘴香煙(云南紅河卷煙廠生產(chǎn))，兔抗鼠MMP-9、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(棕黃色)，均為武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。

OLYMPUS Bx-50顯微鏡、DP12數(shù)碼相機(jī)為日本OLYMPUS光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，GD-8病理彩色圖像分析系統(tǒng)為成都電子科技大學(xué)生產(chǎn)。

Wistar雄大鼠30只(220-250g)由四川瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供(為一級合格動(dòng)物，許可證號(hào)：川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第17號(hào))。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、動(dòng)物分組

將成年Wistar雄大鼠(220—250g)30只隨機(jī)分為對照組、模型組和治療組，各10只。

2、COPD大鼠動(dòng)物模型的建立及取材

模型組大鼠于第1、14天氣管內(nèi)滴注LPS各200μg·(200μl)^－1，第2～13天、第15～28天每天上午在自制的54L密閉箱內(nèi)熏體積分?jǐn)?shù)為0.05的紅河牌香煙霧0.5h。治療組大鼠先制作COPD模型，然后于實(shí)驗(yàn)第29～56天用100g/L的本發(fā)明藥物膠囊溶液灌胃(0.43g/㎏·日)，第57天乙醚麻醉大鼠，快速開胸，剪開氣管，從氣管內(nèi)向肺內(nèi)注射40g/L的中性甲醛溶液(使壓力維持在1kPa左右，約10cmH₂O)，30分鐘后取右肺中葉組織0.5mm³，置于40g/L的中性甲醛溶液繼續(xù)固定12h。對照組大鼠于第1、14天用相同體積的生理鹽水代替LPS作氣管內(nèi)滴注，但不熏煙，第29～56天用相同體積的生理鹽水代替本發(fā)明藥物膠囊溶液灌胃，余同治療組。模型組經(jīng)造模后用相同體積的生理鹽水代替本發(fā)明藥物膠囊溶液灌胃，余同治療組。

3、石蠟切片與免疫組化

各大鼠肺組織行常規(guī)石蠟切片，片厚4μm。各切片脫蠟至水，常規(guī)SABC法進(jìn)行MMP-9免疫組織化學(xué)反應(yīng)(一抗?jié)舛葹?1﹕150)，DAB室溫顯色。陰性對照用0.01M的PBS代替一抗。

4、結(jié)果分析與判斷

用DP12數(shù)碼相機(jī)在400倍下照相，用GD-8病理彩色圖像分析系統(tǒng)對各切片在400倍下進(jìn)行圖象分析，每張切片在有細(xì)支氣管的周圍隨機(jī)選擇2個(gè)計(jì)算機(jī)視野，測定各組有MMP-9陽性反應(yīng)物質(zhì)的光密度，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。光密度反應(yīng)某物質(zhì)吸收光的程度，被測結(jié)構(gòu)顏色越深，光密度值則越大。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

組間比較用方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

見表2、圖4-6。

表2.三組大鼠肺組織MMP-9陽性細(xì)胞的光密度(x±s)

▲P<0.05，與對照組比；★P<0.05，與模型組比

MMPs是降解氣道各種細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，其中，MMP-9主要降解彈力纖維、纖維連接素、層黏連蛋白及Ⅳ、V、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型膠原等，MMP-9的增多使氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞失去正常的支撐作用，是肺氣腫形成的重要環(huán)節(jié)，參與了COPD病理過程中氣道的重塑。

由表2、圖4-6可知，

三組大鼠肺組織MMP-9的表達(dá)均廣泛且相似，主要位于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡隔內(nèi)的成纖維細(xì)胞及部分Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞，陽性細(xì)胞為胞質(zhì)染棕色。

其中模型組大鼠肺組織MMP-9的表達(dá)較對照組顯著增強(qiáng)(P<0.05)，且陽性的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增多；而治療組大鼠肺組織MMP-9的表達(dá)較模型組顯著減弱(P<0.05)。

可見，本發(fā)明組合物可以降低COPD大鼠肺組織中MMP-9的表達(dá)，有效地預(yù)防大鼠肺氣腫的形成,可用于預(yù)防及治療COPD。

(三)對COPD肺氣虛證大鼠肺組織TNF-a表達(dá)的影響

一、實(shí)驗(yàn)材料

本發(fā)明藥物：實(shí)施例1制備的藥物組合物，

兔抗鼠TNF-a(腫瘤壞死因子-a)多克隆抗體、SP免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。自制有機(jī)玻璃染毒箱:長×寬×高:60×40×40(cm)，箱體兩側(cè)均有換氣孔。OLYMPUS Bx-50顯微鏡、DP12數(shù)碼相機(jī)：日本OLYMPUS光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，瀘州醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。GD-8病理彩色圖像分析系統(tǒng)：成都電子科技大學(xué)生產(chǎn)。茶堿緩釋片，廣州邁特興華制藥廠有限公司生產(chǎn)。脂多糖：美國sigma公司生產(chǎn)。天下秀過濾嘴卷煙：川渝中煙工業(yè)公司廠生產(chǎn)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級健康雄性SD大鼠50只，體重270士20g，由重慶滕鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司提供。將50只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、茶堿緩釋組、本發(fā)明藥物低劑量組、本發(fā)明藥物高劑量組，每組10只。

2、造模

制備COPD“肺氣虛證”大鼠模型，具體方法如下：第1、14天分別向模型組、茶堿緩釋組、本發(fā)明藥物低劑量組、本發(fā)明藥物高劑量組大鼠氣管內(nèi)滴脂多糖200ul(1mg/mL)，對照組予以等量的生理鹽水；第2～13天，第15～28天(對照組除外)其余各組大鼠分次置于自制的有機(jī)玻璃染毒箱內(nèi)被動(dòng)吸煙，每次點(diǎn)燃8支香煙，每天1次，每次30分鐘。

3、模型評價(jià)

造模期間觀察記錄大鼠的一般情況；造模結(jié)束后，從各組隨機(jī)抽取1只大鼠處死，取右肺下葉行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理，判斷造模是否成功。

4、給藥

造模成功后，開始灌胃，灌胃劑量如下：對照組、模型組分別予以生理鹽水2ml/d，茶堿緩釋組予以茶堿緩釋片0.04g/kg.d，本發(fā)明藥物低劑量組、高劑量組分別予以本發(fā)明藥物0.31g/kg.d、0.62g/kg.d，連續(xù)灌胃16天。

5、標(biāo)本的采集

第45天，用1％戊巴比妥鈉溶液(50mg/kg)麻醉大鼠，取右肺下葉組織置于10％福爾馬林溶液中固定12小時(shí)，石蠟包埋、切片(每樣本連續(xù)切3張)，切片厚約5μm，常規(guī)做HE染色和免疫組化染色。

6、觀察指標(biāo)及檢測方法

6.1大鼠的一般情況

觀察各組大鼠的活動(dòng)度、飲食、皮毛光澤、對外反應(yīng)靈敏度、咳嗽、呼吸、鼻分泌物，反應(yīng)有無氣虛及氣虛的程度。

6.2計(jì)算平均肺泡數(shù)(MAN)

HE染色完后，在同一倍數(shù)下(10×10)，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野，計(jì)算MAN，測量時(shí)避開大血管和支氣管，測量方法如下：在每個(gè)視野正中心劃十字交叉線，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)的肺泡數(shù)(Na)，同時(shí)測出十字線總長(L)和每個(gè)視野面積(S)，按公式MAN＝Na/S，計(jì)算平均肺泡數(shù)，反映肺泡密度。病理組織讀片采用雙盲法。

6.3測量肺組織中TNF-a的表達(dá)

各切片脫蠟至水，常規(guī)SP法進(jìn)行TNF-a免疫組織化學(xué)反應(yīng)，DAB室溫顯色。陰性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。陽性結(jié)果，細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒。免疫組化染色完后，在同一高倍鏡(10×40)下，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野(避開大血管和支氣管)，由攝像系統(tǒng)提取數(shù)值化細(xì)胞圖像輸入Image-proPlus6.0形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，測量每視野陽性細(xì)胞的積分光密度值(IOD)和陽性細(xì)胞所占面積，按公式AOD＝IOD/area計(jì)算，取3個(gè)視野AOD的平均值作為每張切片的AOD值。

7、統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，多組間比較采用單因方差分析，組間兩兩比較采用LSD，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中，4只大鼠在煙熏過程中死亡，5只因氣管滴藥時(shí)麻醉過量致死。

1、各組大鼠的一般情況

造模結(jié)束后，光鏡下觀察大鼠肺組織病理切片顯示：支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞脫落、壞死，氣道管壁充血水腫，粘膜、粘膜下層可見大量的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤；肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺泡壁變薄或斷裂，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合成肺大皰，MAN較正常對照組減少，符合人類慢性阻塞性肺疾病的病理表現(xiàn)。結(jié)合大鼠的一般情況，大鼠咳嗽、氣喘逐漸加重，鼻分泌物增多，毛發(fā)萎黃、無光澤，活動(dòng)量減少，行動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍，說明COPD肺氣虛證模型復(fù)制成功。

各組大鼠的一般情況如下：

對照組：大鼠皮毛光澤、活潑好動(dòng)、外界反應(yīng)靈敏、呼吸平穩(wěn)、飲食正常。

模型組：大鼠毛發(fā)逐漸萎黃、無光澤、脫落，活動(dòng)量、食量逐漸減少，反應(yīng)遲鈍、鼻分泌物增多、呼吸急促、咳嗽頻繁、撮毛、蜷縮。

各治療組：灌藥前，各組大鼠情況同模型組，治療過程中，各組大鼠的上述癥狀逐漸減輕，以本發(fā)明藥物高劑量組改善最明顯。

2、各組大鼠肺組織TNF-a的免疫組化結(jié)果

見圖7-11：光鏡下觀察，大鼠肺組織中TNF-a陽性著色部位主要位于胞漿，呈棕黃色。對照組TNF-a呈弱陽性表達(dá)，陽性產(chǎn)物為淡黃色；模型組呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性產(chǎn)物為棕褐色；各治療組呈陽性表達(dá)，陽性產(chǎn)物為棕黃色。3、各組大鼠MAN、TNF-a平均光密度值的比較

見表3-4，其中：MAN：平均肺泡數(shù)；TNF-a：腫瘤壞死因子-a。

表3對照組、模型組MAN、TNF-a平均光密度值的比較

注：與對照組相比：▲P＜0.01；

表4模型組、各治療組MAN、TNF-a平均光密度值的比較

注：與模型組相比：△P＜0.01，▽P＜0.05；

與茶堿緩釋組相比：◆P＜0.05；

與本發(fā)明藥物低劑量組相比：□P＜0.01。

近年來，大量研究證實(shí)，炎癥介質(zhì)在COPD發(fā)病中起重要作用，TNF-α是一種主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的前炎癥細(xì)胞因子，TNF-α的大量產(chǎn)生和釋放則會(huì)破壞機(jī)體的免疫平衡，血清中TNF-α的變化可用于判斷COPD病情及治療效果。其中，急性加重期COPD患者痰液及氣道上皮細(xì)胞中的TNF-a水平比緩解期明顯升高，且與氣道阻塞程度呈正相關(guān)。急性加重期TNF-a與COPD患者發(fā)病有密切關(guān)系，其與嚴(yán)重感染有關(guān)。

從表3-4可知：

(1)各組大鼠MAN結(jié)果顯示：COPD模型組大鼠MAN較正常對照組顯著減少(P＜0.01)；各治療組MAN較模型組增加(P均＜0.05)；各治療組組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，以本發(fā)明藥物高劑量組效果顯著。

(2)各組大鼠肺組織TNF-a AOD值結(jié)果顯示：模型組肺組織TNF-a的AOD值顯著高于對照組(P＜0.01)；各治療組肺組織中TNF-a的AOD值均低于模型組(P均＜0.01)；各治療組組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，以本發(fā)明藥物高劑量組效果顯著。

說明本發(fā)明藥物可以降低大鼠肺組織中TNF-a的表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞趨化、聚集，達(dá)到預(yù)防及治療COPD的目的。

綜上，本發(fā)明組合物可以通過降低肺組織中MMP-2、MMP-9、TNF-a的表達(dá)，有效地預(yù)防肺氣腫的形成,可用于預(yù)防及治療COPD。

試驗(yàn)例2本發(fā)明組合物治療COPD穩(wěn)定期的臨床觀察

一、研究對象

選擇2007年6月-2009年12月到我院就診的COPD穩(wěn)定期患者87例，均符合COPD診治指南2007年修訂版標(biāo)準(zhǔn)，病情分級為Ⅰ～Ⅱ級，慢性起病(病程在2年以上)，年齡40～75歲，中醫(yī)辨證為氣虛血瘀痰阻證，均簽署知情同意書。利用投硬幣的方法將研究對象隨機(jī)分為2組，治療組44例，男28例，女16例，平均年齡(64.11±10.83)歲，其中Ⅰ級27例，Ⅱ級17例；對照組43例，男26例，女17例，平均年齡(65.06±9.84)歲，其中Ⅰ級26例，Ⅱ級17例；2組性別構(gòu)成(χ²＝0.093)、年齡(t＝0.428)及病情分級(χ²＝0.007)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)，具有可比性。

二、實(shí)驗(yàn)方法

2.1試劑及治療方法

本發(fā)明藥物：實(shí)施例1制備的藥物組合物，規(guī)格：48粒/瓶，0.4g/粒。

對照組按GOLD(COPD全球倡議)方案給藥：Ⅰ級不用藥，Ⅱ級使用支氣管擴(kuò)張劑茶堿緩釋片，0.1g/次，2次/d，3個(gè)月為1個(gè)療程。

治療組在對照組用藥的基礎(chǔ)上，同時(shí)口服本發(fā)明藥物，4粒/次，3次/d。

2.2檢測指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

(1)中醫(yī)證候療效標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》進(jìn)行評定，共分為4類：①臨床控制：臨床癥狀、體征消失或基本消失，證候積分減少≥95％。②顯效：臨床癥狀、體征明顯改善，證候積分減少≥70％。③有效：臨床癥狀、體征均有好轉(zhuǎn)，證候積分減少≥30％。④無效：臨床癥狀、體征均無明顯改善，甚或加重，證候積分減少不足30％。證候積分計(jì)算：根據(jù)咳嗽、咯痰、喘息癥狀分為無、輕、中、重度，積分分別為0、1、2、3分；依據(jù)舌象、脈象正常、異常積分分別為0、1分；聽哮鳴音或濕鳴音無、少、中(散在)、重(滿布肺野)積分分別為0、1、2、3分；查肺氣腫體征(分別計(jì)算望、捫、叩、聽)：無、有，積分分別為0、1分。(2)肺通氣功能檢測：FEV₁％(第1秒用力呼氣容積)、FEV₁/FVC(第1秒用力呼氣容積/用力呼氣量)均采用德國耶格公司生產(chǎn)的Master-screenPET肺功能儀進(jìn)行檢測。(3)BODE指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)按照Celli BR.等提出的方法進(jìn)行計(jì)算：①BMI(kg/m²)：體質(zhì)指數(shù)＝體質(zhì)量(kg)/[身高(m)]。②FEV₁％pred:第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值的百分比。③MRC分級(呼吸困難量表分級)：0級：除非劇烈活動(dòng)，無明顯呼吸困難。1級：當(dāng)快走或上緩坡時(shí)有氣短。2級：由于呼吸困難比同齡人步行得慢，或以自己的速度在平地上行走時(shí)需要停下來呼吸。3級：在平地上行走100米或數(shù)分鐘后需要停下來呼吸。4級：明顯的呼吸困難、不能離開住所或穿脫衣服時(shí)出現(xiàn)氣短。④6MWD(6分鐘行走距離實(shí)驗(yàn))：在室內(nèi)一條長35m的道路進(jìn)行測定，操作規(guī)程符合6MWD標(biāo)準(zhǔn)測量方法。BODE指數(shù)評分表見表5。

表5 BODE指數(shù)評分表

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，計(jì)量資料以表示，2組間比較行兩樣本比較的t檢驗(yàn)，治療前后用配對t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例(％)表示，行χ²檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 2組中醫(yī)證候療效比較見表6。

表6 2組中醫(yī)證候療效比較例(％)

可見，治療組中醫(yī)證候療效總有效率(88.64％)高于對照組(67.44％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ²＝5.723，P＝0.017)，本發(fā)明藥物可有效治療COPD患者。

3.2 2組肺功能指標(biāo)比較

見表7。

表7 2組治療前后FEV₁％、FEV₁/FVC比較(％，)

^*P<0.05，^**P<0.01

可見，治療組在治療后FEV₁％、FEV₁/FVC均呈現(xiàn)出不同程度的上升，治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；對照組治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，本發(fā)明藥物可有效改善COPD患者的肺功能。

3.3 2組BODE指數(shù)比較

見表8。

表8 2組治療前后BODE指數(shù)比較(分，)

^*P<0.05

BODE評分系統(tǒng)從患者的生理因素、氣道阻塞程度、呼吸困難的程度及運(yùn)動(dòng)能力4個(gè)方面綜合評價(jià)COPD患者的疾病狀態(tài)，能全面反映COPD患者的呼吸和系統(tǒng)性特征；且BODE指數(shù)與COPD患者的生存質(zhì)量密切相關(guān)，是評價(jià)慢性阻塞性肺疾病患者病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。

可見，2組BODE指數(shù)在治療后均降低，治療組治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，對照組治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明本發(fā)明藥物對COPD患者減輕病情嚴(yán)重程度，提高生活質(zhì)量具有良好作用。

3.4安全性及不良反應(yīng)

觀察期間2組病人未發(fā)現(xiàn)肝、腎功能損害，治療組有少數(shù)病人(3例)出現(xiàn)口干，對整個(gè)治療過程未產(chǎn)生影響，余無其他不良反應(yīng)。

可見，本發(fā)明藥物使用安全可靠。

因此，本發(fā)明組合物對能有效提高COPD穩(wěn)定期患者的中醫(yī)證候療效，緩解臨床癥狀；延緩肺功能下降，減緩病情進(jìn)展；降低BODE指數(shù)平均值,提高患者的生存質(zhì)量，輔助治療效果顯著，使用安全。

綜上所述，本發(fā)明組合物配伍合理，可降低COPD患者的MMP-2、MMP-9和TNF-a的表達(dá)，對COPD患者的療效顯著，臨床治愈率高；而且本發(fā)明組合物安全性好，使用方便，為臨床提供了一種新的藥物選擇。