本發(fā)明屬于醫(yī)藥用途領(lǐng)域，具體涉及一種用于治療胃癌的中藥復(fù)方組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
胃癌(gastriccancer)是全球癌癥相關(guān)死亡的第3大常見(jiàn)病因，也是發(fā)病率排名第4的常見(jiàn)惡性腫瘤，被視為國(guó)際間重要的健康危機(jī)。癌的分類可分為早期胃癌及進(jìn)行性胃癌，臨床表現(xiàn)癥狀則是模糊且不具特異性。大部分診斷出胃癌的病人被發(fā)現(xiàn)時(shí)都已經(jīng)是以進(jìn)行性疾病的形式來(lái)呈現(xiàn)。一般而言，胃癌病人平均五年的存活率大約為22%左右，而晚期胃癌患者的五年的存活率更小于5%以下。
傳統(tǒng)的胃癌治療方式有手術(shù)治療、放療和化療三種，都是屬于胃癌的西醫(yī)治療方法的范疇。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，超過(guò)50%的病人會(huì)進(jìn)行手術(shù)，但是，手術(shù)之后，大約60-70%的病人會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性的胃癌仍然是一種無(wú)法治愈的疾病。而且手術(shù)對(duì)胃癌患者身體的損耗很大，容易使原本虛弱的患者身體更加虛弱，從而導(dǎo)致術(shù)后恢復(fù)緩慢，體內(nèi)殘留的癌細(xì)胞更加快速生長(zhǎng)。放化療在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)，會(huì)對(duì)人體正常免疫細(xì)胞，正常器官也造成一定傷害，發(fā)生惡心、嘔吐、無(wú)食欲、脫發(fā)等癥狀，這些都是西醫(yī)治療的副作用。
中醫(yī)藥治療腫瘤，近年來(lái)受到重視。越來(lái)越多的臨床研究表明，中藥可以調(diào)整或增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，改善患者臨床癥狀，增強(qiáng)或鞏固放化療效果，減輕毒副反應(yīng)，延長(zhǎng)患者帶瘤存活時(shí)間，提高患者生活質(zhì)量。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種療效良好、毒副作用小的用于治療胃癌的中藥復(fù)方組合物。
本發(fā)明用于治療胃癌的中藥復(fù)方組合物，其特征在于，由如下重量份的原料制備而成：蘭坪蟲草40-45份、蛹蟲草5-7份、靈芝2-4份、三七4-6份、鐵皮石斛2-4份、山茶果6-8份、黃芩4-6份、滇重樓3-5份、龍葵1-3份、蒲公英1-3份、土茯苓4-6份、半夏5-7份、薏苡仁4-6份、白芍2-4份、大棗2-4份、甘草1-3份、桔梗1-3份、山藥2-4份、枸杞1-3份、蘆筍5-7份。
所述蘭坪蟲草（ophiocordycepslanpingensishyu&zhchen）以2007年在蘭坪縣營(yíng)盤鎮(zhèn)采集到的蟲草新鮮材料為種子，經(jīng)人工栽培得到。
具體栽培方法為：將種子培養(yǎng)基（包含土豆粉20%、葡萄糖20%）經(jīng)115℃滅菌30min后接入適量的蘭坪蟲草菌絲體，置于20℃，150r/min搖床上培養(yǎng)15d，得到蘭坪蟲草種子液。隨后，將蘭坪蟲草種子液以8%的接種量接入50ml大米蠶蛹培養(yǎng)基（大米8g、蠶蛹9g、酵母1g、土豆粉0.1g、蔗糖0.1g、kh2po40.025g、mgso40.05g、維生素溶液0.1ml；其中維生素溶液包含vb10.002%、vb60.004%、煙酸0.004%），置于16℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)10d，然后，轉(zhuǎn)入20℃培養(yǎng)箱內(nèi)每天光照12h培養(yǎng)12d，最后在22℃培養(yǎng)箱內(nèi)弱光培養(yǎng)至蘭坪蟲草子實(shí)體成熟，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程在45d左右。
冬蟲夏草的有效成分主要是蟲草多糖，蟲草多糖是由甘露糖、蟲草素腺苷、半乳糖、阿拉伯糖、木糖精、葡萄糖、巖藻糖組成的多聚糖。大量實(shí)驗(yàn)研究均表明，蟲草多糖可提高人體免疫力和升高白細(xì)胞含量；而人工培養(yǎng)蘭坪蟲草中的多糖含量則顯著高于野生蘭坪蟲草和野生冬蟲夏草。
雖然有研究表明，以蛹蟲草為代表的多類蟲草中的蟲草多糖含量也都高于野生冬蟲夏草，但對(duì)它們的抗癌能力進(jìn)行研究，卻發(fā)現(xiàn)作用都不明顯，而人工培養(yǎng)蘭坪蟲草對(duì)癌癥的治療效果卻很明顯，甚至要優(yōu)于野生冬蟲夏草。
本發(fā)明另一目的是提供上述中藥復(fù)方組合物的制備方法，包括如下步驟：
（1）按比例稱取蘭坪蟲草、蛹蟲草、靈芝、三七、鐵皮石斛、山茶果、黃芩、滇重樓、龍葵、蒲公英、土茯苓、半夏、薏苡仁、白芍、大棗、甘草、桔梗、山藥、枸杞、蘆筍，清洗晾干，混合研磨粉碎至100-150目；
（2）混合物料用水浸泡后，沸水煎煮，過(guò)濾濾渣重復(fù)煎煮1-2次，合并濾液；
（3）將步驟（2）濾液減壓濃縮，得到相對(duì)密度為1.15-1.5的浸膏；
（4）將步驟（3）浸膏加水稀釋后與等體積的d-101型大孔吸附樹(shù)脂混合拌勻，上樣于d-101型大孔吸附樹(shù)脂柱中，靜態(tài)吸附20-40min，然后用水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；
（5）將步驟（4）洗脫液濃縮干燥，即得用于輔助治療胃癌的中藥復(fù)方組合物。
上述方法中濃縮、干燥溫度均不超過(guò)70℃。
本發(fā)明所述中藥復(fù)方組合物在用于治療胃癌時(shí)是作為治療的主要活性成分，在該組合物中還可以加入一種或多種藥物上可接受的輔料，并可將組合物制成藥劑學(xué)上任何一種常用的內(nèi)服藥劑型，包括但不限于糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、糖漿劑、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、滴丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、液劑、注射劑；且輔料添加量為常規(guī)劑量，制備工藝為常規(guī)工藝。
所述膠囊含有上述中藥復(fù)方組合物和藥用輔料，所述藥用輔料包括潤(rùn)滑劑、填充劑等，填充劑選自乳糖、微晶纖維、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、預(yù)膠化淀粉中的一種或幾種；崩解劑選自羥丙基纖維素、羥甲基淀粉鈉、羧甲基纖維素鈉、十二烷基硫酸鈉、十六烷基硫代琥珀酸鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、磺基丁二酸二辛酯鈉中的一種或幾種；潤(rùn)滑劑選自十二烷基硫酸鎂、二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣中的一種或幾種。
所述顆粒劑含有中藥復(fù)方組合物和藥用輔料，所用藥物輔料包括填充劑。填充劑選自乳糖、微晶纖維、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、預(yù)膠化淀粉中的一種或幾種。
所述顆粒劑的制備方法為：（1）按照上述方法制備中藥復(fù)方組合物；（2）將中藥復(fù)方組合物粉碎后，加入填充劑，混合均勻，加入水制粒、干燥、整粒。
例如片劑的制備方法為：（1）按照上述方法制備中藥復(fù)方組合物；（2）將中藥復(fù)方組合物粉碎，加入乳糖，再加入淀粉、羥丙基纖維素，混合均勻，用水制粒、干燥、整粒，加入硬脂酸鎂，混合均勻，壓片，制成片。
為了證明本發(fā)明的中藥復(fù)方組合物的安全性，首先進(jìn)行其對(duì)人正常肺上皮細(xì)胞株beas-2b的活性影響的實(shí)驗(yàn)。采用本發(fā)明的中藥復(fù)方組合物連續(xù)72h作用于人正常肺上皮細(xì)胞株beas-2b，結(jié)果表明，本發(fā)明的中藥復(fù)方組合物對(duì)人正常肺上皮細(xì)胞株beas-2b無(wú)毒副作用，表明本發(fā)明中藥復(fù)方組合物毒副作用小，可以長(zhǎng)期使用。
為了證明本發(fā)明中藥復(fù)方組合物對(duì)胃癌的治療作用，采用本發(fā)明的中藥復(fù)方組合物作用于人胃癌細(xì)胞株sgc-7901以及接受手術(shù)及化療治療后的病人。結(jié)果表明，本發(fā)明的中藥復(fù)方組合物能夠有效抑制人胃癌細(xì)胞株sgc-7901的活性，延長(zhǎng)胃癌患者的生存期，提高胃癌患者的生存質(zhì)量。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下：（1）本發(fā)明的中藥復(fù)方組合物療效好，毒副作用小，價(jià)格便宜，適于臨床普及使用；（2）本發(fā)明的中藥復(fù)方組合物可以制成多種形式的藥物，如膠囊、片劑和顆粒劑，滿足不同患者的需求；（3）本發(fā)明20味中藥配伍使用，可扶正固本，攻邪除結(jié)、清熱解毒、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)，可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抑制腫瘤生長(zhǎng)適于臨床廣泛推廣；（4）該組合物制備工藝簡(jiǎn)單，易操作，適于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
附圖說(shuō)明
圖1為中藥復(fù)方組合物對(duì)人胃癌細(xì)胞株sgc-7901蛋白表達(dá)的影響結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中方法如無(wú)特殊說(shuō)明的采用常規(guī)方法，使用的試劑如無(wú)特殊說(shuō)明的使用常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。
實(shí)施例1：本用于治療胃癌的中藥復(fù)方組合物，由如下原料制備而成：蘭坪蟲草400g、蛹蟲草50g、靈芝20g、三七40g、鐵皮石斛20g、山茶果60g、黃芩40g、滇重樓30g、龍葵10g、蒲公英10g、土茯苓40g、半夏50g、薏苡仁40g、白芍20g、大棗20g、甘草10g、桔梗10g、山藥20g、枸杞10g、蘆筍50g。
上述組合物制備工藝如下：將上述藥材清洗晾干，混合研磨粉碎至100目，用紗布包裹，用水浸泡后，沸水煎煮0.5h，過(guò)濾濾渣重復(fù)煎煮2次，合并濾液；濾液減壓濃縮（70℃）得相對(duì)密度為1.20的浸膏，將浸膏加其質(zhì)量5倍的水稀釋后與等體積的d-101型大孔吸附樹(shù)脂混合拌勻，上樣于d-101型大孔吸附樹(shù)脂柱中，上樣量為1:30（浸膏量:樹(shù)脂量的質(zhì)量比），靜態(tài)吸附30分鐘，然后用10個(gè)柱體積的水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮并干燥（70℃），將干燥物粉碎即得用于治療胃癌的中藥復(fù)方組合物。
實(shí)施例2：本用于治療胃癌的中藥復(fù)方組合物，由如下原料制備而成：蘭坪蟲草450g、蛹蟲草70g、靈芝40g、三七60g、鐵皮石斛40g、山茶果80g、黃芩60g、滇重樓50g、龍葵30g、蒲公英30g、土茯苓60g、半夏70g、薏苡仁60g、白芍40g、大棗40g、甘草30g、桔梗30g、山藥40g、枸杞30g、蘆筍70g。
上述組合物制備工藝如下：將上述藥材清洗晾干，混合研磨粉碎至120目，用紗布包裹，用水浸泡后，沸水煎煮0.5h，過(guò)濾濾渣重復(fù)煎煮1次，合并濾液；濾液減壓濃縮（60℃）得相對(duì)密度為1.4的浸膏，將浸膏加其質(zhì)量5倍的水稀釋后與等體積的d-101型大孔吸附樹(shù)脂混合拌勻，上樣于d-101型大孔吸附樹(shù)脂柱中，上樣量為1:30（浸膏量:樹(shù)脂量），靜態(tài)吸附25分鐘，然后用10個(gè)柱體積的水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮并干燥（70℃），將干燥物粉碎即得用于治療胃癌的中藥復(fù)方組合物。
實(shí)施例3：本用于治療胃癌的中藥復(fù)方組合物，由如下原料制備而成：蘭坪蟲草420g、蛹蟲草50g、靈芝30g、三七50g、鐵皮石斛30g、山茶果70g、黃芩50g、滇重樓40g、龍葵20g、蒲公英20g、土茯苓50g、半夏60g、薏苡仁50g、白芍30g、大棗30g、甘草20g、桔梗20g、山藥30g、枸杞20g、蘆筍60g。
上述組合物制備工藝如下：將上述藥材清洗晾干，混合研磨粉碎至120目，用紗布包裹，用水浸泡后，沸水煎煮0.5h，過(guò)濾濾渣重復(fù)煎煮1次，合并濾液；濾液減壓濃縮（60℃）得相對(duì)密度為1.3的浸膏，將浸膏加其質(zhì)量5倍的水稀釋后與等體積的d-101型大孔吸附樹(shù)脂混合拌勻，上樣于d-101型大孔吸附樹(shù)脂柱中，上樣量為1:30（浸膏量:樹(shù)脂量），靜態(tài)吸附35分鐘，然后用10個(gè)柱體積的水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮并干燥（70℃），將干燥物粉碎即得用于治療胃癌的中藥復(fù)方組合物。
為驗(yàn)證上述中藥復(fù)方組合物的活性，采用上述實(shí)施例制得的中藥復(fù)方組合物作用于人胃癌細(xì)胞株sgc-7901以及人正常肺上皮細(xì)胞beas-2b：
1材料
1.1藥物：上述實(shí)施例制備的中藥復(fù)方組合物
1.2細(xì)胞株：人胃癌細(xì)胞株sgc-7901，人正常肺上皮細(xì)胞株beas-2b。
2實(shí)驗(yàn)方法
2.1細(xì)胞培養(yǎng)：人胃癌細(xì)胞株sgc-7901、人正常肺上皮細(xì)胞株beas-2b培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基中，置于5%co2，37℃，飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每24h更換一次新鮮培養(yǎng)基，并按1：3的比例傳代培養(yǎng)，以保證實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。傳代時(shí)，先用pbs（ph=7.2）清洗細(xì)胞兩次，隨后加入胰酶液（含0.25%胰酶）1ml覆蓋培養(yǎng)瓶底面，于37℃培養(yǎng)箱中消化3-5min，加入3-5ml含血清的rpmi-1640培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞液離心（1000r/min，5min），離心后棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
2.2實(shí)驗(yàn)分組
中藥復(fù)方組合物組：使用rpmi-1640培養(yǎng)基溶解中藥復(fù)方組合物，采用梯度稀釋法，設(shè)置6個(gè)濃度梯度，分別為15.625μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml和250μg/ml；
陰性對(duì)照組：加rpmi-1640培養(yǎng)液；空白對(duì)照組：不加細(xì)胞。
2.3噻唑鹽（mtt）比色法進(jìn)行體外細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)
將1×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔加入100μl。實(shí)驗(yàn)組同時(shí)分別加入100μl5個(gè)濃度的測(cè)試藥物，每個(gè)濃度5個(gè)平行孔，另設(shè)5個(gè)不加藥物的細(xì)胞孔作為對(duì)照。37℃，5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，1000r/min離心5min，棄上清。再向每孔加入0.5mg/ml的mtt與pbs緩沖液（ph=7.4）的混合液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，1500r/min離心10min，棄去上清液，每孔加入150μl二甲基亞砜（dmso），震蕩2min使細(xì)胞中的結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm波長(zhǎng)下的吸光度值，按下公式計(jì)算細(xì)胞存活率及藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率：
其中，陰性對(duì)照組平均od值=陰性對(duì)照組實(shí)際測(cè)定的平均od值-空白組實(shí)際測(cè)定的平均od值；用藥組平均od值=給藥組實(shí)際測(cè)定的平均od值-空白實(shí)際測(cè)定的平均od值。
3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
數(shù)據(jù)采用spss8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、2；
表1：中藥復(fù)方組合物對(duì)人胃癌細(xì)胞株scg-7901活性的影響
表2：中藥復(fù)方組合物對(duì)人正常肺上皮細(xì)胞株beas-2b活性的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明中藥復(fù)方組合物能抑制人胃癌細(xì)胞株sgc-7901的細(xì)胞活性，并能顯示出一定的劑量依賴關(guān)系和時(shí)效依賴關(guān)系，即隨著藥物濃度的增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制率越高，抑制率可達(dá)到72.21±1.39%。與此同時(shí)，本發(fā)明中藥復(fù)方組合物不會(huì)對(duì)人正常肺上皮細(xì)胞株beas-2b的活性產(chǎn)生抑制作用，說(shuō)明本發(fā)明復(fù)方中藥組合物對(duì)人正常細(xì)胞是安全的。
westernblot法檢測(cè)上述實(shí)施例制得的中藥復(fù)方組合物對(duì)胃癌細(xì)胞株sgc-7901蛋白表達(dá)量的影響
1、實(shí)驗(yàn)方法：將中藥復(fù)方組合物作用于人胃癌細(xì)胞株sgc-790148h，胰酶消化并收集細(xì)胞，采用蛋白裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解。bca試劑盒測(cè)定蛋白樣品濃度。配制sds-page凝膠后，在蛋白樣品中加入適量5×sds-page蛋白上樣緩沖液，100℃或沸水浴加熱5min，冷卻到室溫后，把蛋白樣品上樣到sds-page膠加樣孔內(nèi)進(jìn)行電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近停止電泳。選用pvdf膜，使用bio-rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為120min。加入western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60min。參考一抗的說(shuō)明書，按照適當(dāng)比例用一抗稀釋液稀釋一抗。在4℃恒溫?fù)u床上孵育過(guò)夜。加入western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌30min，共洗滌3次。參考二抗的說(shuō)明書，按照適當(dāng)比例用二抗稀釋液稀釋二抗，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)室溫孵育1h。加入western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌30min，共洗滌3次。使用eclplus試劑來(lái)檢測(cè)蛋白。用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。本實(shí)驗(yàn)選取濃度2作為實(shí)驗(yàn)濃度，與空白對(duì)照對(duì)比抑癌基因蛋白（ccdc8，p16），凋亡基因蛋白（caspase3，caspase8）的變化，以研究中草藥組合物對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制機(jī)理。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1；結(jié)果表明中藥復(fù)方組合物對(duì)人胃癌細(xì)胞株sgc-7901的抑制作用是通過(guò)調(diào)控ccdc8、p16、caspase8的通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
臨床實(shí)驗(yàn)
所有病例均為2009年1月-2014年4月云南省腫瘤醫(yī)院腹部外科患者，均經(jīng)胃鏡檢查及病理學(xué)證實(shí)。選擇中、晚期（按a-jcc癌癥分期法確診為ⅲ、ⅳ期）胃癌患者246例作為研究對(duì)象，其中男性180例，女性66例，平均年齡（62.61±10.26）歲。分組如下：中藥復(fù)方組合物配合化療組和對(duì)照組。其中，中藥復(fù)方組合物配合化療組214例，男152例，女62例，平均年齡（61.76±13.55）歲；對(duì)照組32例，男21例，女11例，平均年齡（64.84±12.77）歲。2組在男女比例及年齡上沒(méi)有顯著差異。
中藥復(fù)方組合物配合化療組在化療的基礎(chǔ)上，口服中藥復(fù)方組合物1g-1.5g，每日3次；對(duì)照組采用氟尿嘧啶持續(xù)輸注配合化療的治療方法。結(jié)果顯示，中藥復(fù)方組合物配合化療治療ⅲ、ⅳ期胃癌可顯著地提高患者的生活質(zhì)量，與對(duì)照組相比具有顯著差異性。利用中藥復(fù)方組合物配合化療組治療胃癌，病灶穩(wěn)定率達(dá)到79%，疾病控制率達(dá)90.2%，明顯優(yōu)于對(duì)照組的62.5%和52.5%。中藥復(fù)方組合物配合化療組治療胃癌，3年存活率為74.62%，5年存活率為60.37%，明顯優(yōu)于對(duì)照組的51.26%和24.31%。
典型案例如下：
昝某，65歲，2012年4月確診為：胃低分化腺癌（胃癌），采用手術(shù)治療。術(shù)后化療3個(gè)療程后，體重減輕，飲食減少，出現(xiàn)惡心嘔吐等癥狀。因化療副作用大，身體不能承受，隨后服用本發(fā)明中藥復(fù)方組合物，每日3次，每次1g-1.5g，30天為一個(gè)療程，連服兩個(gè)療程后見(jiàn)效，體力恢復(fù)正常，精神好轉(zhuǎn)，不良反應(yīng)消失。
白某，72歲，2013年出現(xiàn)腹痛，惡心，2014年初被確診為胃癌，采用手術(shù)療法，術(shù)后化療2個(gè)療程，但病情仍未得到控制。服用本發(fā)明中藥復(fù)方組合物，每日3次，每次1g-1.5g，30天為一個(gè)療程，服用三個(gè)療程后，食欲轉(zhuǎn)好，體重增加，精神明顯變好。