本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種載抗癌藥物的可注射納米短纖維dox/mwnts/plga及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著環(huán)境污染的加劇以及人們不良習(xí)慣的養(yǎng)成，使得癌癥的發(fā)生率變得越來越高。目前癌癥的治療手段依然是以手術(shù)療法、放射療法和化學(xué)療法為主。手術(shù)療法和放射療法屬于局部治療，帶有一定的局限性。化學(xué)療法可以通過藥物的釋放，對全身進行治療，同時還可以對潛在的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)以及中晚期癌細(xì)胞有較好的療效。但目前臨床用于癌癥治療的大多數(shù)化療藥物顯示出低的水溶性、有限的穩(wěn)定性、快速的血液清除和缺乏選擇性等問題，進入機體后不僅分布于腫瘤組織也分布在正常組織，在殺傷癌細(xì)胞的同時也損傷了人體正常組織細(xì)胞，從而導(dǎo)致療效低、毒副作用強。

針對化療存在的問題，學(xué)者也紛紛提出通過降低全身化療藥物濃度的同時提高癌細(xì)胞部位藥物濃度并延長藥物作用時間來達到腫瘤更好更長時間的治療效果。近年來，隨著納米技術(shù)的興起和各種生物相容性高分子材料的大量涌現(xiàn)，高分子材料的納米級藥物控釋系統(tǒng)受到了人們的廣泛關(guān)注。靜電紡絲法制備載藥纖維構(gòu)建的給藥系統(tǒng)因其包封率高、穩(wěn)定性好、控釋給藥以及可實現(xiàn)局部給藥的特點有望解決這一世界難題，已成為當(dāng)前癌細(xì)胞治療領(lǐng)域研究的熱點。

然而，目前通過靜電紡絲技術(shù)制備出具有復(fù)合性能的載藥纖維膜，多是作為外敷的醫(yī)用材料，藥效低、利用率低，大大影響了其廣闊的研究價值和使用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種載抗癌藥物的可注射納米短纖維及其制備方法和應(yīng)用。所述載抗癌藥物的納米纖維膜為直徑在納米級、長度在微米級的短纖維，可注射，提高了藥物的利用率，能夠更精準(zhǔn)、有效、安全地對腫瘤部位進行治療。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種載抗癌藥物的可注射納米短纖維的制備方法，包括如下步驟：

(1)按照質(zhì)量比1:2～2:1分別稱取dox和mwnts，超聲條件下進行充分均勻混合，之后調(diào)節(jié)ph為9.5～10，攪拌條件下進行充分反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)洗滌、離心、干燥，得到負(fù)載dox的mwnts粉體；

(2)取plga并加入到thf/dmf混合溶劑中，所述plga的添加質(zhì)量與所述混合溶劑的體積之比為0.2～0.3g/ml，攪拌使plga充分溶解，得到紡絲液；

(3)將步驟(1)所述負(fù)載dox的mwnts粉體加入到步驟(2)所述紡絲液中，所述負(fù)載dox的mwnts粉體的質(zhì)量與所述紡絲液的體積之比為4:1～6:1mg/ml，攪拌條件下進行充分分散，之后進行靜電紡絲，得到dox/mwnts/plga復(fù)合納米纖維膜；

(4)將步驟(3)所述的dox/mwnts/plga復(fù)合納米纖維膜進行破碎處理，得到碎片，向所述碎片中加入分散劑并浸泡10～20min，之后進行均質(zhì)處理，得到均質(zhì)液依次進行洗滌、離心、干燥，得到所述的載抗癌藥物的可注射納米短纖維。

步驟(1)中，所述mwnts采用如下方法制備得到：以lanio3為催化劑，導(dǎo)入甲烷在660～700℃催化裂解100～140min，再調(diào)溫至600～1000℃繼續(xù)裂解15～25min，得到mwnts。

步驟(1)中，所述攪拌反應(yīng)的時間為24～48h；

采用ph為9.5～10的堿液(由稀鹽酸和稀氫氧化鈉調(diào)配制得)進行所述洗滌2～5次；

進行所述離心的轉(zhuǎn)速為8000～8500rpm，進行所述離心的時間為20～30min；

所述干燥為冷凍干燥，所述冷凍干燥的溫度為-80℃～-75℃，所述冷凍干燥的時間為48～72h。

步驟(2)中，所述混合溶劑中thf與dmf的體積比為2:1～3:1。

步驟(3)中，所述靜電紡絲的條件為：紡絲溫度20～30℃，濕度為40～50％，施加電壓為15～20kv，接收距離為10～20cm，紡絲推進速度為0.4～0.8ml/h。

步驟(4)中，所述分散劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5～1wt％的聚乙烯醇溶液。

步驟(4)中，進行所述均質(zhì)處理的轉(zhuǎn)速為15000～16000rpm，進行所述均質(zhì)處理的時間為30～60min。

步驟(4)中，采用蒸餾水進行所述洗滌以去除分散劑，所述洗滌的次數(shù)為3～5次；

進行所述離心處理的轉(zhuǎn)速為8000～8500rpm，進行所述離心處理的時間為20～30min；

所述干燥為冷凍干燥，所述冷凍干燥的溫度為-80℃～-75℃，所述冷凍干燥的時間為48～72h。

所述載抗癌藥物的可注射納米短纖維的直徑為400～700nm，長度為20～50m，所述載抗癌藥物的可注射納米短纖維中dox的質(zhì)量百分含量為0.5～2.5％。

所述方法制備得到可注射納米短纖維在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明所述的載抗癌藥物的可注射納米短纖維的制備方法，通過先在中空結(jié)構(gòu)的mwnts上負(fù)載抗癌藥物dox，即為負(fù)載dox的mwnts粉體；之后再將負(fù)載dox的mwnts粉體與可生物降解的高分子plga在特定條件下進行靜電紡絲，得到dox/mwnts/plga復(fù)合納米纖維膜；最后將dox/mwnts/plga復(fù)合納米纖維膜進行破碎、均質(zhì)處理后，制得的所述載抗癌藥物的可注射納米短纖維具有良好的緩釋性能，從而能夠更好、更長時間發(fā)揮癌細(xì)胞治療功效；可注射，藥物利用率高，穩(wěn)定性高，能夠更精準(zhǔn)、有效、安全地對腫瘤部位進行治療；具有良好的生物相容性，具體表現(xiàn)為良好的血液相容性和細(xì)胞相容性，殺傷癌細(xì)胞的同時對人體正常組織細(xì)胞基本不造成損傷；此外，本發(fā)明所述載抗癌藥物的可注射納米短纖維能夠自發(fā)兩種熒光，從而注射到人體被細(xì)胞吞噬后，通過對所述納米短纖維進行實時檢測，有利于實現(xiàn)對癌細(xì)胞治療機理進行研究；本發(fā)明所述可注射納米短纖維的制備方法簡單，易于操作，應(yīng)用前景廣闊。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實施例1所得載抗癌藥物的可注射納米短纖維的sem圖；

圖2是本發(fā)明實施例1所得載抗癌藥物的可注射納米短纖維的直徑分布統(tǒng)計圖；

圖3是對比例1所得mwnts/plga和實施例1所得dox/mwnts/plga短纖維在醋酸鹽緩沖液中的藥物緩釋對比圖；

圖4a為dox(10g/ml)、mwnts(1％)/plga、dox(1％)/plga、dox/mwnts(1％)/plga短纖維(短纖維濃度1mg/ml)及tcps分別與a549細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞)共培養(yǎng)得到的細(xì)胞存活率圖；

圖4b為dox(20g/ml)、mwnts(2％)/plga、dox(2％)/plga、dox/mwnts(2％)/plga短纖維(短纖維濃度0.5mg/ml)及tcps分別與a549細(xì)胞共培養(yǎng)得到的細(xì)胞存活率圖；

圖4c為不同時間(24h、48h、72h)下，a549細(xì)胞分別在的dox(10g/ml)、mwnts(2％)/plga、dox(2％)/plga、dox/mwnts(2％)/plga短纖維(短纖維濃度0.5mg/ml)以及對照組tcps下共培養(yǎng)得到的細(xì)胞存活率圖；

圖4d為不同時間(24h、48h、72h)下，l929細(xì)胞分別在dox(10g/ml)、mwnts(2％)/plga、dox(2％)/plga、dox/mwnts(2％)/plga短纖維(短纖維濃度0.5mg/ml)以及對照組tcps下共培養(yǎng)得到的細(xì)胞存活率圖；

(備注：圖4a-4d中，在不同濃度、不同組分、不同時間下，每組都會測試5種不同的材料，從左到右依次為tcps、mwnts/plga、dox、dox/plga、dox/mwnts/plga，其中tcps為對照組)

圖5a為a549細(xì)胞分別與tcps、dox、mwnts/plga、dox/plga、dox/mwnts/plga共培養(yǎng)24h后的熒光顯微鏡圖；

圖5b為l929細(xì)胞分別與tcps、dox、mwnts/plga、dox/plga、dox/mwnts/plga共培養(yǎng)24h后的熒光顯微鏡圖；

圖6a為h2o、pbs及不同濃度梯度的復(fù)合納米短纖維(2、4、6mg/ml)mwnts/plga和dox/mwnts/plga與血紅細(xì)胞共培養(yǎng)后在450-700nm范圍內(nèi)的紫外吸收圖；

圖6b為pbs及不同濃度梯度的復(fù)合納米短纖維(2、4、6mg/ml)mwnts/plga和dox/mwnts/plga與血紅細(xì)胞共培養(yǎng)后在500-600nm范圍內(nèi)紫外吸收的放大圖；

圖7為人全血分別與tcps、mwnts/plga、dox/mwnts/plga共培養(yǎng)5min、10min、20min、40min、60min后，動態(tài)凝血實驗研究540nm處的紫外吸收圖；

圖8為在alexafluor488、redmondred及dapi通道下，觀察a549肺癌細(xì)胞進行細(xì)胞吞噬的共聚焦顯微鏡圖；

圖9為在alexafluor488、redmondred及dapi通道下，觀察可注射復(fù)合納米短纖維自發(fā)兩種熒光的共聚焦顯微鏡圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細(xì)的描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬于本發(fā)明所保護的范圍。

實施例1

本實施例提供一種載抗癌藥物的可注射納米短纖維的制備方法，包括如下步驟：

(1)按照質(zhì)量比1:1分別稱取dox和mwnts，超聲條件下進行充分均勻混合，之后調(diào)節(jié)ph為9.5，攪拌條件下進行充分反應(yīng)24h，得到反應(yīng)產(chǎn)物先采用ph為9.5的氫氧化鈉水溶液洗滌4次，再在轉(zhuǎn)速為8500rpm條件下進行離心30min，最后在-80℃進行冷凍干燥72h，得到負(fù)載dox的mwnts粉體；經(jīng)檢測，所述負(fù)載dox的mwnts粉體的載藥量為99.6wt％，封裝率為49.9wt％；

其中，所述mwnts采用如下方法制備得到：以lanio3為催化劑，分散到瓷舟中，將瓷舟置于石英管中，并位于管式爐恒溫區(qū)內(nèi)，抽真空，通入氫氣，壓力為常壓，在氫氣流中緩慢升溫還原，至600℃穩(wěn)定30min后，迅速調(diào)到680℃，導(dǎo)入甲烷催化裂解120min，再調(diào)溫至800℃繼續(xù)裂解20min，反應(yīng)到設(shè)定時間后，逐漸冷卻至室溫，收集并稱量，得到mwnts粗品。mwnts粗品經(jīng)鹽酸浸泡48h，并采用超聲波震蕩分離，徹底溶解去除催化劑顆粒，再經(jīng)蒸餾水多次洗滌至ph等于7，采用甲苯萃取，自然干燥，得到所述mwnts。

(2)取plga并加入到thf(四氫呋喃)與dmf(n-n-二甲基甲酰胺)按照體積比3:1配成的混合溶劑中，所述plga的添加質(zhì)量與所述混合溶劑的體積之比為0.25g/ml，攪拌使plga充分溶解，得到紡絲液；

(3)將步驟(1)所述負(fù)載dox的mwnts粉體(20.04mg)加入到步驟(2)所述紡絲液(4ml)中，所述負(fù)載dox的mwnts粉體的質(zhì)量與所述紡絲液的體積之比為5:1mg/ml，攪拌條件下進行充分分散，之后利用高壓靜電紡絲機進行靜電紡絲，真空干燥48h后，得到dox/mwnts/plga復(fù)合納米纖維膜；所述靜電紡絲的條件為：紡絲溫度25℃，濕度為45％，施加電壓為15kv，接收距離為15cm，紡絲推進速度為0.6ml/h；

(4)將步驟(3)所述的dox/mwnts/plga復(fù)合納米纖維膜進行破碎處理，得到碎片，向所述碎片中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5wt％的聚乙烯醇溶液作為分散劑，浸泡10min，之后利用均質(zhì)機在轉(zhuǎn)速為16000rpm條件下進行均質(zhì)處理40min，得到均質(zhì)液先采用蒸餾水進行洗滌3次以除去分散劑聚乙烯醇，再在轉(zhuǎn)速為8500rpm離心機中進行離心20min，最后在-80℃溫度下進行冷凍干燥72h，得到所述的載抗癌藥物的可注射納米短纖維；經(jīng)檢測，所述載抗癌藥物的可注射納米短纖維的直徑為485±136nm、長度為24.8±16.1μm，所述載抗癌藥物的可注射納米短纖維中dox的質(zhì)量百分含量為0.980％，mwnts的質(zhì)量百分含量為0.984％。

實施例2

本實施例提供一種載抗癌藥物的可注射納米短纖維的制備方法，包括如下步驟：

(1)按照質(zhì)量比1:2分別稱取dox和mwnts，超聲條件下進行充分均勻混合，之后調(diào)節(jié)ph為10，攪拌條件下進行充分反應(yīng)48h，得到反應(yīng)產(chǎn)物先采用ph為10的氫氧化鈉水溶液洗滌3次，再在轉(zhuǎn)速為8000rpm條件下進行離心25min，最后在-75℃進行冷凍干燥48h，得到負(fù)載dox的mwnts粉體；經(jīng)檢測，所述負(fù)載dox的mwnts粉體的載藥量為95.4wt％，封裝率為48.2wt％；

其中，所述mwnts采用如下方法制備得到：以lanio3為催化劑，分散到瓷舟中，將瓷舟置于石英管中，并位于管式爐恒溫區(qū)內(nèi)，抽真空，通入氫氣，壓力為常壓，在氫氣流中緩慢升溫還原，至600℃穩(wěn)定30min后，迅速調(diào)到660℃，導(dǎo)入甲烷催化裂解100min，再調(diào)溫至600℃繼續(xù)裂解25min，反應(yīng)到設(shè)定時間后，逐漸冷卻至室溫，收集并稱量，得到mwnts粗品。mwnts粗品經(jīng)鹽酸浸泡48h，并采用超聲波震蕩分離，徹底溶解去除催化劑顆粒，再經(jīng)反復(fù)蒸餾水洗滌至ph等于7，采用甲苯萃取，自然干燥，得到提純的所述mwnts。

(2)取plga并加入到thf與dmf按照體積比2:1配成的混合溶劑中，所述plga的添加質(zhì)量與所述混合溶劑的體積之比為0.2g/ml，攪拌使plga充分溶解，得到紡絲液；

(3)將步驟(1)所述負(fù)載dox的mwnts粉體(30.4mg)加入到步驟(2)所述紡絲液(4ml)中，所述負(fù)載dox的mwnts粉體的質(zhì)量與所述紡絲液的體積之比為4:1mg/ml，攪拌條件下進行充分分散，之后利用高壓靜電紡絲機進行靜電紡絲，真空干燥24h后，得到dox/mwnts/plga復(fù)合納米纖維膜；所述靜電紡絲的條件為：紡絲溫度20℃，濕度為40％，施加電壓為15kv，接收距離為10cm，紡絲推進速度為0.4ml/h；

(4)將步驟(3)所述的dox/mwnts/plga復(fù)合納米纖維膜進行破碎處理，得到碎片，向所述碎片中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1wt％的聚乙烯醇溶液作為分散劑，浸泡20min，之后利用均質(zhì)機在轉(zhuǎn)速為15000rpm條件下進行均質(zhì)處理30min，得到均質(zhì)液先采用蒸餾水進行洗滌5次，以去除分散劑聚乙烯醇，再在轉(zhuǎn)速為8000rpm離心機中進行離心30min，最后在-75℃溫度下進行冷凍干燥48h，得到所述的載抗癌藥物的可注射納米短纖維；經(jīng)檢測，所述載抗癌藥物的可注射納米短纖維的直徑為404±127nm、長度為22.2±15.6μm，所述載抗癌藥物的可注射納米短纖維中dox的質(zhì)量百分含量為0.971％，mwnts的質(zhì)量百分含量為1.941％。

實施例3

本實施例提供一種載抗癌藥物的可注射納米短纖維的制備方法，包括如下步驟：

(1)按照質(zhì)量比2:1分別稱取dox和mwnts，超聲條件下進行充分均勻混合，之后調(diào)節(jié)ph為9.5，攪拌條件下進行充分反應(yīng)36h，得到反應(yīng)產(chǎn)物先采用ph為9.5的naoh水溶液(由1mol/ml的hcl和naoh調(diào)配后制得)洗滌5次，再在轉(zhuǎn)速為8500rpm條件下進行離心20min，最后在-80℃進行冷凍干燥72h，得到負(fù)載dox的mwnts粉體；經(jīng)檢測，所述負(fù)載dox的mwnts粉體的載藥量為96.1wt％，封裝率為48.9wt％；

其中，所述mwnts采用如下方法制備得到：以lanio3為催化劑，分散到瓷舟中，將瓷舟置于石英管中，并位于管式爐恒溫區(qū)內(nèi)，抽真空，通入氫氣，壓力為常壓，在氫氣流中緩慢升溫還原，至600℃穩(wěn)定30min后，迅速調(diào)到700℃，導(dǎo)入甲烷催化裂解140min，再調(diào)溫至1000℃繼續(xù)裂解15min，反應(yīng)到設(shè)定時間后，逐漸冷卻至室溫，收集并稱量，得到mwnts粗品。mwnts粗品經(jīng)鹽酸浸泡48h，并采用超聲波震蕩分離，徹底溶解去除催化劑顆粒，再經(jīng)反復(fù)蒸餾水洗滌至ph等于7，采用甲苯萃取，自然干燥，得到提純的mwnts。

(2)取plga并加入到thf與dmf按照體積比3:1配成的混合溶劑中，所述plga的添加質(zhì)量與所述混合溶劑的體積之比為0.3g/ml，攪拌使plga充分溶解，得到紡絲液；

(3)將步驟(1)所述負(fù)載dox的mwnts粉體(15.4mg)加入到步驟(2)所述紡絲液(4ml)中，所述負(fù)載dox的mwnts粉體的質(zhì)量與所述紡絲液的體積之比為6:1mg/ml，攪拌條件下進行充分分散，之后利用高壓靜電紡絲機進行靜電紡絲，真空干燥24h后，得到dox/mwnts/plga復(fù)合納米纖維膜；所述靜電紡絲的條件為：紡絲溫度30℃，濕度為50％，施加電壓為20kv，接收距離為20cm，紡絲推進速度為0.8ml/h；

(4)將步驟(3)所述的dox/mwnts/plga復(fù)合納米纖維膜進行破碎處理，得到碎片，向所述碎片中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5wt％的聚乙烯醇溶液作為分散劑，浸泡10min，之后利用均質(zhì)機在轉(zhuǎn)速為16000rpm條件下進行均質(zhì)處理60min，得到均質(zhì)液先采用蒸餾水進行洗滌4次，以除去分散劑聚乙烯醇，再在轉(zhuǎn)速為8500rpm離心機中進行離心25min，最后在-80℃溫度下進行冷凍干燥72h，得到所述的載抗癌藥物的可注射納米短纖維；經(jīng)檢測，所述載抗癌藥物的可注射納米短纖維的直徑為610±158nm、長度為23.4±17.2μm，所述載抗癌藥物的可注射納米短纖維中dox的質(zhì)量百分含量為0.985％，mwnts的質(zhì)量百分含量為0.493％。

對比例1

本對比例提供一種納米短纖維mwnts/plga的制備方法，包括如下步驟：

(1)取plga并加入到thf(四氫呋喃)與dmf(n-n-二甲基甲酰胺)按照體積比3:1配成的混合溶劑中，所述plga的添加質(zhì)量與所述混合溶劑的體積之比為0.25g/ml，攪拌使plga充分溶解，得到紡絲液；

(3)將mwnts粉體(20.04mg)加入到步驟(2)所述紡絲液(4ml)中，mwnts粉體的質(zhì)量與所述紡絲液的體積之比為5:1mg/ml，攪拌條件下進行充分分散，之后利用高壓靜電紡絲機進行靜電紡絲，真空干燥48h后，得到mwnts/plga復(fù)合納米纖維膜；所述靜電紡絲的條件為：紡絲溫度25℃，濕度為45％，施加電壓為15kv，接收距離為15cm，紡絲推進速度為0.6ml/h；

(4)將步驟(3)所述的mwnts/plga復(fù)合納米纖維膜進行破碎處理，得到碎片，向所述碎片中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5wt％的聚乙烯醇溶液作為分散劑，浸泡10min，之后利用均質(zhì)機在轉(zhuǎn)速為16000rpm條件下進行均質(zhì)處理40min，得到均質(zhì)液先采用蒸餾水進行洗滌3次，再在轉(zhuǎn)速為8500rpm離心機中進行離心20min，最后在-80℃溫度下進行冷凍干燥72h，得到納米短纖維mwnts/plga。

對比例2

本對比例提供一種dox/plga的制備方法，包括如下步驟：

(1)取plga并加入到thf(四氫呋喃)與dmf(n-n-二甲基甲酰胺)按照體積比3:1配成的混合溶劑中，所述plga的添加質(zhì)量與所述混合溶劑的體積之比為0.25g/ml，攪拌使plga充分溶解，得到紡絲液；

(3)將dox加入到步驟(2)所述紡絲液中，dox與所述紡絲液的體積之比為5:1g/ml，攪拌條件下進行充分分散，之后利用高壓靜電紡絲機進行靜電紡絲，真空干燥48h后，得到dox/plga復(fù)合納米纖維膜；所述靜電紡絲的條件為：紡絲溫度25℃，濕度為45％，施加電壓為15kv，接收距離為15cm，紡絲推進速度為0.6ml/h；

(4)將步驟(3)所述的dox/plga復(fù)合納米纖維膜進行破碎處理，得到碎片，向所述碎片中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5wt％的聚乙烯醇溶液作為分散劑，浸泡10min，之后利用均質(zhì)機在轉(zhuǎn)速為16000rpm條件下進行均質(zhì)處理40min，得到均質(zhì)液先采用蒸餾水進行洗滌3次，再在轉(zhuǎn)速為8500rpm離心機中進行離心20min，最后在-80℃溫度下進行冷凍干燥72h，得到納米短纖維dox/plga。

實驗例

1、緩釋效果測試

將實施例1制得的可注射納米短纖維dox/mwnts/plga和對比例1制得的納米短纖維mwnts/plga分別作為待測樣品進行緩釋效果測試，檢測方法具體如下：

取待測樣品30mg，置于截流分子量為3500透析袋中，取10mm醋酸鹽緩沖液(ph＝5.4)2ml分散短纖維，另取13ml醋酸鹽緩沖液分散在透析袋外部。緩釋外部條件為37℃的搖床中，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm。前期要間隔時間短些，后期間隔長些。每次取出2ml，然后再加入2ml醋酸鹽緩沖液。檢測用紫外分光光度計，測在481nm波長處特征吸收峰出的吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出dox濃度。計算出dox累計釋放量，比較分析兩者的藥物緩釋情況，測試結(jié)果如圖3所示，可以看出dox/mwnts/plga復(fù)合納米短纖維相較于mwnts/plga具備更好的緩釋效果，40天內(nèi)釋放量低于50％。

2、細(xì)胞毒性評價

細(xì)胞毒性研究中，癌細(xì)胞采用a549肺癌細(xì)胞，正常細(xì)胞采用l929小鼠成纖維細(xì)胞，對復(fù)合納米短纖維進行細(xì)胞毒性評價。步驟包括：

(1)先種板培養(yǎng)。處于生長旺盛期的細(xì)胞在25ml細(xì)胞瓶中培養(yǎng)2～3天，倒出培養(yǎng)液，用pbs洗滌3次，加胰蛋白酶1ml消化5min，取出置于15ml離心管中，離心5min，加入1ml新鮮培養(yǎng)液，取出40l均勻的細(xì)胞懸浮液于2ml離心管中，再加入360l生理鹽水，通過細(xì)胞計數(shù)器計算細(xì)胞總數(shù)。配置細(xì)胞懸浮液濃度為5萬/ml，往96孔板每孔加入200l，保障每個孔板加1萬細(xì)胞，在37℃的5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。

(2)加材料培養(yǎng)。取出培養(yǎng)12h的細(xì)胞，倒出細(xì)胞培養(yǎng)液，往里分別加入復(fù)合納米短纖維mwnts/plga、dox/plga、dox/mwnts/plga(本發(fā)明實施例1所得)及dox四個材料進行培養(yǎng)。

(3)一部分進行cck-8測細(xì)胞存活率，另一部分細(xì)胞染色，熒光顯微鏡下觀察活細(xì)胞分布。取出加材料培養(yǎng)24h、48h、72h后的細(xì)胞，倒出細(xì)胞培養(yǎng)液，生理鹽水洗滌，加cck-8共培養(yǎng)2小時，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，結(jié)果如圖4a-圖4d所示，在不同濃度、不同組分、不同時間下，每組都會測試5種不同的材料，從做到右每組材料依次為tcps、mwnts/plga、dox、dox/plga、dox/mwnts/plga，其中tcps為對照組；另一部分也用生理鹽水洗滌干凈，加4％多聚甲醛浸泡20～30min，生理鹽水洗滌3～5次。dapi避光下浸泡5min，生理鹽水洗滌3～5次。然后在倒置熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞的形貌，結(jié)果如圖5a和圖5b所示。

可以得出：短纖維dox/mwnts/plga比dox/plga有更好的更長間的癌細(xì)胞治療效果，同時復(fù)合納米短纖維dox/mwnts/plga表現(xiàn)出可以殺死癌細(xì)胞細(xì)胞，而對正常細(xì)胞影響較小。同時也輔證了本發(fā)明所述dox/mwnts/plga有更好的藥物緩釋效果。

3、血液相容性評價

血液相容性研究中，設(shè)計了可注射復(fù)合納米短纖維的溶血實驗和動態(tài)凝血實驗。

取肝素鋰穩(wěn)定的健康成年人全血，加入到15ml離心管中，離心3min，轉(zhuǎn)速為3000r/min，每次加入14mlpbs進行洗滌(大概5次)，直到上清液呈無色，棄去上清液得紅細(xì)胞hrbcs。取0.2ml紅細(xì)胞溶于0.8ml的去離子水中，作為陽性對照。再取0.2ml的紅細(xì)胞溶于0.8ml的磷酸鹽緩沖液(pbs)中，作為陰性對照。接下來取0.2ml的紅細(xì)胞分別加入到含不同濃度mwnts/plga和dox/mwnts/plga復(fù)合納米短纖維的磷酸鹽緩沖液中，配置成不同的濃度梯度，兩種材料的質(zhì)體比分別為2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml。在37℃恒溫箱中共培養(yǎng)2個小時，用酒精棉球擦拭過的無菌鑷子，夾出短纖維材料，然后在離心機上10000rpm，離心1min，取出后離心管，按照h2o、pbs、mwnts/plga(2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml)和dox/mwnts/plga(2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml)依次排列進行拍照觀察。然后再取離心后的上清液，在紫外分光光度計波長為450nm-700nm范圍內(nèi)測吸光度，溶血率均低于5％，表現(xiàn)出良好的血液相容性，如圖6a和圖6b所示，其中，“1”代表mwnts/plga(2mg/ml)，“2”代表mwnts/plga(4mg/ml)，“3”代表mwnts/plga(6mg/ml)，“4”代表dox/mwnts/plga(2mg/ml)，“5”代表dox/mwnts/plga(4mg/ml)，“6”代表dox/mwnts/plga(6mg/ml)。

動態(tài)凝血實驗中，直接取肝素鋰穩(wěn)定的健康成人全血，加入到12孔板中，每個孔20l，再將每孔加入0.2mol/l的cacl2溶液10l，取復(fù)合納米短纖維dox/plga、dox/mwnts/plga，在對應(yīng)的培養(yǎng)時間的孔中各加入1mg，與12孔板中的溶液充分接觸，設(shè)置一組為不加材料的對照組實驗。將加好材料的孔板加入到37℃的恒溫箱中，開始計時，5分鐘后，向dox/plga、dox/mwnts/plga對應(yīng)的反應(yīng)5分鐘的兩個孔中各加入5ml去離子水，滴加過程中，采用從邊緣滴加慢慢向中間滲透的方法加入到孔板中。然后放回37℃的恒溫箱中，5分鐘中后取出2ml待測吸光度。同樣的方法，10min、20min、40min、60min到培養(yǎng)的時間之后，加入5ml去離子水，放回37℃的恒溫箱中，5分鐘中后取出2ml待測吸光度。用uv-vis測試上清液的血紅蛋白在540nm處的吸光值，每組設(shè)計三個平行實驗，進行比較分析，凝血效果和對照組相差不大，表現(xiàn)出良好的血液相容性，如圖7所示。

4、細(xì)胞吞噬實驗

進一步為了研究復(fù)合納米短纖維對癌細(xì)胞治療的機理，設(shè)計了細(xì)胞吞噬實驗。具體操作為：共聚焦顯微鏡制樣，包括12孔板中加玻片，酒精消毒、生理鹽水沖洗以及在dmem培養(yǎng)基中浸泡12h；癌細(xì)胞a549種板，8萬/孔，培養(yǎng)12h；復(fù)合納米短纖維dox/mwnts/plga濃度為0.5mg/ml，共培養(yǎng)24h。接下來生理鹽水洗滌3～5次，進行活細(xì)胞染色。包括4％多聚甲醛浸泡20～30min，生理鹽水洗滌3～5次；0.1％tritonx-100浸泡10min，生理鹽水洗滌3～5次；1％bsa浸泡30min，生理鹽水洗滌3～5次；鬼筆環(huán)肽(10l+400lsaline)浸泡30min，生理鹽水洗滌3～5次；dapi避光下浸泡5min，生理鹽水洗滌3～5次。

設(shè)置一對照組，在加有玻片的孔板中加入復(fù)合納米短纖維dox/mwnts/plga，密度為0.5mg/ml，加入500l/孔，共培養(yǎng)36h。

取出玻片在共聚焦顯微鏡下，選擇alexafluor488、redmondred及dapi通道進行觀察分析。對照組選擇alexafluor488、redmondred通道進行觀察分析。如圖8和圖9所示，可以看出，自發(fā)兩種熒光的短纖維(本發(fā)明所述載抗癌藥物的可注射納米短纖維)可以被癌細(xì)胞吞噬，進行癌細(xì)胞治療。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護范圍為準(zhǔn)。