本發(fā)明涉及一種遠(yuǎn)志總皂苷的抗衰老與免疫調(diào)節(jié)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd.或卵葉遠(yuǎn)志Polygala sibirica L.的干燥根。味苦、辛，溫。歸心、腎、肺經(jīng)。具有安神益智，交通心腎，祛痰，消腫的功效。遠(yuǎn)志皂苷類(lèi)成分是主要活性成分之一，現(xiàn)已分離出80多種不同類(lèi)型的遠(yuǎn)志皂苷，主要結(jié)構(gòu)為五環(huán)三萜型，基本母核為齊墩果酸。目前，以三萜皂苷為主要活性成分的人參皂苷、三七皂苷、黃芪皂苷均具有抗炎和免疫作用，而對(duì)于遠(yuǎn)志總皂苷的研究較少，因此有必要開(kāi)展遠(yuǎn)志總皂苷的抗衰老與免疫調(diào)節(jié)作用研究，為遠(yuǎn)志皂苷藥理作用的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供參考。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種遠(yuǎn)志總皂苷的抗衰老與免疫調(diào)節(jié)應(yīng)用，經(jīng)本發(fā)明采用不同劑量遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用，及對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用的研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志皂苷具有抗衰老以及增強(qiáng)免疫功能的作用。
本發(fā)明所涉及的遠(yuǎn)志總皂苷可根據(jù)現(xiàn)有的方法進(jìn)行制備，如采用下述方法：首先進(jìn)行石油醚回流脫脂處理；脫脂后的遠(yuǎn)志再進(jìn)行乙醇回流提??；提取所得浸膏再進(jìn)行大孔吸附樹(shù)脂純化即得；
其中，石油醚回流脫脂處理可按照如下步驟進(jìn)行：
遠(yuǎn)志藥材粉碎至40目，30～60℃石油醚于45℃水浴條件下回流脫脂處理，第1次5倍體積石油醚脫脂1h，第2次3倍體積石油醚脫脂0.5h，脫脂后的遠(yuǎn)志藥粉晾干備用。
乙醇回流提取可按照如下步驟進(jìn)行：
上述脫脂后的遠(yuǎn)志中加入8倍量(質(zhì)量)的85％乙醇水溶液，置于回流裝置中回流提取3次，每次為1.5h，提取液回收乙醇，至無(wú)醇味，放置水浴鍋上揮干溶劑，置于35℃烘箱中烘干24h，制成浸膏，備用。
大孔吸附樹(shù)脂純化可按照如下步驟進(jìn)行(孔輝，鄭德，周洪雷，等.遠(yuǎn)志總皂苷大孔吸附樹(shù)脂純化工藝研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014，41(10):2196-2199.)：D101大孔樹(shù)脂以95％乙醇水溶液濕法裝柱，用蒸餾水洗脫，洗至無(wú)醇味；吸取供試品溶液上樣D101大孔柱，依次用2BV蒸餾水、3BV70％乙醇水溶液洗脫，洗脫速度1BV/h，收集乙醇部分的洗脫液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收溶劑，在水浴鍋上揮干溶劑，放在35℃烘箱中烘干24h，得遠(yuǎn)志總皂苷。
經(jīng)本發(fā)明的遠(yuǎn)志皂苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志總皂苷可用于制備抗衰老的產(chǎn)品。
所述抗衰老的產(chǎn)品具體具有如下功能：
1)提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)；
2)提高血清中CAT和SOD活力；
3)降低腦組織中MDA含量；
4)提高腦組織中SOD含量降低。
遠(yuǎn)志總皂苷在制備如下1)-4)中任一種產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
1)提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的產(chǎn)品；
2)提高血清中CAT和SOD活力的產(chǎn)品；
3)降低腦組織中MDA含量的產(chǎn)品；
4)提高腦組織中SOD含量的產(chǎn)品。
經(jīng)本發(fā)明的遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志總皂苷可用于制備增強(qiáng)免疫功能的產(chǎn)品。
所述增強(qiáng)免疫功能的產(chǎn)品具體具有如下功能：
遠(yuǎn)志總皂苷在制備提高血清細(xì)胞因子IL-2和IL-6含量的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
經(jīng)本發(fā)明抗衰老作用研究表明，與模型組相比，遠(yuǎn)志總皂苷高(400mg·kg-1)、中劑量組(200mg·kg-1)的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著降低(P<0.01，P<0.05，P<0.05，P<0.05)，血清的CAT活力極顯著升高(P<0.01)；低量組(100mg·kg-1)的SOD活力顯著升高(P<0.05)。高、中、低劑量組腦組織的MDA水平、SOD活力組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，高、中、低劑量組腦組織的MDA含量、SOD活力組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)本發(fā)明免疫功能調(diào)節(jié)作用研究表明，與模型組相比較，遠(yuǎn)志皂苷高(400mg·kg-1)、中劑量組(200mg·kg-1)均顯著升高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)(P<0.05)；高劑量組的血清細(xì)胞因子IL-2和IL-6的含量均顯著升高(P<0.01)。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)充分證明遠(yuǎn)志皂苷具有抗衰老以及增強(qiáng)免疫功能的作用。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
材料與方法：
1、動(dòng)物
SPF級(jí)昆明小鼠144只，雌雄各半，4周齡，體質(zhì)量20±2g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0004)。
2、藥品與試劑
遠(yuǎn)志藥材(河北全泰藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：1601001)，石油醚(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160108)，無(wú)水乙醇(天津市進(jìn)豐化工有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20101014)，D-半乳糖(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20141212)，維生素E(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2015828)，0.9％生理鹽水(石家莊四藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：1508103201)，超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20160714)，過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)試盒(南京建成科技有限公司，批號(hào)：20160415)。環(huán)磷酰胺(Solarbio Cat.No.C8650)；鹽酸左旋咪唑(Solarbio Cat.No.L8230)；大孔樹(shù)脂(D101)；Mouse IL-2ELISA Kit；Mouse IL-6ELISA Kit。
3、主要儀器
Ultra-3000系列紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普源精電科技有限公司)，Multiskan FC型酶標(biāo)儀(上海賽默飛世爾儀器有限公司)，AX224ZH/E電子天平(奧豪斯(常州)有限公司)，DE-100g萬(wàn)能高速粉碎機(jī)(浙江紅景天工貿(mào)有限公司)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，SC-02低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，02-0510PRO200Bio-Gen Series勻漿機(jī)，RB3渦旋混勻器(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)。
下述實(shí)施例所使用的遠(yuǎn)志總皂苷按照如下方法制備：
遠(yuǎn)志藥材粉碎至40目，30-60℃石油醚于45℃水浴條件下回流脫脂處理，第1次5倍體積石油醚脫脂1h，第2次3倍體積石油醚脫脂0.5h，脫脂后的遠(yuǎn)志藥粉晾干備用。
脫脂后的遠(yuǎn)志中加入8倍質(zhì)量的85％乙醇水溶液(體積濃度)，置于回流裝置中回流提取3次，每次為1.5h，提取液回收乙醇，至無(wú)醇味，放置水浴鍋上揮干溶劑，置于35℃烘箱中烘干24h，制成浸膏，備用。
D101大孔樹(shù)脂以95％乙醇水溶液(體積濃度)濕法裝柱，用蒸餾水洗脫，洗至無(wú)醇味；吸取供試品溶液上樣D101大孔柱，依次用2BV蒸餾水，3BV70％乙醇洗脫，洗脫速度1BV/h，收集乙醇部分的洗脫液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收溶劑，在水浴鍋上揮干溶劑，放在35℃烘箱中烘干24h，得遠(yuǎn)志總皂苷。
實(shí)施例1、遠(yuǎn)志皂苷抗衰老作用研究
SPF級(jí)昆明小鼠72只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組、陽(yáng)性組、模型組、給藥組(高、中、低劑量組)，每組12只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后。模型組和各給藥組頸背部注射D-半乳糖1.25g·kg-1，空白組皮下注射等體積的生理鹽水；陽(yáng)性組灌胃維生素E 1.25g·kg-1，高、中、低劑量給藥組依次灌胃遠(yuǎn)志總皂苷400、200、100mg·kg-1，空白組和模型組灌胃等體積的蒸餾水。連續(xù)4周，每周記錄一次小鼠的體重，并觀察小鼠一般狀態(tài)，組間比較小鼠毛光澤、稀疏程度，活動(dòng)程度。實(shí)驗(yàn)第4周末禁食12h，小鼠活體稱(chēng)重。
末次給藥后，禁食12h，稱(chēng)量小鼠體重，取胸腺和脾臟稱(chēng)重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。小鼠血清與腦組織分別按試劑盒說(shuō)明測(cè)定CAT、SOD和MDA。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異。
1、遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響
如表1所示，與空白組相比，模型組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低(P<0.01，P<0.05)，觀察發(fā)現(xiàn)脾臟、胸腺有萎縮跡象，說(shuō)明D-半乳糖致衰老模型成功。與模型組相比，陽(yáng)性組的胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)；遠(yuǎn)志皂苷高劑量組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；遠(yuǎn)志皂苷中劑量組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明遠(yuǎn)志皂苷可顯著抑制脾臟和胸腺指數(shù)的降低。
表1免疫器官指數(shù)比較
注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01
2、遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)小鼠血清CAT和SOD活力的影響
如表2所示，與空白組相比，模型組血清的CAT和SOD活力均顯著降低(P<0.01，P<0.05)，CAT、SOD是體內(nèi)清除自由基的主要抗氧化酶。CAT、SOD酶活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基能力大小，說(shuō)明D-半乳糖致衰老模型成功。與模型組相比，陽(yáng)性組血清的CAT顯著升高(P<0.05)；高、中劑量組血清的CAT活力組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；低劑量組血清的SOD活力顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明遠(yuǎn)志皂苷在一定程度上可顯著抑制兩種酶活力的降低。
表2血清抗氧化能力比較
注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01
3、遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)小鼠腦組織MDA和SOD活力的影響
如表3所示，與空白組相比，模型組腦組織的MDA含量升高(P<0.05)，SOD活力顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，陽(yáng)性組腦組織的MDA含量顯著降低(P<0.05)；高、中、低劑量組腦組織的MDA含量、SOD活力組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。
表3腦組織的抗氧化能力比較
注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01
注射D-半乳糖溶液致衰老是一種經(jīng)典的亞急性衰老模型，小鼠連續(xù)頸背部注射D-半乳糖溶液，小鼠體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生多項(xiàng)生化指標(biāo)的改變，如血清SOD、CAT活力的降低[13]。CAT、SOD的活性間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力，表明D-半乳糖會(huì)引起細(xì)胞的衰老。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物，其高低間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。
本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，遠(yuǎn)志皂苷可以有效對(duì)抗D-半乳糖導(dǎo)致的衰老型小鼠，具有抗衰老作用；其抗衰老的機(jī)制可能是通過(guò)提高機(jī)體CAT、SOD等抗氧化酶活力，進(jìn)而對(duì)抗自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，通過(guò)給予衰老小鼠遠(yuǎn)志皂苷可顯著提高衰老小鼠體內(nèi)CAT、SOD活力，降低MDA含量，從而一定程度上可緩解D-半乳糖導(dǎo)致的小鼠衰老，提高整個(gè)機(jī)體的抗氧化能力。
實(shí)施例2、遠(yuǎn)志皂苷的免疫作用研究
將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性組、皂苷高、中、低劑量組，每組12只小鼠，雌、雄各半，除空白組外其余各組腹腔注射劑量為30mg·kg-1的環(huán)磷酰胺溶液，空白組注射等劑量的生理鹽水，陽(yáng)性組灌胃劑量為20mg·kg-1的鹽酸左旋咪唑溶液，高、中、低劑量給藥組依次灌胃遠(yuǎn)志總皂苷400、200、100mg·kg-1，空白組和模型組灌胃等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥14天。
末次給藥后，禁食12h，稱(chēng)量小鼠體重，取胸腺和脾臟，稱(chēng)取重量計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。按照ELISA說(shuō)明書(shū)測(cè)量小鼠血清中IL-2和IL-6的含量。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異。
1、遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響
如表4所示，與空白組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)以及脾臟指數(shù)相較于空白組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，免疫器官的質(zhì)量在一定程度上可以反映免疫調(diào)節(jié)的強(qiáng)弱，該結(jié)果說(shuō)明免疫低下小鼠模型制造成功。與模型組比較，陽(yáng)性組的胸腺指數(shù)以及脾臟指數(shù)均有顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明陽(yáng)性藥可以緩解免疫低下小鼠臟器的萎縮；從脾臟指數(shù)這一水平來(lái)看，遠(yuǎn)志皂苷高、中劑量組均顯著升高(P<0.05)，從胸腺指數(shù)這一水平來(lái)看，遠(yuǎn)志皂苷高、中、低劑量組均顯著升高(P<0.01或P<0.05)，說(shuō)明遠(yuǎn)志皂苷對(duì)于小鼠臟器的萎縮起到一定的緩解作用。
表4遠(yuǎn)志皂苷對(duì)小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響
注：與空白組比較，#P<0.05；##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01
2、遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子IL-2和IL-6含量的影響
如表5所示，與空白組相比，模型組小鼠的血清細(xì)胞因子IL-2和IL-6的含量均顯著降低(P<0.05)，血清細(xì)胞因子含量的降低反應(yīng)了小鼠免疫調(diào)節(jié)功能的降低，說(shuō)明免疫抑制小鼠模型制造成功。
與模型組相比較，陽(yáng)性組的小鼠的血清細(xì)胞因子IL-2和IL-6的含量均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，說(shuō)明鹽酸左旋咪唑可以緩解小鼠血清細(xì)胞因子含量的降低從而調(diào)節(jié)小鼠免疫功能。皂苷高劑量組的血清細(xì)胞因子IL-2和IL-6的含量相較于模型組均極顯著升高(P<0.01)，中劑量組的血清細(xì)胞因子IL-6的含量顯著升高(P<0.05)。說(shuō)明遠(yuǎn)志皂苷能夠抑制由于環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠血清細(xì)胞因子含量的降低。
表5遠(yuǎn)志皂苷對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子IL-2、IL-6含量的影響
注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01,；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；
在整個(gè)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中，選擇性引起Th1/Th2的混和反應(yīng)起著主要作用，Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子是通過(guò)激活效應(yīng)細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞分泌則是通過(guò)分泌IL-4、IL-5、IL-6等細(xì)胞因子以輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體為主要作用，從而介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，因此本實(shí)施例選用IL-2和IL-6的含量作為評(píng)估遠(yuǎn)志皂苷對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)的影響的兩個(gè)指標(biāo)。
本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，遠(yuǎn)志皂苷對(duì)小鼠胸腺指數(shù)以及脾臟指數(shù)、IL-2和IL-6的含量有一定的影響，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出隨著劑量的增加，其影響程度增加。